Biochemie A: eiwitten en enzymenHoorcollege 1 & 2 Algemene opbouw eiwitten, hemoglobine en myoglobineEiwittenPrimaire structuurEiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren. Deze aminozuren bestaan allemaal uit dezelfde basisformule:
De basisformule bestaat uit een tetrader met daaraan een aminogroep (NH2), een carboxylgroep (COOH), een waterstof (H) en een restgroep (R). De C in het midden is een asymmetrisch koolstof atoom (C).De R groep is de rest groep en is voor elk aminozuur verschillend. De zijgroepen zijn zeer bepalend voor de functie en de vorm van een eiwit. De aminozuren zijn gekoppeld door een peptide binding. Deze binding zit tussen de aminogroep (NH-groep) van het ene aminozuur en de carboxy groep van het andere aminozuur. Deze binding ligt samen met de twee C-atomen in een plat vlak. Dit is de primaire structuur: de lineaire aaneenschakeling van een specifieke volgorde van aminozuren.
De primaire structuur is zeer belangrijk voor de vorming van de secundaire structuur. Om een secundaire structuur te vormen zijn er een paar belangrijke dingen: Disulfide bindingen. 2 cystenes die bij elkaar in de buurt komen, kunnen onder oxiderende omstandigheden een zwavelbrug vormen. Deze zwavelbrug is een covalente binding. Het kan optreden binnen een eiwit. Op deze manier kan de lineaire structuur dus worden gevouwen. De peptide binding is niet zo goed draaibaar. Dit komt door resonantie. Resonantie is het steeds overklappen van een dubbele binding. Bij een peptide binding vindt dit plaats tussen de dubbel gebonden O en de peptide binding. Dit zorgt voor stijfheid van de peptide binding. De draaiing kan wel plaatsvinden tussen het C atoom en de amino of carboxy groep. Een amino en een carboxyl groep kunnen waterstof bruggen vormen. Niet binnen een aminozuur, maar wel tussen aminozuren. Dit is de belangrijkste parameter voor het vormen van een secundaire structuur.Secundaire structuurEen vorm van secundaire structuur is de helix. Dit is een rechtsdraaiende helix. Hierbij steken de zijgroepen naar buiten. Er is maar weinig ruimte tussen de aminozuren, het is dus een compacte structuur. Er zijn 3,6 residuen per winding. Alle hoofdketengroepen, dus carboxy en amino groepen, vormen waterstofbruggen. De waterstofbrug wordt gevormd met een aminozuur wat 4 aminozuren verder op ligt. O uit de carboxy groep maakt een waterstofbrug met een rechts liggende NH-groep dat dus 4 residuen verder op ligt. Door deze waterstofbruggen ontstaat de helix.
Niet alle aminozuren kunnen in een helix. Wanneer het hele grote zijgroepen heeft, kan er geen compacte vouwing meer plaatsvinden. Dit wordt sterische hindering genoemd. Dit gaat vaak om vertakte zijketens of zijketens met grote cyclische verbindingen (V,T,I,S,D,N,P). De aminozuren valine, threonine, isoleucine, serine, aspartaat, asparagine en proline kunnen niet in de -helix.
Een andere secundaire structuur is de sheet of vouwblad structuur. Dit wordt weergegeven met pijlen. Hier zit meer ruimte tussen de aminozuren, dus is het een vrijere structuur. Bij deze structuur gaan alle carboxy groepen waterstofbruggen aan met amino groepen. Het is geen systematische binding. Het is dus niet te voorspellen welke carboxy met welke amino bindt. Er zijn 2 vormen van sheets: parallel en antiparallel. Antiparallel gaat van carboxy naar amino en terug (of andersom). Bij parallel gaan allebei de ketens dezelfde kant op. Dus van carboxy naar amino, via een loop weer terug en weer van carboxy naar amino. antiparallelparallel
een sheet kan bestaan uit parallel en antiparallel door elkaar. Een eiwit bestaat uit een mix van helices en sheets. Deze worden gelinkt in de 3D structuur via loops. Dit zijn ongestructureerde delen van het eiwit, maar dit zorgt puur voor een goede structuur. Daarnaast zijn er ook speciale vormen van helices, bijvoorbeeld de coiled-coils helices. Daarvan wordt keratine gevormd (en dus bijvoorbeeld je haar). Dit zijn helices die om elkaar heen zijn gedraaid en deze zijn ook verbonden met waterstofbruggen.Tertiaire structuurDit is de 3D structuur van het eiwit met de interacties tussen de helices en de sheets. Over het algemeen zitten aan de buitenkant de hydrofiele aminozuren en aan de binnenkant de hydrofobe aminozuren. Dat aan de binnenkant het hydrofoob is en aan de buitenkant hydrofiel, noemt men amfipatisch, eiwitten zijn dus amfipatisch. De vouwing van het eiwit wordt bepaald door de volgorde van de aminozuursequentie en dit zorgt weer voor specifieke interacties tussen helices en sheets, waardoor het eiwit vouwt. De interacties tussen helices en sheets kunnen disulfide bindingen, vanderwaals binding, H bruggen of covalente bindingen zijn. Het is echter niet te voorspellen hoe een eiwit vouwt. De structuur kan alleen experimenteel worden bepaald.
Wanneer het eiwit is gevormd kan het nog verder gemodificeerd worden, dit worden posttranslationele modificaties genoemd. Een voorbeeld is fosforylering. Hierbij wordt een fosfaatgroep op serine, threonine of tyrosine gezet, want deze bevatten een OH groep. Quaternaire structuurHierbij gaan eiwitten met verschillende andere eiwitten interacties aan om een functioneel complex te vormen. Dit zijn bijvoorbeeld dimeren, hierbij gaan 2 eiwitten met elkaar een interactie aan. Er zijn homodimeren (2 dezelfde eiwitten) en heterodimeren (2 verschillende eiwitten). Sommige eiwitten kunnen enkel functioneel zijn wanneer deze plaats hebben in een complex, anders worden ze afgebroken omdat ze instabiel zijn. MyoglobineMyoglobine is 1 subunit en bestaat uit helices. Het is een spiereiwit en heeft als belangrijkste functie het opslaan van zuurstof in de spieren en de weefsels. Dit is een van de eerste waarvan de kristal structuur is ontdekt. De helices zijn gelinkt door loops en verder heeft het een globulaire vorm. Aan de binnenkant van het eiwit zit een hydrofobe holte en daarin zit een prosthetische groep genaamd heem. Een prosthetische groep is een niet eiwit onderdeel, maar wat wel deel uit maakt van het eiwit. Het is noodzakelijk dat deze groep er is.
In heem zit een ijzer molecuul en dit bindt zuurstof. Het molecuul heem wordt ook wel een ijzer protoporphyrine genoemd. Het bestaat uit een aantal amino groepen gebonden aan het ijzer en aan die groepen zitten cyclische groepen. Een kant met zijketens (onder) zijn hydrofoob en willen dus in het eiwit zitten, de andere 2 zijketens zijn hydrofiel (2x COO, boven). Dit zorgt ervoor dat heem op de juiste manier in myoglobine zit.
De heem groep wordt op zijn plek gehouden door een proximale histidine. Dit is een histidine die uit de helix steekt van myoglobine. Daarnaast is er ook een distale histidine en deze is van belang bij het binden van zuurstof aan myoglobine. In het midden van de heem groep zit het ijzer gebonden aan de 4 cyclische structuren. Met de 5e binding zit het ijzer vast aan de amino groep van de proximale histidine. Met de 6e bindingsplek kan het ijzer zuurstof binden. Door de binding van zuurstof aan ijzer kan het zuurstof nu waterstofbruggen vormen met de distale histidine. Doordat dat gebeurd wordt de ijzer een beetje omhoog getrokken, zodat het in het vlak ligt van de heem groep. Daardoor wordt ook de proximale histidine omhoog getrokken en dit is belangrijk voor de functie van de globines. Wanneer zuurstof aan hemoglobine of myoglobine is gebonden, wordt het oxyhemoglobine of oxymyoglobine genoemd. HemoglobineDit bestaat uit 4 subunits (22). Elke subunit lijkt op een myoglobine. Ze worden gecodeerd door andere genen, maar lijken erg op elkaar als je kijkt naar de aminozuur structuur. Doordat het uit 4 subunits bestaat, heeft hemoglobine een andere functie, namelijk het transporten van zuurstof van de longen naar de weefsels. Elke subunit heeft 1 heemgroep en hier kan dus zuurstof aan binden. de subuntis gaan ook interacties met elkaar aan: 1 met 2 en 1 met 2.
Hemoglobine heeft een lagere affiniteit voor zuurstof dan myoglobine. Bij een lage zuurstofdruk is er namelijk al veel myoglobine verzadigd met zuurstof. Bij hemoglobine is dit anders. Hierbij wordt bij een lage zuurstofdruk weinig zuurstof gebonden en bij een hoge zuurstofdruk veel zuurstof gebonden. Dit is belangrijk voor de functie. In de spieren is de zuurstofdruk namelijk laag (20 torr), wanneer hemoglobine dus in die omgeving komt, zal het zijn zuurstof afgeven aan myoglobine. Hemoglobine zal in de longen wel verzadigd zijn want daar is de zuurstof druk hoog (100 torr). Dit maakt hemoglobine tot een goede transporter en myoglobine tot een goed opslagmolecuul. Vervoer longen weefselsEen voorwaarde voor het vervoer is goede binding van O2 in de longen en snel loslaten in weefsels. Er moet dus snelle verzadiging van O2 zijn bij hoge zuurstofdruk en snelle afgifte bij lage zuurstofdruk. Dit wordt gedaan door coperatieve binding, dit betekend: hoe meer zuurstof is gebonden, hoe hoger de affiniteit voor zuurstof wordt. Dit levert een S-vormige (simoide) verzadigingsgrafiek op. Wanneer deze soort binding er niet was zou de binding van zuurstof aan hemoglobine veel minder efficint zijn. De grafiek zou dan als die van myoglobine lopen, alleen niet tot 100% verzadigd. Als je dan kijkt naar de efficintie van zuurstof afgifte in de spieren (dus van 100 naar 20 torr) levert dat met coperatieve binding 66% afgifte op en zonder levert het 38% afgifte op. De efficintie van myoglobine is 17% van 100 naar 20 torr.
Het transport van zuurstof veranderd ook wanneer het lichaam meer zuurstof nodig heeft. Als het lichaam in rust is, heeft hemoglobine een afgifte van 21%, dit komt doordat in weefsels en spieren dan niet veel zuurstof wordt verbruikt en er dus een hogere zuurstofspanning is (40 torr). Wanneer er beweging plaats vindt is er dus een efficientie van 66% (dus 20 torr). CoperativiteitHoe kan binding van zuurstof in 1 subunit ervoor zorgen dat er in de andere subunits sneller zuurstof bindt?Dit komt doordat het ijzer in 1 vlak wordt getrokken wanneer zuurstof heeft gebonden. Wanneer dit gebeurt wordt ook de proximale histidine van zn plaats gehaald en hierdoor vinden er in allerlei helices en loops kleine structuur veranderingen plaats. Dit heeft een invloed op de bindingsinterface (interactie) van de en subunits. Want wanneer er in 1 subunit een verandering plaats vindt, zorgt dit er voor dat er in andere subunits ook een verandering plaats vindt. Dit kan dus alleen wanneer een eiwit bestaat uit subunits die met elkaar verbonden zijn, vandaar dat dit niet mogelijk is bij myoglobine. Door die verandering maken 2 en 2 een kleine draaiing ten opzichte van de 1 en 1 subunits. Deze draaiing is 15. Hiervoor moeten een aantal zoutbruggen worden verbroken tussen de subunits (bijv. bij tyr en asp). Zoutbruggen zorgen namelijk in de tense state voor stabiliteit en bij het binden van zuurstof worden zoutbruggen verbroken. Naar mate er meer zuurstof bindt, zullen er dus meer zoutbruggen verbroken worden en hierdoor kan het dus makkelijker naar de relaxed state. Door de draaiing komt er een nieuwe interactie in de R state die ook gestabiliseerd wordt met een nieuwe zoutbrug (asp en asp).
