Download pdf - Konventionelle und molekularpathologische Untersuchungen während und nach klinischer Herztransplantation

Z. Herz-. Thorax-, Geff, igchir. 11:7-22 (I997) © Steinkopff Yerlag 1997 Suppl.

Ph. A. Schnabel R. Lange K. Amann T. M. Bingold H. Jakob M. Kampmann A. Koch B. Koch A. Magener H. Mehmanesh Z. Niemir E-U. Sack M. Schmid A. Schmiedl R. Waldherr R. Zimmerrnann S. Hagl H. E Otto

Mit Unterstiitzung durch den ,,Forschungsschwerpunkt Transplantation Heidelberg" des Landes Baden- W/.irttemberg

Priv.-Doz. Dr. reed. Ph. A. Schnabel ([~) K. Amann • T. M. Bingold, M. Kampmann • A. Koch • B. Koch A. Magener • Z. Niemir • R. Waldherr H. E Otto Pathologisches Institut der Universit/it Heidelberg Im Neuenheimer Feld 220/221 69120 Heidelberg

R. Lange ' H. Jakob • H. Mehmanesh E-U. Sack - S. Hagl Abteilung Herzchirurgie, Chirurgische Universit/itsklinik, Heidelberg

R. Zimmermann Abteilung Kardiologie, Medizinische UniversitS.tsklinik, Ruprecht-Karls- Universit/it Heidelberg

M. Sctimid Institut ftir Virologie, Infektiologie und Epidemiotogie e.V., Medizinisch- diagnostisches Gemeinschaftslabor, Stuttgart

A. Schmiedl Abteilung Elektronenmikroskopie, Zentrum Anatomie, Georg-August- Universit/it G6ttingen

Ronventionelle und molekularpathologische Untersuchungen w ihrend und nach klinischer Herztransplantation

Conventional and molecular pathological investigations of myocardial biopsies taken during and following clinical heart transplantation (HTx)

Zusammenfassung Die wesentlichen Fragen nach Herztransplantation (HTx) beinhalten Transplantatversagen, akute Abstol3ung, Infektionen und die chronische Rejektion. Im Rahmen der HTx wurden rechtsventrikul~ire Myokardbiopsien zu folgenden Zeitpunkten entnommen: a) vor Kardiople- gie, b) sofort nach Kardioplegie mit Custodiol ® und Explantation, c) vor Implantation, d) nach 30 und/oder 60 rain Reperfusion, e) im ersten postoperativen Monat w6chentlich und danach in gr613eren Intervallen. Nach Formalinfixierung der Proben und Schnelleinbettung in Paraffin erfolgten histopathologische Begutachtung und immunhistochemische Analysen. Nach Fixierung mit gepuffertem Glutar- und Paraformaldehyd wurde der ultrastrukturelle Erhaltungsgrad des Myokards beurteilt. Schockgefrorene Proben wurden fiir immunhistochemische und molekularpathologische Un- tersuchungen herangezogen. Mittels konventioneller Licht- und Elektronen- mikroskopie wurden Ver/inderungen der Zusammensetzung des Myokards (interstitielle Infiltrate, Fibrose), der Kardiomyozyten (Zellgdem, Hypertro- phie) und Endothelien (Organellenschfiden, Zellgdem) qualitativ und morphometrisch charakterisiert. Molekulare Ver/inderungen im Rahmen ent- ztindlicher Prozesse (akuter myozyt/irer und/oder vaskul~irer Rejektionen, Infektionen) oder komplexer Vorgfinge wie der chronischen Rejektion wurden mittels Immunhistochemie auf Protein-Ebene und Polymerase-Kettenre- aktion (PCR) oder In situ-Hybridisierung auf DNA- oder mRNA-Ebene analysiert.

Qualitativ und morphometrisch waren lichtmikroskopisch nach vier Stun- den Ischfimie keine Unterschiede zwischen den nach Ex- und Implantation entnommenen Proben auszumachen. Elektronenmikroskopisch zeigten die Kapillarendothelien eine wesentlich hghere Empfindlichkeit gegentiber Isch~imie/Reperfusion als die Kardiomyozyten. Bestimmte quantitative ultrastrukturelle Parameter der Strukturprotektion zeigten statistisch signifikante Korrelationen mit der Isch~imiezeit, andere mit der Anzahl und dem Schweregrad der myozyt/iren oder vaskul~iren Rejektionen im ersten Jahr nach HTx. Infektionen mit dem Zytomegalie-Virus wurden mittels Immun- histochemie und In situ-PCR nachgewiesen, veriinderte Expressionen von Zytokinen und Wachstumsfaktoren mittels Immunhistochemie und In situ- Hybridisierungo Nur durch einen differenzierten Einsatz konventioneller und

8 Zeitschrift fiir Herz-, Thorax- und Gef:,if3chirurgie, Band 11, Supplement i (1997) © Steinkopff Verlag 1997

molekularer Methoden k6nnen unterschiedliche Fragen nach HTx beant- wortet werden. Voraussetzung darer ist eine adfiquate Entnahme, Fixierung und Aufarbeitung der jeweiligen Proben.

Summary The most important diagnostic questions following HTx relate to graft failure, acute rejection, infections and chronic rejection. Right ventricular biopsies were taken during and following HTx at different time points: a) before cardioplegia, b) immediately following cardioplegia with Custo- diol ® and explantation, c) before implantation, d) after 30 and/or 60 rain reperfusion, e) weekly during the first postoperative month and then after longer time intervals. After fixation of the probes in formalin and rapid embedding in paraffin, histopathology of the myocardium was evaluated, immunocytochemical analyses followed. Applying fixation in buffered glutar- and paraformaldehyde and embedding in epon-araldite, myocardial ultrastructural preservation was evaluated. Samples rapidly frozen in liquid nitrogen were taken for immunocytochemical and/or molecular investigations. By means of conventional light and electron microscopy, alterations of the composition of the myocardium (interstitial infiltrates, fibrosis), of cardiac myocytes (cellular edema, hypertrophy), and of endothelia (damage of cell organelles, cellular edema) were evaluated qualitatively and morphometrically. Molecular alterations underlying inflammation (acute myocardial and/or vascular rejections, infections) or complex processes such as chronic rejection were investigated on the protein level by means of immunocytochemistry and on the DNA or mRNA level by means of the polymerase chain reaction (PCR) or in situ hybridization.

Qualitatively and morphometrically, light microscopy could not detect dif- ferences between biopsies taken after explantation and those before implantation following 4 hours of ischemia. Ultrastructural stereology was able to demonstrate that during HTx capillary endothelia were more susceptible to ischemiaJreperfusion than cardiac myocytes. Single quantitative ultrastructural parameters for structural protection showed statistically signifi- cant correlations with the duration of ischemia. Different parameters correl- ated with the number and severity of myocardial or vascular rejections during the first year after HTx. Infections with the cytomegalovirus were de- tected by means of immunocytochemistry and in situ PCR. Altered expression of cytokines and growth factors was demonstrated by means of immunocytochemistry and in situ hybridization.

Thus, different questions following HTx can only be answered by applica- tion of corresponding conventional and/or molecular methods, provided that adaequately fixed samples are prepared.

Sehliisselw6rter Herztransplantation - Histopathologie - Elektronenmikroskopie - Morphometrie - Immunhistochemie - In situ- Hybridisierung - In situ-Polymerase-Kettenreaktion

Key words Heart transplantation - histopathology - electron microscopy - morphometry - immunocytochemistry - in situ hybridisation - in situ polymerase chain reaction

EinleRung

Die orthotope Herztransplantation ist bei einer terminalen, konservativ und/oder chirurgisch ausbehandelten Herzinsuffizienz als Standard-Thera- pieverfahren fest etabliert (26). In den letzten Jahren nimmt jedoch weltweit das Mil3verh/iltnis zwischen der steigenden Zahl von Patienten auf der Warteliste und dem riicklg_u- figen Angebot an Spenderorganen kontinuierlich zu (9, 12, 17, 18). Mit zunehmender Erfahrung wurden die kurz- und mittelfristigen Ergebnisse verbessert, die Indikationen erwei- tert und die AusschluBkriterien ffir die Akzeptanz von Spenderherzen gelockert (4, 9, 17, 18, 26). Die her- ausragende Ursache fiir die frfih- postoperative Letalitfit ist zuneh- mend das Transplantatversagen (4, 12, 17, 26). Dabei kommt dem Versa- gen des rechten Ventrikels eine besondere Bedeutung zu (7). Als statistisch hochsignifikanter Risikofaktor ffir einen frfihzeitigen Tod nach HTx wurden Ischfimiezeiten von mehr als vier Stunden ermittelt (4). Somit stellt die Verbesserung der Toleranz kalter Ischfimie im Rahmen der HTx mit der Strukturprotektion der unterschiedlichen Gewebe und Zellen ein klinisch besonders relevantes Ziel dar. Wesentlich ffir die Beurteilung und Verbesserung von Verfahren zur Konservierung des Herzens ist die Kenntnis der fundamentalen Pro- zesse, die dutch die Perfusion mit unterschiedlichen kardioplegischen L6- sungen, die anschlieBende Ischfimie und Reperfusion initiiert werden.

