Download ppt - Riparazione del danno da radiazione al DNA Esame di Radiobiologia Scuola di Specializzazione in Fisica Sanitaria A.A. 2003-2004 Antonella Roggio

Riparazione del danno da radiazione al DNA

Esame di Radiobiologia

Scuola di Specializzazione in Fisica Sanitaria

A.A. 2003-2004Antonella Roggio

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Mutazione = Danno - Riparazione

Cause di mutazioni

• Errori naturali endogeni al DNA• Danni esogeni al DNA (agenti fisici o chimici)• Riparazione del DNA tendente all’errore

Le mutazioni del DNA possono essere il risultato di danno al DNA non riparato o

mal riparato

La riparazione del DNA danneggiato ha una funzione centrale non solo nella protezione del genoma ma anche nella generazione della

diversità genetica.*

* Nilsen- Krokan “Base excision repair in a network of defence and tolerance” Carcinogenesis, Vol. 22, No. 7, 987-998, July 2001

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Survival of a species depends on balanced generation of genetic variation but at the same time on the protection of the genome from changes that cause disease and fitness reduction. DNA repair pathways limit mutations but do not totally eliminate them. In fact, some DNA repair pathways are error prone. La sopravvivenza di una specie dipende dall'equilibrio che si stabiliscee tra la generazione di "variazioni"genetiche e la protezione del genoma dalle cause che provocano danniI processi di riparazione del DNA limitano le mutazioni ma non le eliminano del tutto. à bisogna anche considerare infatti che ci sono dei processi riparativi tendenti all’errore. DNA repair thus has a central function not only in protecting the genome, but also in the generation of genetic diversity.

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Base excision repair in a network of defence and tolerance Carcinogenesis, Vol. 22, No. 7, 987-998, July 2001© 2001 Oxford University Press Hilde Nilsen,1 and Hans E. Krokan,2 Institute of Cancer Research and Molecular Biology, Norwegian University of Science and Technology, N-7489 Trondheim, Norway

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Perché proprio il DNA?

È più radiosensibile il nucleo o il citoplasma?

È possibile provocare la morte cellulare irraggiando solo l’uno o l’altro?

Il nucleo è 100 volte più radiosensibile del citoplasma per quanto concerne l’effetto letale

Solo quando la dose al citoplasma è molto elevata si può verificare la morte della cellula

È possibile uccidere le cellule e provocare altri tipi di danno irradiando il citoplasma ma è più semplice ottenere lo stesso effetto con

l’irradiazione del nucleo

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Sono stati effettuati degli esperimenti per distinguere se fosse più radiosensibile il nucleo o il citoplasma e se fosse possibile provocare la morte cellulare irraggiando solo l’uno o l’altro.

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Questa era una conclusione “ovvia” perché molte delle manifestazioni del danno da RI sono intimamente legate alla funzione del nucleo:danno cromosomico, ritardo nell’inizio della mitosi, inibizione deella mitosi e divisione cellulare (morte cellulare) inibizione di sintesi DNA.Inoltre in biologia si ritiene che il DNA contenga la maggior parte delle informazioni per i processi cellulari, quindi un danno a suo carico non può essere di secondaria importanza

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per uccidere il 63% di una popolazione cellulare (mammifero) sono necessari 1-2 Gy;nei virus invece ce ne vogliono 500.questi sono valori di dose al DNA.

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una cellula in vitro si definisce morta quando non è + capace a produrre una colonia di 32-64 cellule...è una colonia macroscopica!!!

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Come è “fatto” il DNA

NUCLEOTIDE

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L'unità fondamentale costituente il DNA e il nucleotide che a sua volta è costituito da un grupo fosforico, una base azotata e uno zucchero.Lo zucchero è il desossiribosio, la base può essere una Purina (A, T) o una Pirimidina (C,G)

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• Evento fisico: Radiazioni x, γ, UV o particelle cariche di alta energia ionizzano la materia biologica cedendo energia [Dose = ΔE/Δm].