Het lichaam is zo gebouwd dat het moeilijk is om de draaiing te maken, het houdt het eiwit in de open (tense) stand en dit maakt het dus een goede transporter. De oxyhemoglobine wordt de R-vorm (relaxed) genoemd en de deoxyhemoglobine is de T-vorm (tense). De deoxyhemoglobine wordt zo genoemd omdat de structuur hiervan gespannen is. De R-vorm heet relaxed omdat dit een lager energetische staat is voor hemoglobine, en dus relaxed is.
Modellen voor coperativiteitEr zijn verschillende modellen over hoe de coperatieve binding plaats vindt. 1. Het concerted modelHierbij kan hemoglobine alleen in 1 van de twee staten verkeren: of in de T of in de R. Er is geen overgangstaat mogelijk. Hierbij gaat het hemoglobine van de T staat naar de R staat. De kans wordt verhoogd wanneer er een zuurstof is gebonden aan het heem. En hoe meer zuurstof is gebonden, hoe groter de kans is dat ie in de R state zit. Wanneer de R state is bereikt, wordt de affiniteit van de subunits veel hoger. Dit model is zeer waarschijnlijk omdat een hemoglobine met 3 zuurstoffen gebonden, altijd in de R-state staat. De affiniteit om dan het laatste zuurstof molecuul te binden is dan 20x hoger dan in deoxyhemoglobine.
2. Het sequentile modelHierbij bestaan tussenvormen van de T en R state. Dit betekend dat er bij elke zuurstofbinding een klein beetje veranderd in de subunits, zodat ze een hogere affiniteit krijgen voor zuurstof. Bij onderzoek blijkt dat met 1 O gebonden dat het dan altijd in de T state zit, maar dat de affiniteit voor zuurstof in de overige subunits 3 keer hoger is.
Deze twee modellen bevatten allebei een kern van waarheid, maar het precieze model is nog niet ontdekt. Waarschijnlijk zal het dus een combinatie van deze twee zijn.
Bij de afgifte van zuurstof werkt het ook ongeveer zo. Wanneer er 1 zuurstof wordt afgegeven, zullen de andere zuurstofmoleculen ook sneller loslaten. Wanneer hemoglobine helemaal met zuurstof is gebonden, zit het in de R-state. Dit is een stabielere vorm en blijft hier het liefst in zitten. Wanneer het in een lage zuurstofspanning komt, moet het zijn zuurstof afstaan en dus weer naar de T-state. Hiervoor moet dus iets zijn, wat de afgifte bevorderd en dus wat het blijven in de R-state tegenwerkt. Ook moet de T state bevoordeeld zijn in de longen omdat hemoglobine niet zomaar naar de R state moet gaan. Hiervoor zijn verschillende manieren.BPGDit zit in rode bloedcellen en bemoeilijkt de opname van zuurstof en bevorderd de afgifte van zuurstof. Het stabiliseert de T-state. De volledige naam in bifosfoglyceraat en is een zeer negatief molecuul. Het verlaagt de affiniteit van hemoglobine voor zuurstof. Wanneer rode bloedcellen geen BPG bevatten is de efficintie van afgifte maar 18%. BPG bindt in het centrum van het hemoglobine molecuul. Dit is alleen bereikbaar in de T-state. Door de draaiing in de R-state is dit gat verdwenen.Het kan binden in het gat doordat er in de subunits positieve aminozuren (lysine) zitten die kunnen binden aan het negatieve (fosfaatgroep, COO-) BPG.Wanneer de zuurstofspanning hoog is en er dus zuurstof bindt aan hemoglobine, wordt het BPG (door de draaiing) uit het molecuul gedrukt. Wanneer het dan komt in een gebied met lage zuurstofspanning, zal er wat zuurstof loslaten waardoor de draaiing naar de T-state plaats kan vinden. BPG zal dan meteen zijn plek in het gat weer innemen, waardoor het niet meer terug kan vallen in de R-state.
BPG kan niet binden aan foetaal hemoglobine. Dit maakt foetaal hemoglobine een hele goede opnemer van zuurstof uit het bloed van de moeder. Foetaal hemoglobine heeft namelijk y subunits in plaats van subunits, waardoor het er net iets anders uit ziet. Hierdoor heeft het een hogere affiniteit voor zuurstof. De grafiek van het foetale hemoglobine is opgeschoven naar links. Dus bij een lage zuurstofspanning, zal het zuurstof van volwassen hemoglobine worden overgedragen op foetaal hemoglobine. Foetaal hemoglobine ligt tussen volwassen hemoglobine en myoglobine in. Het kan dus afnemen van volwassen hemoglobine en vervolgens wel weer doorgeven aan het eigen myoglobine. BPG kan niet binden aan foetaal hemoglobine doordat er in de y ketens een mutatie heeft plaats gevonden. Daar is namelijk his143, wat normaal in de ketens zit, vervangen door een serine. Hierdoor hebben de zijketens van myoglobine dus geen interactie met het BPG. De T state is dan minder stabiel en het gaat dus makkelijker naar de R state. Foetaal hemoglobine heeft dus een hogere kans dat het zich in de R-state bevindt bij een lagere zuurstofspanning. Omgeving weefselsWeefsels gebruiken energie en dit zorgt voor afgifte van CO2 en een lagere pH. Ook dit zorgt voor een snellere afgifte van zuurstof. CO2 komt via de capillaire wand bij de rode bloedcellen en reageert daar met water tot HCO3- (koolzuur) en H+. De hoge concentratie van CO2 en H+ waardoor de affiniteit van zuurstof aan hemoglobine verlaagd, wordt het Bohr effect genoemd en ook dit bevorderd dus de T-state. H+ bindt aan histidines in de subunits die op de grens van de subunits zitten (het is het laatste aminozuur van een subunit). Deze histidine 146 kan daardoor een zoutbrug vormen met aspartaat. Dit bevindt zich in dezelfde keten, maar zorgt dan voor een meer rigide structuur. Ook zit his 146 vlak bij een carboxy groep, wat van invloed is bij de binden van CO2. CO2 bindt aan de aminoterminus (dus de eerste keten van een subunit), er wordt dan een carbonaat groep gevormd, deze zijn negatief geladen. Door de negatieve lading kunnen deze carbonaatgroepen zoutbruggen vormen met geprotoneerde (door de lage pH) histidines.
Ook dit principe vindt alleen plaats in de T-state. Deze zoutbruggen kunnen dus alleen gevormd worden wanneer hemoglobine in de T-state zit.
Doordat hemoglobine H+ opneemt zal de reactie van CO2 naar HCO3- nog meer verlopen en zo wordt CO2 dus naar de longen vervoerd. In de longen zal het koolzuur dan weer loslaten.
Alles bij elkaar, dus coperativiteit, BPG en het bohr effect, maakt hemoglobine een allosterisch eiwit. Allosterie houdt in: regulatie van een eiwit door de binding van moleculen aan het eiwit op een plek wat niet het actieve centrum is. Dit gebeurd bij veel eiwitten in een cel. Ziekten bij hemoglobineEen ziekte door een mutatie in hemoglobine is sikkelcelanemie. Er wordt namelijk een glutamaat vervangen door een valine aan de buitenkant van een subunit. Hierdoor gaan hemoglobine polymeriseren, dus aan elkaar binden. Dit zorgt ervoor dat hemoglobine niet meer werkt en de rode bloedcel sterft. Deze mutatie is nog steeds aanwezig omdat het zorgt voor resistentie tegen malaria. Dit komt dus ook vaak in malaria gebieden voor.
Andere ziektes door mutaties in hemoglobine zijn:
Hoorcollege 3 & 4 Thermodynamica, enzymkinetiek & enzymologie
Enzymen zijn van groot belang in de cel omdat deze chemische reacties versnellen en in gang zetten. Hiervoor moet je begrijpen wat chemische processen inhouden en hiervoor is enige kennis van thermodynamica nodig. Naast de thermodynamische wetten moet je begrijpen dat om ons heen de chaos regeert, omdat de eigenschap van energie is zich verdelen over de ruimte.
Volgens de regels van de natuur moet alle energie verdeeld zijn over het hele universum. Alle systemen werken tegen deze regel in. Energie gaat niet verloren. Entropie (S) is de maat voor de diffusie van energie, de maat voor chaos. Elk systeem neigt naar een verhoogde entropie, dus naar een verhoogde diffusie van energie in dat systeem. Bijvoorbeeld de roestende auto. Zonder er energie in te steken, zal het systeem vervallen in meer chaos (dus het gaat roesten). Hierdoor gaat de overgang, van bijvoorbeeld een eiwit, van geordend naar wanorde snel. Het is mogelijk om van een wanorde-staat naar een iets georganiseerdere staat te komen, als de energie-staat daarvan lager is. Dit gaat heel langzaam. Enzymen kunnen deze reacties katalyseren wanneer deze reactie ook spontaan kan plaatsvinden. De reactie wordt dan zodanig versneld dat de reactie zin heeft in levende cellen. Ook kunnen enzymen niet spontane reactie mogelijk maken om zo nog meer georganiseerde staten te bereiken.Enzymen verkrijgen de energie via de zon (fotosynthese). Dit geldt voor alle organismen. Enzymen katalyseren (versnellen) een traag proces naar een evenwicht. Dit evenwicht wordt bepaald door de wetten van de thermodynamica.De kennis over enzymen is belangrijk omdat enzymen de schakelaars zijn van reacties in cellen. Daarnaast spelen medicijnen vaak in op de werking van enzymen. ThermodynamicaDe eerste wet: Er gaat geen energie verloren.Dit wil zeggen dat het heelal wordt gezien als een gesloten systeem met een bepaalde hoeveelheid energie die altijd constant blijft. Energie kan wel overgaan in verschillende vormen van energie zoals warmte of licht. Ook kan je de energie in een systeem bekijken, bijvoorbeeld de energie in een cel. Het systeem is dan het deel van het heelal dat je wilt bestuderen, de cel. De omgeving is de rest van het heelal. De interne energie E is alle energie van het systeem. Alle systemen hebben zon interne energie. De energie in een lichaam kan worden gebruikt voor dagelijkse handelingen, maar een ook zit er energie in de chemische verbindingen, wat ontstaan is bij de bouw. De toename of afname van de energie is afhankelijk van opgenomen warmte (Q) en de gedane arbeid (W):
E = E2 - E1 = Q W
Het systeem krijgt niet alle energie wat er in wordt gestopt. Een deel van de energie wordt namelijk omgezet in arbeid.
De tweede wet: Tijdens een proces moet de totale entropie van het heelal moet toenemen. Oftewel: alle vormen van energie in de materiele wereld spreiden uit na verloop van tijd, tenzij dit verhinderd wordt, of: reacties verlopen alleen maar als energie vrijkomt, tenzij je energie toevoegt. De entropie van een systeem (dit is immers een deel van het heelal) kan afnemen, zolang de entropie van de omgeving maar toeneemt. Dus de verandering van entropie in een systeem + de verandering van entropie in de omgeving moet altijd meer zijn dan 0:
Ssysteem + Somgeving > 0
De entropie is echter heel moeilijk te meten, daarom zijn hier andere manieren voor.
