Beobachtungen fiber zwei EigentiJmlichkeiten der roten BlutkGrperchen (,,Fndokoagulation-

und ,,Reversion der H imolyse"). Von H. R o h o n y i (Budapest).

(Aus dem physiol. Institut der K6nigl. ung. Univ. Budapest. Direktor: Franz Tangl.). (E ingegangen am _'2~. August 191~.t

In meinen Versuchen fiber die Rolle der Blutzellenmembran habe ich aul]er einigen anderen Erscheinungen die Koagulation des H~mo- globins in der Zelle und in seiner L6sung vergleichend untersucht. Dabei wurde ich zwei Erscheinungen gewahr, die aui]er dem, dab sie fiber die ,Membranwirkung" wichtige Aufschlfisse bieten, auch anderweitiges Interesse zu haben scheinen, weshalb sie separat angeffihrt werden sollen.

io

Die ,,Endokoagulation des H~moglobins".

Wird zur Suspension yon mit KochsalzlOsung ausgewaschenen roten Rinderblutk6rperchen etwas Sulfosalizyls~iurel6sung (oder ein sonstiger, EiweiB fiillender Stoff) gegeben, so wird folgende eigentfimliche Er- scheinung wahrzunehmen sein. Die Suspension agglutiniert nicht, sondern bleibt auch fernerhin leicht trfib; setzen sich nach einiger Zeit die Zellen, so werden sie sich nach Aufsch/~ttelung wieder gleichm~ii~ig zerstreuen; die lebhaft rotfarbige Suspension ist kaffeebraun geworden; unter dem Mikroskop erscheinen die einzelnen Zellen in ihrer ursprfing- lichen Gr0i3e und Kontur, dennoch mit dem Unterschiede, dat~ in jeder Zelle ein his zwei eigentfimliche leuchtende K~rnchen ersichtlich sind; d ie Zellen haben zugleich ihre H~imolysierbarkeit verloren: werden sie

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n/imlich mit destilliertem Wasser gewaschen, oder mit Saponin, mit Aether behandelt, so werden sie nicht aufgel6st. All dies weist offenbar darauf hin, dab in der r o t e n B 1 u tz e 11 e EiweiBkoagulation entstanden ist: das H / i m o g l o b i n i s t a u s g e f a l l e n u n d a u f d a s S t r o m a f i x i e r t . Diese Erscheinung ist in allen ihren Einzelheiten mit Leichtig- keit yon der Agglutination der Blutk6rperchen zu unterscheiden.

Diese ,Endokoagulation" des H/imoglobins kommt auch dann zu- stande, wenn die in konzentrierten ( m / I - - m / 4 ) Salzl6sungen suspen- dierten, mit Rohrzuckerl6sung ausgewaschenen roten Blutk6rperchen mit verdfinnten Mineralsfiuren versetzt werden. Wird z. B. roten Blut- k6rperchen, die in m/2 KJ-L6sung suspendiert wurden, soviel Salpeter- s~iure zugesetzt, daf~ die Suspension die S/iure in n / 1 0 0 - - n / 2 0 0 - Konzentration enthfilt, so wird nicht H~imolyse, auch nicht Agglutination, sondern die bereits erw~ihnte Erscheinung auftreten.

Wird das H/imoglobin in g e 16 s t e r Form auf seine diesbezfigliche Reaktion hin geprfift, so wird beobachtet werden k6nnen, dab die Zusammenwirkung solcher Salz- und S~iurekonzentrationen eine K o a - g u 1 a t i o n des H/imoglobins herbeiffihrt.

Ich habe nun die Bedingungen der Koagulation des H~imoglobins in L6sung und im BlutkSrperchen vergleichend untersucht.

a) B l u t k 6 r p e r c h e n .

In eine Reihe nebeneinander gesetzter Eprouvetten gab ich je 5 ccm der S~iuresalzl6sung und je 1 ccm der mit Rohrzucker ausge- waschenen Blutzellensuspension; sodann beobachtete ich die eintretenden Ver~inderungen und notierte deren Zeitpunkt.

In der ersten Reihe wurden m/2 Salzl6sungen, enthaltend n/50- H NO3, verwendet.