• Evento radiochimico: Formazione di radicali liberi

• Evento biologico: Danno a carico di molecole biologicamente importanti come acidi nucleici, membrane, etc.

Danno al DNA

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Principali Tipi di Danno al DNA

• Danno alle basi• Danno ai nucleotidi• SSB• DSB • Ponti di collegamento

Ionizing Radiation

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Ionizing radiation produces a wide spectrum of DNA lesions, such as: base damage, sugar damage, single strand breaks (SSB), double strand breaks (DSB), DNA-DNA and DNA-protein cross links.

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Morte 2/3 di una popolazione cellulare (mammifero)Una dose di 1 ÷ 2 Gy

• Tutte le cellule hanno subito elevato numero di distruzione di basi

• 1000 SSB

• 50 DSB

Le rimanenti cellule hanno riparato un elevato numero di lesioni o sono in grado di sopravvivere con un genoma lesionato

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LET e Distribuzione del Danno nel DNA

Il tipo e la distribuzione spaziale delle lesioni dipende dalla qualità della radiazione.

Basso LET

•Le tracce della radiazione sono uniformemente distribuite entro il nucleo

•Distruzione di basi, nucleotidi, SSB

Alto LET

•Le tracce della radiazione sono “raggruppate” entro il nucleo

• DSB

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Cos è la riparazione ?

È presente in tutti gli organismi studiati: batteri, lieviti, drosophila, pesci, anfibi, roditori e uomini.

È un processo di difesa nei confronti di un danno

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DNA repair is involved in processes that minimize cell killling, mutations, replication errors, persistence of DNA damage and genomic instability. Abnormalities in these processes have been implicated in cancer and aging (Figure 1). invecchiamento

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Modi o tipi di riparazione

Riparazione esente da errore

Riparazione tendente all’errore

Mancata Riparazione

Non causa letalità o mutazioni

Può provocare mutazioni non letali o

letali

La mancata riparazione è letale

La cellula sopravvive Insorgenza di neoplasie Morte cellulare

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Lesioni a carico della Timina

Correlazione lineare con la dose

Insorge attraverso l’interazione con radicali liberi acquosi come l’OH•

Nelle cellule di mammifero è più frequente delle SSB (rotture di catena singola).

Incapacità nella riparazione alcuni tipi di danno alle basi

atassia-telangiectasia (AT)

Danno alle basi

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Short Patch Repair

Rimuove la singola base danneggiata

Damaged Base

Abasic Site

DNA Polymerase bXRCC1

DNA Ligase III

DNA Glycoslyase

AP endonuclease

DNA Pol /PCNA

FEN1DNA Ligase I

Short Patch Repair Long Patch Repair

Long Patch Repair

Rimuove 2 ÷ 10 nucleotidi

Base excision repair - BERRiparazione mediante asportazione

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Nel processo di BER gli enzimi coinvolti sono diversi:La DNA-glicosilasi riconosce la base danneggiata, si lega al DNA e lo piega, facendo saltare via la base danneggiata.Si generano, rimuovendo le basi, dei siti apurinici o apirimidinici APAP endonucleasi rompe lo scheletro fosfodiesterico accanto al sito AP Il rimpiazzamento della base corretta avviene ad opera della DNA-polimerasi che avvia la nuova sintesi. DNA-ligasi effettua il legane tra il nuovo nucleotide e DNA

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Nucleotide Excision Repair (NER)nell’uomo

• Una nucleasi di escissione si lega al DNA nei pressi della lesione e taglia il filamento in entrambi i punti ai lati della lesione.

• Il frammento viene rimosso dalla DNA-elicasi

• Il segmento mancante viene colmato dalla DNA-polimerasi

• Infine viene unito al DNA dalla DNA-ligasi

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Single Strand Break — SSB

Nro SSBs Dose [0.2Gy – 60 MGy]Per quanto piccola la dose si

verificheranno sempre delle SSBs !

Radiazioni Ionizzanti di basso LET

10 ÷ 20 eV per 1 rottura

Riparazione mediante asportazione

• Tecnica rapida ed efficiente – esente da errori

• Nelle cellule di mammifero la velocità di riparazione mediante escissione è esponenziale

• Il processo è controllato enzimaticamente e dipende dalla temperatura: a 0° non avvengono riparazioni.