Gibbs(vrije)-energie (G) is het deel van de energie die nuttig gebruikt kan worden, oftewel de energie die beschikbaar is voor reacties. In de gibbs energie zitten de eerste 2 wetten van de thermodynamica verwerkt. De Gibbs-energie wordt gemeten in kcal/mol. De formule voor de gibbs vrije energie luidt:
G = H TSWaarbij H de enthalpie is (de interne energie die in een biologisch systeem gerekend kan worden in warmte, oftewel de hitte-inhoud van het systeem), T de absolute temperatuur en S de entropie (die afhangt van de temperatuur).H bevat hierin de eerste wet, namelijk de toe of afname van hitte, warmte in een systeem. S bevat de tweede wet, namelijk de verandering in entropie.
In biologische systemen bestaat de energie inhoud meestal uit beschikbare warmte, dus H=E:
G = E TS
Wanneer G negatief is verloopt de reactie spontaan (de energie die gebruikt kan worden is na de reactie minder). Bijvoorbeeld bij het hete kopje koffie, deze bevat meer warmte voor afkoeling dan daarna. H is dus negatief. Na afkoeling heeft het kopje koffie dus minder beschikbare energie om af te koelen, wat logisch is. Het eind product heeft dus een lagere energetische staat dan het begin product. wanneer G nul is, is de reactie in evenwicht. Dit is dus wanneer het kopje koffie even heet is als de omgeving. Het zal dan niet afkoelen. Wanneer G positief is verloopt de reactie niet spontaan. Denk aan een heet kopje koffie in een nog hetere kamer. De warmte van het kopje koffie zou dan naar de omgeving moeten, maar deze omgeving is al heter dan het kopje koffie, dit zal dus niet gebeuren. G zegt niks over de manier van verloop van de reactie of de reactiesnelheid.Rekenen met Gibbs-energie
Er is een reactie: A B. Daarvan kan je de evenwichtsconstante bepalen Keq = [A]/[B]. Deze evenwichtsconstante hangt af van de concentraties van A en B. De formule van gibbs vrije energie kan worden omgezet, via allerlei wiskundige routes naar de volgende formule:
G = G0 + RT ln[A]/[B]R = gasconstanteT = absolute temperatuurG0 = de standaard vrije energieverandering van een bepaalde reacties bij 1 M reactanten
Bij evenwicht geldt dat G = 0. Hierdoor kan je de formule dus als volgt weergeven:G0 = - RT ln[A]/[B]
Onder standaard omstandigheden, dus bij 25 graden en een pH 7,0 heeft R x T een vaste waarde en kan je ln omzetten tot log:G0 = - 1,36 log[A]/[B]Onder de standaardomstandigheden en 1M reactanten kun je zeggen dat G0 is G0.
G0 is een constante die (voor vrijwel alle reacties) al bepaald is. Met de G0 kan je de G van een reactie met een andere hoeveelheid reactanten berekenen. G0 vul je alleen in in de volledige formule wanneer de temperatuur 25 graden is en de pH 7,0 is. Wanneer de omstandigheden anders zijn moet je G0 invullen. G = G0 + 1,36 log[A]/[B]G0 = G0eind - G0beginEnzymenEnzymen zorgen ervoor dat een reactie versnelt kan worden, het katalyseert de reactie. Dit doen ze door een molecuul te binden, het vormt dan een enzym-substraat complex. Vervolgens zal de katalyse plaats vinden waardoor het substraat wordt omgezet naar een product. Het product zit nog steeds gebonden aan het enzym en dus vormt het nu een enzym-product complex. Vervolgens zal het enzym het product verlaten. Het enzym verandert in tegenstelling tot het molecuul niet.
De gibbs vrije energie (zoals in de afbeelding is te zien) is bij het substraat vaak hoger dan bij het product. G is dus negatief wat wil zeggen dat de reactie spontaan verloopt. Om deze reactie te laten verlopen moet de reactie eerst een soort hobbel nemen, dit wordt de transition state of overgangstoestand genoemd. De vorm van het subtraat in de transition state is energetisch hoger dan de energie van het oorspronkelijke substraat. De energie die nodig is om de transition state te bereiken wordt de activeringsenergie (G) genoemd. Wanneer de transition state bereikt is en de hobbel is genomen, zal de reactie weer vanzelf verlopen. Enzymen verlagen de activeringsenergie en faciliteren zo de overgang naar de transition state. De binding van een enzym aan het substraat via veel zwakke interacties zorgt ervoor dat het enzym door een conformatieverandering in een lagere energietoestand terecht komt. De energie van het enzym wordt dus op die manier verlaagt. Deze bindingsenergie die vrijkomt, dus de verlaging van energie van het enzym, wanneer het substraat aan het enzym bindt wordt gebruikt om de activeringsenergie te verlagen. Hoe specifieker het substraat is, des te meer zwakke bindingen er worden gevormd, des te meer bindingsenergie er vrijkomt en des te meer kan de activeringsenergie worden verlaagd. De interacties van het enzym met het substraat zijn optimaal wanneer het substraat zich in de overgangstoestand bevindt. Dit zorgt ervoor dat het enzym het substraat stabiliseert om het nog even in de overgangstoestand te houden zodat er nog meer energie kan worden gegeven door het enzym.
Er zijn 3 principes van katalyse door een enzym: Het veranderen van conformatie van de reactant (zoals hierboven uitgelegd). Het bij elkaar brengen van reactanten. Doordat reactanten bij elkaar worden gebracht kan dit de concentratie erg verhogen, waardoor de reactie opeens wel spontaan kan verlopen. De lading van de reactant veranderen. Een geladen enzym kan de lading van het reactant beinvloeden zodat deze makkelijker de overgangstoestand bereikt.
Een reactant bindt aan een enzym in de active site. Hiervoor zijn verschillende modellen. Een model is het sleutel-slot model. Dit houdt in dat het substraat precies in de active site van een enzym past, zoals een sleutel in een slot. Een ander model is het induced fit model. Dit houdt in dat wanneer een substraat bindt aan de actieve site van een enzym, dit ervoor zorgt dat het enzym zo verandert dat het ook daadwerkelijk kan katalyseren. Het substraat verandert dan naar een lagere energetische toestand. Dit kan dus een lading of conformatie verandering betreffen.
Daarnaast kan een enzym maar in n richting werken en zorgt er ook voor dat reacties in de juiste volgorde plaatsvinden. Een enzym kan een substraat omzetten tot 1 product. Dit komt door de specificiteit van enzym-substraat bindingen. Doordat een enzym een substraat omzet tot 1 bepaald product en dit product kan weer dienen als een ander substraat kan een ander enzym dit weer omzetten tot 1 specifiek product. Een cascade van reacties kan zo in een precieze richting leiden.
EnzymkinetiekWanneer je aan een reactie met een enzym meer substraat ([S], substraatconcentratie) toevoegt krijg je initieel een hoge snelheid van productvorming (V0) en daarna zal de reactie in een evenwicht terecht komen. De curve zal na de initiele hoge reactie snelheid afvlakken omdat het het evenwicht bereikt. Wanneer er weinig substraat is, zal er een lineaire curve worden gevormd en dit heeft een minder hoge snelheid, dus wordt het evenwicht later bereikt. Met enzym wordt het evenwicht sneller bereikt, dan zonder.
Wanneer je die curves uitzet in een nieuwe grafiek met de concentratie substraat en de reactiesnelheid, dus hoe snel substraat wordt omgezet tot een product door een enzym, zie je dat bij de hoogste substraat concentratie een maximale snelheid wordt bereikt. Dit houdt in dat bij die concentratie alle enzymen bezet zijn met het substraat en dat alle enzymen bezig zijn met het vormen van product. Als je de ontstane curve bekijkt zie je dat het een asymptotische curve is. Dit betekend dat de curve richting de Vmax zal lopen, maar deze nooit echt zal bereiken. Dit komt doordat de reactie altijd weer terug zal lopen (evenwichtsreactie!!) en dus zullen niet alle enzymen bezig zijn met het vormen van product.De half maximale snelheid (Vmax/2) is een maat voor specificiteit voor dat substraat. Daarnaast kan je bij de Vmax/2 de Km bepalen, dit is een ook maat voor specificiteit van het enzym voor zn substraat. De Km is die substraatconcentratie waarbij de Vmax/2 wordt bereikt. Wanneer je een hoge substraat concentratie nodig hebt om de Vmax/2 te bereiken is de specificiteit van het enzym voor het substraat dus niet heel hoog. Er is immers veel substraat nodig om de helft van de Vmax te bereiken. Hoe lager dus de Km, hoe hoger de specificiteit van een enzym voor zijn substraat. Dit alles wordt samengebracht in de Michaelis-Menten vergelijking:
Deze formule houdt in hoeveel product kan worden gevormd in een bepaalde tijdseenheid met een bepaald enzym en zijn substraat. Wanneer de parameters Vmax en Km bekend zijn, kan je dus de snelheid van omzetting van een substraat berekenen.
De Km kan je bepalen met de volgende formule:
Deze formule is af te leiden uit de afbeelding waarbij er eerst een enzym en een substraat zijn, wanneer deze binden vormt er een enzym substraatcomplex (ES). Vervolgens zal het substraat om worden gezet in een product en wordt het een enzym productcomplex, dit zie je niet terug in de reactie. Het enzym zal vervolgens los laten en er zal een enzym en een product zijn. Er zijn in deze reactie 3 evenwichtsconstantes:K1 = evenwicht van de reactie van het enzym en het substraat naar een enzym-substraatcomplexK2 = evenwicht van de reactie van het enzym-substraatcomplex naar een enzym en een productK-1 = evenwicht van de terug reactie van enzym-substraatcomplex, naar een enzym en een substraat.
De Km kan je dan als volgt berekenen:
Het blijkt dat de Km gelijk staat aan hoe snel ES wordt opgebouwd en hoe snel het ook weer wordt afgebroken.Wanneer een substraat een sterke affiniteit heeft voor een enzym, zal er snel een enzym substraatcomplex worden gevormd en dus zal K1 groot zijn. De noemer van de formule is dus groot. Daarnaast zal de K-1 juist heel klein zijn wanneer er hoge specificiteit van een enzym voor een substraat is. Wanneer de K1 groot is en de K-1 klein, zal de totale breuk klein zijn en dus zal de Km laag zijn. Er zal dus weinig enzym nodig zijn om de helft van de maximale reactiesnelheid te bereiken. De Km is een constante voor elk enzym-substraat paar. Dit wordt de Michaelis Menten constante genoemd.
Om tot de michaelis menten vergelijking te komen, zullen er een aantal stappen moeten worden genomen. Als eerste is er de formule voor de katalytische snelheid. De katalystische snelheid geeft aan hoeveel product er wordt gevormd per tijdseenheid. Dit hangt af van K2 en de concentratie van ES. Je krijgt dan de volgende formule, de eerste vergelijking:
(met V als katalystische snelheid)
De concentratie ES wordt bepaald door:
Wanneer de substraatconcentratie heel hoog is en de VMAX is bereikt spreken we van een steady state van ES, waarbij vorming = afbraak, dus:
Dit kan je vervolgens weer omzetten tot:
En dit kan je weer herschrijven tot:
Bij deze vergelijking zijn er een aantal aannames die gedaan moeten worden. [E] en [S] moeten nog worden vastgesteld. Hiervoor gelden de volgende regels:
Voor [E] geldt dat er een deel van de concentratie van het enzym zich bevindt in het enzym-substraatcomples. Voor [S] geldt dit niet omdat je aanneemt dat de concentratie van het substraat in overmaat is. Dit geldt namelijk voor elke reactie in cellen. De vergelijking die we hadden kunnen we dan nu omzetten tot de volgende vergelijking:
Deze vergelijking kan je na een aantal stappen weer herschrijven als de tweede vergelijking.
