Diagnosticul de laborator in infectii urinare si

genitale

Prof. Dr. Olga Mihaela Dorobat

Organ steril – exceptie uretra Rezista invaziei bacteriene

– Secretor• mucoasa produce mediatori solubili-proteina Tamm-Horsfall

adera la pilii bacteriilor/impiedica aderarea

• IgA • Lactoferina restrictioneaza cantitatea de Fe• Lipocalin necesara bacteriilor• Peptide constitutive/ inductibile- actiune bactericida

β defensive - produse de epiteliul renal

α defensine – produse de leucocitein cursul inf. urinare

cathlicidine – peptide antimicrobiene

Tractul urinar

• Raspuns imun celular – mediatori ai inflamatiei IL-6 si IL-8– cu actiune chemotactica pentru neutrofile

• Receptori prezenti la suprafata celulelor– TLR4 controleaza producerea

de chemokine si citokine– TLR2 stimuleaza producerea de TNFα

– TLR5 recunoaste flagelina bacteriana– TLR11 previne infectiile tract urinar

Urina – lichide, dieta, medicatieMediu bun de culturaBacteriile –aerobe cresc bine

anaerobe nu cresc vagin – cresc

Bacteriile– Supravietuire– Crestere in urina– Aderare la mucoasa– Reziste la scurgerea urinii

Tract urinar superior Steril- rata scurgerii 0.35ml/minBacteriile adera – uroepiteliu,

pietre

Tract urinar inferior – Mediu static de culturaMucusul inhiba aderareaDescuamareaIgA. IgG – inhiba aderarea

Recoltare• Jet mijlociu - Recipient steril –Ø 5cm

Instruire toaleta localaMoment –dimineata /3- 4h de la ultima mictiuneInaintea administrarii de antibioticeNr.probe 1/zi 1-2 la barbat 2-3 la femeie

F.subclinice• Punga sterila- nn, sugar• Punctie suprapubiana –nn, sugari, femei, suspiciune

bacterrii anaerobe• Cateter – reduce riscul contaminarii probei

bolnavi neooperanti….• Cateter permanent - Nu din punga, cu seringa din sonda

PRELUCRARE IMEDIATA max 2h• PASTRARE – 40C• Consevare – acid boric – 24 h la TCUroculturaMetoda ansei calibrate Calibrare anse

0,01ml Ø 5mm Din 0,1 ml 10 anse

0,001 ml Ø 2,5 mm 100 anse Dilutii - 0,1 din dil. 1/10

CLED±

gel sange

Examen microscopic IUrina necentrifugata - camera de numarat• Nr.leucocite /μl sau mm3

• Nr.hematii /μlPiurie ≥ 10 leucocite/ mm3

10x106 leucocite/l *Centrifugare – se pierd 20 - 80% celule Frotiu colorat Gram – 0,001 ml Ø 2,5 mm

1 bacterie/camp >105 UFC/ml1 leucocit/camp Piurie

*European Urinalysis Guidelines

Examen microscopic II

• Celule epteliale –scuamoase –marker –tehnica recoltare necoprespunzatoare– Exceptie – gravide- crescuta exfolierea celulelor

epiteliale

• Celule epiteliale mici rotunde – Celule urotheliale– Celule epiteliu tubular renal

greu de deosebitindica leziune renala

Citire - interpretare• Limita – bacteriurie semnificativa se bazeaza:

– Simptome clinice– Specie bacteriana– Numarul de specii izolate– Metoda de recoltare– Sex

• Infectii tract urinar necomplicate majoritatea o specie

Flora normal din uretra/org.genitale - contaminanti

Interpretarea cantitativa a cresterii

Volum inocul (ansa )

Nr.colonii pe placa Nr. colonii in urina (CFU/ml)

1μl (Ø 2,5 mm)1 103

10 104

100 105

10μl (Ø 5 mm)1 102

10 103

100 104

Citire - interpretare• > o specie- interpretarea conditionata:

