Download ppt - UE6 Initiation à la connaissance du m é dicament - Module « Pharmacologie g é n é rale » - Item « Paramètres de quantification des effets pharmacologiques

UE6 Initiation à la connaissance du médicament - Module « Pharmacologie générale » -

Item « Paramètres de quantification des effets pharmacologiques »

C Capdeville-Atkinson, C Perrin-Sarrado, N Gambier,F Dupuis, C Gaucher, G Trocklé

Livres: «Pharmacologie : des cibles vers l’indication thérapeutique», Yves LANDRY et Jean-Pierre GIES, Dunod, Paris 2009

«Initiation à la connaissance du médicament-UE6 1° année santé», Yves LANDRY, EdiScience, Dunod, Paris 2010

Plan1. Interaction Ligand - Récepteur

1.1 Les 3 propriétés importantes1.2 Notion de ligand, agoniste, antagoniste1.3 Loi d’action de masse1.4 Théorie d’occupation des récepteurs

2. Méthodes d’étude de l’interaction Ligand - Récepteur

1.1 Approche fonctionnelle1.2 Etude de liaison à haute affinité

3. Notion de sélectivité

4. CONCLUSION

1. Interaction Ligand - Récepteur

Affinité = traduit la puissance de l’interaction physico-chimique entre le ligand et son récepteur = capacité de reconnaissance entre les 2 partenaires

Réponse = effet ou activité du ligand suite à sa fixation sur le récepteur

Sélectivité : - affinité préférentielle d’un ligand pour un récepteur par rapport à un autre- liée à la concentration utilisée : « l’important, c’est la dose »

- production de médicaments de plus haute sélectivitéRapport effet primaire/effets secondaire

- liaisons non covalentes (hydrophobes, ioniques, H, van der Walls)

1.1 Les 3 propriétés importantes

Sélectivité

Transduction intracellulaire

Réponse biologique effet Activité

Couplage avec des effecteurs

Affinité

Cible (récepteur)

médicament

reconnaissance mutuelle des 2 partenaires


récepteur

Signald'entrée

affinité

Systèmeamplificateur

Systèmeeffecteur

effet

TransductionAmplificationModulation

Signalde sortie

activité


1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste

Ligand : toute molécule se liant à un récepteur

Agoniste : molécule capable d’engendrer, par sa liaison à ses récepteurs, une réponse biologique semblable à celle du médiateur endogène

Antagoniste : molécule dont l’interaction avec les mêmes récepteurs ne déclenche pas de réponse biologique et s’oppose à

l’effet du médiateur endogène

Cascade enzymatique- phosphorylations

- déphosphorylations

Réponse cellulaire

- contraction- sécrétion- croissance et division

- …..

AGONISTE

Absence de signal intracellulaire

Absence de réponse cellulaire

Seconds messagers

ANTAGONISTE


LigandEndogène

Agoniste Antagoniste

REPONSEPHARMACOLOGIQUE

AUCUNEREPONSE

Médiateur endogène



Médicament agoniste : mime l’effet du médiateur

entier (réponse cellulaire maximale) partiel

Médicament antagoniste neutre : - s’oppose à la liaison du médiateur à son récepteur - n’induit pas de réponse par lui-même mais l’effet du médiateur endogène

Médicament agoniste inverse : - s’oppose à la liaison du médiateur à son récepteur- entraîne une réponse opposée à celle de l’agoniste

1.3 Loi d’action de masse

Modèle de la loi d’action de masse

- équilibre dynamique entre formes libres et associées du ligand et récepteur

[L] + [R] [LR] k1

k-1

[L] : concentration molaire de ligand libre[R] : concentration molaire de récepteur libre[LR] : concentration molaire du complexe ligand-récepteurk1 : constante cinétique d’association (M-1 x min-1)

k-1 : constante cinétique de dissociation (min-1)

Notion d’équilibre

- modèle satisfaisant pour les études de base

- constante d’équilibre K (à une T°C donnée)