1. KCI, 2. K J, 3. K S C N , 4. KNOB, 5. K~(COO)~, 6. K2SO4; als Kontrolle diente 7. achtprozentige RohrzuckerlOsung (enthielt eben- falls n /50-H N Oa).

In der Probe 7 konnte in einer Minute eine Agglutination und (teilweise) eine H~imolyse der Blutk6rperchen wahrgenommen werden; die Blutk6rperchen blieben aber dauernd rot. In der Probe 5 trat auch nach Stunden wederAgglutination, noch H/imolyse ein. DieBlutk6rperchen blieben rot und waren nach Zentrifugieren mit destilliertem Wasser hiimolysierbar. In allen anderen Eprouvetten wurden die Blutk6rperchen

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in kiirzerer oder l~ingerer Zeit b r a u n, ohne dab eine Agglutination eintrat; die Zellen konnten dann nach Zentrifugieren mit destilliertem Wasser nicht h~imolysiert werden. Das Braunwerden der Zellen konnte am fr/ihesten in Probe 3 (nach 1'), dann in Probe 1 (nach 2'), Probe 2 (nach 3'), Probe 4 (nach 4'), Probe 6 (nach 50') konstatiert werden.

In einer zweiten Reihe wurden m/2 Salzl6sungen mit n /200-HNO3 verwendet.

Probe 7: Agglutination und H~imolyse binnen einer Minute. Die Zellen sind rot keine Veranderung binnen zw61f Stunden , 5 :

,, 1 : nach 20' ,, 2 : nach 10' . 3: nach 1' ,, 4: nach 10' . 6 : nach 60'

Braunwerden der Zellen, keine Agglutination, keine H~imolyse.

Die Zellen sind mit destilliertem Wasser nicht mehr zu h~imolysieren.

Demgem~it~ kommt also in gewissen (konzentrierten) Salzl6sungen der agglutinierende und h~imolysierende EinfluB verdiinnter S~iuren auf rote Blutk6rperchen nicht zur Geltung. Hingegen tritt in kiirzerer oder langerer Zeit eine ,Endokoagulation" auf. Die Anionenreihe dieser S~iuresalzwirkung auf das H~imoglobin der roten Blutk6rperchen ist folgende: (Oxalat) < SO4 < C1, NO.B < J < SCN.

b) H ~ i m o l y s i e r t e s B l u t u n d k r i s t a l l i s i e r t e s H~imoglobin .

Zu 5,5 ccm derselben S~iure-Salzl6sungen wurde 1,1 ccm Blutk6r- perchenl6sung gegeben; diese wurde aus Rohrzucker-BlutkBrperchen durch Verdiinnung mit dem zwanzigfachen Volum destillierten Wassers erhalten. Die Nacheinanderfolge war wiederum: 1. KCI, 2. K J, 3. KS C N, 4. KNOa, 5. K2(COO)~, 6. K2SO~; als Kontrolle diente: achtprozentige Rohrzuckerl6sung. Die Salzl6sungen enthielten m/2 Salz, alle L6sungen enthielten n / 1 0 0 - H N O 3 .

In der Kontroll6sung (7) trat nun binnen einer Stunde keine sicht- bare Ver~inderung (weder Koagulation, noch Farbenwechsel) "ein; die L6sung blieb dunkelrot. Auch in der Oxalatl6sung (5) ist keine Ver- .finderung sichtbar. In den anderen L6sungen war aber eine Koagu- lation eingetreten, und zwar in Probe 2, 3 und 4 sofort, in 6 in zwei Minuten eine totale Koagulation (wobei die obenstehenden Schichten farblos wurden), in 1 nach 15' eine unvollkommene Koagulation.

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Es wurde noch eine zweite Reihe mit m/2 Salzl6sungen, die n / 2 0 0 - H N O a enthielten) ausgef/ihrt. (Die Kontroll6sung enthielt eben- falls n/100-HNOa.) Das Ergebnis war folgendes:

In Probe 7: . ,) 5 :

. )) 3 :

. ,, 4 :

. . 6 "

binnen einer Stunde keine Ver/inderung

unvollst/indige Koagulation nach einer Stunde

totale Koagulation sofort

totale Koagulation nach einer halben Stunde.