– Daca o specie este dominanta– Cum a fost recoltata - jet mijlociu / cateter cronic– Prezenta de leucocite / celule epiteliale– Simptome clinice– Istoric

• Infectie adevarata cu 2-3 specii poate aparea– A se repeta - purtători sondă

• Trei sau > specii - de obiceise raporteaza “cultura mixta”

Citire - interpretare• Interpretare Kass 1957 - 95% femei cu pieleonefrita

≥ 105 UFC/ml Pozitivspecificitate > sensibilitate <

• Femei - Infectii acute simptomatice -o singura specie>102 –104 UFC/ml + piurie + răspuns terapeutic≥ 103 UFC/ml specificitate > sensibilitate ><105 UFC/ml – fara simptome obisnuit

contaminare • Barbaţi ≥ 104 UFC/ml > sensibilitatea fără sa <

specificitatea Infectii acute necomplicateInfecţii complicate ≥105 UFC/ml

Citire - interpretarePielonefrita – 80% ≥ 105 UFC/ml

10-15% 104 - 105UFC/mlBacteriurie asimptomatica

2 probe ≥ 105 UFC/mlLevuri < 103 UFC/ ml

C.albicans* 104 UFC/mlStafilococi* – 5.104UFC/mlIdentificare / antibiograma – clasic/ automatRezultat 48h / 24hNeconcordanta frotiu/cultura –incubare -48h

*Buiuc D, Negut M- Tratat de microbiologie clinica –ed II

Cauze posibile pentru o concentratie scazuta de bacterii*• Stadiul initial al infectiei• Diureza mare• Simptome urgente (timp scurt de incubatie

in vezica)• Prezenta antibioticelor in urina• pH-ul scazut al urinii• Crestere bacteriana inceata• Proba contaminata

*European Urinalysis Guidelines

Bacteriurie Simptome PiurieColonizare + - -Infectie asimptomatica + - +Infectie simptomatica + + +Inflamatie fara infectie - - +Simptome fara infectie - + -

METODE ALTERNATIVE ISistemul Dipslide• 2 medii CLED /Mac Conkey…….• Sensibilitate 92-95,5%, specificitate 97,2-100%• Corespunzator pentru ID Gram negativi E.coli• Probleme legate de ID

• Enterococi, stafilococi – S.saprophyticus • Unele sp.Pseudomonas nu cresc

• Probleme legate de cantitate • Inoculul nu este reproductibil• Numaratoarea nu este sigura• La concentratii mari crestere conflenta – necesita

subcultivare

METODE ALTERNATIVE II

Medii cromogene – rezultat la 24 h-identificare

E.coli

P.mirabilis

Enterococcus

METODE ALTERNATIVE III

Multistix– 8 parametri –– Leucocite – activ. esterazică -decelare >10

leucocite/ml– Nitraţi – maj. patogeni reduc nitraţii – nitriţi

106UFC/ml Neg. - streptococi, enterocociImpreună – sensibilitate 79%Specificitate Leucocite 87%, Nitrati 100%

Proteine Sange Glucoza Corpi cetonici pH Densitate2 min – citire pe urina proaspat emisă

METODE ALTERNATIVE IV

• Reactia catalazei – 2ml urină + 4 pic. H2O2 10% 2 min. Bule gaz + reactie pozitivă

• Bioluminiscenţa – adenosin trifosfatul –sensibilitatea 93%, specificitatea 78% Test screeningFals neg. Stafilococi, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas

• Metode automateFlowcitometrie

Erori in efectuarea uroculturii I• Recoltarea din primul jet de urina• Recoltare la < 4h de la utima mictiune• Recoltarea in recipiente nesterile• Trimiterea unei probe din toata cantitatea de urina• Pastrarea > 2 h la TC pana la prelucrare• Utilizarea de medii lichide • Utilizarea urinii centrifugate pentru insamantare• Folosirea de anse cu calibru neverificat• Culturi de rutina pentru bacterii anaerobe

