Carmen Terreu y Elisa Vivas

2 Biotecnologa Grupo 4

INFORME DE PRCTICAS DE INMUNOLOGA

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PRCTICA 1: Muerte inducida por activacin en leucemia T Jurkat

Para ver el mecanismo de muerte inducida por activacin como regulacin de los linfocitos T, en

esta prctica utilizaremos como modelo la leucemia T Jurkat, que expresa Fas en la membrana y es sensible a la muerte inducida por ligacin de Fas.

Como activador al mitgeno, no se pueden usar linfocitos T normales porque necesitan

cultivarse y dan problemas en cuanto al TCR. Por lo que partimos de un linfocito T activado de un paciente con leucemia T Jurkat, este linfocito T expresa TCR, Fas, CD4, CD28... es sensible a FasL y a la muerte inducida por activacin. No se sabe el antgeno especfico de su TCR, asique para estimularlo usamos un activador policlonal de linfocitos T, la fitohemaglutinina (PHA), una lectina de origen vegetal que liga y agrega diversas glicoprotenas de membrana, entre ellas el propio complejo TCR/CD3. Reconoce los glicanos que expresan en su superficie, se une con especificidad. Produce el entrecruzamiento de todos los receptores, lo que da una mejor seal por lo que la clula sobreactivada expresa el ligando de Fas y muere.

La activacin con PHA va a tener como consecuencia la induccin de la expresin y finalmente la

secrecin de FasL, lo cual conducir a la muerte de las clulas activadas tras interaccin de FasL secretado con Fas expresado en su membrana.

Como vamos a trabajar con clulas eucariticas en cultivo, lo hacemos en las condiciones

estriles posibles, trabajamos en una campana de flujo laminar y usamos todo el material previamente esterilizado, manipulndolo con cuidado.

Primero, realizamos el contaje de clulas para determinar la viabilidad celular. Para ello,

teimos las clulas del cultivo (50l en nuestro caso) con azul Trypan (50l), porque este colorante no tie las clulas vivas puesto que no puede atravesar su membrana plasmtica intacta. Colocamos sobre el hemocitmetro un cubre e introducimos entre ambos una pequea cantidad de la suspensin coloreada de clulas con una micropipeta. Lo observamos al microscopio y contamos las clulas vivas, es decir, las no coloreadas.

=

104

La suspensin est diluida 1/2 por lo que la dilucin es x2. Con este mtodo tenemos un 10% de error por lo que hay que contar al menos 100 clulas. Nuestro resultado: 1.3106 cl/ml de la clase = 1,66 106 cl/ml Ahora que conocemos la cantidad total de clulas presentes en el cultivo, aadimos el volumen

necesario para obtener una densidad de 500.000 cl/ml. Para ello, preparamos 5ml de suspensin celular + 11ml de medio de cultivo. Cogemos 4 eppendorfs estriles (control, 1, 2.5, 5):

1) 500l suspensin control 2) 500l suspensin + 1g/ml 3) 500l suspensin + 2,5g/ml PHA Stock 1mg/ml 4) 500l suspensin + 5g/ml

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Realizando los clculos correspondientes, hallamos la cantidad de PHA exacta para cada

concentracin, aadimos 0,5l para 1g/ml, 1,25l para 2,5g/ml y 2,5l para 5g/ml. En placas de 96 pocillos estriles introducimos en cada carril 100l de cada tubo eppendorf. 100l en cada pocillo Control 2,5g/ml 1g/ml 5g/ml Una vez que todos los grupos han cargado sus muestras en la placa, dejamos la calle 12 como

blanco, 100l de medio (RPMI 1640 ptimo para clulas linfoides). Dejamos incubar la placa hasta el da siguiente en un incubador a 37oC con una bandeja de agua

para saturar la humedad y un equilibrio entre CO2 y bicarbonato para mantener el pH 7,4.

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PRCTICA 2: Determinacin de la viabilidad celular

En esta prctica primero observamos la morfologa de las clulas tratadas en las diferentes

concentraciones de PHA en el microscopio invertido. A mayor concentracin de PHA se ven mayor nmero de clulas que han muerto por apoptosis y trozos celulares.