Das unmittelbare Ausmal3 von Verfinderungen bzw. Sch~iden an unterschiedlichen Zellen, d.h. deren verschiedene Vulnerabilitfit sowie die ReversibilitM der Alterationen k6n- nen nur elektronenmikroskopisch beurteilt und morphometrisch ob- jektiviert werden (38, 40, 47). Eine unabdingbare Voraussetzung ftir derartige stereologische Untersu- chungen ist die Fixierung von Pro-

Ph. A. Schnabel et al. 9 Konventionetle und molekuIarpathotogische Untersuchungen

ben unmittelbar nach Entnahme in einem speziellen Fixativ und die weitere gesonderte Aufarbeitung bis zur Einbettung in Kunstharz. Dagegen miissen Proben fiir molekulare Ana- lysen sofort schockgefroren werden, f/Jr besondere Untersuchungen (z. B. die In situ-Hybridisierung) unter Einsatz kryoprotektiver Substanzen.

Mit diesem Methodenspektrum wurde die besondere Situation der HTx mit einer inhomogenen Vor- schS, digung unterschiedlicher Zellar- ten im Rahmen des Hirntodes (48) und der Vorgeschichte der Herzspen- der (44)jedoch noch nicht analysiert. WS, hrend die Induktion bestimmter Zytokine durch Ischfimie und Reper- fusion bereits experimentell iiber- prfift wurde (22), ist deren Bedeu- tung ffir die humane Situation noch unklar. In der friihen postoperativen Phase kann die rechtzeitige Dia- gnose von Rejektionen und/oder In- fektionen, vor allem mit dem Zyto- megalievirus (10), sowohl die Kom- plikations- als auch die LetalitS, tsrate senken (4, 12, 18). Der Langzeitver- lauf wird vor allem durch die chronische Rejektion mit der Ausbildung der Transplantatvaskulopathie, der Sonderform einer beschleunigt auf- tretenden Arteriosklerose, begrenzt (49). Zusammen mit diesen vaskulfi- ten Prozessen tragen die interstitielle Myokardfibrose (42) und die Myo- kardhypertrophie mit degenerativen Myozytenverfinderungen wesentlich zu dem chronischen Transplantat- versagen bei.

Im Folgenden sollen unterschiedliche pathologisch-diagnostische Un- tersuchungsmethoden mit logistischen und methodisch-technischen Voraussetzungen vorgestellt werden.

MateriaJ und Methoden

Probenentnahme und -bearbeitung

Bei 29 Herztransplantationen wurden rechtsventrikulfire Proben der

Spenderherzen zu folgenden Zeit- punkten (2, 40) entnommen: a) vor Explantation, b) sofort nach Kardio- plegie mit Custodiol ® und Explanta- tion, c) vor Implantation, d) nach 30 und/oder 60 rain Reperfusion, e) im ersten Monat nach HTx w6chentlich und danach in gr613eren Abst/inden. Zur Konservierung der Spender- herzen wurde ausschlieglich die kar- dioplegische L6sung Custodiol ® eingesetzt (Histidin-, Tryptophan-, Ka- lium-a-Ketoglutarat-haltige L6sung nach Bretschneider 1). Die Zusam- mensetzung der L6sung betrug (jeweils in mmol/1): 15 NaC1, 9 KC1, 4 MgC12, 180 Histidin, 18 Histidin- HC1, 30 Mannitol, 2 Tryptophan und 1 K-a-Ketoglutarat (2, 5, 6, 14, 45, 46). Die Herzen wurden mit 2000 bis 4000 ml (2, 44) der L6sung fiber l0 +- 3 min perfundiert. Zu a) und d) wurden transmurale Biopsate (45) mittels Tru-Cut®-Biopsienadeln entnommen (Tru-Cut ® needle2)). Zu b) und c) wurden Trabekel mit einer fei- nen Schere an beiden Enden abge- trennt und quetschfrei auf den Bran-

i) Dr. F. K6hler Chemie GmbH, Alsbach- Hfihnlein, Deutschland

2) Travenol Laboratories, Inc., Deerfield, Ill., USA

chen der Schere in das jeweilige Fi- xativ fiberffihrt. Zu e) wurden En- domyokardbiopsate mittels Konno- Bioptomen gewonnen (3). Die unterschiedlichen Entnahmezeitpunkte und Fixierungen sind mit dem Pro- tokoll ftir die Jahre 1993 bis 1996 in Tabelle 1 zusammengestellt. Je nach Gr6ge der Proben nahm die Schnell- einbettung (von Hand) mit Anferti- gung der Paraffinschnitte (3-5 gm) in Stufen und Schnittserien (3) und F~rben der Schnitte 4 bis 5 Stunden in Anspruch. Die Paraffinschnitte wurden mit H/imatoxilin-Eosin und nach Ladewig (Bindewebsf~irbung) gef~irbt, histochemisch wurde die PAS-Reaktion (Perjods/iure-Schiff- Reaktion) eingesetzt. Parallel wurden immer Leerschnitte ftir eventu- elle zus~itzliche histochemische oder immunhistochemische Untersu- chungen angefertigt.

Die mit flfissigem Stickstoff in einem Kryoprotektans (Tissue-Tec ®, Miles Inc., Diagnostics Division, Elkhart, IN 46515 USA) schockgefrorenen Proben wurden bei -24 °C mit einem Kryostaten geschnitten (Frigocut E, Reichert-Jung, Nul3- loch, Deutschland). Die Kryostat- schnitte (5-10 gm) wurden konven- tionell wie die Paraffinschnitte ge- f~irbt und ffir die Immunhistochemie

Tab. 1 Protokoll der Probenentnahme und -fixierung bei Herztransplantation in Heidel- berg (Form. = Formalin; EM-Fix. = Fixativ f~r Elektronenmikroskopie)

Zeitpunkt Lokalisation Instrument Art der Fixierung

Form. Kryo EM-Fix.

Vor Kardioplegie Re. Ventrikel Biopsienadel - - + transmural

Sofort nach Re. Ventrikel Schere + - + Explantation Trabekel Unmittelbar vor Re. Ventrikel Schere + + + Implantation Trabekel

Re. Atrium Schere + + + transmural

Nach 30/60 min Re. Ventrikel Biopsienadel - - + Reperfusio n transmural 1/2 Wochen Re. Ventriket Biopsiezange + + + postoperativ endomyokard.

Pathologisches Institut, Abt. Herzchirurgie, Universitiit Heidelberg, 1993-1996

10 Zeitschrift f~r Herz-, Thorax- und GeF, iBchirurgie, Band l l , Supplement 1 (1997) © Steinkopff Verlag 1997

(mit nicht Paraffin-gfingigen Anti- k6rpern) und die In situ-Hybridisie- rung eingesetzt.

Ffir die Elektronenmikroskopie wurden die Proben in einem Ge- misch aus jeweils 1,5% Glutaralde- hyd und Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (2) fiber mehrere Stunden bei Raumtemperatur pri- m/irfixiert. AnschlieBend wurden die B16ckchen in Phosphatpuffer (mit Zusatz von 7,5%iger Saccharose) mehrfach gewaschen und in Phos- phat-gepuffertem Osmiumtetroxyd (mit Kaliumhexacyanoferrat, 1:1) postfixiert. Nach Entwfisserung in einer aufsteigenden Alkoholreihe erfolgte die Durchtr/inkung der Proben mit Propylenoxyd und einer aufsteigenden Harz-Propylenoxyd-Reihe bis zur Einbettung in reinem Epon- Araldit. F/Jr die Polymerisation des Harzes wurden tiblicherweise 24 Stunden bei 70°C ben6tigt. Die Routineeinbettung nahm 2 bis 3 Ar- beitstage (von Hand) in Anspruch, mit Einsatz eines Automaten (Histo- mat, bio-med, Theres, Deutschland) wurde sie auf einen Tag verkfirzt. Eine Schnelleinbettung ffir die Elek- tronenmikroskopie konnte ein- schlieBlich forcierter Polymerisation innerhalb 24 Stunden abgeschlossen werden. Semid/innschnitte (1 ~m) und Ultradfinnschnitte (60-80 nm) wurden mit Ultramikrotomen (U1- tracut, Reichert, Wien) angefertigt. Die Semidfinnschnitte wurden mit basischem Fuchsin und Methylen- blau geF~irbt, die Ultradfinnschnitte mit Uranylacetat und Bleizitrat kon- trastiert.

