tatianaNoteLa funcin de una proteina esta directamente relacionada con su secuencia o estructura primaria, si se modifican algunos aa de la secuencia, la funcion de la prot se ve comprometida

tatianaNoteProteinas diferentes con funciones similares tienen estructura primaria similar

tatianaNotePara conocer el residuo aminoterminal de una proteina se puede usar la marcacion con compuestos como 1-fluoro-2,4 dinitrobenceno (FDNB), el cloruro de dansilo o cloruro de dabsilo seguida de hidrolisis. Este procedimiento informa la identidad del residuo amino terminal y el numero de polipeptidos que componen la proteina.

tatianaNoteOJO ver reacciones

tatianaNoteLa secuencia de un polipeptido completo se determina por el procedimiento de la degradacin de Edman en un instrumento denominado secuenciador que se encarga de hacer la mezcla correcta de reactivos para determinar la secuencia. Ver figura para reacciones

tatianaNoteLas proteinas con polipeptidos muy grandes deben romperse en pequeos fragmentos mediante mtodos qumicos o enzimticos para despues ser secuenciados por el procedimiento de Edman

tatianaNoteLos puentes disulfuro interfieren en la secuenciacin por lo que deben romperse con reduccion de DTT seguida de carboxilacin o por oxidacin con cido performico.

tatianaNoteLa cadena polipeptdica puede ser cortada en enlaces peptdicos especficos por proteasas o por qumicos.

tatianaNoteLa tripsina corta los enlaces peptdicos en los que el grupo carbonilo esta proporcionado por un residuo de lisina o arginina (Lys o Arg)

tatianaNoteSe puede identificar el fragmento carboxi terminal del polipeptido por ser el unico que no tendra una Lys o Arg carboxi terminal.

tatianaNoteLos fragmentos se separan por cromatografia o por electroforesis e se secuencian individualmente por el procedimiento de Edman.

tatianaNotepara determinar el orden de los fragmentos de tripsina se debe fragmentar el polipeptido intacto por otra proteasa o qumico (ejemplo el bromuro de ciangeno que solo tompe el enlace peptidico de los residuos Met que aporten el grupo carboxilo), secuenciar nuevamente los fragmentos y comparar con los fragmentos obtenidos con tripsina

tatianaNotesi la estructura primaria incluye puente disulfuro, su localizacin sera determinada una vez completada la secuenciacin. Se debe hacer una tripsinizacin sin romper los puentes disulfuro al polipeptido original y realizar una electroforesis, si existen puentes disulfuro deben reducir el numero de fragmento cuando comparado a la tripsinizacion de la proteina sin romper los puentes disulfuro

tatianaNoteEspectrometria de masas de desorcin/ionizacin por laser asisitida por matriz o MALDI MS

tatianaNoteESI MS espectrometria de masa de ionizacion por electrospray

tatianaNoteImportante para electiva en quimica