Wanneer je de eerste en de tweede vergelijking verwerkt in 1 vergelijking, krijg je de volgende vergelijking, deze lijkt al heel erg op de Michaelis Menten vergelijking.
Maar bij een overmaat van substraat is al het enzym betrokken in ES, dus de [ES] = [ET] en de snelheid bij een overmaat van substraat zal gelijk zijn aan de Vmax, dus: V = VMAXHier uit kan je dus concluderen dat: Vmax = K2 x [ET]Door met deze gegevens te substitueren krijg je de Michaelis-Menten-vergelijking:
Met deze vergelijking kunnen we nu de snelheid van productvorming per tijdseenheid bepalen bij een bepaald enzym substraat paar. Uit deze formule kun je een aantal dingen afleiden: [S] > Km. Wanneer de substraatconcentratie veel groter is dan de KM, kan de KM worden verwaarloosd en kan de reactievergelijking worden omgeschreven naar V = VMAXDit betekent dat wanneer de substraatconcentratie heel veel groter is dan de KM, de relatieve snelheid gelijk is aan de maximale snelheid. En dit klopt want wanneer er een hoge [S] is, zijn alle enzymen bezet en is de snelheid dus gelijk aan Vmax. [S] = Km. Wanneer de substraatconcentratie gelijk is aan de KM kan de vergelijking worden omgeschreven naar:V = VMAXDus, zoals we al weten, is KM de substraatconcentratie bij de half maximale snelheid. Dit komt doordat de breuk in de M-M vergelijking allemaal dezelfde hoeveelheden bevat. De breuk wordt dan 1/2, wat dus de Vmax geeft.
De Michaelis Menten vergelijking verteld dus precies hoe de tijd voor product verandert bij verschillende substraatconcentraties.
Als je een enzym en een substraat hebt waar je nog geen parameters van hebt is het lastig om de bovenstaande grafiek te produceren. Een truc hiervoor is om een grafiek met een rechte lijn te produceren. Dit doe je met behulp van een dubbelreciproke weergave (Lineweaver-Burk plot) van de Michaelis-Menten-vergelijking; je draait hierbij de noemers en de tellers van de vergelijking om (zie figuur 2). Dit doe je door V = VMAX [S] / [S]+KM om te schrijven naar: 1/V = S + KM / VMAX S 1/V = (S / VMAX S) + (KM / VMAX S)
1/V = 1/VMAX + KM / VMAX 1 / [S]
Hiermee krijg je een rechte lijn in je grafiek (doordat je de vergelijk nu hebt omgeschreven naar een vorm van y = a(Km/Vmax)x(1/[S]) + b (1/Vmax). Hierbij is b het snijpunt met de y-as en a de richtingscofficint. Met deze rechte lijn kan je bij een nieuw enzym met drie metingen deze grafiek construeren.
Figuur 2: Lineweaver-Burk plot
De KM heeft meerdere afgeleide betekenissen. Ten eerste geeft de KM de enzymconcentratie waarbij de helft van de active sites zijn gevuld, dus de half maximale snelheid. Op deze manier geeft de KM een maat voor de substraatconcentratie die nodig is om een significante enzymactiviteit te bereiken. Ten tweede zegt ook iets over de bindingsaffiniteit van het substraat voor het enzym; een hoge KM staat voor een zwakke binding, een lage KM staat voor een sterke binding. De VMAX geeft het turnover nummer van een enzym; het aantal substraatmoleculen die omgezet worden in product per enzymmolecuul per tijdseenheid bij maximale snelheid. EnzymremmersDe werking van enzymen kan worden benvloed door remmers, die de enzymactiviteit verlagen of stoppen, en door activatoren, die de enzymactiviteit stimuleren. Veel medicijnen en vergiften zijn remmers van enzymen. Daarnaast zorgen remmers van enzymen ook voor regulatie. Er wordt een onderscheidt gemaakt tussen reversibele en irreversibele remmers. Irreversibele remmers blokkeren een enzym permanent. Als irreversibele remmers eenmaal aan een enzym binden, dissociren ze niet of nauwelijks meer. Het enzym is dan blijvend vergiftigd. Een voorbeeld is DIPF (diisopropylfosfofluoridaat), ook wel zenuwgas, is een remmer die reageert met de acetylcholine-esterase. Het gaat dan een covalente binding aan in de active site met een serine (OH groep). Een ander voorbeeld van een reversibele remmer is aspirine. Reversibele remmers moeten constant worden toegevoegd om hetzelfde effect te behouden. Een reversibele remmer kan een: competitieve remmer zijn, die op dezelfde plek als het substraat bindt en daarom competeert met het substraat, Bij een competitieve remmer blijft de VMAX onveranderd, want door heel veel substraat toe te voegen zal uiteindelijk alsnog de VMAX bereikt worden. De KM wordt wel hoger, dit wordt de Km apparant genoemd, de schijnbare Km in aanwezigheid van een remmer. een niet-competitieve remmer, die remt de katalyse door ergens anders te binden. De niet-competitieve remmer haalt het enzym weg uit de actieve pool, het zorgt ervoor dat het enzym niet meer werkt. Het kan nog wel substraat binden, maar het kan het minder goed tot een product omzetten. Hierdoor wordt de VMAX lager, maar de KM hetzelfde. Dit verschil tussen een competitieve en een niet-competitieve remmer is te zien in een Lineweaver-Burk plot (zie figuur 3).
Figuur 3: Lineweaver-Burk plot verschil tussen competitieve en non-competitieve remmers
Een voorbeeld van een reversibele remmer is antabuse of disulfiram. Dit zorgt voor een enorme kater bij een kleine inname van alcohol. Dit wordt toegediend bij alcoholisten. De remmer zorgt ervoor dat acetaldehyde dehydrogenase wordt geremd en dus blijft acetaldehyde bestaan, wat zorgt voor de kater.
NIET IN COLLEGE GENOEMD, WEL LERENTransition state analogs zijn moleculen die erg op de overgangstoestand van het substraat van een enzym lijken en op deze manier de enzymactiviteit kunnen verminderen. Suicide inhibitors zijn remmers die een remmende werking op een enzym hebben doordat het enzym ermee reageert tot een intermediair, waarna dat intermediair het enzym onwerkzaam maakt.
Veel enzymen hebben een cofactor nodig: een gebonden niet-eiwit molecuul. Wanneer dit molecuul sterk is gebonden is het een prosthetische groep (zoals heem). De cel bevat daarnaast ook hulpstoffen die niet zo sterk aan het enzym gebonden zijn maar vrij in de cel voorkomen en daarom met verschillende enzymen kunnen reageren. Dergelijke hulpstoffen worden co-enzymen genoemd. Een belangrijk voorbeeld is NAD+.
Hoorcollege 5 & 6 Katalyse en regulatiemechanismen
Stryer Lysozym katalyseert het knippen van polysaccharideketens in de celwanden van bacterin. De reactie die lysozym katalyseert is een hydrolyse; er wordt water aan een binding tussen twee suikers toegevoegd, waardoor de binding verbreekt. De energetische staat na het knippen van de keten is lager, maar zal spontaan heel langzaam plaatsvinden. De binding kan alleen verbroken worden als de suikers eromheen in een afwijkende vorm staan, de transition state. De activeringsenergie die hiervoor nodig is, is heel hoog. In de actieve site van lysozym passen 6 gekoppelde suikers. Lysozym houdt het substraat zo vast dat n van de 2 suikers van de binding die verbroken wordt een afwijkende, minder stabiele conformatie krijgt. De binding die wordt verbroken wordt ook dicht bij 2 zure zijketens gehouden. Door al deze omstandigheden wordt de activeringsenergie van de overgangsstaat verlaagd. Het verbreken van de binding gaat via de volgende stappen:1. Het enzym duwt het gebonden substraat zodat 1 suiker meer gaat lijken op de hoog energetische overgangstoestand.2. Het negatief geladen asparaginezuur reageert met het C1-atoom van deze verstoorde suiker, en het glutaminezuur doneert een proton aan de zuurstof tussen deze en de naastgelegen suiker. Hierdoor breekt de binding en is het asparaginezuur covalent gebonden aan de suiker.3. Met behulp van het negatief geladen glutaminezuur reageert een watermolecuul met het C1-atoom, waardoor het asparaginezuur loslaat en de hydrolyse compleet is.ProteolyseProteolyse is een voorbeeld van een enzymatische reactie waarbij een peptidebinding wordt verbroken tussen C en N. De peptide-binding resoneert; het is soms een dubbele binding en soms een enkele binding. Hierdoor is de peptide-binding heel star en zal het onder normale omstandigheden heel lang duren voordat deze spontaan zal verbreken. Maar wel spontaan, eiwitten (die bestaan uit aminozuren) hebben dus de neiging om uit elkaar te vallen. Het maken van die verbindingen heeft dus energie nodig (denk aan ribosomen e.d.). Proteases zijn enzymen die de proteolyse-reactie, het verbreken van de peptide-binding, katalyseren en dus versnellen tot msec. Ook bij deze reactie is water nodig om de binding te verbreken.
Chymotrypsine Een voorbeeld van een protease is chymotrypsine. Dit is een serine-protease dat wordt geproduceerd door proteolyse-reacties. Het voorlopereiwit chymotrypsinogeen van 25 kD wordt geknipt door trypsine (familie van) tot -chymotrypsine. Dit bestaat uit 2 ketens een A keten en een BC keten. Het eiwit is nu gedeeltelijk actief en zal zichzelf nog een keer knippen, waardoor er 3 ketens (losse A, B en C) ontstaan. Deze vormen met elkaar een nieuwe tertiaire structuur, waardoor -chymotrypsine volledig actief wordt.
Chymotrypsine verbreekt de peptide-binding tussen aminozuren na grote aromatische (met een cyclische verbinding in de zijgroep, zoals phenylalanine) of hydrofobe aminozuren (bijv. methionine). Dit protease knipt aan de C terminale kant van dat aminozuur, dus rechts ervan. Dit heeft te maken met de vorm en de mogelijk interacties in de actieve site.
De katalyse van chymotrypsine verloopt in 2 stappen. Na het binden van het substraat aan het enzym ontstaat eerst het eerste product door acylering en daarna het tweede product door deacylering. Chymotrypsine acyleert zichzelf, het koppelt de acyl-groep van de peptide aan zijn eigen OH-groep (een serine bevat een OH groep). Er ontstaat hierbij het eerste product. Hierna deacyleert het zichzelf met behulp van water, door de een OH-groep aan de acyl-groep van de peptide te binden. Water speelt eigenlijk bij elke katalyse een rol, het is namelijk nodig voor de deacylering van het enzym. Het geacyleerde enzym wordt het acyl-enzyme intermediate genoemd.