Licht- und Elektronenmikroskopie

Sfimtliche Proben wurden zuf'fillig eingebettet und zuF, illig geschnitten (,,random embedding", ,,random sectioning"; 50), so dab keine Vor- zugsrichtung der Kardiomyozyten in den Schnitten vorlag. Pro Entnah- mezeitpunkt wurden/iblicherweise 5

Proben licht- und elektronenmikroskopisch qualitativ und quantitativ nach dem ,,random systematic sam- pling"-Verfahren (50) untersucht (47). Ffir die Auswertung kamen das Lichtmikroskop Standard 25 (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) und die Elektronenmikroskope EM 10 und EM 902 (beide Zeiss, Oberkochen, Deutschland) zum Einsatz. Die qua- litativen Ergebnisse wurden immer durch zwei unabh~ingige Untersu- cher fiberprfift (46). Die Graduie- rung akuter Rejektionen erfolgte nach der ,,working formulation" der International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT) (3). Zusgtzlich wurden (peri-)vaskulfire mononuklefire Infiltrate nach folgen- dem Score eingeteilt: V0 = kein Infit- trat, Vl = Perivaskulitis, V2 = Endo- thelialitis, V3 = Vaskulitis (39). Bei histologischem oder serologischem Verdacht auf eine CMV-Infektion wurden entsprechende immunhistochemische Untersuchungen durchgeffihrt.

Morphometrie

Lichtmikroskopisch wurde die Zu- sammensetzung des Myokards mit dem Punktzfihlverfahren (50) bestimmt, bei 100facher Vergr6Berung (bezogen auf den Referenzraum Ge- samtprobe) die Volumendichten der Myozytenbfindel, des perimysialen Bindegewebes, der Gewebespalten zwischen den Myozytenbtindeln sowie der perimysial gelegenen groBen Arterien, Venen und LymphgeF~iBe, bei 1000facher Vergr6Berung (Refe- renzraum Myozytenbfindel) die Vo- lumendichten der Kardiomyozyten, des endomysialen Bindegewebes, des freien Interstitiums sowie der en- domysial gelegenen Arteriolen, Ve- nolen und Kapillaren (36, 41).

Elektronenmikroskopisch wurden die Zusammensetzung der Myozy- ten, die Mitochondrienschwellung sowie das Zell6dem der Kardiomyo-

zyten und der Kapillarendothelien mit dem Punkt- und Schnittpunkt- Z/ihlverfahren (50) ermittelt. Bezo- gen auf die Kardiomyozyten als Re- ferenzraum wurden die Volumen- dichten der Myofibrillen, der Mito- chondrien, des freien Sarkoplasmas, der Zellkerne und der fibrigen Zell- organellen bestimmt (38, 40). Als MaB fiir das Zell6dem der Kardio- myozyten diente die Volumendichte der Myofibrillen unter der Voraus- setzung, dab weder eine Myofibrillo- lyse noch eine Myofibrillogenese nachweisbar waren (47). Die Schwel- lung der Mitochondrien wurde bei Konstanz der Oberfl~iche durch das Oberfl~ichen-Volumen-Verhfiltnis der Mitochondrien wiedergegeben (37). Dazu wurde die getrennt bestimmte Oberfl/ichendichte der Mitochon- drien auf deren Volumendichte bezogen (37).

Das Zell6dem der Kapillarendo- thelien wurde durch deren mittlere Barrierendicke (t) als Volumen- Oberflgchen-Verh~iltnis ermittelt (50). Dazu wurden mit einem Mehr- zweck-Raster mit Testpunkten und Testlinien (Abb. 1) nach Weibel (50) Testpunkte, die auf den Anschnitt der Barriere (d. h. das Zytoplasma der Endothelzellen) fielen, auf die Schnittpunkte mit der interstitiell be- grenzenden Oberfl~iche (d. h. der Ba- satmembran der Endothelzellen) bezogen. Die mittlere Barrierendicke t wurde nach folgender Formel errech- net:

t = V u / S b ~- ( g T / 2) * (Pb / Ib)

V b = Volumendichte des Gewebes, aus dem die Barriere besteht, Sb = OberflS.chendichte der endothelialen Oberfl/iche, Lr = LS.nge der Testlinie, die mit jedem Testpunkt des Punkterasters verbunden ist, Pb = Anzahl der Punkte, die auf die Bar- riere fallen, I b -- Anzahl der Schninpunkte mit der OberflS.che der Barriere.

Ph. A. Schnabel et al. I l Konventionelle und molekularpathologische Untersuchungen

Abb. 1 Elektronenmikroskopie und Morphometrie: Rechtsventrikul/irer Trabekel, Kapil- late mit Perizyten und benachbarten Kardiomyozyten vor Implantation, GesamtischS.miezeit: 250 min; Raster mit Testlinien und Testpunkten zur stereologischen Bestimmung der mittleren Barrierendicke (50).

Immunhistochemie

Die Schnitte wurden fiber Nacht bei 4 °C in Feuchtkammern mit dem primS_ren Antik6rper gegen das nachzuweisende Antigen in entsprechender Verdfinnung inkubiert (29). Zur Detektion des Zytomegalievirus (CMV) setzten wir den monoklona- len Antik6rper ,,Anti-Cytomegalovi- rus Clone E-13" ein (Paesel und Lo- rei, Frankfurt/M). Im Langzeitver- lauf nach HTx kamen Antik6rper gegen folgende Antigene zum Ein- satz (21): TGF/31, TGF]32,3, TGFI3- LAP, PDGF AA/BB, M-CSF, GM- CSF, IL-tc~, IL-2, IL-2 Rezeptor, IL- 4, IL-4-Rezeptor, IL-10, INF7, INFy-Rezeptor, TNFa, TNFIB, CD 8, CD 45 R0, CD 68.

Im AnschluB an eine kurze Spfi- lung mit TBS (0,15 M NaC1, 0,05 M Tris) folgte die Behandlung mit Ha- se-anti-Maus- (HAM-) Immunglo- bulinen (Dakopatts, Dako, Ham- burg) ffir eine Stunde bei Raumtem- peratur. Um die sogenannte Sand- wich-Technik zu vervollstfindigen, wurden die Schnitte f/.ir eine weitere Stunde bei Raumtemperatur mit el- nero 16slichen alkalische Phosphata- se- anti-alkalische Phosphatase- Komplex (APPAR Dakopatts, Dako,

Hamburg) behandelt. Diese beiden Schritte wurden ffir weitere 20 min wiederholt, um eine Verbesserung der Komplexbildung zu erreichen. Der F~irbeschnitt beinhaltete eine In- kubation der Schnitte mit der frisch hergestellten F/irbel6sung (Naphtol AS-MX-Phosphat, fast red dye) entsprechend den Herstelleranweisun- gen (beides Sigma Chemical Co., M/inchen). Als Gegent'~irbung kam eine 70%ige HS.malaunl6sung nach Mayer zur Anwendung. Die Schnitte wurden mit Glyzerin-Gelatine (Kai- sers Glyzerin, Merck, Darmstadt) bedeckt. Die Auswertung erfolgte unabh~ingig voneinander durch zwei Untersucher. Sfimtliche Ergebnisse wurden mit den vor Implantation ge- wonnenen Werten verglichen.

In situ-Hybridisierung

Die Herstellung der Sonden erfolgte durch Einbringen entsprechender cDNA-Abschnitte in pGEM-Trans- kriptionsvektoren zwischen SP6- und T7-Promotoren (28) (Promega Biotech, Madison, WI, USA). Nach der Linearisierung mit entsprechen- den Restriktionsenzymen wurden die Anti-Sense- und Sense-Sonden mit

Digoxigenin-markiertem Uridintri- phosphat durch SP6- oder T7-Poly- merasen hergestellt (DIG RNA labe- ling kit, Boehringer-Mannheim). Im Langzeitverlauf nach HTx wurden folgende cRNAs eingesetzt (21): TGF]3, PDGF A/B, PDGF [3-Rezep- tor, M-CSF, IL-lc~, IL-1-Rezeptorl, IL-2, IL-4, IL-10, INFy.