Erori in efectuarea uroculturii II

• Utilizarea de sisteme miniaturizate cu suprafete mici de medii gelozate care nu permit obtinerea unui numar suficient de colonii

• Efectuarea sistematica a antibiogramelor din direct din urina

• Neincubarea placilor necrescute la 24h timp de 48h in conditiile in care s-au observat bacterii / leucocite la ex.microscopic direct

• Necorelarea nr/ml si a felului bacteriilor cu starea clinica a bolnavului

PIELONEFRITA

Debut - brusc Febră 39-400C oscilantăFrisoane Durere lombarăSimptome mictionale - arsuri

pot lipsi disuriepolakiurie

Femei Persoane in vârstă Bărbati - uzual initial prostatita

Obstructii –litiaza, apoi inf. urinară Gg, tumori - compresiuniAderente, stricturi ureter, Reflux vezico-uretral

Ex. Urina – leucocite – piurie – nu intotdeauna Lipsa – indiciu localizare –bazinet

Fara atingere parenhim renalEx.gravide

- bacterii – E.coli, Proteus, KlebsiellaComplemantar – Hemocultura –pozitiva

Nr.leucocite >, VSH >, Uree, Creatinina

Infecţii urinare joase CISTITEUrgenţa, frecvenţa Femei în perioada de activ. sexuală Polakiurie 10-20 % cel puţin odată / viaţăDisurie 5 % inf recidivante < 21 zileDureri suprapubiene aceeaşi bacterie cistalgia reinfecţie > 21 zileFebra – absenta bacterii diferite

Diagnostic diferential – inf ginecologiceinf digestive

Infecţii urinare joase CISTITE• Patogenie

– Contaminare din apropiere – intestin, genital– Incapacitatea de a goli complet vezica

• Ex. urinii –indispensabil –– leucocite ≥ 10 / mm3

– bacterii ≥ 105 UFC /ml........... ≥ 103 UFC /mlE.coli S.saprophyticusStreptococ B Enterococcus

• Supraveghere – La 2 zile de la oprire tratament2 - 4 săptămâni pt. depistare recidive

Infecţia urinară la gravideFactori favorizanţi compresie căi urinare

dilatare uretereimunodepresie oarecare

Frecventă 5-10 %Nu este banală/ benignăMulte asimptomaticePolakiuria confundăDurerea suprapubiană sarcinaRisc – copil – n. prematură, hipotrofie fetala

inf. neonatale(meningita, sepsis)mama - pieleonefrită

Infecţia urinară la gravide• Inf. urinară

bine tolerată 6-7 luni - neglijatabrusc – tablou grav- 8-9 lună

nastere – fat mort mama – soc septic

Necesara depistare sistematică

• Febra - Ex. urină - Hemocultură

Infecţia urinara la copil

0,2% .........5,8% spitalizaţi0-2 luni (nn) – urmare tulburarilor digestive,

fără febră – primele 10 zile> baieţi – malformaţii, megaureter,

sindrom de jonctiune,diverticul vezical

2 luni - 6 ani – frecventa > predominant fetefebra 50%, tulburari digestive 25%enuresis, falsa albuminurie

Infecţia urinară la purtatori de sondă permanentă

Infecţia – 8% - I zi Schimbare – 2 luni – 17% - II zi eroziuni

75% - III zi bacteriemie100% - IV zi febra - soc

Pentru retenţie acută de urină –sonda nu > 48 hEx. urină – febra

- cu o săptămână inaintea schimbării

Infecţia urinară la persoanele in varstă10 – 20 %Factori favorizanţiFemei – cistocel,diabet, tulburari neurologice reziduuBarbati - adenom prostată, scleroza col vezical vezicalIntervenţii chirurgicale Adenocarcinom

Polipi vezicaliUreterotomie

Extirpare calculi•

Vezica neurologicăMalformaţii congenitale – spina bifidaTumori Accidente – secţiune medulară

Reziduu vezical asociat Reflux vezico-uretral Favorizează infecţia urinară

PseudomonasProteus Insuficienţă renală PielonefrităE.coli

Izolare patogeni specifici• Mycobacterium tuberculosis

– Recoltare -3 zile - 50ml– Centrifugare 15min. 13000g*- Tratare -idem sputa– Frotiu Ziehl-Neelsen - Cultivare -Lowenstein

• Salmonella typhi– Jet mijlociu 20ml - centrifugare 3000g 30 min– Insamantare selenit - trecere Mac Conkey, SS..