Der Vergleich dieser Ergebnisse mit den oben beschriebenen er- gibt, daft die koagulierende Wirkung saurer Salzl6sungen auf das ge- 16ste und in der Zelle eingeschlossene H/imoglobin durchaus/ihnlich ver- l/iuft. Die Anionreihen decken sich bis auf einen Platzwechsel der Ionen,. Chlor und Sulfat vollst~indig. Die mit der L6sung des k r i s t a l l i s i e r t e n , H/imoglobins ausgef/ihrten Proben verhielten sich ganz wie jene mit: h/imolysiertem Blute.

Ich will hier bemerken, dab die yon mir sogenannte ,Endokoa- gulation" als Erscheinung gar nicht neu ist, vollzieht sich doch dieselbe bei der Fix a t i o n (mit Hitze oder Methylalkohol oder Sublimat) eines jeden mikroskopischen Bluttrockenpr/iparates. Durch Vergleichen mit der Koagulation yon H~imoglobinl6sungen kann aber aus dieser Er- scheinung - - wie wir sehen werden - - eine wichtige Folgerung ge- zogen werdeu.

I1.

D i e , , R e v e r s i o n d e r H ~ m o l y s e " .

S p i r o machte im Jahre 1897 die Beobachtung, daB, wenu ztr Blut, das mit Wasser h~imolysiert wurde (in welchem unter dem Mikros- kop keine roten Blutk6rperchen sichtbar sind), Natrium-Monosulfat oder ein sonstiger ,wasserentziehender" K6rper gegeben wird, die lackfarbene L6sung sofort deckfarben wird und unter dem Mikroskop unz~thlige Blutk6rperchen erscheinen. Er beschrieb diese Erscheinung folgendermaBen: Die bis zur Unsichtbarkeit gebl/ihten Stromata ver- lieren infolge des Salzzusatzes das aufgenommene Wasser, schrumpfen zusammen, und zugleich kehrt das ausgel6ste H~imoglobin von der L6sung in die zusammengeschrumpften Stromata zur/ick. Diese Er-

ROHONYI, EIOENTOMLICHKEITEN DER ROTEN BLUTKORPERCHEN 3 9 5

scheinung wurde seitdem a u c h v o n anderen beobachtet. Bei meinen verschiedenen h/imolytischen Versuchen habe ich inzwischen auch selbst (ohne yon den Versuchen yon S p i r o gewuBt zu haben) diese Er- scheinung wahrgenommen und habe dieselbe anfangs in gleicher Weise aufgefaBt. Im Verfolge meiner weiteren Untersuchungen hat sich fiber diese Erscheinung folgendes herausgestellt: Ich habe durch Z~ihlung der Blutzellen festgestellt, dab in dem mit dem gleichen Volum destillierten Wassers h~imolysierten Blute auf Zusatz jedwelchen Quantums konzentrierter Salzl6sung h 6 c h s t e n s 5 Pro z. d e r Z e 11 e n wieder zum Vorschein treten; ferner, dab die ,,Reversion" /iberhaupt nicht zustande kam, wenn das Blut vorher nicht mit dem gleichen Volum destillierten Wassers, sondern mit dem ffinf- bis zehnfachen Volum desselben verdfinnt wurde; endlich erscheinen die Zellen auch dann nicht mehr wieder, wenn die H/imo!yse nicht mit dem gleichen Vo- lum destillierten Wassers, sondern ohne Verdfinnung durch Zusatz von Saponin erfolgt, mag noch so viel Salz in die LSsung gebracht werden.

Diese Umst~inde lassen keinen Zweifel darfiber often, dab die S p i ro ' sche Auslegung dieser Erscheinung unrichtig ist. Das H~imo: globin, das aus den Zellen gel6st wurde, kebrt nicht in die Stromata zur/ick, sondern die durch destilliertes Wasser stark gequollenen Zellen schrumpfen, in Gegenwart des Salzes, wieder zusammen, wo- durch ihre Konturen wieder sichtbar werden. Es kann nicht von der ,R/ickkehr" des Harnoglobins in die Zelle gesprochen werden, da es doch, bei der m a n g e l h a f t e n H ~ i m o l y s e , gar nicht heraus- getreten ist.