Vor der Hybridisierung erfolgte eine 30-minfitige Behandlung der Schnitte mit 0,1% Triton X-100 in PBS (Phosphat-gepufferter NaC1- L6sung) bei pH 7,2. Danach wurden die Schnitte in PBS gespfilt, 15 min in 3%iger gepufferter Paraformalde- hydl6sung fixiert und erneut kurz in PBS gesp/ilt. AnschlieBend wurden sie i0 min in eine 0,1 M Triethanol- amin-L/Ssung mit Zusatz yon 0,4% Essigs/iureanhydrid verbracht, erneut in PBS gespfilt und in einer aufsteigenden Alkoholreihe entw/issert. Die entsprechende cRNA wurde bei 95 °C fiber 5 min in 5 mM EDTA und 10 mM Tris denaturiert. Die Sonden kamen nach Abkiihlen auf Eis in die vorbereitete Hybridisie- rungsl6sung. Diese bestand aus 50% Formamid, Denhardt-L6sung (0,02% Polyvinylpyrrolidin, 0,02% Ficoll 400, 0,02% BSA), 0,3 M NaC1, 10% Dextransulfat, 500 gg/ml Lachs- sperma-DNA, 500 l.tg/ml Hefe- tRNA, 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA und 50 mM DTT. Die Schnitte wurden mit jeweils 20 gl Hybridisierungsl6sung inkubiert, mit RNAse-freien Deckgl/isern ein- gedeckt und fiber Nacht bei 42 °C in Feuchtkammern hybridisiert.

Nach der Hybridisierung erfolgten verschiedene Spfilungen in SSC (0,15 M NaC1, 0,015 M Natriumzitrat): zweimal 5 min in SSC 5 °C unter- halb der Hybridisierungstemperatur. zweimal 5 min in SSC bei Hybridi- sierungstemperatur und abschlie- Bend eine Stunde in SSC bei Raum- temperatur.

Die colorimetrische Detektion der mRNA erfolgte mit Hilfe des DIG- Nonradioactive Nucleic Acid Detec-

12 Zeitschrift fiir Herz-. Thorax -und Get~,iBchirurgie, Band 11, Supplement 1 (1997) © Steinkopff Verlag 1997

tion Kit mit geringen Modifikatio- nen der Anweisungen des Herstel- lers (Boehringer-Mannheim). Die Schnitte wurden 30 min in Puffer 1 (100 mM Tris-HC1, 150 mM NaC1 (pH 7,5)) mit 1% normalem Schafse~ rum (NSS) und 0,1% Triton X-100 inkubiert. Die Anti-Digoxigenin- Antik6rper waren an eine alkalische Phosphatase gekoppelt. Die Schnitte wurden ffir drei Stunden bei Raum- temperatur mit jeweils 100 gl der Antikfrperlfsung (Verdiinnung 1:800 in Puffer 1, 2% NSS) bei abso- luter Dunkelheit in Feuchtkammern inkubiert. Nach dieser Antik6rperin- kubation erfolgten kurze Spiilg~inge in Puffer 1 und Puffer 2 (100 mM Tris-HC1, 100 mM NaC1, 50 mM MgC12 (pH 9,5)) sowie die Lrberfiih - rung in die F~irbel6sung, in der die Schnitte fiber Nacht bei Dunkelheit verblieben. Um die F~rbereaktion zu stoppen, muBten die Schnitte in Puf- fer 3 (10 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA (pH 8,0)) gespfilt und an- schliel3end in einer aufsteigenden A1- koholreihe entw/issert werden. Die Schnitte wurden mit Glyzerin-Gela- tine (Kaisers Glyzerin, Merck, Darmstadt) bedeckt und ffir die Aus- wertung konserviert. Negativ-Kontrollen erfolgten durch Inkubation mit Sense-Sonden und nicht markierten cRNA-Sonden. Die Auswertung erfolgte wie bei der Im- munhistochemie beschrieben.

In situ-PCR

Zur Vorbehandlung wurden die Schnitte 15 min mit frischem Xylol entparaffiniert und in einer aufsteigenden Ethanolreihe (80%, 90%, 100%) dehydriert (35). Ffir die Permeabilisie- rung der Zellen wurden auf jeden Schnitt 100 gl Pepsinl6sung (2 mg Pepsin in 0,1 N HC1) aufgetragen. Die Schnitte wurden dann ffir 25 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubiert, anschlieBend in PBS gespfilt und an der Luft getrocknet.

Auf die Schnitte wurden 50 gl PCR-Reaktionsansatz (10x PCR- Puffer, 3 mM MgCI> 0,2 mM dNTR 200 u/ml AmpliTaq DNA Polyme- rase IS (Perkin Elmer, Forster City, CA, USA), 50 pmol Primer CMV-S1 und CMV-S2) pipettiert. Zielsequenz der Primer war der HCMV IE1- Genbereich, wobei das resultierende Amplifikationsprodukt eine Lfinge von 280 bp aufwies (CMV-SI: 5'- AGA CCT TCA TGC AGA TCT CC-Y, CMV-S2: 5'-GGT GCT CAC GCA CAT TGA TC-3'). Nach dem VerschlieBen der Reaktionskammer (AmpliCover TM Clips) mit dem As- sembly-Tool (Perkin Elmer) wurden die Schnitte in den Thermocycler (GeneAmp In Situ PCR System 1000, Perkin Elmer) fiberffihrt. Die Amplifikation hatte folgendes Tem- peraturprofil:

94 °C (3 min): 1 Zyklus und 55 °C (2 min), 72 °C (2 min) und 94 °C (1 min) 20 Zyklen. Als Kontrollen fiir die In situ-PCR wurden In situ- PCR-Mixe ohne Primer verwendet. Zur Detektion der PCR-Produkte mit der In situ-Hybridisierung wurden die Clips nach der In situ-PCR entfernt, die Schnitte in PBS gewaschen, dehydriert und getrocknet. Pro Schnitt wurden 10 gl einer mit Biotin markierten Probe (biotin tCMV probe, Kreatech, Amsterdam) aufgetragen, auf der Heizplatte denaturiert (mit einem Deckglas vor Evaporation geschfitzt) und an- schliegend fiber Nacht in einer feuchten Kammer bei 37 °C inkubiert. Die Detektion erfolgte nach stringentem Waschen der Objekttr/i- ger durch einen mit alkalischer Phos- phatase konjugierten Anti-Biotin- Antikfrper (Boehringer, Mannheim) in Kombination mit dem Substrat NBT/BCIR

Ergebnisse

Qualitative Lichtmikroskopie

In den rechtsventrikul~iren Trabekeln nach Explantation und vor Implan- tation waren lichtmikroskopisch meist keine oder gering- bis m~il3ig- gradige, selten deutliche pathologi- sche Ver/inderungen zu finden. Da- bei handelte es sich fiberwiegend um chronische Ver/inderungen der Spen- derherzen wie eine subendokardiale und/oder interstitielle Fibrose, eine Hypertrophie der Kardiomyozyten sowie eine Mediahypertrophie intra- muraler Arterien. Interstitielle Infil- trate, entzfindliche Geffd3ver/inderungen oder atypische Zellproliferate fehlten. Nach Kardioplegie zeigte sich ein moderates interstitielles Odem, die BlutgetSge waren meist frei von Blutbestandteilen. Gelegent- lich fanden sich Erythrozyten peri- und/oder intravaskul/ir, sehr selten am Endothel anhaftende Leukozy- ten. Vereinzelt fielen Kontraktions- bfinder in zentralen Anteilen der grf- Beren Proben auf, die nicht mit SchnittkantenlS_sionen erklfirt wet- den konnten (vgl. Abb. 6A). In der Nachbarschaft derartiger Kontrak- tionsb/inder sahen wir hfiufiger interstitielle und/oder intravaskulfire Erythrozyten, auch kleine intramyo- kardiale Arterien und vereinzelt Nerven.