• Le SSBs non riparate possono prendere parte alla formazione di DBSs.

Nro SSBs indotte attraverso radicali liberiIn condizioni di ipossia il Nro SSBs

si riduce a 1/3

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cmq il valore dell'energia necessaria per produrre una rottura è influenzato da fattoroi biochimiciex. Radicali liberi OH°

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la metà delle SSBs introdotte da radiazioni è viene riparata entro 15 minuti. Poiché gran parte delle rotture vengono riparate anche in cellule letalmente irradiate, si ritiene che esse siano determinanti di morte cellulare molto meno che le rotture di catena doppia o distruzione di basi.

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Viene asportato il tratto di catena contenente il frammento deficitario di DNA e viene utilizzata il filamento non alterato complementare della catena per la

risintesi del nuovo tratto di DNA.

Riparazione mediante asportazione delle SSBs

• Riconoscimento della sede del danno e

incisione (endonucleasi)

• Risintesi (DNA-polimerasi)

• Asportazione della lesione (esonucleasi)

• Unione (ligasi)

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vedi COOGLE

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Rotture di catena doppia — DSBs

Il rapporto tra dose e numero di DSBs indotte lineare-quadratico

Possono prodursi per evento singolo ionizzante o per la coincidenza di casuali rotture della catena su catene complementari.

OGGI: È possibile una riparazione “tendente all’errore”

Si può solo stabilire se le estremità libere di una molecola di DNA frammentata si sono riunite; non si può stabilire se l’accoppiamento originario di basi è ripristinato.

La sequenza di basi nucleotidiche può non essere disponibile sull’una o sull’altra catena e può non esservi continuità tra le due “estremità libere”

!

IERI: Le DSBs non possono essere riparate e sono necessariamente letali !!!

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Il rapporto tra dose e numero di DSBs indotte non è ben chiaro, almeno nelle cellule di mammifero: relazione lineare relazione lineare-quadratica

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Sistemi di riparazione delle DSBnelle cellule di mammifero

NHEJ HR SSA

• fase G0 e G1 del ciclo cellulare

• ci può essere una perdita dell’ informazione genetica — error prone

• cellule meiotiche

• cellule mitotiche in fase di Replicazione del ciclo cellulare

• riparazione esente da errore — error free

Può essere vista come una variante dell’ HR

In un genoma complesso, dove non tutti i nucleotidi sono codificanti, il rischio

associato alla perdita di informazioni per una

riparazione non esente da errore è inferiore a quello che si corre se la cellula

entrasse nella fase S o M col DNA non riparato

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NHEJ

DNA-PK = DNA-PKcs Ku+

XRCC4

DNA-Ligasi IV

!Cellule che mancano di

DNA-PKcs o Ku o XRCC4 sono più radiosensibili e

difettose nella riparazione delle DSBs

XRCC4 esiste in un complesso con la DNA-ligasi IV

L’interazione di quest’ultima con XRCC4 stimola l’azione di “ligasi”

e forse anche di annealing

Cellule che mancano di XRCC4 hanno un basso

livello di DNA-ligasi IV morte per apoptosi

!

Pro

tein

e co

invo

lte

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La proteina DNA-PK è composta da una subunità catalitica DNA-PKcs e da una proteina eterodimera Ku che ha una alta affinità con le estremità libere dei filamenti del DNA

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l’eterodimero Ku70/80 si lega alle estremità del DNA in corrispondenza della rottura, interagisce con la subunità catalittica PKcs attivandola e legandosi ad essa per formare il complesso DNA-PKSi forma una Sinapsi quando le due molecole di PKcs, ciascuna a una estremità della DSB, mantengono unite le due parti terminali libere del DNA, funzionando come una "struttura di supporto" per l'assemblaggio di altre componenti del complesso sistema di riparo Per il processamento delle parti finali libere del DNA e l'allineamento omologo sono necessari altri enzimi: esonucleasi ed elicasi. avviene il legame tra le estremità del DNA mediante il complesso XRCC4/DNAligasiIV (processo non ancora del tutto chiaro) il complesso XRCC4/DNA ligasi IV è interagisce con il complesso DNA-PK e opera la giunzione avviene il rilascio di tutto la “macchina” proteica

