PELACAKAN AKTIVITAS ANTIKANKER TERHADAP TIGA SENYAWA SANTON TERPRENILASI DARI SPESIES GARCINIA

Oleh:

Dwi Oktaviani Jamil

(1406 100 062)

Dosen Pembimbing:

Prof.Dr.Taslim Ersam,MS.

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

ITS Surabaya 2010PAKTI

LATAR BELAKANG

PAKTI

KANKER

Sel kanker

Sel kanker

Pengobatan

Kemoterapi

Bahan bioaktif sintetis

Bahan bioaktif dari Isolasi Bahan Alam

TUMBUHAN

Hutan Tropika Indonesia

Senyawa Metabolit Sekunder

SantonANTIKANKER

Garcinia sp.

O

O

B A

•

PERMASALAHAN

TUJUAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas senyawa-senyawa santon terprenilasi yang diisolasi dari spesies Garcinia sebagai antikanker baru.

Santon Terprenilasi

ANTIKANKER

PAKTI

?

METODOLOGI

PAKTI

Alat:bak pemeliharaan hewan coba, gavage, seperangkat alat bedah, seperangkat alat gelas (labutakar, pipet tetes, mikro pipet, gelas ukur, gelas beaker, gelas arloji, tabung reaksi, corong gelas),mortar, mikropipet, rak tabung reaksi, penangas air, stirrer, botol semprot, waterbath, tabungmikro (Ependorf), lemari pendingin, digital pH meter (Inolab-WTW), neraca analitik (Sartoriusbasic P-160), tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi (Denley tipe BR 401), inkubator (memmert),spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), mikroskop cahaya (Nicon), hot plate, dan autoklaf(Gnatus).

Bahan:Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah senyawa terapi (1), senyawa terapi (2),senyawa terapi (3), tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar, PBS (Phospat BufferSaline), balok es, NaCl 0,9%, larutan stok MDA (malondialdehid), aquades, TCA 5%, HCl 1N, Na-tiobarbiturat, benzopiren, formaldehid 10%, etanol (80%, 90%, 95%, dan absolut), larutan xilol,parafin cair, antibodi primer anti-Rat-PCNA, p53 wild-type, dan Ras, antibodi sekunder Anti-Rabbit IgG Biotin labeled, kromogen DAB (diamino benzidine), H2O2, serum 2% BSA, pelarut SA-HRP (Strep Avidin-Horseradish Peroxidase), dan aquades steril.

METODOLOGI

Isolasi Senyawa*

-dikeringkan

-ekstraksi

-fraksinasi

-pemisahan/Pemurniaan

-penentuan struktur

*telah dilakukan pada penelitian sebelumnya

G. Tetranda & G. dulcis

Santon terprenilasi

PAKTI

Dibedah dan diambil organ paru

Dikonfirmasi jumlah radikal bebas (MDA)

Ekspresi PCNA, Ras, dan p53

-diadaptasi selama 7 hari-dikelompokkan menjadi 5 kelompok

Uji In vivoTikus Wistar

(berat badan 200-250 g)

K0 K2 K3 K4 K1

-Diinjeksi 4x (berselang sehari) secara intraperitorial dengan larutan benzopirendosis 200mg/kg BB) dan diinkubasi selama 30 hari

Kelompok tikus kanker B

Kelompok tikus kanker C

Kelompok tikus kanker D

Kelompok tikus kanker A

-Diobati 7x dengan senyawa (1)(dosis 100mg/kgBB)-Diinkubasi 7

hari.

-Diobati 7x dengan senyawa (2)(dosis 100mg/kgBB)-Diinkubasi 7 hari.

-Diobati 7x dengan senyawa (3)(dosis 100mg/kgBB)- Diinkubasi 7 hari.

PAKTI

- diperfusi dengan PBS pH 7,4- diambil, dipotong kecil-kecil, direndam dalam PBS pH 7,4- ditimbang 0,45 g- digerus dalam mortal yang diletakkan diatas balok es

1. Uji Malon dialdehida (MDA)a. Pembuatan homogenate paru

Tikus

- dibedah, diambil parunya

Paru

Homogenat

- ditambah 0,5 mL 0,9% NaCl dingin- dimasukkan dalam ependorf 1,5 mL- disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit

Supernatan

Uji MDA

PAKTI

- diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit- dibiarkan dalam suhu ruangan- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)