Die rechtsventrikuI/iren Endo- myokardbiopsien zeigten in den ersten beiden postoperativen Wochen immer eine Hypertrophie der Kar- diomyozyten, allerdings mit deutli- cher interindividueller Streuung. Isch~imische Myozytolysen und eine subendokardiale/interstitielle Fibrose waren vor allem nach Isch~miezeiten yon mehr als vier Stunden nachzu- weisen. Akute AbstoBungen traten in den ersten zwei Wochen nach HTx seltener auf als in den darauffolgen- den Wochen und Monaten. In einem Kollektiv yon 17 Patienten wurden die intraoperativ entnommenen

Ph. A, Schnabel et al. I3 Konventionelle und molekuIarpathologische Untersuchungen

rechtsventrikulfiren Biopsate morphometrisch ausgewertet. Im ersten postoperativen Jahr wurden pro Pa- tient 15 _+ 2 mal Endomyokardbi- opsate entnommen. Im Mittel traten eine Perivaskulitis 5,7 mal, eine Endothelialitis 2,1 mal und eine Vas- kulitis 0,7 mal auf. Die mittlere Hfiu- figkeit akuter Rejektionen nach der ,,working formulation" der ISHLT (3) betrug: Grad ,,0" 4 mal, Grad ,,1" 6,7 mal, Grad ,,2" 2,1 mal, Grad ,,3" 1,8 mal und Grad ,,4" 0,3 mal. Ab der dritten bis vierten Woche waren selten CMV-Infektionen mit schfitteren lymphoidzelligen interstitiellen Infiltraten (vgl. Abb. 6B), einer Aktivierung von Fibroblasten und einer Vermehrung kollagener Fasern assoziiert. Sehr selten waren histologisch die Kriterien einer Myo- karditis mit lymphoidzelligen Infil- traten und gleichzeitigen Sch/iden (Myozytolysen) der Kardiomyozyten erfiillt. Bei serologischem oder histologischem Verdacht auf eine CMV- Infektion wurden immer entsprechende immunhistochemische Un- tersuchungen durchgeffihrt.

In den folgenden Jahren traten akute Rejektionen am h/iufigsten bei den Patienten auf, die auch innerhalb des ersten Jahres vermehrt h6- hergradige Abstol3ungen gezeigt hat- ten. Im Mittel nahmen Fibrose und Hypertrophie gegenfiber der ersten Jahresbiopsie zu, die im Vergleich zu den Ausgangswerten signifikant er- h6hte Werte zeigte (41, 42). Bei einzelnen Patienten land sich nach meh- reren Jahren eines stabilen Verlaufs eine deutliche Zunahme interstitiel- ler Narbenfelder. Vereinzelt sah man Zeichen einer ischfimischen Schfidi- gung der Kardiomyozyten und/oder intramurale Arterien mit einer Me- diahypertrophie.

Qualitative Elektronenmikroskopie

Nach Explantation fand sich eine weitgehend gut erhaltene myokar-

Abb. 2 Elektronenmikroskopie: RechtsventrikulS.rer Trabekel, Kardiomyozyten mit Kapil- late nach Explantation desselben Spenderherzens wie in Abb. 1.

diale Feinstruktur (Abb. 2, Abb. 3A), jedoch mit einer inhomogenen (Vor-) Sch/idigung einzelner Kardiomyozy- ten. Diese zeigten fokale Schwellun- gender Zellen selbst und vor allem der Mitochondrien sowie teilweise [lber- bis Hyperkontraktionen der Sarkomere, letztere mit Aktin-Myo- sin-Verklumpungen. Vor Implanta- tion war das Zell6dem der Kardio- myozyten weiterhin mehr fokal ak- zentuiert, w/ihrend die Mito- chondrienschwellung im Mittel st/ir- ker ausgepr~igt war (vgl. Abb. 1). Nach 60 min Reperfusion blieb die Schwellung der Kardiomyozyten weitgehend unverfindert inhomogen, die der Mitochondrien wurde deutlich zurtickgebildet (Abb. 3B). Die Kapillarendothelien waren nach Ex- plantation generell gut erhalten oder zeigten nur geringe Verfinderungen (Abb. 2). Vor Implantation batten sich ein mittelgradiges Endothelzell- 6dem und entsprechende Verfinde- rungen der Zellorganellen einschlieglich der Mitochondrienschwellung ausgebildet (vgl. Abb. 1). Nach 60 min Reperfusion war im Mittel keine nennenswerte Rfickbildung der Endothelzellschwellung und Orga- nellenschfiden festzustellen (Abb. 4).

Morphometrie

Lichtmikroskopisch zeigten die mor- phometrischen Ergebnisse zwischen Explantation und Implantation keine nennenswerten Unterschiede. Weder die Zusammensetzung der Proben noch die der Myozytenbfin- del wurden durch die IschSimie wesentlich verS.ndert. Z.B. waren die Volumendichten der Myozytenbfin- del und des perimysialen Bindegewe- bes (bezogen auf das gesamte Myo- kard als Referenzraum) und die Vo- lumendichten der Myozyten und des endomysialen Bindegewebes (Refe- renzraum Myozytenbiindel) nach Explantation und vor Implantation fast gleich.

Elektronenmikroskopisch fand sich eine signifikante Zunahme der Mitochondrienschwellung in den Kardiomyozyten zwischen Explanta- tion und 30 min Reperfusion anhand des OberflS_chen-Volumen-Verhfilt- nisses der Mitochondrien (Abb. 5A). Nach 60 min Reperfusion hatte sich das mitochondriale Odem so weit zurfickgebildet, dab kein signifikan- ter Unterschied gegenfiber den Aus- gangswerten nach Explantation festzustellen war (Abb. 5A). Die Volu- mendichte der Myofibrillen als Mal3 fiir das Zell6dem der Kardiomyozy-

14 Zeitschrift ffir Herz-, Thorax- und Get~,iBchirurgie, Band ll , Supplement 1 (1997) © Steinkopff Verlag 1997

A B

Abb. 3 Elektronenmikroskopie: Kardiomyozyten mit subsarkolemmalen Mitochondrien eines Spenderherzens mit einer GesamtischS.miezeit von 236 rain; A: Rechtsventrikul~irer Trabekel, nach Explantation; B: Nadelbiopsie, nach 60 min postisch/imischer Reperfusion.

Abb. 4 Elektronenmikroskopie: Kapillare mit einem Erythrozyten; Nadelbiopsie, nach 60 min postischS.mischer Reperfusion, Gesamtisch~miezeit: 276 min.

ten ver/inderte sich im Mittel w~ihrend Ischfimie und einer Stunde Re- perfusion nut gering (Abb. 5B). Bei den Kapillarendothelien nahmen die Zellschwellung (gemessen mit der mittleren Barrierendicke) (Abb. 5C) und die Organellenverfinderungen einschlieglich der Mitochondrien-

schwellung (bewertet mit einem se- miquantitativen Score) (Abb. 5D) zwischen Explantation und Implan- tation jeweils signifikant zu. Beide wurden wfihrend 60 rain Reperfusion nicht nennenswert zurfickgebildet.

Immunhistochemie

Bei der Differentialdiagnose zwischen Rejektion und Infektion in der frtihen postoperativen Phase konnte mit Hilfe der Immunhistochemie eine CMV-Infektion auf Protein- Ebene bei neun von 155 Patienten nachgewiesen werden (Abb. 6B). In Verlaufsbiopsien konnte bei einem Patienten ein CMV-Nachweis drei- mal, bei zwei Patienten zweimal und bei den iibrigen einmal geftihrt werden. Von diesen zeigten vier eine CMV-Myokarditis mit mononukle- firen Entztindungszellinfiltraten und frischen Myozytolysen. Bei letzteren konnte CMV-Virus-Protein in Zell- kernen yon Kardiomyozyten (Abb. 6B), von Kapillarendothelien und von interstitiellen Zellen nachgewiesen werden.

In allen vor der Implantation ge- wonnenen Proben fand sich immunhistochemisch eine deutliche Expres- sion von TGFI31-LAP in den Kar- diomyozyten (21), dartiberhinaus zeigten endotheliale Strukturen sowie vereinzelte interstitielle Zellen eine positive Reaktion. Zwei Jahre nach HTx war die Expression yon TGFI31-LAP auf Protein-Ebene in allen genannten Zelltypen deutlich verringert. Im Randbereich yon Fi-

Ph. A. Schnabel et al. Konventionelle und molekularpathologische Untersuchungen

15

9,5

Kardiomyozyten: Mitochondrienschwellung w~hrend Isch~mie und Reperfusion ( Stereologie )

9,0

E

i /I // 8,0 - -

O 7,5

7,0

A

6,5 + nach Explantation vor Implantation 30' Reperfusion 60' Reperfusion

Gesamtisch~mie: 189 +/-57rain (n =10)

75

Kardiomyozyten: Zellschwellung w~ihrend Isch~mie und Reperfusion ( Stereologie )

70

65 o >

60

55

50 nach Expiantation vor Implantation 30' Reperfusion 60' Reperfusion

Gesamtisch~mie: 180 +/- 57 rain (n= 10)

Abb. 5 Elektronenmikroskopische Morphometrie, Kardiomyozyten. A: Oberfl/ichen-Volumen-VerhS.Itnis (Svratio) der Mitochondrien, B: Volumendichte (Vv) der Myofibrillen. Mittelwerte _+ Standardabweichung nach Explantation, vor Implantation sowie nach 30 und 60 rain Reperfusion bei 10 Patienten (die n-Zahlen in den S~iulen: Anzahl der Spenderherzen, yon denen zu den einzelnen Zeitpunkten Proben ausgewertet wurden).

