Download docx - Penentuan Kadar Tirosin Dalam Protein

Laporan Praktikum Biokimia I

LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM BIOKIMIA

I. NOMOR PERCOBAAN : IX (SEMBILAN)

II. NAMA PERCOBAAN :

PENENTUAN KADAR TIROSIN

DALAM KASEIN

III. TUJUAN :

Menentukan kadar tirosin dalam kasein

serta dapat membuat kurva kalibrasinya.

IV. DASAR TEORI

Kadar protein yang terkandung dalam setiap bahan berbeda-beda. Karena

itu, pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan. Untuk dapat

menghitung kadar protein, maka diperlukan spektrofotometer dengan cara

penembakan sampel. Untuk itulah maka pada praktikum ini dilakukan percobaan

untuk menentukan kadar protein. Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida

dan enzim protease akan mengahasilkan asam amino karboksilat. Di sisi lain

protein dapat mengalami denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang

menimbulkan perubahan sifat fisika, kimia dan biologi.

Metode Spektrofotokopi dengan ultraviolet yang diserap bukan cahaya

tampak ultra ungu (ultraviolet). Dalam spektrofotokopi ultra ungu energii cahaya

tampak terserap digunakan untuk transfuse elektron. Karena energi cahaya

ultraviolet dapat menyebabkan transfuse elektron (Hendayana, 1997).

Protein juga memiliki molekul besar dengan bobot molekul bervariasi

antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim,

protein akan menghasilkan asam-asam amino. Protein mempunyai sifat yang

sangat dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organik.

Jenis asam amino yang kita gunakan adalah Tirosin dengan rumus :

Riska Ria Lestari (06101410016) 1


Tirosin adalah salah satu jenis asam amino dalam protein. Tirosin ini

mempunyai gugus fenol dan bersifat asam lemah. Tirosin dapat diperoleh dari

kasein, yaitu protein dalam keju atau susu.

Pada percobaan ini kita akan melakukan pemurnian tirosin dari kaseinnya

dengan melarutkan tirosin ke dalam berbagai larutan yang bersifat asam, alcohol,

maupun senyawa yang mengandung logam berat. Dengan demikian, kita harus

memperhatikan sifat-sifat protein antara lain :

1. ionisasi

seperti asam amino, protein juga larut dalam air akan membentuk ion yang

mempunyai muatan positif dan negative. Dalam suasanan asam molekul

protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan

membentuk ion negative. Pada titik isolistriknya protein mempunyai

muatan positif dan negative yang sama, sehingga tidak bergerak kea rah

elektroda positif maupun negative apabila ditempatkan diantara kedua

electrode tersebut. Ionisasi protein dapat digambarkan sebagai berikut :

protein+ H+ + +protein-

kation ion zwitter

Protein memiliki titik isolistrik yang berbeda-beda sebagaimana yang

tertera dalam table berikut :

Tabel Titik Isolistrik Berbagai Protein :

Protein Sumber pH isolistrik

Albumin telur Telur 4,55 – 4,90

Insulin Pancreas 5,3 – 5,35

Albumin serum Darah 4,88

Kasein Susu sapi 4,6

Gelatine Kulit sapi 4,8 – 4,85

Globulin serum Darah 5,4 – 5,5

Fibroin Sutera 2,0 – 2,4

Gliadin Terigu 6,5

Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada

umunya sifat fisika, dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik.



Pada pH diatas titik isolistrik protein bermuatan negative, sedangkan di

bawah titik isolistrik protein bermuatan negative.

Oleh karena itu untuk megendapkan protein dengan ion logam,

diperlukan pH larutan diatas titik isolistrik, sedangkan pengendapan oleh

ion negative memerlukan pH dibawah titik isolistrik. Ion-ion posisitf yang

mengendapkan protein antara lain ialah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, CU++,

dan Pb++, sedangkan ion negative yang dapat mengendapkan protein

adalah ion salisilat, triklorasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat.

Berdasarkan sifat tersebut putih teluratau susu dapat digunakan sebagai

antidotum atau penawar racun apabila orang keracunan logam berat.

