ImmunoanaL Biol. Spec. (1989) 18, 49-54 49 © Elsevier, Paris

Strategies d'exploration fonctionnelle et de suivi therapeutique

Inter t du dosage de la myosine dans le diagnostic et le suivi de I'infarctus du myocarde

C. Larue 1 , C. Calzolari 1 , M.C. Lagrange 1 , C. Heinen 2, Joc L6ger 3, J. Leger3 et B. Pau 4

1 Sanofi Recherche, 371, av. du Professeur-J.-Blayac, 34082 Montpellier Cedex; 2 ERIA-Diagnostics Pasteur, 3, bd Raymond-Poincar6, 92430 Mames-la-Coquette; 3 INSERM U300, Facult6 de pharmacie, av. C.-Flahaut, 34000 Montpellier; 4 Faculte de pharmacie, av. C.-Flahaut, 34000 Montpellier, France

Resume - - Deux anticorps monoclonaux ont ~t6 s~lectionn6s pour leur haute sp6cificit~ envers les chaTnes Iourdes de myosine, majoritairement pr~sentes dans les ventricules humains. Un dosage immunoradiom~trique en un temps, a permis la d~tection des fragments de myosine dans le s~rum de patients apres infarctus du myocarde. Les cinetiques de relargage de la myosine au d6cours de I'infarctus ont ~t~ ~tablies et varient selon la complexit~ et la s6v6rit~ de I'infarctus aigu du myocarde. Le dosage s~rique de la myosine cardiaque a permis : r6valuation de la masse n6cros~e, le diagnostic r~trospectif des micro-infarctus, le suivi de I'efficacit~ des traitements fibrinolytiques, I'appr~ciation de la cicatrisation myocardique, la mesure de la souffrance myocardique en chirurgie cardiaque.

infarctus du myocarde - myosine - anticorps monoclonaux - immuno-essai - n(~crose

Summary - - Applications of myosin assay in the diagnosis and the follow-up of the myocardial infarction. Two monoclonal antibodies were selected for their high affinity for human ventricular myosin heavy chains. A one-step immunoradiometric assay permitted the detection of myosin or its fragments released in patients sera after myocardial infarction. The time courses of myosin release varied according to the complexity and severity of the heart attack observed. This assay permitted : the evaluation of necrosis weight, the retrospective diagnosis of microinfarction and diagnosis of surgical infarction, the follow-up of the efficiency of fibrinolytic treatments, and the appreciation of tissular cicatrization evolution.

m y o c a r d i a l in fa rc t ion - m y o s i n - m o n o c l o n a l a n t i b o d y - i m m u n o a s s a y - n e c r o s i s

In t roduct ion

Le pronostic de I'infarctus aigu du myocarde (IAM) et la d~termination de la strat~gie th6rapeu- tique en d~coulant, s'appuient sur la connaissan- ce de la taille et la Iocalisation de la n6crose. Apr~s un IAM, la n~crose conduit & la liberation dans la circulation sanguine de composants intra- cellulaires :ions, enzymes, prot~ines contractiles, etc. Le diagnostic par 1'61ectrocardiogramme ~tant insuffisant dans un cas sur quatre [1], le

dosage biologique est donc d~terminant : il repo- se sur la mise en ~vidence dans le s~rum de marqueurs de la lyse cellulaire, ce qui a conduit au d~veloppement rapide de nombreux dosages (enzymatiques ou immunologiques) d'enzymes et de prot6ines lib~r~es par les cellules myocar- diques endommag~es.

La d~termination des activit6s enzymatiques de la cr6atine kinase (CK) ou de son isozyme (CK- MB), de la lactate d~hydrog~nase (LDH) ou de la transaminase glutamique oxaloac6tique (GOT)

50 c. Larue et aL

est systematiquement pratiquee [2] : ces enzymes sont neanmoins critiquees du fait de leur ~levation tardive et de leur manque de speci- ficitY. Une elevation de leur taux serique peut ~tre en effet observee Iors de chocs s~v~res, de trau- matismes ou m~me d'intoxications graves... La m~me critique peut ~tre faite & la myoglobine, m~me si elle est, & I'heure actuelie, le marqueur d'IAM le plus precoce [3, 4].