Vitesse d’association = [L] x [R] x k1

- nombre de formation du complexe ligand-récepteur par unité de temps

A l’équilibre : les 2 vitesses sont égales :[L] x [R] x k1 = [LR] x k-1 ([L] x [R]) / [LR] = k-1/k1 = KD

Affinité : inverse de la constante de dissociation : - 1/KA pour agoniste - 1/KB pour antagoniste

KD : constante de dissociation à l’équilibre (M)- KD dénommée KA pour agoniste - KD dénommée KB pour antagoniste

Vitesse de dissociation = [LR] x k-1

- nombre de dissociation du complexe ligand-récepteur par unité de temps


Affinité = 1/KA ou 1/KB = k1/k -1 = 1/KD

En pratique : 1/KA et 1/KB = peu utilisées

KA

KB

Ligands à forte affinité faible concentration pour se lier au récepteur (suggérant dose faible in vivo)

Plus KD est faible, plus l’affinité est élevée

KD = [L] nécessaire pour occuper 50 % des récepteurs à l’équilibre

grandeur de concentrationunité = Molaire


1.4 Réponse et théorie d’occupation des récepteurs

Affinité réciproque de L et R

Formation du complexe LR

Activité ou effet de L

=

Réponse de R Réponse cellulaire ou réponse de l’organisme

1.4.1 Théorie de l’occupation des récepteurs (Clark)

- Réponse proportionnelle au pourcentage de récepteurs occupés - Lorsque 100% des récepteurs occupés réponse maximale

100

50

0

Récepteurs occupés (%)

0 50 100

Effe

t (%

)


[A] + [R] [AR]k 1

k -1

[A] : concentration molaire d’agoniste libre[R] : concentration molaire de récepteur libre[AR]: concentration molaire du complexe agoniste-récepteur

Réponse = [A]/([A]+KA)

Avec - [Rtot] = [R] + [AR]

- KA = ([A] x [R])/[AR]

1.4 Réponse et théorie d’occupation des récepteursLoi d’action de masse

Réponse = [AR]/[Rtot]Si réponse % de récepteurs occupés

Théorie d’occupation des récepteurs

1.4.2 Evolution de la théorie de l’occupation des récepteurs

Ariens réponse maximale obtenue pour une gamme de concentration = différente d’un agoniste à l’autre

facteur de proportionnalité propre à chaque agoniste : activité intrinsèque = capacité du ligand à stimuler le tissu

Réponse = [AR] / [Rtot] = A/(A+KA)

= 1 : agoniste entier

0 < < 1 : agoniste partiel

< 0 : agoniste inverse

= 0 : antagoniste neutre


Théorie d’occupation des récepteurs

complétée par Stephenson et Furchgott :

- Réponse maximale faibles proportions de récepteurs occupés

(2-20%)

- notion de récepteurs de réserve

= récepteurs libres alors que la réponse maximale est obtenue


Conclusion : INTERACTION LIGAND - RECEPTEUR

3 propriétés : - Affinité- Réponse = Activité- Sélectivité

Différents types de ligands :- Agoniste entier- Agoniste partiel- Antagoniste neutre- Agoniste inverse

2. Méthodes d’étude de l’interaction Ligand - Récepteur

1) Approches fonctionnelles activité, affinité

Objectif global : évaluation de l’activité, et de l’affinité du médicament

pour le récepteur responsable de l’effet primaire et les récepteurs

responsables des effets secondaires notion de sélectivité d’un

agoniste ou d’un antagoniste

Etude des ligands : 2 approches

2) Approches par liaison spécifique à haute affinité affinité, activité

2. Méthodes d’étude de l’interaction ligand - récepteur

Les différents modèles d’étude de l’affinité et de l’activité des médicaments

Récepteurspurifiés

Fragmentsmembranaires

Cellules isolées

Etude de la liaison spécifique des ligands

Organes isolés

Organismeentier

Etude fonctionnelle des ligands

in vitro In vivo

2.1 Approches fonctionnelles

Expériences fonctionnelles préliminaires caractéristiques nouveau ligand

- Si ligand = agoniste : observation d’un effet propre du ligand en absence de médiateur endogène