2. Denaturasi

Protein akan mengalami koalgulasi apabila dipanaskan pada suhu 50oC

atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi apabila larutan protein berada pada

titik isolistriknya. Protein yang terdenaturasi pada titik isolistriknya masih

dapat alrut pada pH di luar titik isolistrik tersebut. Air ternyata diperlukan

untuk proses denaturasi oleh panas. Disamping pH, sushu tinggi dan ion

logam berat, denaturasi dapat pula terjadi oleh adanya gerakan mekanik,

alcohol aseton, eter dan detergen.

3. Viskositas.

Viskositas adalah tahanan yang timbul karena adanya gesekan antara

molekul-molekul di dalam zat cair yang mengalir. Suatu larutan protein

dalam air mempunyai viskositas atau kekentalan yang relative besar

daripada viskositas air sebagai pelarutnya.

4. Kristalisasi

Banyak protein yang telah diperoleh dalam bentuk kristal. Meskipun

demikian proses kristalisasi untuk berbagai jenis protein tidak selalu sama,

artinya ada yang dengan mudah dapat terkristalisasi, tetapi ada pula ynag

sukar.

5. Sistem Koloid

Molekul protein apabila dilarutkan dalam air mempunyai sifat koloid,

yang tidak dapat menembus membrane atau kertas perkamen.



Pemurnian Protein

Langkah awal yang dalam pemurnian protein ini ialah menentukan bahan

alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang

terkandung didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar

protein tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan

alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang

akan dimurnikan. Setelah itu protein akan dilarutkan ke dalam air atau pelarut

lainnya. Namun, disini juga harus diperhatikan sushu dan pH larutan agar tidak

merusak protein.

Dalam percobaan ini untuk menentukan kadar atau konsentrasi protein ini

kita menggunakan spectrometer yang berfunsgi untuk menentukan transmittan

maupun adsorbannya.

Tyrosin dapat diubah menjadi asam P-hidroksi fenil piruvat dengan cara

transaminasi. Reaksi ini berlangsung dengan bantuan enzim tyrosin ketoglutarat.

Selanjutnya melalui beberapa tahap reaksi asam P- hidroksi fenil piruvat diubah

menjadi asam fumarat dan asam astoasetat.

Tyrosin dapat dibentuk dari fenil alanin hidroksilasi sebagai katalis.Dalam

proses ini aada dua tahap, yaitu :

1. Tahap 1

Reduksi hidrobiopterin oleh NADPH menjadi tetra biobpterindan

2. Tahap 2

Reduksi O2 menjadi H2O dan pengubahan fenil alanin menjadi tyrosin

kemudian

menjadi hidrobiopterin kembali.



V. ALAT DAN BAHAN

1. ALAT

1. beker gelas

2. gelas ukur

3. pipet tetes

4. penangas air

5. refluks kondensor

6. pipet tetes

7. corong pemisah

8. pengaduk kaca

9. porselen

10. statif dan klem

11. erlenmeyer

12. spektometer

13. kuvet

14. neraca analitik

15. kaca arloji

16. labu bundar

17. penjepit kayu

2. BAHAN:

1. Kasein

2. Tirosin

3. NaOH 6 N 20 ml

4. H2SO4 7 N 30 ml

5. Larutan Tirosina standard 1

ml

6. HgSO4 (5%) 3 ml

7. H2SO4 5 N

8. H2SO4 7 N 2 ml

9. NaNO2 (0,2%) 2 ml

10. 12 ml air

VI. PROSEDUR PERCOBAAN

Hidrolisa 1,0 gr Kaseina dengan 20, 0 ml NaOH 6 N pada refluks

kondensor dalam penangas air selama 4 jam. Tambahkan hati-hati 30 ml H2SO4 7

N. campur. Tempatkan 1,0 ml hidrolisat ke dalam tabung yang bersih dan kering.

Pada tabung-tabung lain pipet masing-masing 1,0 ml larutan tirosina standard

dengan lima macam kadar yang berbeda. Tambahkan 3 ml HgSO4 5 % dalam

H2SO4 5 N pada semua tabung. Panaskan dalam penangas air yang mendidih

selama 10 menit. Dinginkan dan tambahkan ke dalam masing-masing tabung 2 ml

H2SO4 7 N dan 2 ml NaNO2 0,2 %. Campur dan tambahkan 12 ml air ke dalam

masing-masing tabung. Baca ekstingsinya pada spectrometer dengan λ maks = 470

nm.