Om deze reactie te meten wordt er gebruik gemaakt van een synthetisch substraat waarvan het tweede product licht geeft. Door de reactie te meten bleek dat de acylering snel ging en de deacylering vrij langzaam. Op deze manier komt het enzym in een steady-state-toestand en kan het niet snel gerecycled worden, omdat het substraat nog aan het enzym zit. De katalyseDe actieve site van het chymotrypsine bevat een hydroxylgroep van een reactieve serine195. De serine zal dus uiteindelijk de peptide binding verbreken. Chymotrypsine heeft een hydrofobe pocket. Chymotrypsine maakt bij de katalyse gebruik van een catalytic triad. Door de specifieke vouwing van chymotrypsine komen aspartaat102, histidine57 en serine195 bij elkaar in de buurt te liggen. Aspartaat en histidine zijn ervoor nodig om serine reactief te maken, ze zijn dus essentieel voor de katalyse. Doordat ze dicht bij elkaar liggen kunnen ze waterstofbruggen vormen. In aanwezigheid van substraat komen de aminozuren nog dichter bij elkaar te liggen waardoor deze waterstofbruggen sterker worden. In aanwezigheid van het substraat zal een aspartaat het proton van de amino groep van histidine afpakken. Hierdoor wordt histidine meer electronegatief. De dubbele binding die tussen de C en de andere N zit, zal gaan resoneren. Hierdoor wordt de aantrekkingskracht voor protonen van de andere stikstof sterker en neemt deze de waterstof van serine over. Serine heeft hierdoor geen hydroxylgroep meer maar een alkoxide-ion (O), waardoor serine zeer reactief wordt.acyleringIn aanwezigheid van substraat pakt histidine dus de waterstof van serine af. De peptide-binding van het eiwit resoneert (het substraat), waardoor de zuurstof een binding aan kan gaan met de zuurstof van de peptide-binding. Wanneer de dubbele binding met de O loslaat en richting de stikstof gaat, neemt de zuurstof van serine die binding over. Deze toestand heet de tetrahedral intermediate, dit is de overgangstoestand. Er ontstaat ook een oxyanion aan het eiwit, die zeer reactief en daardoor instabiel is. Het enzym stabiliseert dit ion met het oxyanion-gat (oxyanion hole), dit is een deel van het enzym. Dit oxyanion-gat bestaat uit peptide-residuen die waterstofbruggen aan kunnen gaan (NH-groepen, bijvoorbeeld glycine) met het oxyanion, die gebeurt met de hoofdgroepen, dus niet de zijketens. Op deze manier wordt de transitional state gestabiliseerd. Hierna wordt de reactie voortgezet, wanneer dit oxyanion gat er niet zou zijn zou de reactie terug vallen. De stikstof van de peptide-binding kan nu een binding aangaan met de waterstof die histidine van serine heeft afgepakt (dit is thermodynamisch voordeliger). Nu is de peptide-binding verbroken en het enzym geacyleerd. Je hebt nu geen tetrhedral intermediate meer omdat C weer 3 zijgroepen heeft. Ook heb je geen oxyanion hole meer omdat C een extra binding over heeft, waardoor O niet meer reactief is.
DeacyleringHet amine-deel drijft nu weg, waardoor er plaats is voor water, dat was voorheen niet en dat is nodig voor de tweede stap. Water wordt reactief gemaakt door de histidine, net zoals dit aminozuur bij serine deed. De histidine pakt een proton van water af. De overgebleven reactieve OH-groep reageert weer met de koolstof van het substraat, door de dubbele binding bij O. Er is nu weer sprake van een overgangstoestand, een tetrahedral intermediate en van een oxyanion hole.
Als laatste wordt de binding van het eiwit met serine verbroken doordat het energetisch voordeliger is om deze verbinding te verbreken dan binding tussen C en de OH groep. en krijgt de zuurstof weer een dubbele binding. Het tweede product kan nu het enzym verlaten waardoor serine het proton van histidine weer kan pakken, waardoor het niet meer reactief is.
specificiteit van chymotrypsineChymotrypsine heeft een voorkeur voor het knippen van een peptide-binding na een lange aromatische of hydrofobe verbinding, doordat de katalytische site (active site) een vrij diepe hydrofobe pocket heeft. De zijketens van het substraat binden op die manier met het enzym dat precies de peptide binding na een hydrofobe of aromatische zijgroep dicht bij de serine ligt, waardoor die peptide binding dus wordt geknipt. De actieve serine ligt vrij diep in een hydrofobe holte. Eiwitten met langere zijketens kunnen meer interacties aangaan in zon pocket, waardoor er dus meer bindingsenergie vrijkomt en dus katalytische activiteit. Ook gaan in de site alleen de zijketens van de aminozuren in het substraat een interactie aan met de zijketens van het enzym. Wanneer een substraat net een andere zijketen heeft, kan dit het katalytisch vermogen benvloeden van een enzym (het kan daardoor niet binden met een bepaalde zijketen in het enzym), waardoor katalyse niet meer plaats vindt. Serine proteasesEr zijn verschillende soorten serine-proteasen. Deze proteasen verschillen in hun specificiteit. Trypsine heeft bijvoorbeeld een negatieve zijketen in de pocket zitten, waardoor het eerder bij positieve zijketens knipt. Elastase heeft twee valines in de pocket zitten, waardoor het voornamelijk na kleine, hydrofobe ketens kan knippen. Serine-proteasen zoals trypsine en chymotrypsine hebben eenzelfde soort katalysewerking en zijn evolutionair verwant (divergente evolutie). Subtilisine heeft een hele andere katalysewerking, dat onafhankelijk is ontstaan (convergente evolutie), er is een apart gen gecreerd. Subtilisine gebruikt in het oxyanion gat geen hoofdgroepen van aminozuren, maar deze gebruikt zijketens van een ander deel van het enzym. Dit duidt er dus op dat het niet eenzelfde voorloper heeft gehad, zoals bij divergente evolutie.Essentieel voor een enzym is een reactieve zijketen, een keten die een verbinding van een substraat kan overnemen.Naast serine-proteasen zijn er ook zink-proteasen (maken gebruik van zink om een molecuul reactief te maken), thiol(cysteine)-proteasen en aspartyl(carboxyl)-proteasen.(Thiol)Cystene proteasenVoorbeeld: papain of caspaseCystene-proteases hebben een reactieve cystene in plaats van serine. De OH groep van serine is nu dus de SH groep van cystene. Er is geen catalytic triad nodig, histidine kan zonder hulp van aspartaat de waterstof van cystene afpakken. Dit komt doordat de SH groep van zichzelf als iets reactiever is dan de OH groep. Hierna volgen dezelfde stappen als bij de serine-proteasereactie.Aspartyl (carboxyl) proteasenVoorbeeld: HIV protease of reninAspartyl-proteasen hebben twee aspartaat zijketens, die er voor zorgen dat de peptide-binding kan worden verbroken. De twee aspartaten delen samen een waterstof door een waterstofbrug. En van de twee aspartaten gaat een reactie aan met water. Die aspartaat pakt een proton af van het water en de gedeelde proton komt bij de andere aspartaat terecht. Het reactieve zuurstof van het water valt dan aan op de resonerende peptide-binding, waardoor er een tetrahedral intermediate wordt gevormd. Deze wordt gestabiliseerd door een waterstofbrug met een proton van de tweede aspartaat. De stikstof in de peptide-binding gaat hierdoor een binding aan met de proton van een aspartaat, de koolstof vormt dan een dubbele binding met het reactieve zuurstofatoom (dat daardoor niet meer reactief is) en de peptide-binding is verbroken. Deze reactie verloopt dus in 1 stap! Dit komt doordat het ene aspartaat water kan activeren en het andere aspartaat de tetrahedral intermediate kan stabiliseren. Ook komt het doordat water meteen aanwezig kan zijn.
Zink proteasenVoorbeeld: carboxypeptidase ADe zink-proteasen worden ook wel de metalloproteasen genoemd. Een base in de actieve site van het enzym helpt bij de reactie (vaak glutamaat). Het zink wordt vastgehouden door 3 zijketens van het enzym. Het zink en de base maken samen water reactief. De hydroxylgroep gaat een binding aan met de koolstof van de peptide-binding, waardoor de dubbele binding met de zuurstof verbroken wordt. Deze tetrahedral intermediate wordt gestabiliseerd door het zink. De stikstof bindt dan aan het proton van een tyrosine in de buurt, waardoor de koolstof weer een dubbele binding aan kan gaan met de zuurstof. De proton van water wordt dan weer overgenomen door tyrosine.
Het principe van een enzymreactie is altijd hetzelfde. Er vindt altijd een nucleofiele aanval plaats (reactief maken van serine, cystene of water) Hierna wordt er een tetrahedral intermediate gevormd (door aanvallen van de C=O) Ook wordt de overgangstoestand gestabiliseerd (bijvoorbeeld door middel van het oxyanion-gat), zodat er tijd is voor de stikstof om de peptide-binding te laten gaan en een proton te binden en het niet reageert met bijvoorbeeld een andere zijketen.
Het HIV protease is een aspartyl protease en bestaat uit 2 homomeren die samen een dimeer vormen. Doordat het een dimeer is kunnen de twee aspartaten bij elkaar worden gebracht in de actieve site. Voor het HIV-protease is een protease-remmer gemaakt. HIV-protease knipt multi-domeinviruseiwitten in hun actieve vorm. Het remmen van deze protease blokkeert dus de HIV-infectie. De remmer is een molecuul die lijkt op het substraat van de HIV-protease (past in de actieve site), maar het is geen peptide binding waardoor het niet geknipt kan worden. Dit is een competitieve remmer die de activiteit van een protease kan remmen.PenicillinePenicilline remt cross-links (de opbouw) in de bacteriewand door de remming van glycopeptide-transpeptidase. De bacteriewand is opgebouwd uit suikerresiduen, alanineresiduen en glycines. Er bevinden zich reeksen van 5 glycines in de wand, die we de pentaglycine-reeks noemen. De alanines zitten op een rij van 4 die de D-ala eenheid wordt genoemd. De suikers, de glycines en de alanines zijn allemaal aan elkaar gebonden. De verbinding tussen de reeks glycines en de alanines heet de pentaglycine-brug.
Glycopeptide-transpeptidase maakt de verbinding tussen alanine en glycines. Het koppelt het amino-terminale deel van een glycine-residue aan het op n na laatste residu van de alanine-reeks. Hierbij wordt een bestaande peptide-binding verbroken doordat glycopeptide-transpeptidase zichzelf acyleert (de actieve site bevat wederom een serine). Er komt dan een tussen toestand waarna een nieuwe binding, en dus product, wordt gevormd. Dit komt doordat glycine een tweede substraat is voor het enzym, waardoor het zal binden aan de alanine. Er zal dus eerst een proteolytische reactie optreden. Penicilline is een remmer van glycopeptide-transpeptidase, dat essentieel is voor de opbouw van vrijwel iedere bacterie.
Penicilline lijkt op het substraat van glycopeptide-transpeptidase en gaat een covalente binding aan met het enzym. Het is dus een irreversibele remmer. Het wordt ook wel een suicide inhibitor genoemd, omdat het enzym hierbij zichzelf uitschakelt.