- Si ligand = antagoniste : pas d’effet propre mais effet du médiateur endogène ou d’un agoniste ajouté

Suivant agoniste ou antagoniste, protocoles expérimentaux différents

réponses graduelles : augmentent progressivement en fonction de la dose (in vivo) ou de la concentration (in vitro).

dose efficace 50 (DE50) ou concentration efficace 50 (CE50) : dose ou concentration nécessaire pour obtenir 50% de l’effet maximal

2.1 Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistesagonistes

Réalisation d’une courbe dose-réponse ou courbe concentration-réponse (doses ou concentrations cumulatives )

0 10 20 30 40

3Contraction (g)

Temps (minutes)

2

1

10-8 M

3.10-8 M

3.10-7 M

10-7 M

10-6 M

3.10-6 M

10-5 M3.10-5 M

2.1 Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes

ex : courbe concentration réponsed’un anneau aortique isolé

2.1.1.1 Détermination de Emax, DE50 ou CE50

Dose ou Concentration linéaire d’agoniste

Effet

Transformée en courbe sigmoïde

Relation entre l’effet (E) et la dose, ou entre l’effet (E) et la concentration du médicament

courbe dose-réponse ou courbe concentration-réponse :



Transformation en courbe sigmoïde sur papier semi-logarithmique :

2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 91 1 1 1 1

10-9 M 10-8 M 10-7 M 10-6 M 10-5 M[Agoniste](molaire, M)

Effet

Effet max

Effet = f([Agoniste] en Molaire) (ou = f(dose, en quantité/kg))


Transformation en courbe sigmoïde

sur papier millimétré : Effet = f(- log [Agoniste])

9 8 7 6 5

[Agoniste]-log M

Effet

Effet max


Valeurs expérimentales non assimilables à constantes d’affinité - Comparables entre labos si conditions expérimentales identiques

CE50 : concentration d’agoniste produisant 50% de l’effet maximalDE50 : dose d’agoniste produisant 50% de l’effet maximalpD2 = -log10 (CE50) (traduit l’affinité, mais pas valeur d’affinité absolue) : plus pD2 élevé plus affinité forte

Augmentation répartie sur 2 unités log

Effet = f(- log10 [A])

Effet

-log[A]

Emax

89 7 6 5-log(CE50)

Emax/2

2.1.1.2. Détermination de l’activité : Emax et notion d’activité intrinsèque

-log[A]

100

50

9 8 7 6

= 1

= 0,5

-logCE50

Effet (%)

C = Agoniste partiel

A et B = Agonistes entiers


-logCE50

A

BC

NB : CE50 A < CE50 B et C donc affinité de A > B et CCE50 B = CE50 C (affinités identiques)

2.1.1.2. Détermination de l’activité : Emax et notion d’activité intrinsèque

agoniste partiel (réponse maximale relativement faible) suggère changement de conformation partiel du récepteur et signalisation intracellulaire faible en présence d’un agoniste entier, les agonistes partiels exercent en partie un effet antagoniste (donc par ex, attention à l’administration d’un agoniste morphinique partiel (antalgique) chez un morphinoname = risque de précipiter un syndrome de manque)


-log[A]

100

50

9 8 7 6

Effet (%)

Agoniste partiel

Agonistes entiers

en partie effet antagoniste de C par rapport à A ou B si A ou B présents en même temps que C

A

BC

Antagonisme compétitif : liaison de l’antagoniste sur le site de liaison de l’agoniste

Différents types d’antagonisme :

Antagonisme non compétitif : liaison de l’antagoniste sur un site de liaison du récepteur distinct du site de liaison de l’agoniste

pas d’effets propres étude par observation de la modification de l’effet de l’agoniste correspondant