VII. HASIL PENGAMATAN

Pengukuran % Transmittan larutan Tirosina Standar :

Kadar tyrosin

(%)

absorban

1 0.007

2 0.013

3 0.017

4 0.021

5 0.055

VIII. Analisa Data

Perhitungan regresi linier konsentrasi terhadap adsorbannya :

X = konsentrasi

Y = Adsorban

X Y XY X2

1 0.007 0,007 12 0.013 0,026 43 0.017 0,051 94 0.021 0,084 165 0.055 0,275 25

∑ ¿15 0,113 0,443 55

N . XY - X . Y Slope =

N . X2 – (X)2

5 . 0,443 – 15 . 0,113 =

5 . 55 – (15)2

2,215 – 1,695 =

275 – 225

= 0,0104



Y . X2 - X . XY Intersep =

N . X2 – (X)2

0,113 . 55 – 15 . 0,443 =

5 . 55 – (15)2

6,215 – 6,645 = = - 0,0086

275 – 225

Maka diperoleh persamaan regresi linier :

Y = AX + B

Y = 0,0104 X + (-0,0086)

X 0 1 2 3 4 5

Y -0,0086 0,0018 0,0122 0,0226 0,033 0,0434



Tabel Hasil Persamaan Regresi



IX. REAKSI

X. PEMBAHASAN



Percobaan ini merupakan penentuan kadar tyrosein dalam kasein, dengan

cara membandingkan hidrolisat kasein dengan larutan standar yang telah dibuat

dan diukur mengunakan spektrometer UV/Vis. Hidrolisat yang dimaksud adalah

larutan yang terdiri dari 1 mg kasein yang direfluks dengan 20 ml NaOH 6 N yang

kemudian ditambah sedikit demi sedikit H2SO4 7 N. Setelah 4 jam di refluks,

hidrolisat diambil sebanyak 1 ml dan dicampur dengan larutan Tyrosin standar

yng berbeda konsentrasi. Larutan tyrosin staandar yang berbeda konsentrasi

tersebut bertujuan untuk mendapatkan adsorbansi yang berbeda-beda sehingga

dapat memprediksi absorbansi sampel kasein.

Kasein yang digunakan dalam percobaan ini merupakan hasil yang

didapatkan dari hasil percobaan sebelumnya yang kemudian diteruskan untuk

dilakukan pengujian terhadap kadar tirosinnya.

Proses refluks menggunakan suhu konstan yang berkisar 40 oC. Hal ini

dikarenakan protein mengalami denaturasi pada suhu 40 oC, dimana protein atau

asam nukleat kehilangan struktur tersier dan struktur sekunder dengan penerapan

beberapa tekanan eksternal atau senyawa, jika protein dalam sel protein sel hidup

didenaturasi menyebabkan gangguan terhadap aktivitas sel dan kemungkinan

kematian sel. Pada proses ini diharapkan kandungan tirosin dalam kasein

mengalami pemisahan sehingga dapat ditentukan kadarnya.

Saat kasein dihidrolisa dengan NaOH, kasein akan tercampur dan terikat

secara sempurna dalam suhu yang stabil sehingga larutan bersifat basa. Hal seperti

ini dapat terjadi karena konsentrasi (HO-) yang tinggi mampu mengikat ion-ion H+

yang terdapat pada gugus –NH3+ . Dan ketika larutan ditambahkan dengan asam

sulfat, maka akan terjadi pengikatan asam oleh basa dalam larutan kasein itu.

Refluks dilakukan selama 4 jam, dari hasil refluks didapatkan larutan yang bening

tak berwarna.