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HR

•Rad52 riconosce la sede del danno e si lega alle estremità danneggiate dei filamenti del DNA

•Il complesso endonucleasico taglia dei segmenti di DNA

Si ottengono due singole code

•Una coda invade il filamento fratello del DNA non danneggiato generando una struttura D-loop

•L’altra può anch’essa invadere il filamento fratello o legarsi semplicemente all’altro capo del filamento del DNA danneggiato

•Si formano dei legami (giunzioni di Holliday) tra i filamenti appartenenti alla sequenza danneggiata e a quella sana.

•Le informazioni mancanti nel sito della DSB vengono recuperate da una nuova sintesi del DNA.

Proteine coinvolte

• Rad 52

• Complesso endonucleasico Nbs1-Mre11-Rad50

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SSA

Proteine coinvolte

• Rad 52

• Complesso endonucleasico Nbs1-Mre11-Rad50

La riparazione avviene attraverso l’annealing delle sequenze complementari su entrambi i siti di rottura.

! Nella ricerca delle sequenze omologhe da appaiare produce la perdita di larghi frammenti !

Riparazione non esente da errore

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Sindromi associate alla mancanza o alterazione di geni coinvolti nel processo di riparazione delle DSB

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Nilsen- Krokan Base excision repair in a network of defence and tolerance Carcinogenesis, Vol. 22, No. 7, 987-998, July 2001

S.P. Lees-Miller, K. Meek Repair of DNA double strand breaks by non-homologous end joining, Biochimie 85 (2003) 1161–1173

Andrej Dudáš, Miroslav Chovanec, Review DNA double-strand break repair by homologous recombination, Mutation Research 566 (2004) 131–167

Peter Karran, DNA double strand break repair in mammalian cells

• Belli, Sapora, Tabocchini Molecular targets in cellular response to ionizing radiation andimplications in space radiation protection

Coggle, Effetti Biologici delle radiazioni, Ed. Minerva Medica, Torino 1998

Stephen P. Jackson Sensing and repairing DNA double-strand breaks, Carcinogenesis, Vol. 23, No. 5, 687-696, May 2002

www.users.rcn/jkinball.ma.ultranet/BiologyPages

Gary Roberts , DNA repair mechanisms, Cap.III: DNA repair mechanisms. Edited by Timothy Paustian, University of Wisconins-Madison ©2003

• Boreham, Cellular Defense Mechanisms Against the Biological Effects of Ionizing Radiation , IRPA-10, May 2000 Hiroshima, Japan

Bibliografia

BER

Strand Break

5’ Exonuclease Activity

Recombination with intact strand

New DNA Synthesis

DNA strand unwound annealed and ligated

HR

SSA

1. l’eterodimero Ku70/80 si lega alle estremità del DNA in corrispondenza della rottura, interagisce con la subunità catalittica PKcs attivandola e legandosi ad essa per formare il complesso DNA-PK

2. Si forma una Sinapsi quando le due molecole di PKcs, ciascuna a una estremità della DSB, mantengono unite le due parti terminali libere del DNA, funzionando come una "struttura di supporto" per l'assemblaggio di altre componenti del complesso sistema di riparo

3. Per il processamento delle parti finali libere del DNA e l'allineamento omologo sono necessari altri enzimi: esonucleasi ed elicasi.

4. avviene il legame tra le estremità del DNA mediante il complesso XRCC4/DNAligasiIV (processo non ancora del tutto chiaro)

5. il complesso XRCC4/DNA ligasi IV è interagisce con il complesso DNA-PK e opera la giunzione

6. avviene il rilascio di tutto la “macchina” proteica

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Danno alle membrane

Danno al reticolo endoplasmatico

Danno ai lisosomi

Danno ai mitocondri??