I6 Zcitschrift f~r Herz-, Thorax- und Gef:,igchirurgie, Band l I. Supplement ] (1997) © Steinkopff Verlag 1997

600

E 4o0 ==

10

m 200

C

Kapi l la rendothe l ien: Zellschwellung w~hrend Isch~imie und Reper fus ion (Stereologie)

nacb Explantation vor Implantation 30' Reperfusion Gesamtisch~imie: 180 +1- 57 rain {n= 10)

60' Reperfusion

Kapi l la rendothe l ien: M i t o c h o n d r i e n s c h w e l l u n g w~ihrend Isch~imie und Reperfusion (Score)

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6--

O ¢--

O

I)

nach Explantation vor Implantation 30' Reperfusion 60' Reperfusion Gesamt~sch~mie: 180 +/- 57 rain (n= 10)

Abb. 5 Elektronenmikroskopische Morphometrie und semiquantitativer Score, Kapillarendothelien; C: mittlere Barrierendicke; D: Mi- tochondrien-Score. Mittelwerte + Standardabweichung nach Explantation, vor Implantation sowie nach 30 und 60 min Reperfusion bei 10 Patienten (die n-Zahlen in den S/iulen: Anzahl der Spenderherzen, von denen zu den einzelnen Zeitpunkten Proben ausgewertet wurden).

Ph. A. Schnabel et al. 17 Konventionelle und molekularpathotogische Untersuchungen

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C D

Abb. 6 Lich tmikroskopie (Histopathologie) und Immunh i s tochemie : A: Rechtsventr ikul i t rer Trabeke[, Arbe i t smyoka rd mit zent ra len Kont rak t ionsb i indern (rot) nach Exp tan ta t iom Paraff inschni t t , K~irbung nach Ladewig; B: Rechtsventr ikul~re Endomyoka rdb iop s i e 5 Vvbchen pos t HTx , Paraff inschni t t , Immunhi s tochemie . Ant ik6rper gegen Zytomegal ievi rus , positive Signale (dunke tbraan) in zwei ZelI- kemen yon Kard iomyozy ten ; C: Rechtsventr ikuli t re Endomyokardb iops i e 2 Jahr pos t HTx , Kryos ta tschni t t , Immunh i s tochemie , Ant ik6r - per gegen TGF~3L-LAR positives Signal (rot) hauptsi tchl ich in Kard iomyozyten : D: Rechtsventr ikuli i re Endomyka rdb iops i e 3 Jahre pos t HTx, Kryos ta t schni t t , Immur~histochemie, Ant ik6rper gegen P D G F BB, positives Signal (rot) in EndothelzeTlen und M e d i a m y o z y t e n einer wandverd ick ten Arterie.

brosearealen war jedoch die Produk- tion yon TGFI31-LAP in geringerem Mal3e reduziert (Abb. 6C). Bei An- wendung eines Antik6rpers gegen den Platelet Derived Growth Factor (PDGF) Isoform BB, konnte drei Jahre nach HTx in Gef'aBen mit ver- dickter Media eine deutliche Expres- sion auf Protein-Ebene gezeigt wet- den (Abb. 6D).

In situ-Hybridisierung

Korrespondierend zu den Ergebnis- sen der Immunhistochemie mit dem

Antik6rper gegen P D G F BB zeigte die In situ-Hybridisierung mit einer RNA-Sonde fiir die P D G F 13-Rezep- tor-mRNA in einem Folgeschnitt eine deutliche Positivitiit im Bereich des Endothels sowie in einigen Zel- lender Gefiil3media (Abb. 7). Gegen- fiber der abnehmenden Produktion yon TGF[31-LAP konnte auf mRNA-Ebene ein Anstieg der TGFI31-Transkription bis zu f/inf Jahre nach der HTx beobachtet werden (21).

In situ-PCR

Entsprechend dem immunhistoche- mischen Nachweis yon CMV-Virus- Protein erbrachte die In situ-PCR positive Signale in Zellkernen yon Kardiomyozyten, Kapillarendo- thelien und interstitieIlen Zellen (Abb. 8). Lediglich die Sig-nal- intensitiit war h6her als bei der Im- munhistochemie. Weitere Untersu- chungen an immunhistochemisch ne- gativen Biopsaten, die vor der jeweils ersten Biopsie mit Nachweis yon CMV-Virus-Protein gewonnen wTar- den, werden zeigen, ob sich die Sen-

18 Zeitschrfft ffir Herz-, Thorax- and Gef:gl3chirur~e, Band l l, Supplement 1 ([997) © Steinkopff Verlag 1997

Abb. 7 In situ-Hybfidisierung: Rechtsventrikuiiire Endomyokardbiopsie 3 Jahre post HTx, Kryostatschnitt (Folgeschnitt zu Abb. 6D), RNA-Sonde ftir die PDGF [3-Rezeptor-mRNA, positives Sig-na[ (dunkeigrau/schwarz) in Endothelzellen.

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Abb. 8 In situ-PCR: Rechtsventrikul~ire Endomyokardbiopsie 5 Wochen post HTx, Par- affinschnitt (Folgeschnitt zu Abb. 6B), Zielsequenz der Primer: HCMV IEi-Genbereich, positive Sig-nate (dunkelgrau/schwarz) in Zelikernen von interstitiellen ZeIlen, Endothelzet- [en und einzelnen Kardiomyozyten.

sitivit/it des Virus-Nachweises mit der In situ-PCR erh/Shen liBt.

Oiskussion

Wertigkeit der unterschiedlichen Me- thoden

Viele Fragen nach HTx sind dutch die histopathologische Untersuchung der in Formalin fLxierten, in Paraffin ein- gebetteten Proben zu klS_ren.

In den w~ihrend der Transplanta- tion entnommenen Biopsaten lassen sich chronische Ver~nderungen wie Fibrose und Myozytenhypertrophie erkennen sowie entzfindliche Ver/inderungen ausschlieBen. Sehr selten k6nnen Tumorerkrankungen auch tiber das Spenderherz iibertragen werden (33). Bet der Suche nach aty- pischen Zellen k6nnen zus~itzliche immunhistochemische Untersuchun- gen hilfreich sein. Fokale Schgtden des Spenderherzens dutch endogen

und/oder exogen erh6hte Katechol- amine als Folge des Hirntodes (48) und der Intensivtherapie sind zumin- dest teilweise lichtmikroskopisch zu erkennen, z. B. als Kontraktionsb~m- der in zentralen Probenanteilen (vgl. Abb. 6A), in denen Schnittkantenlfi- sionen sicher auszuschliel3en sind (45). Die lichtmikroskopische Mor- phometrie konnte keine Unter- schiede zwischen nach Explantation and vor Implantation entnommenen Myokardbiopsien aufdecken. Jedoch dienen die w~ihrend HTx erhobenen quantitativen Daten als Ausgangs- weft ffir Vefiinderungen im postoperativen Verlauf (27, 32, 41, 42). Ver- /inderungen auf zellul~irer Ebene wie intrazellul/ire Odeme oder Organel- lensch~iden (vgl. Abb. 1-4) sind nut elektronenmikroskopisch zu erkennen und ggf. morphometrisch zu ob- jektivieren (5, 6, t4, 16, 20, 24, 38, 40, 44, 46). Die in dieser Arbeit atff- gezeigten Ergebnisse basieren auf umfangreichen experimentellen Vor- arbeiten, bet denen ultrastrukturetle Befunde mit funktionellen und metabolischen Daten verglichen wurden (5, 6, 14, 24, 37, 46). Aui3erdem wurden methodische Untersuchungen zum Einflul3 unterschiedlicher Arten der Probenentnahme, der Probenbe- handlung und der Fixierung durchgeffihrt, die einen direkten Vergleich z. B. von Nadelbiopsien und mit der Schere entnommenen Proben er- m/Sglichen (36, 38, 45). Experimen- tell wurden diejenigen strukturellen, metabolischen und funktionellen Pa- rameter herausgearbeitet, die fiir die Evaluierung yon kardioprotektiven bzw. Konservierungs-Verfahren besonders geeignet sind (5, 6, 14, 36, 46). Bet der Beurteilung der intra- und frith postisch/imischen Struktur- protektion yon Kardiomyozyten wird das Zell6dem mit der Volumen- dichte der Myofibrillen (47), die Mi- tochondrienschwellung mit deren Oberfl/ichen-Volumen-Verh/iltnis (37) bestimmt. Im Bereich der kapilliiren Endstrombahn sind die validesten

Ph. A. Schnabel et al. 19 Konventionelle und molekularpathologische Untersuchungen

Parameter zur l'_'lberprfifung der Ho- mogenit~it der kardioplegischen Per- fusion der Prozentsatz der Kapillar- anschnitte mit Erythrozyten (46) und fiir das Endothelzell6dem die mittlere Barrierendicke nach Weibel (50).