- dimasukkan dalam tabung reaksi kecil- ditambah 550 L aquades-ditambah 100 L 20% TCA- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N- dihomogenkan- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat- dihomogenkan- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit

b. Pembuatan kurva standar MDA

100 L larutan stok MDA dengankonsentrasi 0,1,2,3,4,5,6,7, dan 8 g/mL

Supernatan

Absorbansi larutan standart + kurva standart MDA

PAKTI

- diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit- dibiarkan dalam suhu ruangan- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)

- dimasukkan dalam tabung reaksi kecil- ditambah 550 L aquades-ditambah 100 L 20% TCA- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N- dihomogenkan- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat- dihomogenkan- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit

c. Preparasi sampel untuk pengukuran MDA

100 L supernatan paru

Supernatan

Absorbansi Sampel

PAKTI

-dimasukkan dalam larutan silol selama 20 menit, sebanyak 2 kali pada suhu ruang

-dimasukkan dalam larutan silol selama 30 menit pada suhu 60-63°C-dicelupkan dalam parafin cair-embedding blok parafin-didinginkan pada suhu 4°C

-diambil dan direndam dalam etanol 70% selama 24 jam-dimasukkan dalam etanol 80% selama 2 jam-dimasukkan dalam etanol 90% selama 20 menit-dimasukkan dalam etanol 95% selama 20 menit-dimasukkan dalam etanol absolut selama 20 menit dan diulangi sebanyak 3 kali

2.Pembuatan Gambaran Histologi Parua.Embedding Paru

Paru dalam formaldehid 10%

Paru hasil dehidrasi dengan etanol

Paru dalam blok parafin

PAKTI

- diiris dengan ukuran 5 μm-didinginkan pada suhu ruang (dimasukkan air) -dimasukkan dalam air hangat dengan suhu 38-40°C-diambil dengan objek glass-dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 38-40°C sampai kering-diinkubasi pada suhu 38-40°C selama 24 jam

b. Pembuatan Preparat Paru

Paru dalam blok parafin

Preparat paru disimpan pada suhu ruang

PAKTI

-dicelupkan dalam larutan silol 2x5 menit-dicelupkan dalam etanol bertingkat dimulai dari absolut, 95%, 90%, 80% dan 70% masing-masing 5 menit.-dicuci dengan aquades-dicuci dengan PBS pH 7,4-diaplikasi dengan 3% H2O2 selama 10 menit- dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-dibloking menggunakan serum 2% BSA selama 60 menit-diinkubasi dengan antibodi primer anti-Rat-p53; anti-Rat-PCNA; dan Ras semalam pada 4°C-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditetesi dengan antibodi sekunder berlabel biotin-diinkubasi selama 1 jam-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditambah dengan SA-HRP selama 40 menit-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditambah kromogen DAB -dibilas dengan aquades-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-dilakukan counterstaining dengan Mayer hematoxilen selama 10 menit-dicuci dengan air kran-dikering anginkan-diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x

c. Imunohistokimia Preparat Paru

Preparat paru

Aktivitas proliferasi sel ( skor p53; PCNA; dan Ras)

PAKTI

Hasil dan Pembahasan Senyawa santon terprenilsai diisolasi dari dua tumbuhan Garcinia, yaitu G.

tetranda dan G.dulcis.

Tiga senyawa santon terprenilasi terbagi menjadi 3 golongan yaitu:

santon monoprenilasi, santon diprenilasi, dan santon triprenilasi.

PAKTI

1,3,6-trihidroksi-7-metoksi-8-(prenil)-4-(geranil) santon (3)

Struktur tiga senyawa santon terprenilasi

O

OH OH

OH

HO

O

HO OH

OHO

O

MeO

1,4,5,7-tetrahidroksi-2(1,1 dimetil alil) santon (1)

α-mangostin (2)

OHHO O

OHO

MeO

PAKTI

Hewan uji diinjeksi dengan senyawa terapi, kemudian dibedah

dan diambill organ parunya.

PAKTI

Persiapan Hewan Uji

Gambar.1 Proses Pembedahan Hewan Coba

Uji MDA (malondialdehid) MDA dihasilkan akibat adanya stress oksidatif sel. Stress oksidasi sel sendiri

merupakan ketidak seimbangan antara antioksidan dengan radikal bebas yang ada dalam tubuh.