Tomamos alcuotas (50l) de un pocillo por cada triplicado y las mezclamos con 50l de azul

Trypan para realizar el contaje tanto de clulas vivas como de muertas, mismo procedimiento que en la prctica 1.

El porcentaje de viabilidad se calcula dividiendo el nmero de clulas viables (no teidas de

azul) por el nmero total de clulas (teidas + no teidas) y multiplicando el resultado por 100.

% =

+ 100

Resultados:

1) Control 109 clulas en 4 cuadrantes, total de 408.750cel/ml

2) 1 g/ml % = 225.000/(225.000+982.500)*100 = 18.63%

3) 2,5 g/ml % = 240.000/(240.000+620.000)*100 = 27.9%

4) 5 g/ml % = 191.250/(191.250+787.500)*100 = 19.54% En los otros dos pocillos del triplicado aadimos 10l de la solucin stock de MTT, metil

tetrazoido. Las enzimas oxidorreductasas del RE son capaces de catalizar la reduccin del MTT pasando de azul (oxidado) a amarillo (reducido). Esto solo lo hacen las clulas viables.

Para determinar el resultado mediante espectrofotometra en un lector de ELISA, previamente

tenemos que centrifugar para que los cristales bajen al fondo y as poder quitar el medio de cultivo haciendo un "flick". Cuando tenemos los cristales sin medio, los disolvemos en un disolvente orgnico DMSO (100l), agitamos en una placa vibradora y ya podemos medir la absorbancia de las disoluciones obtenidas en un lector de ELISA a una longitud de onda de 550nm.

Control 1 g/ml 2,5 g/ml 5 g/ml

0,148 0,012 0,031 0,021

(descartado) 0,032 0,049 0,027

0,084 0,039 0,033 0,041

Media 0,116 0,027 0,037 0,029

4

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0,140

1 2 3 4

El porcentaje de viabilidad en este caso, se calcula a partir de las medias de las Abs:

% =

100

Resultados: 1 g/ml 0.027/0.116 100 = 23% 2,5 g/ml 0.037/0.116 100 = 32% 5 g/ml 0.029/0.116 100 = 25% Como podemos observar, estos resultados difieren de los obtenidos mediante el mtodo de

contaje, ya que en el contaje podemos cometer errores humanos, mientras que con el lector de ELISA es mucho ms exacto, tambin puede haber errores experimentales, pero son menores. Por ejemplo, nosotras tuvimos que quitar un valor de Abs para la media del control, pero esto fue debido a que el "flick" fue realizado con quizs demasiada fuerza.

Lo representamos en una grfica para sacar el IC50: El IC50 terico es de 3,25, mientras que nuestro IC50 es de 1,16. Vemos que es una gran

diferencia entre los dos valores, lo que nos hace replantearnos nuestro procedimiento del experimento. Seguramente pueda deberse al "flick" donde perdimos parte de los cristales, dando absorbancias menores lo que se traduce en un IC50 menor.

1,16

0,058 IC50

[PHA]

Abs (n clulas)

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Inmunodot

El objetivo de esta prctica es detectar la presencia o ausencia de IgGs bovinas en varias

muestras problema de suero mediante un ensayo de inmunodot. El inmunodot se trata de un mtodo estilo al ELISA directo, no es tipo sndwich, ya que el

primer aadido es la muestra, no el anticuerpo. Es muy sensible, detecta hasta un orden de 0,01% de contaminantes, puede dar falsos positivos, por eso se usan controles. Como soporte se utiliza un papel de nitrocelulosa, las protenas se adsorben sobre l, por lo que hay que realizar un proceso de bloqueado, que se lleva a cabo con una protena irrelevante, para evitar que se den falsos positivos ya que los anticuerpos tambin son protenas y se adheriran igualmente dando un producto coloreado al reaccionar con su sustrato. El resultado de esta prueba es cualitativo.