Penicilline is een goede remmer door de structuur. En van de bindingen van penicilline is heel erg reactief, het wilt graag verbroken worden. Hierdoor past penicilline heel goed in de actieve pocket van het enzym, het bindt er graag aan. Restrictie-endonucleasesRestrictie endonucleases knippen dubbelstrengs DNA van een specifieke sequentie. Door deze ontdekking kan klonen plaatsvinden. Er zijn er ongeveer 3000 bekend (600 te koop). Restrictie enzymen zijn twee gedraaide homodimeren, hierdoor kan het palindroom worden gebonden.EcoRVDeze restrictie endonuclease is afkomstig uit de E.coli bacterie, Dit knipt de sequentie GATATC precies in het midden (A-T), blund ends. EcoRV heeft magnesium nodig als co-factor om de knip plaats te laten vinden (net als bij zink-proteasen). Het verbreken van de nucleotide-binding (scissile bond) door restrictie-endonucleases vereist water. Dit water wordt verdeeld over de uiteinden die ontstaan bij het verbreken van de binding. In het EcoRV zit een magnesium dat op zn plaats wordt gehouden door (in dit geval) 2 aspartaten. Dit magnesium is zo geactiveerd dat het, samen met de twee aspartaten, een watermolecuul kan activeren (doordat er een proton wordt afgepakt). EcoRV is specifiek voor een bepaalde sequentie omdat het hierbij veel interacties aan kan gaan. Deze sequenties zorgen op deze manier dat er zo veel mogelijk bindingsenergie vrij komt.
Door het groot aantal interacties van het enzym met het substraat (DNA in dit geval) maakt het enzym een kink in het DNA. De peptide binding die verbroken moet worden komt op deze manier precies op plek dichtbij magnesium. Het is dus een enzym dat katalyseert door de conformatie van het substraat te veranderen. Door die knik is het energetisch voordeliger om de verbinding te verbreken. Wanneer een andere sequentie bindt aan het enzym zullen de interacties minder goed zijn en sowieso minder, de te verbreken verbinding komt dus niet in de buurt van magnesium. De kink in het DNA zal minder zijn. De overgangstoestand bij dit enzym is de kink in het DNA. Een deel van de bindingsenergie wordt dus gebruikt om het DNA te verbuigen.
Restrictie-enzymen hebben zich in bacterin ontwikkeld om zich te kunnen verdedigen tegen bijvoorbeeld binnenkomend DNA van virussen. Door methylering van het bacterie-DNA zorgt de bacterie ervoor dat de restrictie-enzymen niet het eigen DNA knippen. Dit komt doordat het DNA dan niet goed meer in de actieve site past en dus de knik niet kan maken. Regulatie van enzymenEnzymen werken vrijwel altijd samen. Een enzym kan samenwerken met een cofactor, die anorganisch (zoals een metaalion: Mg, Zn, Mn, Ca) of organisch (co-enzym, prosthetische groep) kan zijn. Een andere benaming voor een enzym en een cofactor samen is een holoenzym, dit is zo omdat het enzym slechts het eiwit is, maar het zal nooit werken zonder co-factor. Het enzym wordt hierbij het apo-enzym genoemd. Het enzym blijft onveranderd tijdens de reactie, maar de co-factor veranderd wel. Bij magnesium is dat niet zo, maar bij vitamines wel. Een prosthetische groep is een zeer vast (covalent) gebonden co-factor, zoals heem. Een co-enzym is een niet-eiwitmolecuul en vaak een complex molecuul, dat bij de binding van het substraat of bij de katalyse is betrokken. Hiervan is continue aanvoer nodig, daarom is het nodig om genoeg vitamines binnen te krijgen omdat dit essentile bouwstenen zijn van deze co-enzymen. Zo is vitamineB3 een bouwsteen voor NAD+. Maar een vitamine kan ook een direct co-enzym zijn zoals vitamineC in metabole pathways.
Enzymen kunnen gereguleerd worden met behulp van: Door activatie door de binding van kleine moleculen (remmers en activatoren) bij regulatie-sites Door reversibele covalente modificaties (zoals fosforylering) Door eiwit-eiwit interacties (bijvoorbeeld pseudosubstraat remming) Door een proteolytische knip (zoals bij trypsine uit trypsinogeen)
FosforyleringFosforylatie is effectief omdat: 1 fosfaat zet 2 negatieve ladingen op een eiwit, hierdoor verandert de gehele chemische omgeving van een residu. 1 fosfaat kan 3 of meer waterstofbruggen vormen, dit brengt ook grote veranderingen met zich mee. De G (zeeeer negatief) van fosforylatie is laag, de G voor de reactie is hoog Het is reversibel, de timing kan zelf bepaald worden Fosforylatie kan zorgen voor amplificatie (kinases) Er wordt veel ATP gebruikt in de cel (energievoorziening gekoppeld aan regulatie van processen).Een fosfaat groep kan op de serine, threonine en tyrosine worden gezet omdat deze 3 aminozuren een OH groep bevatten. Kinases zetten de fosfaatgroepen erop, fosfatases halen ze er weer van af. Door een eiwit te fosforyleren kan je dit activeren of juist deactiveren. Wanneer op een bepaalde transcriptiefactor namelijk een fosfaatgroep wordt gezet, kan het uit de nucleus worden getransporteerd waardoor het inactief wordt. Kinases worden zelf ook geactiveerd door fosforylering. Een inactieve kinase heeft een T-loopstructuur die de binding van een substraat blokkeert. Wanneer deze T-loop wordt gefosforyleerd, door een andere kinase, verandert de conformatie waardoor de actieve site vrij komt te liggen.Binding van kleine moleculen of eiwit-eiwit interactiesProtein kinase A (PKA) is een heterotetrameer, met 2 dezelfde katalytische en 2 dezelfde regulatoire subunits. De regulatoire subunit zit in de actieve site van de katalystische subunit, waardoor het substraat niet kan binden. de regulatoire subunit bevat geen serine, threonine of tyrosine waardoor de katalytische subunit niets kan fosforyleren. De regulatoire subunit werkt dus als een competitieve remmer en wordt een pseudosubstraat genoemd. Wanneer cAMP wordt geproduceerd bindt dit aan de regulatoire subunits, waardoor deze van conformatie veranderen. Hierdoor zullen de loops die met het katalytische domein kunnen binden een lagere affiniteit hebben voor het katalytische domein en het enzym zal actief worden. Er ontstaan dan 2 losse actieve katalytische subunits en 2 aan elkaar gebonden zijn via regulatoire subunits.De regulatoire subunit werkt als een pseudosubstraat doordat het twee arginines heeft achter elkaar, wat een hoge affiniteit heeft voor de actieve site van de katalytische subunit. Maar het heeft op de plek waar een serine hoort te zitten (dit zit dus wel in het substraat) een alanine en dit kan niet gefosforyleerd worden. ATCaseATCase koppelt een carbamoyl-fosfaat aan een aspartaat. Het product van deze reactie is een belangrijke component van ATP. Bij deze reactie is er sprake van negatieve feedback. ATCase wordt geremd door het uiteindelijke product van de reactie (CTP). Wanneer er veel CTP aanwezig is, zal het ATCase remmen. CTP is een allosterische inhibitor: het bindt ergens anders dan de actieve site. ATCase is een allosterisch eiwit en volgt daarom niet de Michaelis-Menten vergelijking, maar een sigmode curve (hemoglobine, myoglobine), het substraat bindt dus coperatief. CTP (product) remt de affiniteit voor het substraat, er is dus meer enzym nodig om de half maximale snelheid van het substraat te bereiken. ATP verhoogt de affiniteit voor het substraat (dit is een maat voor voldoende voedsel).
ATCase kan in regulatoire en katalytische subeenheden worden verdeeld door toevoeging van bijvoorbeeld p-hydroxymercuribenzoaat, die met de sulfhydrylgroepen (SH) reageert. ATCase heeft 6 regulatoire en 6 katalytische subunits. De katalytische subunit bestaat uit 3 grote ketens, de regulatoire subunit uit 2 kleinere ketens.
Voor ATCase is een substraat gevonden (PALA) dat lijkt op het intermediair van de reactie (transition state analog). Bij de binding van PALA veranderd het ATCase van vorm. PALA is een competitieve remmer omdat het in het actieve centrum bindt. Hierdoor heeft men kunnen ontdekken dat ATCase een T-state (lage affiniteit voor substraat, minder actief en dicht) en een R-staat (hoge affiniteit voor substraat, actiever en open) heeft. In de R-state zal het enzym open staan en in de T-state dicht, dit is dus precies andersom dan bij hemoglobine. Het evenwicht tussen de T- en de R-staat hangt af van het aantal gebonden substraatmoleculen, er is sprake van coperatieve binding. Bij de binding van CTP wordt ATCase in de T-vorm gehouden. CTP kan binden aan iedere regulatoire keten die niet aan de katalytische subunit vastzit (6 keer dus). CTP stabiliseert zo dus de T-state, de draaiing kan niet makkelijke plaatsvinden. ATP bindt juist graag aan de R-state zodat ATCase niet terugklapt naar de T-state zodat katalyse plaats kan vinden. De substraten binden tussen een regulatoire en een katalytische subunit, er kunnen er dus 6 binden.ATCase is dus een voorbeeld van alle manieren van regulatie die eerder aan bod zijn gekomen. stryerEr zijn 2 verschillende vormen van allosterische regulatie: homotropische en heterotropisce regulatie. Een homotropische allosterische modulator is een substraat voor het target-enzym, maar ook een regulatormolecuul van de enzymactiviteit (typisch een activator). Een heterotropisch allosterische modulator is een regulatoir molecuul dat niet het enzymsubstraat is. Dit kan een activator of een inhibitor van het enzym zijn.
Isozymen, of iso-enzymen, zijn enzymen die verschillen in aminozuursequentie maar wel dezelfde reactie katalyseren. De enzymen verschillen dan ook in bijvoorbeeld de KM, of reageren anders op regulatiemoleculen. Isozymen worden gecodeerd door verschillende genen en ontstaan vaak door duplicatie en divergentie. Een voorbeeld van een isozym is LDH, de mens heeft hier twee vormen van: het H-isozym dat veel tot expressie komt in het hart en spierweefsel en het N-isozym dat veel tot expressie komt in botweefsel. Het H-isozym heeft een hogere substraataffiniteit dan het M-isozym. Hoge concentraties pyruvaat remt allosterisch het H-isozym, maar niet het M-isozym. H-isozym functioneert goed in de aanwezigheid van zuurstof, M-isozym functioneert juist beter wanneer er geen zuurstof aanwezig is.
Voorbeelden van modificaties van een enzym zijn:ModificatieDonormolecuulVoorbeeld van gemodificeerd molecuulEiwitfunctie
FosforyleringATPGlycogeen fosforylaseGlucose-homeostase; energie-transductie
AcyleringAcetyl CoAHistonenDNA-verpakking; transcriptie
UbiquitinyleringUbiquitineCyclineControle van de celcyclus
MethyleringMethylDNAVerpakken van DNA; expressie tegengaan
Fosforylering wordt gedaan door kinases op serine, threonine of tyrosine. Defosforylering door fosfatases wordt gedaan met behulp van water. Sommige enzymen moeten door proteolytische knip worden geactiveerd. Wanneer zon enzym nog niet geknipt is (inactief dus) heet het een zymogen of pro-enzym. Proteolytische knip kan maar n keer gebeuren en is irreversibel. Het kan ook buiten de cel plaatsvinden omdat er geen ATP voor nodig is. Hoorcollege 7 & 8 Eiwittechnieken: eiwitzuivering en detectie
De verzameling van alle eiwitten van een organisme of cel noemt men een proteosoom. Proteomics is het bestuderen hiervan. De mens kan op basis van de aminozuursequentie ongeveer 47.000 eiwitten produceren. Aan deze eiwitten vinden ook posttranslationele modificaties plaats, waardoor het aantal verschillende eiwitten wordt geschat op 200.000 tot 2.000.000.