Im postoperativen Verlauf wird die Diagnose einer akuten Rejektion tiblicherweise an formalin-fixierten Biopsaten gestellt (3). Sofern diese Proben nicht ausreichend Myokard enthalten, k6nnen Kryostatschnitte von schockgefrorenen Proben kon- ventionell gef~arbt werden. Auch ffir die Elektronenmikroskopie fixierte Proben k6nnen einer Schnelleinbet- tung in Paraffin unterzogen werden. Zum Nachweis viraler Infektionen ist ffir einige Erreger eine Immunhi- stochemie mit formalin-g/ingigen Antik6rpern m6glich (11, 13). Ffir bestimmte kardiotrope Viren ist jedoch der Einsatz von schockgefrore- nem Material erforderlich (34). Im Falle einer CMV-Infektion mug fiberprtift werden, ob Virusmaterial in Kardiomyozyten (vgl. Abb. 6B), Kapillarendothelien, interstitiellen Zetlen (vgl. Abb. 8) oder Lymphozy- ten nachweisbar ist. Beim Befall lediglich von Lymphozyten ist eine Flfissigkeitsphasen-PCR positiv. Eine Infektion myokardialer Zellen kann jedoch nut morphologisch nachgewiesen werden. Nach den Un- tersuchungen anderer Arbeitsgrup- pen scheint die In situ-Hybridisie- rung ffir den Nachweis von CMV nicht sensitiver zu sein als die Im- munhistochemie (10, 30). Letztere und die In situ-PCR k6nnen an Paraftinschnitten eingesetzt werden. Weitere Untersuchungen werden zeigen, ob sich die CMV-Diagnostik durch die In situ-PCR mit vertretba- rem Aufwand und wesentlich h6he- rer Sensitivit/it verbessern 1/il3t.

Zur K1/irung der Pathogenese komplexer Vorg/inge wie der chronischen Rejektion sind umfangreiche Untersuchungen auf Protein- (vgl. Abb. 6C, D) und mRNA-Ebene (vgl. Abb. 7) erforderlich, um die Ver/in-

derungen der Expression der betei- ligten Zytokine zu analysieren (1, 8, 21, 22, 25, 31, 49). Fiir die Entwick- lung chronischer Ver/inderungen wie auch akuter Rejektionen (39) dtirfte die initiale Sch~idigung des Trans- plantats durch Hirntod, Intensivthe- rapie, Ischfimie und Reperfusion mit Initiierung immunologischer Pro- zesse wesentlich sein. Somit kommt der Konservierung der Spenderherzen mit der Protektion der Ultrastruktur eine besondere Bedeutung zu.

Konservierung der Spenderherzen

Weltweit werden zur Zeit einige prin- zipiell unterschiedliche Verfahren zur Konservierung yon Spender- herzen entsprechend den Erfahrun- gender jeweiligen Zentren weitestge- hend erfolgreich eingesetzt (3, 6, 7, 15, 19, 23, 44). Dabei ist zur Zeit kein direkter Vergleich der besonders interessanten Grenzf~ille mit gr613e- ren Belastungen z. B. durch h6here Katecholamindosen und/oder durch ausgedehntere Ischfimiezeiten m6g- lich, da fiblicherweise das Ausmal3 der Vorsch~idigung und der akut ver- ursachten Verfinderungen nicht be- kannt ist.

Die verschiedenen Verfahren wurden experimentell unterschiedlich intensiv untersucht und teilweise miteinander verglichen (2, 5, 6, 14, 20, 23, 38, 46). Bei verschiedenen Spezies wurden einerseits verfah- rensabh/ingig Limitierungen der Wiederbelebbarkeit (20) und ande- rerseits unterschiedliche Vulnerabi- litfiten bestimmter Zellarten oder - organellen gefunden (5, 6, 16, 23, 24, 37, 40, 47). Dabei scheint das Kapillarendothel nach Anwendung unterschiedlicher Konservierungs- verfahren im Rahmen der experimentellen Lungentransplantation (16, 23) feinstrukturell fihnlich emp- findlich zu sein wie nach eigenen Untersuchungen bei der klinischen HTx (40).

Zur Konservierung der Spender- herzen wurde ausschliel31ich die HTK-L6sung (Custodiol ®, mit Per- fnsionsvolumina von 2000 bis 4000 ml) eingesetzt. Die klinisch sicher to- lerierbaren Gesamt-IschS_miezeiten konnten im Vergleich mit Miinche- ner Erfahrungen aus den 80er Jahren (15) yon etwa drei auf bis zu ffinf Stunden ausgedehnt werden. Dabei entsprachen die klinischen Ergeb- nisse denen der bereits eingangs an- gefiihrten international relevanten Zentren und Institutionen (4, 7, 8, 12).

Mit grol3er Motivation der betei- ligten Mitarbeiter war es m6glich, das in Tabelle 1 aufgeftihrte Proto- koll der Probenentnahme einschliel3- lich der Voruntersuchungen fiber mehr als drei Jahre in die klinische HTx zu integrieren. Aus operativen oder logistischen Gr/.inden war die Entnahme einzelner Biopsien bei bis zu 20% der Transplantationen nicht m6glich (vgl. Abb. 5). In den Vorun- tersuchungen fiel eine relativ grol3e inter- und intraindividuelle Streuung auf, besonders durch die inhomogenen, fokalen SchS, den, die im Rah- men des Hirntodes und der Intensiv- therapie mit endo- und exogen lo- kal erh6hten Katecholaminkonzen- trationen (48) aufgetretenen sind. Zur Reduktion der Probenvarianz wurden pro Untersuchungszeitpunkt fiblicherweise fiinf Proben semi- und ultradfinn geschnitten. Bei bis zu 10% der Schnitte lagen so schwer- wiegende Biopsie- bzw. Schnittkan- tenartefakte vor, dab diese von den Auswertungen ausgeschlossen werden mul3ten.

Aufgrund derartiger Artefakte wurde die Entnahmetechnik modifi- ziert, wie in Material und Methoden beschrieben. Bei entsprechender Vor- sicht im Umgang mit den Proben und Biopsaten sowie einer sofortigen Fixierung wurden technisch bedingte Schfiden minimiert. Unterschiedliche pathologisch-diagnostische Untersu- chungsverfahren, die je nach Fixie- rungsverfahren und Fragestellung

20 Zeitschrift for Herz-, Thorax- und Gef~igchirurgie. Band 11, Supplement 1 (1997) © Steinkopff Verlag 1997

Tab. 2 Pathologisch-diagnostische Untersuchungsverfahren bei unterschiedlicher Proben- fixierung

Art der Fixierung Technische Anmerkungen

Formalin-fixierte Proben

Routine-Histopathologie Ausreichende Probenzahl I~ Histochemie D,- Immunzytochemie

Morphometrie I~ PCR, (in situ-PCR) Schockgefrorene Proben

Kurze Fixierungszeiten Einheitliche Probenbehandlung m6glichst Phosphat-gepuffert

Histopathologie I~ Immunzytochemie

In situ-Hybridisierung RNA- (DNA-) Extraktion, Reverse Transkription

i~ PCR; South., North. Blot i~ Elektronenmikroskopie

Ffir abbildende Verfahren m6glichst mit Kryoprotektans

Ffir analytische Verfahren kein Kryoprotektans

im EM-Fixans auftauen Glutaraldehyd-Paraformaldehyd-fixierte Proben

~" Histopathologie Gepuffert (Osmolalitfit) Transmissions-EM Einheitliche Probenbehandlung

I~ Morphometrie/Stereologie Ausreichende Probenzahl ~- Analytische EM Besser kein Phosphatpuffer

Pathologisches Institut, Abt. Herzchirurgie, Universit~it Heidelberg 1996

eingesetzt werden k6nnen, sind in Tabelle 2 aufgeftihrt.