En esta prctica, el antgeno se trata de IgG bovina, el anticuerpo es policlonal de conejo y la

enzima es una peroxidasa que cataliza una reaccin de oxidacin del 2-Cl Naftol dando color violeta:

22 + 2 ( )

Para preparar el inmunodot, realizamos el siguiente procedimiento. Cogemos 10L de cada

muestra proporcionada y de los controles, y los inyectamos en el centro de los pocillos correspondientes, dejamos secar al aire. Introducimos la placa de nitrocelulosa en la cubeta y la cubrimos con la disolucin de bloqueo previamente preparada (ovoalbmina y tampn fosfato salino), esperamos media hora. Retiramos la disolucin de bloqueo y lavamos la placa.

Ahora, para continuar con el desarrollo de la prueba, se toma la placa y la dejamos suspendida

en la cubeta. Aadimos en cada pocillo 20L del anticuerpo conjugado con la peroxidasa y lo dejamos incubar. Lavamos bien e introducimos la placa en la cubeta de coloracin, donde le aadimos 50L de sustrato cromgeno. Dejamos desarrollar y detenemos la reaccin cuando veamos las seales de los controles de forma clara. Lavamos y dejamos secar, ya que los resultados se vern mejor.

Bloquear con una protena irrelevante como OVA

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Nuestros resultados fueron:

Control positivo Control negativo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Como podemos observar, han funcionado los dos controles, tanto el positivo que contena

lactosuero de vaca, por lo que s que tiene que reaccionar, y el control negativo con lactosuero de cabra, que no reacciona.

Finalmente podemos concluir que las muestras 1 y 3 s que contienen IgGs bovinas, al contrario

que la muestra 3, que no las contiene.

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PRCTICA 3: ELISA

Bloquear 1er lavado 3er lavado Muestra 2 lavado

Llevamos a cabo un ELISA como se muestra en la figura anterior. El proceso de bloqueado se

lleva a cabo con una protena para que no haya espacio donde los anticuerpos conjugados puedan unirse y dar reaccin que sea falsamente positiva. Los lavados tambin son muy importantes.

Para poder estimar cunta contaminacin con leche de vaca tenemos en la que debera ser

100% de oveja, que es lo que se pretende hacer con este ensayo, vamos a hacer una recta patrn a concentraciones conocidas (Standards) en la que interpolaremos nuestro resultado.

El antgeno que buscamos es la IgG de vaca. El anticuerpo que usamos es policlonal de conejo.

Como control negativo y posterior blanco para el lector de ELISA, usamos lactosuero de oveja. Como la recta no daba un ajuste muy bueno, probamos a hacer el de una ecuacin de 2 grado, que se adecuaba mejor.

ng/mL Abs Abs sin el blanco

Blanco 0 0,08 0 Standard A 375 0,169 0,089 Standard B 250 0,162 0,082 Standard C 125 0,14 0,06 Standard D 25 0,094 0,014

Ajuste lineal Ajuste con ecuacin de 2 grado

Problema 1 231,5 290,5 0,163 0,083 Problema 2 0 0 0,08 0 Problema 3 72,75 103,75 0,118 0,038

Peroxidasa H2O2 + TMB

TMB

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Como podemos observar, en el problema 2 no hay leche de vaca, ya que el resultado nos da una

sensibilidad de hasta 0,1 g/mL y el test para este problema da negativo. En cambio, los problemas 1 y 3 dan positivo y un resultado de 290,5 ng/mL para el primero y de

103,75 ng/mL para el tercero, por lo que ambas muestras de leche de oveja estaban contaminadas con leche de vaca, pero la primera ms que la tercera.

y = 0,0002x + 0,0119R = 0,883

y = -8E-07x2 + 0,0006x + 0,001R = 0,99590

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 100 200 300 400

Patrn

Problemas ajuste de 2grado

Problemas ajuste lineal

Lineal (Patrn)

Polinmica (Patrn)

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PRCTICA 4: Citometra de flujo

Lo que se busca medir es el porcentaje de linfocitos B, T, CD4+ y CD8+ de una muestra

sangunea. Para ello, marcamos con anticuerpos especficos conjugados con PE (ficoeritrina) y FITC (isotiocianato de fluorescena). Antes de hacer eso, usamos una tcnica que nos permite separar linfocitos B y T.