Diese richtige Erkenntnis der Erscheinung war um so wichtiger, weil ich im Verfolge meiner weiteren Untersuchungen einer Erscheinung gewahr wurde, die ich mit Recht die ~Reversion" der H~imolyse nennen daft. Diese Erscheinung besteht im Folgenden: In e i n e r m i t d e r 2 0 - - 3 0 f a c h e n M e n g e d e s t i l l i e r t e n W a s s e r s o d e r m i t S a p o n i n v o l l s t a n d i g h~ imo lys i e r t en B l u t l 6 s u n g e r s e h e i n e n s i imt l i che , u r s p r f i n g l i c h v o r h a n d e n g e w e s e n e r o t e B l u t - z e l l e n w i e d e r , w e n n d e r L 6 s u n g i r g e n d e i n E i w e i B k o a - g u l i e r e n d e r S t o f f z u g e s e t z t wi rd .

Damit die Koagulation der EiweiBstoffe des Serums keine St6rung verursache, erscheint es zweckmM~ig, das Blut vorher mit physiol. Koehsalzl6sung oder mit einer anderen isotonischen L6sung an: der Zentrifuge so lange zu waschen, bis die Waschfl/issigkeit kein Eiweil~

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mehr enth~ilt. Der so erhaltene BlutkSrperchenbrei wird 2 0 - - 3 0 f a c h mit destilliertem Wasser verd/innt, wie auch durch Z u s a t z yon Saponin v o l l s t ~ i n d i g h~imolysiert. Oibt man einer solchen L6sung konzentrierte Salzl6sung hinzu (wie es S p i r o tat), so wird auch nach 24 Stunden keinerlei Ver~inderung wahrzunehmen sein: die L6sung bleibt nach wie vor rein, durchsichtig. Gibt man ]edoch tropfenweise ffinfprozentige Sulfosalizyls~iure, oder etwas Ferrozyankalium und Essig- s~iure, oder konzentrierte Salzl6sung und Minerals~iure dazu. so w i r d sich die L6sung binnen ein bis zwei Minuten fein tr/iben, alsdann bildet sich ein Niederschlag darin, welcher sich - - die L6sung fiber sich f a r b l o s belassend - - in kfirzerer oder l~ingerer Zeit setzt; das gesamte H~imoglobin kann sich also in dem Niederschlage befinden. Besichtigt man den Niederschlag unter dem Mikroskop, so wird man sogleich erkennen, dab derselbe teilweise aus einzelnen, teilweise aus in kleineren Oruppen agglutinierten r o t e n B l u t k 6 r p e r c h e n besteht. Durch geeignete Wahl der Konzentration des EiweiB fiillenden Stoffes kann erzielt werden, daft der Niederschlag a u s s c h l i e B l i c h aus Zellen besteht; sonst kann ein kleinerer oder grOBerer Teil desselben aus amorphen H~imoglobink6rnchen bestehen. Bei weiterer Prfifung dieser Zellen ist es auffallend, daft deren Suspension nicht rot, sondern braun ist; daft sie nicht h~imolysierbar sind; und schlieBlich, dab unter dem Mikroskop in Vielen Zellen ein bis zwei kugelige K6rnchen zu linden sind. Diese Eigentfimlichkeiten lassen erkennen, dab die rtick- gebildeten Zellen der gleichen Art sind, wie diejenigen, in denen nach den Ausffihrungen des vorigen Kapitels die ,Endokoagulation des H~imoglobins" stattgefunden hat. Diese ist also durch EiweiB koagulierende Stoffe sowohl in Zellsuspensionen als auch in d em v o l l k o m m e n h i i m o l y s i e r t e n B l u t e z u s t a n d e g e k o m m e n .