Schluflfolgerungen

In Formalin fixierte, in Paraffin einge- bettete Proben erm6glichen den Ein- satz mehrerer wesentlicher pathologisch-diagnostischer Untersuchungs- verfahren. An diesem Material werden die histopathologische Begutachtung mit Routine- und ggf. Sondeff~irbun- gen, histochemische und immunhistochemische Untersuchungen mit formaling~ingigen Antik6rpern (z. B. anti-CMV) durchgeffihrt. Zusfitzlich k6nnen je nach Fragestellung Mor- phometrie/Stereologie, PCR und In situ-PCR angeschlossen werden. Die technischen Voraussetzungen bzw. methodische Anmerkungen sind in Tabelle 2 aufgeffihrt.

Schockgefrorene Proben k6nnen ebenfalls fiir die Histopathologie herangezogen werden. Im wesentlichen werden diese Proben f/ir die Immunzy- tochemie mit nicht formaling~ingigen

Antik6rpern (z. B. gegen Zytokine, kardiotrope Viren) und die In situ-Hy- bridisierung eingesetzt. F fir eine bes- sere Strukturerhaltung ist das Schock- gefrieren in einem Kryoprotektans (z. B. Tissue-Tek ®) gfinstig. Ffir analytische Verfahren wie RNA- (DNA-) Extraktion, reverse Transkription, Flfissigkeitsphasen-PCR, Southern und Northern Blot sollten die Proben m6glichst ohne Kryoprotektans einge- froren werden. SchlieBlich k6nnen sofort schockgefrorene Proben auch ffir die Elektronenmikroskopie verwandt werden, wenn sie unmittelbar in das entsprechende Fixativ fiberffihrt und erst darin aufgetaut werden.

Die in einem gepufferten Glutaral- dehyd-Paraformaldehyd-Gemisch fixierten Proben k6nnen auch in Paraf- fin eingebettet werden, falls zu wenig formalin-fixiertes Material zur Verffi- gung steht. An diesem Material kann keine Immunhistochemie durchgeftihrt werden. Ublicherweise werden die Proben nach einer Posffixierung der Lipide in Kunststoff eingebettet. Licht- und elektronenmikroskopische

und vor allem morphometrische/stereologische Untersuchungen werden an den Semi- und Ultradfinnschnitten insbesondere im Hinblick auf extra-/ intrazellul/ire Flfissigkeitsverschie- bungen durchgeftihrt. Wenn bei der analytischen Elektronenmikroskopie (mittels Electron Spectroscopic Ima- ging, Electron Energy Loss Spectros- copy oder Energy Dispersive X-ray Microanalysis) Phosphor nachgewiesen werden soil, mul3 anstelle eines Phosphatpuffers z. B. ein Cacodylat- Puffer eingesetzt werden.

Im Rahmen der HTx empfiehlt es sich, Proben mit allen drei aufgeffihr- ten Verfahren zu fixieren. Nicht nur unmittelbar postoperativ, sondern auch im mittelfristigen und Langzeit- verlauftreten Fragen auf, die Untersu- chungen am vor Implantation gewonnen Material erforderlich machen, z. B. nach dem Nachweis yon fiber den Spender fibertragenen Erkrankungen/ Infektionen. Die elektronenmikroskopische Morphometrie erlaubt Korrela- tionen yon pathologischen Ver/inderungen des Spenderherzens mit klinischen Parametem. Mit der Isch/imiezeit z.B. korrelieren die Mitochon- drienschwellung der Kardiomyozyten und das Zell6dem der Kapillarendo- thelien (39). Die Mitochondrien- schwellung der Kardiomyozyten ist bereits nach 60 min postisch/imischer Reperfusion reversibel (vgl. Abb. 5A). Die Abnahme des Zell6dems der Ka- pillarendothelien kann jedoch erst in der ersten postoperativen Biopsie eine Woche nach HTx beobachtet werden (Oberl~inder J. und Schnabel Ph. A., unver6ffentlichte Ergebnisse). Korre- lationen mit der Anzahl und dem Schweregrad akuter AbstoBungsepi- soden im ersten postoperativen Jahr ergeben sich mit zwei Parametern. Das Zell6dem der Kardiomyozyten korreliert mit den myokardialen Abstol3un- gen nach der ,,working formulation" (3) der ISHLT (39). Der Prozentsatz an Kapillaren mit Erythrozyten sowohl nach Explantation als auch vor Implantation korreliert mit den vasku-

Ph. A. Schnabel et al. 21 Konventionelle und molekularpathologische Untersuchungen

1/iren mononukle / i ren Abstol3ungen (39). Somi t sind die S t ruk tu rp ro t ek - tion der K a r d i o m y o z y t e n und Kapi l - la rendothe l ien ( insbesondere im Hin- blick a u f die Pr/ivention von Zell- 6demen) und die vollst/ indige kard io - plegische , ,Aqui l ibr ie rung" (2) der kard ia len Mikroz i rku la t ion wesent- liche Ziele der Konserv ie rung yon Spenderherzen. Im f r / ihpos tope ra t iven Ver lauf sollten schockgef rorene P r o b e n en tnom- men werden, da nur an d iesem M a t e -

rial im Falle e iner humora l en Rejek- t ion I m m u n g l o b u l i n e und K omple - m e n t f a k t o r e n nachgewiesen werden k6nnen. Im Fal le einer D y s f u n k t i o n oder eines Versagens des Transp lan- tates kannen zusS.tzlich Z y t o k i n e u n d / o d e r Er reger nachgewiesen werden. Die E l e k t r o n e n m i k r o s k o p i e empf iehl t sich f r6h- und spf i topera- tiv nach H T x nur zu ausgewfihl ten Ze i tpunk ten , z. B. um zellul/ire Ver- / inderungen im R a h m e n von adap t i - ven (z. B. H ype r t roph i e ) ode r dege-

nerat iven Prozessen ( z B. Vaskulo- pathie) zu analysieren. Ffir Untersu- chungen zur Pa thogenese der unter- schiedl ichen akuten ode r chronischen Prozesse nach H T x sind mole- ku l a rpa tho log i s che Un te r suchungen an schockgef rorenen P roben erfor- derl ich. D u r c h geeignete E n t n a h m e - p ro toko l l e k a n n w/ihrend H T x (vgl. Tabel le 1) und pos tope ra t i v zu aus- gew/ihlten Z e i t p u n k t e n den unter- schiedl ichen Er fordern issen Rech- nung ge t ragen werden.

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Danksagung Die Autoren danken filr wertvolle Diskussionen fiber morphometrische Parameter Herrn Professor Dr. med. G. Mall, Pathologisches Insti- tut der StS_dtischen Kliniken Darmstadt, sowie Herrn Professor Dr. med. J. Rich- ter und Herrn Dr. med. H. Fehrenbach, Abt. Elektronenmikroskopie, Zentrum Anatomie der Georg-August-Universi- t/it G6ttingen, filr die medizinisch-technische Assistenz und fotografische Ar- beiten Frau Z. Antoni, Frau I. Appel, Herrn Dipl.-Ing. H. Derks, Frau G. Gorsberg, Frau B. Hilbert, Herrn J. Moyers, Herrn R Rieger, Frau J. Scheue- rer und Frau U. Sturm, Pathologisches Institut der Universitgt Heidelberg, und ffir die Unterstfitzung der Probenent- nahmen Herrn M. Heinen als Koordi- nator Herztransplantation, Abt. Herz- chirurgie der Universitfit Heidelberg sowie Herrn H. Ghaderipour. Frau S. G6- sele, Herrn M. Kurz, Herrn J. Oberl~inder, Herrn E. Rauchft,13 und Herrn A. Steinmann als Doktorandin/nen des Pa- thologischen Institutes der UniversitS.t Heidelberg. Einzelergebnisse dieser Ar- beit werden als Teile der Inauguraldis- sertationen von Herrn T. M. Bingold, Herrn A. Koch und Herrn B. Koch, Pa- thologisches Institut der Universitfit Heidelberg, eingereicht.