La quantification des prot~ines contractiles dans le serum de patients avec IAM est sans equivoque plus caracteristique d'une perte de I'integrit~ de la membrane cellulaire : les chafnes leg~res (LCM) de la myosine cardiaque sont relargu~es pendant 10-14 jours & partir du jour de I'infarctus [5, 6]. Un module d'infarctus experi- mental chez le chien a permis de montrer que les taux de LCM etaient mieux corr~les avec la dimension de la n~crose que le taux de n'importe quelle enzyme cytoplasmique [7, 8]. Katus et aL, ont obtenu ce m6me resultat recemment chez I'homme [6]. Mais en utilisant un dosage immuno- radiologique (RIA) avec des anticorps poiyclo- naux diriges contre les cha~nes I~g~res, Wang et aL, ont montr~ une grande variabilite interindivi- duelle des taux de clairance des cha~nes leg~res de myosine [9]. Les cin~tiques de relargage d'autres proteines contractiles dans le s~rum ont et~ d~crites pour la tropomyosine [20] et la tropo- nine 1121].

Les chafnes Iourdes de la myosine (HCM) cir- culante (ou de leurs fragments) sont detectees dans un d~lai de 36 & 48 h apr#s infarctus, donc de fagon tr~s retardee par rapport aux enzymes et & la myoglobine [10]; leur taux s'accroft jusqu'au 6 e jour, puis diminue jusqu'& des valeurs normales entre le 12 e et le 14e jour. Un module experimental (chien) a permis de determiner les correlations entre les concentrations d'HCM - ou de ses fragments - et I'~tendue de la masse necrosee [11 ].

Dans cette etude, nous decrivons rutilisation d'anticorps monoclonaux dans le dosage des fragments d'HCM relargues apr~s infarctus, I'application de ce dosage dans le diagnostic et le suivi de I'infarctus du myocarde, e t son int~r~t dans la quantification de la masse n~crosee.

Materiel et Mdthodes

Les conditions d'immunisation et de fusion, ainsi que les modalit~s de production, de purification et de carac- t~risation des anticorps monoclonaux (Acm) ont ~t~ d~crites pr~c~demment [10]. Deux Acm ont ~t# s~lec- tionnes pour ~tre utilis~s dans un dosage immunom~-

trique (IRMA). Ces deux anticorps (4H3 et 5G12) r~agissent avec les m~mes sp~cificite et intensite vis- &-vis des chafnes Iourdes de myosine ventriculaire de type B d'origine humaine, canine, ou bovine. La myosi- ne squelettique ~tant constitute principalement de myosine type B, les 2 Acm ont une r~action crois~e quasi totale avec cette myosine; en revanche, ils ne reconnaissent pas significativement les chafnes Iourdes de type A de ventricule ou d'oreillette humaines, pas plus que les chafnes Iourdes de la myo- sine des muscles squelettiques de type rapide. Environ 50% des fibres atriales et plus de 90% des fibres ven- triculaires de coeur humain normal contiennent la forme B des chai'nes Iourdes de myosine.

Preparation des proteines

La myosine est extraite du ventricule gauche de boeuf et les chafnes Iourdes de myosine sont isol~es [12, 13] et clivees au bromure de cyanog~ne (BrCN) selon la technique de Klotz et aL [14]. Les fragments ainsi obte- nus, appeles MHC-BrCN, sont analys6s en IRMA, et conserves ~.-80 °C : ils constituent I'~talon primaire. Les r~sultats sont exprim~s en ng/ml d'~quivalents- myosine, car si le poids moleculaire de la myosine est bien connu, il est impossible de connaftre rexact poids mol~culaire des fragments de MHC-BrCN reconnus par les 2 Acre; pour la m~me raison, Iorsqu'on utilise r~ta- Ion secondaire (ci-dessous), les resultats sont expri- m~s en micro-unit~s par litre (txU/I). Une p.U/I est d~fi- nie dans le dosage IRMA, comme ~tant ~quivalente & un ~g de myosine par litre.

Des taux elev~s de myosine s6rique sont obtenus par I'administration de chocs ~lectriques chez le chien; sous anesth6sie, des <<patchs,> sont appliques directe- ment sur les muscles des quadriceps. Cinq jours plus tard, le sang des animaux est collectS. Les serums canins ~. taux ~lev~s de myosine sont calibres en IRMA par rapport aux MHC-BrCN et servent par la suite constituer les ~talons secondaires des coffrets.

La conservation pr~caire des fragments MHC-BrCN en milieu liquide et ~. temp6rature ambiante a dirig~ le choix du standard secondaire (s~rum de chien). Ce standard n'a pas ces d~savantages et contient des fragments circulants de myosine ~galement bien recon- nus par les Acm du coffret de dosage.