• Leptospira– Jet mijlociu 20ml - centrifugare 3000g 30 min– Insamantare Korthof cu 200-400 μg/ml fluorouracil/ml –

300C – 30 zile

*Buiuc D, Negut M - Tratat de microbiologie clinica –ed II

Secretia uretrala Recoltare –prelucrare ♂

• La ≥ 2h după micţiune• Scurgere spontana -tampon• Fara - se inseră tampon fin alginat/ dacron –2-4 cm

– se roteşte, se lasă câteva sec., se retrage• Pentru Trichomonas – inainte de prima mictiune

– se imerseaza in 1ml sol salina izotona 370C– examinare rapida

• Pentru ex.microscopic – efectuarea frotiurilor si fixare imediat dupa

recoltare

Secretia uretrala Recoltare –prelucrare ♂

• N.gonorrhoeae – insamantare imediata pe placa –mediu la 370C

– mediu transport Stuart /Amies

• Chlamydia trachomatis – mediu conservant SPG sau 2SP -2ml – Congelare -700C

• Micoplasme – Bulion tripticaz soia 2ml – 40C zile, -700C ani

• Urina matinala primii 10ml, 100ml WC, 10ml – Diferentiere uretrita/cistita

Secretia uretrala Examinare microscopica

• Frotiu Gram– Normal – flora mixta, levuri extracelular– Coci Gram negativi intracelular – N.gonorrhoeae

• Frotiu Giemsa– Incluzii Chlamydia trachomatis

• Preparat proaspat – I proba – Trichomonas

Geloza chocolat, mediu Thayer Martin - N.gonorrhoeaeIncubare atm 5% CO2 ID Testare sensibilitate

Cultivare

Secretia uretralaProbe urina

• Examen macroscopic Filamente mucus –in prima proba

sugereaza• Examen microscopic

Centrifugare 300g – 5 minSediment –lama/lamela X400Leucocite ≥15/camp in prima proba

indica

Diagnostic• Chlamydia trachomatis

– Cultivare – ELISA– imnunofluorescenta– Tehnici moleculare

• Mycoplasma/ Ureaplasma– Seturi comerciale izolare/ identificare (cantitativa)– Serologie

• Mycoplasma genitalium– Evidentierea ADN-ului -urina

• Studiu 2007 SUA tineri • Mycoplasma genitalium depaseste prevalenta

gonoreei – devine a 3-a cauza BTS• 4,2% Chlamydia• 2.3% Trichomonas • 1,0 % M. genitalium• 0.4 % N. gonorrhoeae

Boskey E, About.com Guide Updated May 24, 2009

ProstatiteProbe - dimineata1. Primii 5-10 ml urina2. Urina din jetul mijlociu3. Secretie prostata dupa masaj4. Primul jet dupa masaj prostataExamen citobacteriologic Cuantificarea bacteriilor – geloza sange + Mac ConkeyProstatita bacteriana – nr.bacterii 10X in proba 3 si 4 ≥ 10 leucocite/camp -marire x400

Prostatite• Tuseu rectal orientează

• Agenti etiologiciE.coli 10-20 % Alte enterobacterii – Proteus,Enterococcus KlebsiellaS.aureus discutabil – U. urealyticumS. saprophyticus C. trachomatis

Prostata

Prostatita acuta Edematiata , dureroasa

Prostatita cronica Dura, nedureroasa

Epididimita Normala, durere discreta

EPIDIDIMITE• Clinic

– tumefiere dureroasa-unulaterala- scrot– Scurgere uretrala– Iritatie tract urinar