Met onderzoek naar eiwitten kun je eiwitten scheiden of zuiveren, oftewel detecteren, of karakteriseren (het bepalen van bijvoorbeeld het molecuulgewicht, aminozuurvolgorde, 3D-structuur en activiteit). De specifieke activiteit van een eiwit (enzym) is de activiteit van een enzym per hoeveelheid eiwit.Scheiding
Gelelectroforese Dit is de belangrijkste manier van eiwitscheiding. Hiermee kan een scheiding worden gemaakt op grootte en lading. De snelheid van het eiwit (v) is afhankelijk van de sterkte van het elektrisch veld(E), de lading van het eiwit (z) en de wrijvingscofficient (f):
V = E z / f
Het dragermateriaal is polyacrylamide. Dit wordt gebruikt als moleculaire zeef en is hiervoor heel handig omdat het chemisch inert is (het gaat geen reacties aan met de eiwitten die je erop brengt), het is gemakkelijk te maken en de poriegrootte kun je laten variren door de verhouding tussen acrylamide en cross-linker (methylene, bisacrylamide). Het nadeel ervan is dat de stof neurotoxisch is.SDS-PAGEBij SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gelelectroforese) wordt er alleen gescheiden op grootte. Door SDS toe te voegen worden alle eiwitten negatief geladen, het bindt per molecuul 2 aminozuren. -mercaptoethanol denatureert de eiwitten door de zwavelbruggen te verbreken. Bij gelelectroforese is het belangrijk dat je ook een marker gebruikt, een serie eiwitten waarvan je de grootte weet, zodat de resultaten kunnen worden vergeleken.Iso-electric focussing (IEF)Iso-electric focussing (IEF) is een techniek waarbij een polyacrylamidegel met een pH-gradint wordt gebruikt. Deze pH-gradint wordt gecreerd met polyamfolyten met verschillende ladingen, die in de gel worden gepolymeriseerd, en nadat er een lading op de gel wordt gezet verspreiden de polyamfolyten zich in een pH-gradint. Wanneer je eiwitten over deze gel laten lopen zullen eiwitten naar de positieve of negatieve pool gaan lopen, en stoppen op het punt waar het iso-electrisch punt (pI) neutraal is. Op deze manier kunnen de eiwitten dus gescheiden worden op pI.2D-electroforeseBij 2D-electroforese wordt in een eerste dimensie IEF toegepast en in een tweede dimensie SDS-PAGE. Op deze manier worden de eiwitten eerst op pI en daarna op grootte gesorteerd, waardoor veel meer eiwitten van elkaar kunnen worden gescheiden.ZuiverenEiwitten kunnen worden gezuiverd op grootte, oplosbaarheid, lading of bindingsaffiniteit.DialyseDe eerste manier van zuiveren, eigenlijk verrijken, is dialyse. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een zakje van een semipermeabel membraan in een bak met buffer. Hierbij worden buffermoleculen gewisseld voor kleine moleculen. Hierbij ontstaat er door diffusie een evenwicht, waarbij er geen complete zuivering optreedt (hoewel deze wel benaderd kan worden met een zeer grote opstelling).GelfiltratieBij gelfiltratie worden eiwitten gescheiden op grootte. Hierbij laat men de eiwitten door een kolom lopen met daarin bolletjes met gangetjes waar alleen kleine eiwitten in kunnen. Hierdoor gaan kleine eiwitten dus langzamer door de kolom heen dan de grote eiwitten. Door fracties op te vangen uit de kolom kunnen de eiwitten gezuiverd worden, al is er eerder sprake van verrijking.IonenwisselaarDe ionenwisselaar maakt ook gebruik van een kolom, waar in dit geval bolletjes in zitten die geladen zijn. Bij positieve bolletjes lopen de negatieve bolletjes langzamer door de kolom heen. De snelheid waarmee eiwitten door de kolom lopen hangt af van de sterkte van de lading van het eiwit. Sommige eiwitten binden heel sterk aan de bolletjes. Deze eiwitten kunnen door elutie, het toevoegen van zouten, van de kolom worden verwijderd en worden opgevangen. Er bestaan dus twee verschillende ionenwisselaars: de anionenwisselaar (negatieve deeltjes binden) en de kationenwisselaar (positieve deeltjes binden).UltracentrifugatieBij ultracentrifugatie kunnen eiwitten worden gescheiden, al is het eerder verrijking. De scheiding, de mate waarin het deeltje naar de bodem van het buisje afdaalt, hangt af van de sedimentatiecofficint, die afhankelijk is van de massa en de vorm van het deeltje, de dichtheid van de oplossing en de dichtheid van het deeltje.Bij celfractionering via differentile centrifugatie wordt een homogenaat, mengsel, van een cel, dat je snel afdraait. De zwaarste componenten worden afgedraaid. Door het supernatant af te pipetteren kan dit experiment overnieuw, bij een hogere kracht, worden afgedraaid, waardoor er nog een zuivering plaatsvindt.Bij gradint-ultracentrifugatie kunnen eiwitten nog preciezer worden gescheiden. Hierbij wordt het buisje voor de centrifugatie gevuld met een oplossing van sucrose die van onder naar boven van een hoge naar een lage dichtheid loopt. Hierbovenop wordt het supernatant gebracht. Na centrifugatie kan, door onderaan de buis een gat te maken, in fracties de inhoud van de buis worden opgevangen.Antillichamen Bij het zuiveren van eiwitten op bindingsaffiniteit worden voornamelijk antilichamen gebruikt. Antilichamen hebben een variabele en een specifiek domein. Deze eiwitten worden opgewekt in dieren. Antilichamen herkennen een specifiek antigen (dit kan bijvoorbeeld een eiwit zijn). Het epitoop is het deel van het eiwit dat herkent wordt door een antilichaam (het is ook mogelijk om een antilichaam op te wekken voor slecht een serie van 8 aminozuren). Polyclonale antilichamen is een mengsel van antilichamen die meerdere verschillende epitopen herkennen en samen vrijwel een heel sequentie kunnen herkennen. Monoclonale antilichamen herkennen maar 1 epitoop.AffiniteitschromatografieBij affiniteitschromatografie laat men eiwitten door een kolom lopen met specifieke antilichamen erin. De eiwitten die binden aan de antilichamen kunnen opgevangen worden na elutie (veel protonen toevoegen, verstoord alle waterstofinteracties).ImmunoprecipitatieEen variant hiervan heet immunoprecipitatie, waarbij dit wordt gecombineerd met centrifugatie. Na binding met antilichamen worden de bolletjes naar beneden gedraaid, en kan het supernatant met andere eiwitten worden verwijderd, waarna de eiwitten door elutie kunnen worden verwijderd.DetectieEiwitten kunnen worden gedecteerd door eiwitkleuring of radioactieve markering. Specifieke eiwitten kunnen gedetecteerd worden met behulp van de activiteit (bij enzymen) of antilichamen (in combinatie met kleur).
Bij een algemeen principe van eiwitdetectie door antilichamen wordt een eiwitmengsel vastgemaakt op een drager. Hierover laten we antilichamen lopen die een specifiek eiwit herkennen, het primaire antilichaam. Hierna moet de drager goed gewassen worden. Met een secundair antilichaam dat een fluorescente of gekleurde groep heeft kan, na wassen, gezien worden of het eerste antilichaam heeft gebonden.Men kan ook de antilichamen op de drager vastmaken, waar de eiwitten overheen kunnen lopen. Hierbij moet wel een tweede primair antilichaam worden toegevoegd, en tenslotte een secundair antilichaam met een fluorescerende groep.Door een zuiver eiwit op een drager te brengen, zoals bijvoorbeeld bij een HIV-test wordt gedaan, kan gekeken worden of er in een mengsel (zoals bloed) antilichamen aanwezig zijn voor dit eiwit. Hierna moet nog wel een secundair antilichaam worden toegevoegd. Dit principe heet ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay.Door gebruik te maken van een primair en een secundair antilichaam kunnen door een enkel secundair antilichaam meerdere antilichamen (uit n dier) worden herkent. Bij al deze methoden is het belangrijk dat er na iedere stap wordt gewassen.
Een voorbeeld van een methode waarbij eiwitten op een drager worden aangebracht is Western Blotting. Hierbij laat je de eiwitten over een gel lopen, zoals bij SDS-PAGE. Door hierna een drager achter de eiwitten te plaatsen die sterk positief is geladen, zullen eiwitten overgaan naar de drager. Hierna kunnen de primaire en secundaire antilichamen worden toegevoegd. Op deze manier kan een specifiek eiwit worden gedetecteerd.
Bij immunofluorescentie wordt direct in een cel gekeken in plaats van in een mengsel. Dit gebeurt op een weefselpreparaat. Verschillende antilichamen kunnen samen het preparaat kleuren. Het green fluorescent protein (GFP) is een eiwit waarvan de zijketens in het midden de fluorescentie bepalen. Het gen hiervoor kan in een cel in het genoom gebracht worden, waarna de functie van het eiwit gevolgd kan worden.KarakteriseringEiwitten kunnen gekarakteriseerd worden door hun molecuulgewicht, aminozuurvolgorde, 3D-structuur en activiteit.
Door middel van protein sequencing kan de aminozuursequentie van een eiwit worden bepaald. Hierbij wordt eerst gekeken uit welke aminozuren een eiwit bestaat, door het bij een lage pH te verhitten, de aminozuren te isoleren en door een ionenwisselaar te scheiden (de mate van elutie die nodig is zegt welk aminozuur het is). Vervolgens kan de kwantiteit van een aminozuur worden bepaald door het te laten reageren met een indicator. Edman-degradatie is de ouderwetse manier om dit te doen. Door het eerste N-terminale aminozuur aan een stofje te koppelen, waardoor het afsplitst, kan via pH-chromatografie bepaald worden welk aminozuur dit is. Dit kan herhaald worden voor andere aminozuren. Na 5 of 6 aminozuren kon deze techniek al niet meer worden gebruikt.
Bij massaspectrometrie wordt een mengsel van eiwitten (of klein geknipte eiwitten, door bijvoorbeeld cyanogeenbromide of proteases zoals trypsine) op een drager met een zuur milieu gebracht (waardoor de eiwitten positief geladen worden). Met behulp van bepaalde lasers worden deze eiwitten in de gasfase gebracht, waarna ze door een elektromagneet versneld worden richting een detector. De kleinere eiwitten reizen sneller en de TOF (time of flight) kan worden omgerekend worden naar de exacte massa. Hierbij kunnen de eiwitten in een eiwitmengsel door een protease worden geknipt. Van deze proteases weet je ook de specificiteit. Je krijgt dan kleine stukjes eiwitten waarvan je de massa kan bepalen. De eiwitten kunnen bij verder knippen nog specifieker worden bepaald. Hierbij kunnen ook de posttranslationele modificaties worden bekeken. Deze techniek heet MALDI-TOF.
De tertiaire structuur, de 3D-conformatie, wordt bepaald door interacties die we niet kunnen voorspellen.
Bij X-ray crystallography laat men de eiwitten kristalliseren door ze onder bepaalde omstandigheden in een buffer te brengen. Hierbij is dus een specifieke conformatie gevangen in een kristal. Door een kristal te bestralen met rntgenstraling, waarbij de straling verstrooid wordt. Het defractiepatroon is specifiek voor een bepaald eiwit. De zuiverheid van je preparaat is heel belangrijk om de structuur van het eiwit te kunnen bepalen.