In einer L6sung von k r i s t a l l i s i e r t e m Hamoglobin erzeugen Eiweit~ koagulierende Stoffe einen nicht aus Zellen, sondern aus amorphen K6rnchen bestehenden Niederschlag. Dasselbe ist bei mit A e t h e r e r f o l g e n d e r H / i m o l y s i e r u n g d e r r o t e n B l u t - k 6 rp e r c h e n d e r Fall, indem, falls nachher die Blutzellen-Stromata mit tiberschiissigem Aether in einem Schfitteltrichter entfernt werden (der Aether nimmt die Stromata auf), EiweiB koagulierende Stoffe nur einen aus amorphen K6rnchen bestehenden Niederschlag erzeugen, Wenn auch die Stromata nicht entfernt werden, kann die Reversion beim Vorhandensein von genfigendem Aether nicht herbeigef/ihrt werden.

ROHONYI, EIOENTUMLICHKEITEN DER ROTEN BLUTK()RPERCHEN ~ 7

Aus diesen Tatsachen folgt, dab bei der mit dem d e s t i l l i e r t e n W a s s e r und S a p o n i n e r z e u g t e n H ~ i m o l y s e z w i s c h e n S t r o m a und H / i m o g l o b i n e in e i g e n a r t i g e r Zu- s a m m e n h a n g b e s t e h e n b l e i b t ; d i e s e r Z u s a m m e n h a n g h 6 r t e r s t n a c h d e r B e h a n d l u n g d e r Z e l l e n mi t A e t h e r auf; d e r Z u s a m m e n h a n g / iuBer t s i ch d a r i n , dab b e i E i n - w i r k u n g EiweiB f ~ i l l e n d e r S t o f f e d ie S t r o m a t a u n d das H a m o g l o b i n z u s a m m e n a u s g e f / i l i t w e r d e n , so zwar , dab h i e r b e i d ie u r s p r / i n g l i c h e V e r b i n d u n g ( F o r m usw.) d e r b e i d e n K o n s t i t u e n t e n e n t s t e h t .

Der physiko-chemische Zustand und Verbindung des Stromas und des H~imoglobins in der Zelle ist auch heute noch ungekl/irt. Es fehlt zwar nicht an verschiedenen Hypothesen (dab das Stroma in Gestalt einer [lipoiden] Membran das aus H/imoglobin bestehende Innere der Zelle umgibt; dab das H/imoglobin vom Stroma adsorbiert ist; dab es sich gel6st darin befindet; dab das schwammartige Stroma mit H/imo- globinl6sung geffillt ist usw.), doch vermag keine die bisher bekannt gewordenen hierhergeh6rigen Erscheinungen befriedigend zu erkl~iren. Die in dieser Abhandlung beschriebene ,Reversion ~ der Hiimolyse steht aber mit allen bisherigen Hypothesen in geradezu schroffem Widerspruch. Die Aufkl~irung des ganz eigent/imlichen physiko-che- mischen Verh~iltnisses zwischen Stroma und H/imoglobin erfordert noeh weitere eingehende Untersuchungen.

Zusammenfassung.

1. Wird zur Suspension von ausgewaschenen roten Blutk6rperchen ein EiweiB f/illender Stoff gegeben, so tritt eine Koagulation des H~imo- globins in d e r Z e l l e auf. Die Bedingungen dieser Koagulation stimmen mit der Koagulation yon h~imolysiertem Blute oder von einer L6sung des kristallisierten H~imoglobins nahezu vollstiindig /iberein.

2. In einer mit destilliertem Wasser oder mit Saponin vollst/indig h/imolysierten Blutl6sung k6nnen die s~mtlichen urspriinglich vorhanden gewesenen Blutk6rperchen wieder erscheinen, wenn der L6sung irgend ein EiweiB koagulierender Stoff unter gewissen Bedingungen zuge- setzt wird.

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3. B e i d e E r s c h e i n u n g e n , die ,Endokoagulation" und die ,Reversion der H~imolyse", s ind u n m 6 g l i c h mit der V o r s t e l l u n g e i n e r B l u t k 0 r p e r c h e n - M e m b r a n zu v e r e i n i g e n . (Siehe dazu: H. R o h o n y i, Ueber die Elektrolytpermeabilit~it der roten Blut- k6rperchen, KoUoidchem. Beih. 8, 337, 1916.)

4. Die physikochemische Natur der Verbindung von Stroma und H~moglobin in dem roten Blutk6rperchen ist eine ganz eigenartige und kann durch die bisherigen Vorstellungen nicht erkl~rt werden.