Para detectar linfocitos T, usaremos anti-CD3 conjugado con FITC, mientras que para los B,

usaremos anti-CD19 conjugado con PE. Para distinguir los TCD4+ de los TCD8+, usamos anti-CD4 conjugado con FITC y anti-CD8 con PE. En los diagramas que iremos viendo, cada punto representa una clula.

Primero realizamos un control para eliminar

aquello que se marca de forma inespecfica y establecer ah dos lneas (en rojo) que marquen una frontera y separen dnde hay que medir y dnde no. Esto sirve tambin para eliminar posibles contaminaciones y seleccionar el campo donde queremos medir ms exactamente.

Luego medimos, primero, los linfocitos B y T y

obtuvimos la figura que tenemos a la izquierda. Los linfocitos B nos van a salir en el cuadrante superior-izquierdo, ya que en el eje vertical da la seal la ficoeritrina y esta conjugada con anti-CD19, especfico de los linfocitos B. Los linfocitos T nos salen en el inferior derecho, ya que en el eje horizontal da la seal el FITC, conjugado con anti-CD3, especfico de los linfocitos T.

Podemos observar que, dentro de las fronteras establecidas en el control, tenemos bastantes clulas. Estas podran ser monocitos o clulas NK, difciles de separar mediante la tcnica usada para elegir linfocitos, ya que todas son PBMC.

En el cuadrante superior derecho, donde no debera haber nada ya que un linfocito no puede

ser B y T a la vez, encontramos ciertas clulas, lo que podra indicar leucemia si el nmero fuese significativo.

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Pasamos ahora a ocuparnos de los porcentajes que nos ha dado. Hay que fijarse en la columna de Gated, ya que son aquellos que se refieren a las clulas marcadas y que nos interesan.

Tenemos un 18% de linfocitos B y un 50% de linfocitos T. Los valores normales estn para los

linfocitos B entre un 3 y un 10%, por lo que nuestro donante se sale un poco del valor esperable. Los valores normales para los linfocitos T estn entre un 59 y un 80%, por lo que nuestro paciente tiene menos de los esperables. Habra que estudiar con ms detalle por qu ocurre esto.

Medimos en este momento los linfocitos TCD4+

y CD8+ y obtuvimos la figura adyacente. Los linfocitos TCD8+ nos van a salir en el cuadrante superior-izquierdo, ya que en el eje vertical da la seal la ficoeritrina y esta conjugada con anti-CD8. Los linfocitos TCD4+ nos salen en el inferior derecho, ya que en el eje horizontal da la seal el FITC, conjugado con anti-CD4.

Podemos observar que, dentro de las fronteras establecidas en el control, tambin aqu tenemos bastantes clulas. Estas podran ser monocitos o clulas NK, como antes, pero tambin linfocitos B que en este ensayo no estn marcados.

En el cuadrante superior derecho, donde no debera haber nada ya que, en sangre perifrica, un

linfocito no puede ser TCD4+ y TCD8+ a la vez, encontramos ciertas clulas. Si tomsemos sangre del timo, el nmero de clulas que tendramos aqu sera mucho mayor, ya que podran estar en un estadio temprano de maduracin con ambos correceptores expresados.

Pasamos ahora a ocuparnos de los porcentajes que nos ha dado. Como antes, hay que fijarse en

la columna de Gated, ya que son aquellos que se refieren a las clulas marcadas y que nos interesan.

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Tenemos un 15% de linfocitos TCD8+ y un 37% de linfocitos TCD4+. Hacemos el coeficiente entre los dos y nos da un 37/15=2,47. Lo esperable para este coeficiente es de entre 1,2 y 2,5, por lo que nuestro donante entra muy justo en los rangos considerados normales.