Een andere techniek om de 3D-structuur te bepalen is NMR. Hierbij kan echter een dynamische structuur worden gedetecteerd, in plaats van een enkele structuur. Er kunnen hierbij geen grote eiwitten worden gebruikt, in tegenstelling tot bij kristallografie. Onder invloed van radiofrequente straling in een magnetisch veld kan de spin van een elektron veranderen. Hierbij neemt het atoom energie op. Deze absorptie van energie in dit magnetisch veld kan worden gemeten. In een sterk magnetisch veld is het grootste verschil te zien. De omgeving van een atoom (bijvoorbeeld in de hoofd- of zijketen) bepaald hoeveel energie een atoom moet opnemen om de spin van een elektron om te draaien. De resultaten worden vergeleken met een referentieatoom (nullijn).De absorptie is ook afhankelijk van andere protonen in de buurt. Door twee metingen achter elkaar te doen kan men zien of deze twee protonen dicht bij elkaar zitten. Dit komt doordat na de eerste absorptie energie wordt overgedragen naar het andere proton, waardoor bij beide atomen een verschil te zien is in de chemical shift, de mate van verandering ten opzichte van de referentie.
Aspartaat 1 maakt water reactief
Aspartyl proteasen
Aspartaat 2 stabiliseert oxyanion
H
Zink ion maakt water!reactief
Zink proteasen: Metalloproteasen
Base: vaak Glu
Mechanisme Metalloprotease!(carboxypeptidase A)
http://juang.bst.ntu.edu.tw/BCbasics/Animation1.htm
Mechanisme Metalloprotease!(carboxypeptidase A)
http://juang.bst.ntu.edu.tw/BCbasics/Animation1.htm
Penicilline
Alexander Flemming, ~1928
Penicilline remt cross-links in bacteriewand door remming van glycopeptide transpeptidase
Pentaglycine-brugD-Ala-brug
Glycopeptide!transpeptidase!
reactie
Text
Penicilline lijkt op substraat en gaat een covalente binding aan met het enzym
Irreversibele remmer: Suicide Inhibitor
R - D-ala- C - O - ser -
O enzymsubstraatTussenstap in katalyse
penicilline- C - O - ser -
O+ penicilline
Penicilline bindt aan het enzym net zoals het!substraat in overgangstoestand
Restriction Endonucleases
Hydrolyse DNA backbone mbv water en Mg2+
Mg2+
water geactiveerd door Asp en Mg2+
CTP remt affiniteit voor Substraat
feedback controle
ATP verhoogt affiniteit voor Substraat
maat voor voldoende !voedsel
CTP en ATP zijn regulatoren van ATCase
Sigmoide curve: substraat bindt coperatief!Voegt zich niet naar M&M kinetiek!
aspartaat
carbamoylfosfaat
Transition state analog
Kleine verandering, Groot effect Hoogtepunten..
- Primaire, secundaire, tertiaire, quaternaire structuur! van eiwitten
- Hoe worden -helices en -sheets gevormd? - Wat is myoglobine en waaruit is het opgebouwd?
- Hoe ziet de prosthetische groep eruit, en hoe bindt! zuurstof aan het ijzer atoom?
- Wat gebeurt er met heme wanneer zuurstof ! bindt, en waarom?
Myoglobine: 1 subunitFunctie: opslag O2 in spieren / weefsel
Hemoglobine: 4 subunits (22)Functie: transport O2 van longen naar weefsel
Myoglobine vs Hemoglobine:Opslag vs Transport
Hemoglobine
1
21
2
Coperatieve binding! ! hoe meer O2 er per hemoglobine molecuul !! bindt, hoe hoger de affiniteit voor O2!
!! S-vormige of sigmoide verzadigingsgrafiek
Efficint O2 transport
!33
Door zuurstof binding verandert de quaternaire!structuur van hemoglobine.
T-vorm (tense) R-vorm (relaxed)
!44
draaiing subunits t.o.v elkaar! verbreken van zoutbruggen
Het gevolg (2):
!42
2 modellen voor Cooperativiteit O2 binding door hemoglobine:
1. Concerted Model: T of R
Hb met 3 O2 moleculen altijd in R staat.!Laatste O2 bindingsplaats 20X hogere affiniteit voor O2 dan deoxyHb
2. Sequentieel model: tussenvormen T/R
Hb met 1 O2 molecuul altijd in T staat (concerted), maar affiniteit van overige 3 sites voor O2 is 3X hoger !46
2 modellen voor Cooperativiteit O2 binding door hemoglobine:
1. Concerted Model: T of R
Hb met 3 O2 moleculen altijd in R staat.!Laatste O2 bindingsplaats 20X hogere affiniteit voor O2 dan deoxyHb
2. Sequentieel model: tussenvormen T/R
Hb met 1 O2 molecuul altijd in T staat (concerted), maar affiniteit van overige 3 sites voor O2 is 3X hoger !46
2,3 bisphosphoglyceraat (BPG)
BPG !verlaagt de O2 affiniteit van Hb!! bindt in centrum van de tetrameer!! bindt aan T-vorm (laag O2) en niet aan R-vorm
Efficint O2 transport: Verbeterde O2 afgifte
1
!50
Foetaal hemoglobine
Ander eiwit, 22, met hogere affiniteit voor O2!BPG kan niet binden aan foetaal Hb
ketens! !!!
ketens!!!!
!54
Zoutbruggen in deoxyhemoglobine!(worden verbroken tijdens deoxy naar oxy overgang)
COO-
Bohr Effect CO2
Bohr Effect H+
!60
Allosterie
Regulatie van de functie van een eiwit door moleculen die binden aan het eiwit
op een plek dat niet het actieve centrum is
Hb ziekten: 1. Sikkelcel anemie
mutatie Glu Val aan buitenkant -keten
Gevolg: deoxy-HbS polymeren
Hb ziekten: 2. Anemie 3. Thalassemie
4. Porfyrie 5. Polycytemie
Anemie: te weinig HbOorzaak: ijzertekort: weinig heme productie
Porfyrie: te weinig HbOorzaak: Genetisch defect: weinig heme productie
Polycytemie: te veel HbOorzaak: Allerlei, waaronder Overproductie rode bloedcellen, wonen op grote hoogten
Thalassemie: slechte zuurstof opname in weefselsOorzaak: Hb met slecht 1 soort keten: geen coperativiteit
Indische Gans
Vliegt op hoogtes van 4-6 kmIs gespot tijdens vlucht over M. Everest
Hb heeft 4 aminozuur veranderingen:
Groter gat tussen dimerenMinder stramme T-stateIJzer meer in vlak van porfyrineHogere affiniteit voor O2Meer O2 opname bij lagere pO2
Enzym versnelt omzetting substraat in product
ES EP PS
Enzymen verlagen de activeringsenergie
A + B C + D
ligging evenwicht wordt bepaald door wetten thermodynamica
reactie verloopt tot evenwicht
A + B C + D
Wat doen enzymen?
snelheid wordt bepaald door !activeringsenergie
G
SXP
Enzymen zorgen voor een juiste volgorde !van reacties
Enzymkinetiek
Relatie snelheid V en substraat S
Michaelis-Menten vergelijking:
Vmax en KM bepalen kinetiek van een enzym
Enzymkinetiek
Relatie snelheid V en substraat S
Michaelis-Menten vergelijking:
Vmax en KM bepalen kinetiek van een enzym
Enzymkinetiek
Relatie snelheid V en substraat S
Michaelis-Menten vergelijking:
Vmax en KM bepalen kinetiek van een enzym
Michaelis - Menten constante
Wat is de KM?
KM is een constante voor een enzym-substraat paar
kafbraak van ESkopbouw van ES
KM=k-1 + k2
k1
k2
k-1
Michaelis - Menten constante
Wat is de KM?
KM is een constante voor een enzym-substraat paar
kafbraak van ESkopbouw van ES
KM=k-1 + k2
k1
k2
k-1
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
[E] [S][ES] =
KM[E] = [Etotaal] - [ES]
[S] = [Stotaal] als [S]>>[E] (aanname)
([ET] - [ES]) [S][ES] =
KM
[S]
[ES] =KM + [S]
[ET]
[ES] KM = [ET] [S] - [ES] [S]
[ES] KM + [ES] [S] = [ET] [S]
[ES] (KM + [S]) = [ET] [S]
[S][ES] =
[S] + KM[ET] of (2)
E definiren en S definiren
k2
k-1
[E] [S][ES] =
KM[E] = [Etotaal] - [ES]
[S] = [Stotaal] als [S]>>[E] (aanname)
([ET] - [ES]) [S][ES] =
KM
[S]
[ES] =KM + [S]
[ET]
[ES] KM = [ET] [S] - [ES] [S]
[ES] KM + [ES] [S] = [ET] [S]
[ES] (KM + [S]) = [ET] [S]
[S][ES] =
[S] + KM[ET] of (2)
E definiren en S definiren
k2
k-1
Irreversibele remmers
Zenuwgas
Reversibele remmers
Competitieve remmer
remt vorming enzym-substraat complex ! (remt k1)
Niet - competitieve remmer
remt katalyse (turnover number) ! (remt k2)
snelle dissociatie van enzym-remmer complex
k2
k-1
Reversibele remmers
Competitieve remmer
remt vorming enzym-substraat complex ! (remt k1)
Niet - competitieve remmer
remt katalyse (turnover number) ! (remt k2)
snelle dissociatie van enzym-remmer complex
k2
k-1
Reversibele remmers
Competitieve remmer
remt vorming enzym-substraat complex ! (remt k1)
Niet - competitieve remmer
remt katalyse (turnover number) ! (remt k2)
snelle dissociatie van enzym-remmer complex
k2
k-1
Voorbeeld Reversibele remmer uit de praktijk
Antabuse (Disulfiram): Medicijn tegen alcoholisme:!Zorgt voor enorme kater bij inname beetje alcohol
C H3
C=O
alcohol
Alcohol!dehydrogenase!
(+NAD)
Acetaldehyde!dehydrogenase
C H3
C H2 OH
acetaldehyde
Misselijk!Hoofdpijn
azijnzuur
H
C H3
C=O
OH
Competitieve remmer !
C H3
R-S=O
H
Antabuse
Proteolyse
10-1000 jaar stabiel!(vanwege resonantie) Proteases:!
versnellen proteolyse tot msec
serine protease!! !25 Kd!!voorloper: !chymotrypsinogeen
Chymotrypsine
!!1. acylering: covalente binding !! enzym met n van de producten!!!2. deacylering: losmaken ! enzym-product
Katalyse verloopt via 2 stappen
Acyl
Principe katalyse door Chymotrypsine:!reactief maken van de OH-groep van serine
Histidine en aspartaat maken serine reactief
catalytic triad
base catalystIn aanwezigheid van substraat
Thermodynamica:!Stap 2: G voordeligst voor interactie van koolstof in substraat met alkoxide ion van Ser195. Oxyanion mag niet direct reageren met andere moleculen, dus stabilisatie door Oxyanion hole is gewenst.
De katalyse, Stap 1: Acylering
mogelijk gemaakt door resonantie peptide binding
O- wordt gestabiliseerd door!hoofdketen groepen
Thermodynamica:!Stap 3: koolstof-stikstof binding in substraat instabiel vanwege resonantie met oxyanion, en dus G voordeligst voor interactie stikstof van substraat met proton in histidine van enzym.
De katalyse, Stap 1: Acylering
De katalyse, Stap 2: Deacylering
Thermodynamica:!Stap 6: OH- reageert met koolstof van acyl-enzym complex. Oxyanion Hole stabiliseert wederom instabiele overgangstoestand.
De katalyse, Stap 2: Deacylering
Thermodynamica:!Stap 7: G voordeligst voor verbreking interactie tussen Acyl en Enzym.!
Serine proteasen
bindingsplaats van substraat
Zelfde catalyse, verschillende specificiteit
Histidine maakt !cysteine (S-H) reactief
Cysteine proteasen
Recommended
