(Aus dem Zoologischen Institut GieBen.)

O B E R D I E VON H. W. KRANZ B E S C H R I E B E N E N K R I S T A L L - B I L D U N G E N IM I N N E R E N D E R ROTEN BLUTKORPERCHEN.

Von

H. TSCHACHMACHTSCttlAN (Erivan).

Mit 7 Textabbildungen.

(Eingegangen am 20. Oktober 1931.)

Um meinem Wunsche, mich in die Methodik der mikroskopischen Untersuchungen im polarisierten Lichte einzuarbeiten, entgegenzu- kommen, hat mir Herr Prof. W. J. SCHMIDT freundlichs~ angeboten, die yon Dr. KRASZ (1928) in den roten BlutkSrperchen entdeckten Kristallbildungen nachzuprfifen. Dieser Autor mSchte die Kristalle als eine Verbindung des Hdmoglobins mit irgendwelchen vorlgufig unbe- kannten Substanzen ansprechen (S. 226 a. a. 0.). Es lag aber der Verdacht nahe, dab die Kristallbildungen yon dem Paraffin herrfihren kSnnten, mit dem das yon KRANZ zur Untersuchung benutzte Material jedesmal bearbeite~ w a r . -

Die Entdeckung der Kristallbildungen in den Erythrocyten machte KRA~Z an Schnitten des Augapfels zwischen gekreuzten Nikols: bei aufmerksamer Untersuchung der mit Blur gefiillten Gefi~Be stellte er im Inneren der roten BlutkSrperchen doppelbrechende Gebilde fes~. Welter land KRANZ durch mtihsame und zeitraubende Untersuchungen, wie er sagt, dal3 diese Kristalle nur bei bestimmter Behandlung zutage treten, und zwar bei Anwendung yon Kaliumbichromat als Fixiermittel, dem ein Paraffinverfahren folgen muff.

K ~ z hat mit groBer Sorgfalt eine Reihe yon Methoden auf ihren Einflul3 fiir das Auftreten der Kristalle geprfift. Er machte z. B. Blut- ausstriche nach der Agarmethode (KOH~), stellte Prgparate mit Zelloidin- verfahren her - - mit negativen Resultaten. Fixierung mit Formol, Sublimat, Pikrinss weiter nach CArbOY, Mt2LLER, ORTH, ZENCKER 1 U. a. gaben auch nichts Positives. SchlieI~lich zeigten zahlreiche Versuche mit den Salzen der Chromsgure, dal~ die Kristallisation am besten zustande kommt, wenn das Blur mit , ,piasmaerhaltenden" (Buxc~-

1 KSrnige doppelbrechende Gebilde aui3orhalb der Erythrocyten.

~ber die Kristallbildungen im Inneren der roten BlutkSrperchen. ][]5

HARD) Chromsalzen 1 fixiert wird. Dabei ,,lassen" wohl bemerkt ,,die mit Kaliumbiehromat vorbehandelten Zelloidinpraparate keine doppel- brechende Gebilde in den roten BlutkSrperchen auftreten" (KRANZ, S. 262).

Weiter hat KRANZ nicht weniger sorgfaltig die Natur der Kristalle gepriift. Von Interesse ist ffir uns, in weleher Weise er die Annahme, die doppelbrechenden Gebilde in den BlutkSrperchen seien Kalium- bichromatkristalle, ausschaltete. Dabei stellten sich namlich folgende beachtenswerte Eigenschaften der Kristalle heraus: 1. die Kristalle sind unlSslich in Wasser, 2. sie zeigen ein positives Warmephanomen, d .h . schmelzen beim Erwarmen bis 48,5 o und kommen beim Abkfihlen (yon 35 ~ an) wieder zum Vorsehein, 3. sie sind keinem EinfluB der Belichtung unterworfen. Ferner erfahren wir, da[~ sie 15s]ich in ~ ther und Alkohol und unl6slieh (!) in Xylol sind. KRANZ denkt auch an die M5glichkei~, ,,dab es sieh bei unseren doppelbreehenden Substanzen evtl. aueh um Anteile des Paraffins handelt, das bei dem Verfahren mSglicherweise in die BlutkSrperchen eingedrungen sein kSnnte" (S. 262). Er glaubt aber, diese MSglichkeit auf Grund logischer f~ber- legung 2 beseitigt zu haben.