2.1 Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes

Antagonisme surmontable : déplacement courbe vers la droite

sans diminution effet maximum pentes des courbes avec et sans antagoniste = parallèles

Ex : cas des antagonistes compétitifs réversibles


Effet

agoniste seul

+ antagoniste

-log [agoniste]

Antagonisme insurmontable : diminution de l’effet maximum de l’agoniste

Ex : cas des antagonistes non compétitifs


Effet

-log [agoniste]

agoniste seul

+ antagoniste

2.1.1.1 Détermination du pA2 (ou pKB) d’un antagoniste

Pour antagonisme surmontable compétitif pA2

Etude de l’effet de plusieurs concentrations (doses) d’antagoniste sur la courbe concentration (dose)-réponse de l’agoniste

Déplacement vers la droite de la courbe concentration (dose)-réponse de l’agoniste est fonction de l’affinité de l’antagoniste et de sa concentration (dose)

Effet

agoniste seul

+ antagoniste

-log [agoniste]


Quantification de la réponse de l’agoniste en absenceet en présence antagoniste

= fonction loi action de masse et théorie occupation des

récepteurs

Réponse identique si conditions identiques

d’occupation du récepteur par l’agoniste


En absence d’antagoniste :

Pour une concentration A d’agoniste, une fraction des récepteurs A est

occupée avec pour résultat un effet E


A + R AR

Effet E

A

Effet : E

A ++ B ++ R AR + BR ’A

- fraction des récepteurs occupés par la concentration A d’agoniste: ’A

- Compétition entre A et B pour se lier à R

effet pour la même concentration A d’agoniste

- Fonction des concentrations des ligands

En présence d’antagoniste :


en présence d’antagoniste B et de la même concentration A d’agoniste:

Pour occuper même fraction de récepteurs et obtenir même effet, il faut augmenter la concentration d’agoniste A’ telle que A’>A et A = A’

A’R + + BRA’ ++ B ++ R

Effet E

’A=A

A’ > A Effet : E

A ++ B ++ R AR + BR’A


En absence d’antagoniste :

A + R AR

Effet E

A

A’R + + BRA’ ++ B ++ R

Effet E

’A = A

A’ > AEffet : E

A ++ B ++ R AR + BR’

A

En présence d’antagoniste :

rapport de concentrations de l’agoniste occupant la même fraction de récepteurs et donnant le même effet en absence et en présence d’une concentration d’antagoniste

= A’/A = rapport des concentrations équi-actives

log10 ((A’/A) – 1) = log10 [antagoniste] – log10 KB

Représentation graphique : représentation de Schild = droite

Calcul du rapport des concentrations équi-actives (ou rapport des doses équi-actives = « dose-ratio ») et représentation graphique de Schild


Intersection de la droite de Schild avec axe des abscisses pA2

pA2 = - log de [antagoniste] (molaire) qui oblige à doubler la concentration

d’agoniste pour obtenir le même effet qu’en absence d’antagoniste

Plus le pA2 est , plus l’affinité de l’antagoniste pour le récepteur

lorsque log ((A’/A) – 1) = 0 A’/A = 2

log10 ((A’/A) – 1) = log10 [antagoniste] – log10 KB


pA 2

Log 10 (A’ ‘’ ‘’’/A - 1)

- log10 [antagoniste]0

1

2

3

log10 (a-1)

log10 (b-1)

log10 (c-1)

Représentation graphique de Schild

a

a = A’/A

b

b = A’’/A

c

c = A’’’/A

agoniste seul

Effet

[agoniste]A A’

A + antagoniste B : [B1]

A’’


A’’’



permet caractériser l’affinité d’une nouvelle molécule synthétisée vis à vis de récepteurs connus

détermination de KD

permet caractériser les récepteurs d’un tissu ou d’une cellule en utilisant des ligands connus

détermination de Bmax (nombre maximal de récepteurs)