Preparation des r~actifs de I'IRMA

L'anticorps 5G12 est coupl~ ~. du Magnogel AcA44 activ~ (LKB) par rinterm~diaire du glutarald~hyde [15]; I'efficacit~ de couplage est de I'ordre de 0,5 mg d'Acm pour 1 ml de Magnogel active. L'anticorps 4H3 est radiomarqu~ avec 37 MBq d'iode 125 par I'interm~diai- re de la chloramine T [16] avec une efficacite d'incorpo- ration d'iode d'environ 90%. L'activit~ sp~cifique de I'anticorps est approximativement de 0,44 MBq/Ixg, ce qui correspond & 0,9 mole d'iode par mole d'anticorps.

Pour chaque essai, 50 ~1 de plasma (standard ou #. doser) sont m61ang~s & 200 ~1 de Magnogel ~ 5% (v/v) coupl~ ~ I'Acm 5G12. 200 ~1 d'Acm 4H3 marqu~ I'iode 125 (100 000 cpm) dilu~ dans le tampon (phos- phate 50mM pH7,4, Tween 20 0,04%, NaN3 0,1%, plasma de chien normal 10%) sont ajout~s. Chaque ~chantillon est test~ en double, ainsi que chaque point

Int6r6ts du dosage de la myosine dans le diagnostic et le suivi de I'infarctus du myocarde 51

de la gamme standard (100 & 6 000 #U/I). Les tubes sent incubus 3 h & temperature ambiante sous agita- tion. A la fin de I'incubation, le Magnogel est maintenu danS les tubes par application d'un barreau aimante et les surnageants sont ~limin~s. Apr~s lavage (NaCI 0,9%, Tween 20 0,1%, NaN3 0,1%), la radioactivit~ est d~termin~e.

Tousles 6chantillons seriques de volontaires sains (s6dentaires ou sportifs) sont obtenus par venipunctu- re, Les plasmas de 57 patients avec IAM ont #te col- lectes quotidiennement depuis I'admission & I'hbpital, jusqu'a 10 & 12 jours apr~s I'accident cardiaque.

La comparaison des patients fibrinolys~s par rapport aux patients non fibrinolys6s (30 patients au total) est r~partie en 3 groupes : 13 malades avec traitement conventionnel (groupe A); 17 malades, admis dans I'unit~ de soins intensifs moins de 4 h apr~s le d~but des douleurs, ont re(~u une dose de 1 500 000 unit6s de streptokinase en perfusion intraveineuse pendant 1 h. Ces 17 malades sont r~partis en 2 groupes en fonction des r~sultats de la coronographie pratiquee entre 4 et 10 jours plus tard; groupe B : traitement fibri- nolytique inefficace; groupe C : traitement fibrinolytique efficace (9 patients). En plus des examens cliniques, electrocardiographiques et biologiques de routine, un dosage journalier de myosine cardiaque plasmatique a 6t~ fait pendant 9 jours.

Analyse statistique Les resultats sont exprim~s sous la forme moyenne + deviation standard. Les moyennes sont comparees par le test t de Student. Les variances sont comparees par le test F.

Resultats

Gamme standard I l I I

15.10 15.102 15.10 a 15.104

L'~tendue de la gamme standard (100 - 6 000 ~LU.L -1) a 6t6 choisie afin de pouvoir doser prati- quement tous les 6chantillons plasmatiques sans les diluer. Cette courbe est lin~aire jusqu'& la valeur de 1 200 ~U.L - t (Fig. 1). Le ph6nomene ,,d'effet-crochet,, est observ6 pour des valeurs sup6rieures A 15 000 pU.L -1 (Fig. 2), cette valeur n'ayant jamais encore 6t~ atteinte sans 16sions irr6versibles. La limite de d6tection du dosage est de I'ordre de 10 IxU.L - t . La conservation du cof- fret de dosage n'est limit6e que par la stabilite du traceur radioactif (6 semaines apres la date de pr6paration).

Par ailleurs, 1'6preuve de r6cup6ration quantita- tive du s6rum humain est totale, que ce soit avec les standards primaire ou secondaire [19].

B/T

20

10

Recrutement des malades et pr61#vement des 6chantillons s6riques

Micro-unlt6s. L ~t de MyOsine

Fig. 1. Courbe d'6talonnage du dosage IRMA-myosine. T : nombre de cpm totaux introduits; B : signal en cpm correspon- dant ~t la fraction antig~nique li6e par les anticorps (non speci- fique d~duit).

B f r

80-

7 0 -

6 0 -

5 0 -

4 0 -

30

20

10 5

Concentration de Myosine (p. U.L -~)

Fig. 2. Effet-crochet du dosage IRMA-myosine. T : nombre de cpm totaux introduits; B : signal en cpm correspondant ~t la fraction antigenique (i~e par les anticorps .(non specifique d~duit).