Pengukuran kadar MDA pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode tes thiobarbituric acid (TBA) yang dikembangkan oleh Alvarez dan Storey (1995).

hv+ H

PAKTI

Gambar.2 Reaksi Pembentukan Radikal benzopiren

Kromogen MDA-TBA

Pengukuran MDA dilakukan dengan mengukur absorbansi supernatan paru menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ= 533 nm

PAKTI

Gambar.3 Reaksi Pembentukan Kromogen MDA-TBA (merah muda)

konsentrasi

MDA

(µ g/mL) Absorbansi

0 0

1 0.168

2 0.224

3 0.278

4 0.382

5 0.445

6 0.533

7 0.642

8 0.711

Gambar. 4 Kurva Standar MDA

y = 0.084x + 0.039R² = 0.992

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 2 4 6 8 10

ab

sorb

an

si

konsentrasi (μg/mL)

Tabel.1 Data Absorbansi MDA Kurva standar

PAKTI

Pada penelitian ini digunakan kurva standar MDA untuk mengukur konsentrasi MDA pada hewan uji.

Tabel .2 Data absorbansi MDA hewan uji yang telah diobati dengan senyawa terapi

Kode

Kelompok

Kode

Senyawa

Terapi

Absorbansi [MDA]Rerata

[MDA]1 2 3 1 2 3

Biru 1 10,27 0,3 0,3 2,75 2,51 2,75 2,67

merah 1 10,27 0,3 0,3 2,75 2,87 2,99 2,87

merah biru 1 10,29 0,3 0,3 2,99 2,63 2,75 2,79

Biru 2 20,38 0,4 0,4 4,06 3,70 3,94 3,90

merah 2 20,36 0,4 0,4 3,82 3,82 3,70 3,78

merah biru 2 20,35 0,4 0,4 3,70 3,94 4,06 3,90

Biru 3 30,41 0,4 0,4 4,42 4,77 4,54 4,58

merah 3 30,45 0,5 0,5 4,89 5,25 5,01 5,05

merah biru 3 30,45 0,5 0,4 4,89 5,01 4,77 4,89

Kontrol negatif0,2 0,2 0,2 1,92 2,04 2,27 2,08

Kontrol positif0,52 0,5 0,6 5,73 5,85 6,20 5,92

Keterangan

Kontrol negatif : Tikus sehat

Kontrol positif : Tikus sakit

Uji MDA (malondialdehid)

2,78

3,86

4,84

PAKTI

Paru Tikus Sehat dan Sakit

Histologi paru tikus sehat dan tikus sakit (kanker).

Gambar .5 Histologi paru (a) tikus sehat dan (b) tikus sakit

(a) (b)

Sel terlihat kompakSel terlihat banyak

kerusakan

PAKTI

diamati menggunakan mikroskop cahayap53, PCNA, dan Ras

Imunohistokimia

aktivitas prolifersi akan ditunjukkan oleh inti yang berwarna kecoklatan.

PAKTI

Histologi paru yang mengekspresikan p53

(3)(2)(1)

(tikus sehat)(tikus sakit)

Gambar.6 histologi paru yang mengekspresikan p53

PAKTI

Histologi paru yang mengekspresikan PCNA

(tikus sakit) (tikus sehat)

(1) (2) (3)

Gambar.7 histologi paru yang mengekspresikan PCNA

PAKTI

Histologi paru yang mengekspresikan Ras

(tikus sakit) (tikus sehat)

(1) (2) (3)

Gambar.8 histologi paru yang mengekspresikan Ras

PAKTI

Imunohistokimia

Gambar.9 Data p53, PCNA, dan Ras untuk masing-masing senyawa terapi, kontrol negatif dan kontrol positif

PAKTI

Mekanisme Antikanker

B-X

B DNA B-DNA

X

X-B-DNA

B-X + DNA

Gamabr.10 Skema interaksi obat dan penyakit. Keterangan

X: santon; B: benzopiren; DNA: DNA di dalam tubuh

PAKTI

1

2

(kanker)

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian terhadap tiga senyawa santonterprenilasi yang berasal dari dua spesies Garciniamenunjukkan bahwa ketiga senyawa yang telah diuji kadarMDA dan ekspresi p53, PCNA, dan Ras poten sebagaiantikanker, dimana senyawa (1) lebih aktif dibandingkansenyawa lainnya. Hal ini ditunjukkan oleh nilai MDA senyawa(1) yang hampir sama dengan kontrol negatif dan data ekspresip53 menunjukkan nilai tertinggi pada uji imunohistokimia.

PAKTI

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk sifat toksisitas

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai hubunganstruktur dan aktivitas senyawa.

PAKTI

Ucapan Terimakasih

• Hibah Program Penelitian Guru Besar LPPM-ITS

• Lab. Kimia Organik ITS dan Lab. Biokimia Universitas Brawijaya

Malang

• Kelompok PAKTI

• Seluruh pihak yang berperan demi kelancaran seminar ini.

PAKTI

TERIMAKASIH

…….

PAKTI

PAKTI