• Diagnostic – examinare– Prelevat de electie – cultura din ureter– Prima urina si jet mijlociu– Aspirat din epididim sau testicol dupa dezinfectia

pielii cu dezinfectant chirurgical

• Agenti etiologici – C.trachomatis N.gonorrhoeae– Enterobacteriaceae , Pseudomonas > 35 ani– M.tuberculosis

• Adeseori virale - V.urlian,Coxsakie B,• Prelevate intraoperatoriu• Examinare

– Microscopica– Cultivare bacterii aerobe

• Agenti etiologici– E coli K.pneumoniae P.aeruginosa– Stafilococi Streptococi

ORHITE

Tract genital femininSuperior – steril bacteriologicInferior – contaminat cu flora –piele / tract digestiv• Variaţii Vagin/ cervix Vârsta Ciclul

Graviditate ImunodepresieFlora influenţată de estrogeni

– Nou-nascut –6 săpt- estrogeni de la mamă – lactobacili – Pană la pubertate-floră de pe piele - Stafilococi cg. neg,

difteromorfi, bacterii / fecale - E.coli– Dupa pubertate – predomina lactobacilii– Menopauza- lacobacili <, nr.mare enterobacterii

Femeia adulta • In absenta infectiei 106-109 bacterii/gram secretie vaginalaFrecventa izolarii speciilor Portaj obisnuit Portaj

frecventPortaj exceptional% %

Lactobacili (Flora Doderlein) >80 Bacili anaerobi (Bacteroides, prevotella, Mobiluncus)

20

Streptococi negrupabili >60 Stafilococi coagulazo-negativi 20

Enterococi >30 S.aureus 10

Candida albicans 30 Mycoplasma hominis <5

Enterobacterii (E coli, Proteus, etc) 30 Pneumococi ≤4

Ureaplasma 30 Haemophilus spp. ≤4

Gardnerella vaginalis 20 Streptococ grup A ≤4

Streptococi anaerobi 20 Meningococ <1

Streptococ grup B 20

Vaginite- vaginoze Recoltare secretie• 3 tampoane fund de sac vaginal posteriorPrelucrare• Tampon 1- in 0,5 ml solutie salina isotona 370C

– Examinare lama/lamela x100 x400– Trichomonas, levuri inmugurite, pseudofilamente– Raportul PNM/ celule epiteliale– Reactie inflamatorie

• Intensa - Trichomonas• Discreta – Candidoza• Absenta- vaginoza

• Tampon 2 – Frotiu Gram

Interpretarea frotiu Gram pentru vaginoza bacteriana

Numar bacterii/camp microscopic imersie Nugent modificat4+ = >303+ = 6 -12 Interpretare SCOR2+ = 1 – 5 0 – 3 Flora normala1+ = <1 4 – 7 Flora modificata 0 = 0 7 -9 Vaginoza bacteriana

Morfotip Apreciere cantitativa

Scor dupa morfotip

0 1+ 2+ 3+ 4+

Bacili Gram pozitivi medii si mari 4 3 2 1 0

Bacili miciGram negativi sau variabili

0 1 2 3 4

Bacili incurbati Gram negativi sau variabili

0 1 1 2 2

Vaginite- vaginoze • Tampon 3

– Cultivare pentru Candida- Sabouraud cu cloramfenicol sau mediu cromogen

– La solicitare cultura pentru • N.gonorrhoeae• S.aureus- in sindromul socului toxic

– evidentierea toxinei –ELISA, reverse pasive latex agglutination• Streptococcus pyogenes• Streptococcus agalactiae• Listeria monocytogenes