Cin6tiques d'6volution des taux de myosine cir- culante

En utilisant ce coffret de dosage, les taux de chaTnes Iourdes de myosine circulante ont ~t~

52 C. Larue et aL

mesur~s chez des donneurs sains ou apr~s IAM :

chez des sujets normaux, la concentration de myosine est de 57 + 23 #U.L -1 pour une popula- tion s~dentaire (n=52), et de 95 + 31 #U.L -1 pour une population sportive (n=60) avec des valeurs maximales pouvant atteindre 290 #U.L -1 (Fig. 3) pour des personnes pratiquant des sports vio- lents (ex. : catch, boxe); chez des patients atteints d'infarctus, la lib6ration de myosine est d6tectable entre 36 et 48 h apr~s I'infarctus et suit diff~rentes cinetiques selon 1'6volution des dommages du tissu myocardique. Les taux maximaux de myosine sont observ6s 6,0 + 0,7 jour apr~s I'infarctus. La moyenne des taux de myosine est, pour une population de 57 patients avec IAM, de 2 100 + 1 200 #U.L -1. Si la concentration de myosine revient & des valeurs basales 10 jours apr~s I'infarctus, il s'agit d'une cin~tique <<typique>> (Fig. 4 en grist). Un pronostic favorable de cicatrisation peut en #tre conclu. Les cin~tiques ,<atypiques,> (Fig. 4) sont observ~es partir du jour JO+6 : les taux de myosine plafon- nent ou pr~sentent un rebond refl~tant un infarc- tus compliqu~ ou r~current, parfois suivi du d~c#s du patient [11]. Dans la majorit~ des cas, la cli- nique a confirm~ un pronostic s~v~re dans le cas de ces infarctus complexes.

Myosine ~U.L ~

2.000

1.000

0 2 4 6 8 10 12 14

jours epr~s Infarctus

Fig. 4. Taux de myosine apr~s infarctus du myocarde : exemple d'une cinetique r6guli~re (en trait plein); exemple de 3 cinetiques ,,atypiques,>, correspondant & des infarctus com- plexes (en traits pointill~s).

Moyenne ~ 5 3 ix U.L -1 Suje ts

s 6 d e n t a i r e s

Moyenne 90 ~ U.L -~ Suje ts

sport| fs

Effectifs

I I I I ! f I I I 10 50 90 130 170 p U.L -1

Fig. 3. Taux de myosine circulante, mesures dans une popula- tion normale. 3 a • population s~dentaire (n=52; moyenne=53 ~U.L-1); 3 b : population sportive (n=60; moyenne=90 p.U.L-1).

Mesure de I'efficacite d'un traitement fibrinoly- tique La valeur moyenne de la quantit~ cumul~e de myosine relargu~e (mesur6e par calcul de I'aire sous la courbe de liberation de la myosine) pen- dant 9 jours est de 7 000 + 3 300 ~U.L -l. j pour le groupe A (trait~ de fa£;on conventionnelle) et de 10 000 + 4 100 pU.L -l. j pour le groupe B (trait~ sans succ~s par fibrinolyse intraveineuse); au contraire, le groupe C qui a regu avec succ~s le traitement fibrinolytique n'a lib6r~ en 9 jours qu'une quantit~ moyenne de myosine de 3 800 + 2 300 ~U.L-I.j. Comme le montrent les ~carts statistiques (Fig. 5), la variabilit~ interindividuelle des quantit~s cumul~es de myosine circulante est ~lev~e dans chaque groupe de malades. Les comparaisons entre les moyennes obtenues entre chaque groupe de malades sont cependant significatives statistiquement. Ainsi, les malades du groupe A (malades trait~s conventionnelle- ment) et ceux du groupe B (malades qui ont regu sans succ~s un traitement fibrinolytique) relar- guent des quantit~s cumul~es de myosine circu- lante non significativement diff~rentes. Au contrai- re, les malades du groupe C, qui ont re£:u un traitement fibrinolytique efficace, relarguent des quantit~s cumul~es de myosine circulante signiii- cativement inf~rieures aux malades des groupes AetB.

Int~r@ts du dosage de la myosine dans le diagnostic et le suivi de I'infarctus du myocarde 53

Quantite totale de rnyosine (103 pU-L -1 .j)

20

15

10

A B C (=) ([3) Col

[3

1 -

x x

x x x

x

[]

E3

B

A • non trait~s B : traites sans succOs C : traitds avec succ~s

©

© o

8 o

o o o

NS ~

t 0,01 I

i

L 0,001 -J

Fig. 5. Distribution des valeurs individuelles de la quantite cumul6e de cha~nes Iourdes de myosine darts le plasma apr~s infarctus du myocarde pour chacun des malades, trait6s de fagon conventionnelle (groupe A), trait~s sans succ~s (groupe B), et trait6s avec succ~s par fibrinolyse intraveineuse (groupe C). La valeur moyenne et la d6viation standard sont repr~sent6es pour chacun des groupes & gauche des valeurs individuelles.