2.2 Liaison spécifique haute affinité

2.2.1 Réalisation des études de liaison

- Préparations subcellulaires :* homogénat

* membranes* récepteurs purifiés ou cellulaires

- Utilisation de ligand marqué = radioligand (L*) : 3H, 14C, 125I

- 3 étapes : incubation, séparation, mesure


L*

récepteurs

Séparation

* **

** *** *

L*R

Mesure

* **

Mélange scintillant

Incubation

**

**

**

*

**

*


radioligand L* en présence d’une population de récepteurs (conditions précises de temps, pH, T°C)

formation complexe L*R

Centrifugation ou filtration

séparation ligand libre L* et complexe L*R

Radioactivité retenue sur le filtre

quantification complexe L*R

Liaison non spécifique : liaison à sites de fixation autres que récepteurs- faible affinité- non saturable

Liaison spécifique : liaison à des récepteurs- forte affinité- critère de saturabilité


Mesure de la liaison totale= liaison spécifique + liaison non spécifique

Protocoles expérimentaux permettant de déterminer liaison spécifique

Méthode par saturation

Méthode par compétition


détermination de la liaison totale

Première série d’expériences = concentration récepteur fixe et concentrations croissantes de ligand marqué (L*):

Deuxième série d’expériences = tubes dans conditions identiques + surcharge ligand non marqué (L):

- Compétition entre L et L*- L >> L* L en excès déplace L* des récepteurs (car nombre limité)- mais pas de compétition pour les sites de liaison non spécifiques

(car nombre infini)

détermination de la liaison non spécifique

2.2 Liaison spécifique haute aff 2.2.2 Méthode par saturation

Liaison du radioligand

L*R

[L*]

liaison spécifique

liaison non spécifique

liaison totale

Liaison spécifique = différence entre les 2 mesures


Avec densité de sites de liaison spécifique : [Rt] = Bmax = [R] + [L*R]

Détermination de l’affinité du ligand pour le récepteur :

et loi d’action de masse : KD = ([L*] x [R]) / [L*R]

KD : [radioligand] requise pour occuper 50% des récepteurs

KD = ([L*] x (Bmax – [L*R])) / [L*R]

Si [L*R] = Bmax/2 KD = [L*]

plus KD faible, plus l’affinité du ligand est grande


- Nature hyperbolique de la liaison spécifique : [L*R]

[L*]

liaison spécifique100%

50%KD

Bmax

-Transformation en régression linéaire : 1) Représentation de Scatchard2) Représentation de Hill


Représentation de Scatchard

détermination précise KD et Bmax (quantité totale de récepteurs dans la préparation) si conditions expérimentales strictes, suffisamment de points expérimentaux …

B/F

Pente = -1/K D

B

Bmax

Bmax /K D

[L*R] = Bound = B

[L*] = Free = F

- ordonnée : B/F - abscisse B

B/F = -1/KD x B + Bmax/KD


Représentation de Scatchard

Ex : en augmentant le nombre de points expérimentaux, il est possible de « découvrir » une 2° population de récepteurs dans la préparation, sur lesquels le ligand radioactif se fixerait avec une affinité plus faible que sur la 1° population

B/F

Pente = -1/K du radioligand pour la 1° population de RrD

B

B de la 1° population de Rrmax

Bmax /K D


Bmax /K D

B de la 2° population de Rrmax

Pente = -1/K radioligand 2° population de RrD

Représentation de Hill

- ordonnée : log10 (B/(Bmax-B)

- abscisse : log10 [L*]

log10 (B/(Bmax-B) = nlog10 F-log10 KD

- log [L*]

Log (B/(Bmax - B))

pente = n


- Pente de la droite n représente le nombre de Hill correspondant au nombre de sites par récepteur

Si n = 1 : loi d’action de masse vérifiée : 1 site de fixation pour le ligand

population homogène de récepteurs

Si n > 1 : présence de plusieurs sites d’affinité différente pour le ligand population hétérogène de récepteurs

Représentation de Hill Quantifier la déviation éventuelle de l’interaction ligand récepteur de la loi d’action de masse :