Kemudian larutan standar tirosin ditambahkan dengan HgSO4 5 % dalam

H2SO4 5 N dengan kadar konsentrasi yang berbeda pada 5 tabung. Hal ini

bertujuan untuk mengendapkan protein dengan ion logam positif yaitu Hg++.

Penambahan H2SO4 pada larutan protein akan menyebabkan struktur molekul

asam amino. Hal ini terjadi karena konsentrasi H+ yang tinggi mampu berikatan



dengan ion –COO-, sehingga membentuk gugus –COOH. Setelah itu larutan yang

telah dicampurkan dengan kadar yang berbeda dipanaskan menggunakan

penangas air yang mendidih selama 10 menit dan untuk selanjutnya dinginkan

lalu tambahkan ke dalam masing-masing tabung tadi H2SO4 dan NaNO2.

Penambahan NaNO2 pada larutan tirosin bertujuan untuk memberikan

warna. Warna yang terjadi akibat penambahan NaNO2 yaitu terjadinya warna

merah pada larutan protein. Adanya warna merah pada larutan protein ini karena

kita akan menghitung adsorban pada larutan protein dengan menggunakan

spektrofotometer. Karena alat spektrofotometer ini menggunakan cahaya UV-Vis

yang menggunakan warna dalam penganalisisannya. Dari hasil pengukuran

diperoleh harga absorbansi yang sebanding lurus dengan konsentrasi larutan.

Semakin besar konsentrasi larutan maka harga absorbansinya semakin besar.

Pengukuran absorbansi larutan ini harus dilakukan dengan cepat karena jika

larutan dibiarkan terlalu lama hal ini akan mengubah warna larutan karena adanya

reaksi dengan lingkungan.

XI. Kesimpulan



1. Berdasarkan hasil pengamatan,semakin besar konsentrasi larutan asam

amino maka semakin besar pula nilai adsorbannya.

2. Semakin besar konsentrasi larutan tirosin yang digunakan, maka warna

yang ditimbulkan akan semakin pekat, sesuai dengan semakin besarnya

kuantitas analit yang ada dalam larutan.

3. Proses kondensasi menggunakan suhu konstan yakni 40oC

4. Alat spektrofotometer ini menggunakan cahaya UV-Vis yang

menggunakan warna dalam penganalisisannya.

5. Pengukuran absorbansi larutan dengan menggunakan spektrometri ini

harus dilakukan dengan cepat karena jika didiamkan terlalu lama akan

mempengaruhi hasil pengamatan yang didapat karena warna larutan akan

berubah seiring dengan bereaksinya dengan udara luar.

6. Penambahan NaNO2 bertujuan untuk mengubah larutan yang awalnya

bening pada saat penambahan dengan H2SO4 menjadi kemerahan saat

penambahan NaNO2.

7. Dari hasil pengukuran diperoleh harga absorbansi yang sebanding lurus

dengan konsentrasi larutan. Semakin besar konsentrasi larutan maka harga

absorbansinya semakin besar.

8. Kondensor merupakan tempat terjadinya proses kondensasi dimana pada

saat larutan menguap menjadi cair uapnya tidak keluar atau pun habis.

XII. DAFTAR PUSTAKA



Arbianto, Purwo. 1993. Biokimia Konsep-Konsep Dasar. Bandung:ITB

Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta :UI Press

Martoharsono, Soeharsono. 1998. Biokimia Jilid 1. Yogyakarta :Gajah Mada University Press .

Pudjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta:Universitas Indonesia

Sukaryawan, Made. 2011. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Sriwijaya:Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan.

XIII. GAMBAR ALAT



1. beker gelas

2. gelas ukur

3. pipet tetes

4. penangas air

5. kondensor

6. corong pemisah

7. pengaduk kaca

8. porselen



9. statif dan klem

10. erlenmeyer

11. spektometer

12. kuvet

13. neraca analitik

14. kaca arloji

15. pembakar bunsen

16. kaki tiga penyangga

17. kawat kasa



18. labu bundar

19. penjepit tabung