Discussion

Avec les 2 Acm choisis, un dosage de la myosine serique est utilisable en routine. Le dosage IRMA-Myosine detecte, en 3 h, 10 IxU/I de frag- ments de chaTnes Iourdes de myosine. Les Acm reconnaissent le fragment SF2 de la meromyosi- ne Iourde [10], et ce fragment est connu pour ~tre tr~s resistant a la proteolyse, ce qui peut expli- quer sa presence reguli~re apr~s IAM.

La sensibilite immunologique du dosage (10 #U.L -1) a permis de distinguer, dans une popula- tion normale, des taux de myosine plus eleves, mais non pathologiques, chez les individus spor- tifs de haut niveau.

Le dosage de la myosine est surtout un nouvel outil pour ~valuer la dimension du tissu necrose : une forte correlation a pu etre observee [11] entre la quantite cumulee de myosine serique et la masse necrosee chez I'homme (par scintigraphie au Thallium 201) et dans un module d'infarctus

experimental chez le chien (par coloration histoio- gique de la necrose). Dans les 57 IAM 6tudies, la liberation des HCM est directement reliee & la destruction membranaire apres un IAM. II faut rappeler que la concentration moyenne de myosi- ne circulante chez des humains normaux (n=52) est 40 fois plus faible que la valeur maximale moyenne des taux de myosine mesuree sur 57 IAM, ce qui permet de confirmer la tr~s bonne sensibilite diagnostique de la myosine. Chez tous les patients avec un IAM non complexe, les cine- tiques de liberation de myosine sont pratiquement identiques, indiquant que la liberation de la myo- sine s'effectue selon un processus metabolique bien defini et reproductible. Le taux maximum de myosine etant etabli au 6 e jour apr~s I'infarctus, le dosage suivi de la myosine permet de visuali- ser les cas d'infarctus complexes (confirmes par la clinique) : des taux eleves persistants apr6s le 6 e jour indiquent des lesions tissulaires addition- nelles ~. celles causees par I'infarctus initial.

La distribution de la quantite de cha~nes Iourdes de myosine apr~s IAM, pour des groupes de malades traites de fagon conventionnelle, ou trai- tes (avec ou sans succ~s) par fibrinolyse intravei- neuse, a pu etre comparee : les taux de myosine des malades traites avec succ~s par fibrinolyse intraveineuse sont significativement inferieurs & ceux des malades traites de fagon conventionnel- le ou fibrinolyses, mais sans succ~s [17]. Si, comme I'a montre I'equipe de Leger et al. [11] & I'aide d'un modele experimental chez le chien, la quantite cumulee de myosine relarguee chez I'homme est proportionnelle au volume de ia necrose, ces resultats d6montrent bien que la desobstruotion precoce du vaisseau coronaire occlu limite I'extension de la zone de necrose myocardique.

En dehors du suivi de la souffrance myocar- dique dans I'infarctus, ce dosage peut ~tre utilise pour comparer pr6cisement differentes tech- niques de protection du myocarde en chirurgie cardiaque [18]. Des taux eleves de myosine apr6s chirurgie cardiaque indiquent une necrose myocardique perioperatoire, de fagon plus preci- se que les variations d'ECG ou qu'une augmenta- tion de CK-MB, bien que la myosine apparaisse plus tardivement (dans les 3 jours apr#s I'opera- tion).

Conclusion

La determination de la quantite cumulee de myo- sine liberee dans le plasma apr~s IAM est un indice fiable de la lyse myocardique. Le temps

54 c. Larue etaL

relativement long avant I'apparition des fragments de myosine (2 jours) compare & celui des autres prot#ines cytoplasmiques ne fait ~videmment pas de ce dosage un diagnostic precoce de I'infarc- tus. II appara~t comme un nouvel outil biologique pour I'~valuation de la masse n~cros6e, I'appre- ciation de I'evolution de la cicatrisation tissulaire et du risque de r~cidive, le diagnostic r~trospectif de micro-infarctus et d'infarctus periop#ratoires, et enfin, la d~termination de I'efficacit# d'un traite- ment fibrinolytique et I'evaluation de la qualit6 de la reperfusion limitant la lyse myocardique.

R~ferences

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