• Shigella spp.- fetite • Enterobacteriile nu se comunica- fac parte din flora normala

a vaginului

Caractere diagnostice pentru vaginite si vaginoza

Boala sau conditie pH Observatii la ex. preparat umed

Miros de amina

Alte teste

Normal 4-4,5 Bacili lungi Absent

Atrofie >6 Absent

Candidoza 4-4,5 Pseudohife sau levuri inmugurite

Absent Cultura pentru levuri

Vaginoza bacteriana

>4,5 Clue cells Prezent Coloratie Gram

Thricomoniaza 5-6 Paraziti flagelati Prezent in mod obisnuit

Cultura Trichomonas

Testul Whiff= testul aminelor volatile10% KOH

Vulva Recoltare-durere, eritem, edem

– Curatirea cu sol. 0.85% NaCl– Exsudat/ eritem cu tampon –pentru culturi levuri– Vezicule –

• Rupte –colectare lichid cu tampon• Aspirat cu seriga cu ac 26-27gauge

– Cruste – se indeparteaza– Tampon umezit sol. 0.85% NaCl

• Examinare– Microscopica – Trichomonas

Gram- reactie inflamatorie, bacterii– Cultivare – pentru S.aureus, S.pyogenes ……..

Streptococ grup B• Evidentiere la gravide s 35-37 gestatie• Recoltare - tampon vaginal• Metoda de electie

– Bulion LIM (Todd Hewitt) • colistin 10μg/ml, ac nalidixic 25 μg/ml

– Bulion Trans Vag– Trecere pe geloza sange– Latex aglutinare

• Insamantare directa mediu Granada – 20-60% dintre pozitivi– Necesita atm. anaeroba

Streptococ grup B

Dificultati• Inhibitia cresterii in prezenta Enterococcus –LIM• 2% nu produc hemoliza• 3-4% nu produc pigment• Clasic rezultatul 48 ore

Metode moleculare – AccuProbe – Cepheid Real time PCR

Glanda Bartholin• Recoltare

– Decontaminare – povidone/iodine- alt preparat– Aspirare din canal– Frotiu – in momentul recoltarii– Transport rapid in mediu Amies /Stuart

• Examinare – Microscopica- frotiu Gram– Cultivare pentru

• N.gonorrhoeae Enterobacterii (E.coli, Proteus)• S.aureus Streptococi Haemophilus• Anaerobi Pasteurella bettyae

– Teste pentru Chlamydia trachomatis, Ureaplasma

• l

Cervicite• Recoltare scurgere mucopurulenta

– Se indeparteaza secretia –exocol –comprese sterile– Se introduc tampoanele(3) in endocol 1-2 cm

• Tampon 1- frotiu Gram• Tampon 2 -cultivare N.gonorrhoeae• Tampon 3 – C.trachomatis -Frotiu Giemsa –

Alte teste ImunofluorescentaELISACultivare Metode moleculare

Endometrite• Recoltare transvaginala prin aspirare• Transport in conditii de anaerobioza• Examinare

– Microscopica- Frotiu Gram– Cultivare bacterii aerobe si anaerobe

• Agenti etiologici• ActinomycetesBacteroides spp C. trachomatis

Enterococcus spp. E.coli G.vaginalis H.influenzae Klebsiella L.monocytogenes Prevotella S.agalactiae S.pyogenes

Isenberg HD- Clinical Microbiology Procedures Handbook

Salpingite• Recoltare • Aspirat si probe biopsice prin laparascopie• Examinare• Microscopica- Frotiu Gram• Cultivare – bacterii aerobe / anaerobeAgenti etiologici

Actinomycetes Bacteroides spp C. trachomatis Enterococcus spp. E.coli H.influenzae N.gonorrhoeae Pasteurella Prevotella S.aureus S.epidermidis S.agalactiae Streptococi

Situatii particulare

• Daca Proba a fost obtinuta invaziv

Cultura abundenta predominenta Se identifica

– Haemophilus spp– Bacilii Gram negativi

• enterici (exceptie enterobacteriile din vagin - Nu se raporteaza)• Pseudomonas spp. /alti Gram negativi nefermentativi • Pasteurella bettyae – la nn.• Capnocytophaga spp.• Campylobacter fetus

– S. aureus S. pneumoniae N. meningitidis– G.vaginalis