- Mise en présence d’une concentration déterminée de récepteur [R] et de radioligand [L*]

Affinité d’un ligand non marqué pour son récepteur R proportionnelle

au pouvoir de déplacement d’un radioligand L* de caractéristiques (KD) connues

X se fixe sur le récepteur et déplace L*

- Addition de concentrations croissantes ligand non marqué X à étudier

radioactivité en fonction affinité de X et L* pour récepteur

2.2 Liaison spécifique haute aff 2.2.3 Méthode par compétition

Liaison spécifique à haute affinité : déplacement du ligand radiomarqué

CI50

- log [X]

50 %

100 %

Liai

son

spéc

ifiqu

e du

ra

diol

igan

d [L

*R]

[R] fixe : * * *

Radioligand [L*] fixe ** *[X] croissantes :

* **

**

*


** *

CI50 : concentration inhibitrice 50

= concentration de ligand non marqué qui inhibe 50% de la liaison spécifique du radioligand.

Plus CI50 faible, plus l’affinité du ligand non marqué est grande


CI50 dépend de la concentration et du KD de radioligands L*

comparables uniquement dans des conditions expérimentales strictement identiques

Ou :

KI (équation de Cheng et Prusoff) :

KI = CI50 / (1 + ([L*] / KD))


KI : Valeur corrigée qui ne varie pas en fonction de la concentration ou du KD de L* assimilable à l’inverse de l’affinité du ligand pour le récepteur.

Dénominations KD et KI dépendent uniquement du protocole utilisé (saturation/compétition) ; leurs valeurs sont comparables.

Méthode par compétition = la plus utilisée car pas de nécessité de radiomarquer la nouvelle molécule synthétisée : utilisation de banque de ligands connus radiomarqués

2.2 Liaison spécifique haute aff 2.2.4 KD et KI

3. Notion de Sélectivité

Sélectivité de l’effet du médicament pour l’effet recherché E1 vis à vis effet secondaire E2 =

Rapport : Concentration ou dose effet E2

Concentration ou dose effet E1CE50 ou DE50

Sélectivité d’un ligand pour la cible R1 vis à vis de la cible R2 =

affinité pour R2

affinité pour R1Rapport :

Notion essentielle à la connaissance d’un médicament

Comparaison de la liaison spécifique d’un ligand à 3 récepteurs R1, R2, R3 en fonction de la concentration du ligand

> 100 Ligand sélectif de R1 par rapport à R3

< 10 Ligand non sélectif de R1 par rapport à R2

KD R3

KD R1Rapport : = 1000

KD R2

KD R1Rapport : = 3

3. Notion de Sélectivité (étude liaison spécifique haute affinité)

Sélectivité et marge thérapeutique d’un médicament

Effet

-log[concentration]89 7 6 5

Emax/2

Effet thérapeutiqueEffet indésirable

CE50(ET) CE50(EI)

Marge thérapeutique =(= espacement entre courbes)

CE50(E Ther)CE50(E Ind)

Plus la marge thérapeutique est élevée (= plus l’espacement entre les courbes est grand, avec courbe « effet indés à droite de courbe effet thérap), plus la sécurité du médicament est importante

3. Notion de Sélectivité (approche fonctionnelle)

Que choisir pour bien comparer 2 ligands ?

Comparer efficacité de divers agonistes sur un système expérimental unique CE50 peuvent être comparées de manière fiable par

méthode fonctionnelle

Comparer affinité de divers ligands sur divers systèmes expérimentaux

comparer les KD méthode de liaison spécifique à haute affinité

CONCLUSION

CONCLUSION

Paramètres mesuréscomparables d’un labo à un autre ? (indépendamment des conditions expérimentales locales)

Etudes fonctionnelles

CE50 / DE50 non

pD2 non

pA2 (antagonistes compétitifs) pA2 assimilable à pKB

plus ou moins

Etudes de liaison à haute affinité

KI oui

KD oui

CI50 non (calculer KI)