Nachdem im vorausgegangenen die Momente fiir die Vermutung, die Kristallgebilde kSnnten yon dem Paraffin herrfihren~ kurz hervor- gehoben sind, mSchte ich zu den Ausffihrungen fibergehen, die den Verdacht von Herrn Prof. W. J. SCHMIDT bestatigen.

Meine naehste Aufgabe war, unter strenger Berficksich~igung der von KRANZ angewandten Technik, dieselben Kristallbildungen in den BlutkSrperehen entstehen zu lassen. Ich land aber bei KRANZ die Methode der Darstellung leider nicht genfigend detailliert angegeben. Es fehlten z. B. die Angaben fiber Fixierungsdauer, Konzentration des Kaliumbichromats, die Menge des ihm zugesetzten Eisessigs usw. Dieser Umstand komplizierte insofern die Sache, als ich versehiedene Varianten der Bearbeitung des Materials anzustellen genStigt war, ohne zunachst die Sicherheit auf Erfolg zu haben. Die Bedenken erwiesen sich abet sparer als grundlos; denn in allen Pr/~paraten waren Kristalle vollkommen identiseh mit denen yon KRANZ ZU sehen, was auch die Photogramme - - die ich der Kunst und Freundlichkeit des Herrn Dr. W. E. ANKEL verdanke ~ bestatigen. Abb. 1. gibt eine Stelle aus einem Original- praparat yon Herrn Dr. KRANZ wieder, das dieser Herrn Prof. SCHMIDT freundlichst fiberlassen hatte, Abb. 2 ein von mir nach der Methode yon KRANZ herges~elltes Praparat .

1 Yon den Mischungen der einzdnen plasmaerhaltenden und plasmazerst6ren- den Chromverbindungen ergaben nur Kalium- und Bariumbichromat sch6ne Kristalle.

2 ,,Da nun . . . . die mit anderen Fixierungsfliisslgkeiten . . . . vorbehandelten Paraffinpraparate keine Spur yon Doppelbrechung innerhalb der Erythrocyten zeigen . . . . " (S. 262}.

] l 6 H . T s c h ~ c h m a c h t s c h i a n :

~-bb. 1. 0riginalpr~tparat yon KRANZ: Verschiedene Kris ta l lbi ldungen in den ro ten BIutkSrperchen zwischen gekreuzten Nikols. I m m . ~/~a, Okul. 8 • (Phot. ANKEI,).

A.bb. 2. Nach der ~r yon KRANZ hergestell tes P r ~ p a r a t lni~ Kr is ta l lb i ldungen in den ro ten BlutkSrperchen zwischen gekreuzten Niko]s. ][mm. ~/~a, 0kul . 8 • (Phot. AN]~EI~).

t~ber die K r i s t a l l b i l d u n g e n im I n n e r e n der ro ten Blu tk6rperchen . ] 17

Die Pr~parate waren unter Berilcksich~igung aller Vorsichtsma~- regeln, den Angaben yon KRANZ folgend, aus Blutgerinnsel hergestellt. Dem Kuchen.des eben geronnenen Ochsenblut~s wurden mit zwei Rasier- klingen drei St/icke aus der Mitre ausgeschnitten; dann kamen die St/lcke, auf diinn ausgezogene Glasnadeln aufgespieBt, demnach allseits frei, in 20/oige Kaliumbichromatl6sung, der 1 Volumprozent Eisessig zugesetzt war. Nach 25 Stunden wurden alle drei Stiicke (die wir mit A, B, C be- zeichnen wollen) in eine 30/0ige Kaliumbichromatl6sung -k 1-Volumprozen~ Eisessig iibertragen fiir eine verschiedene Fixierungsdauer: A 6 Stunden, B 46 Stunden und C 4 Tage. Die weitere Behandlung bis zum Paraffin war flit alle Stiicke gleich: Auswaschen unter fiieBendem Wasser w/ihrend 32--48 Stun@n; Entwitssern vom 15%igen bis absoluten Alkohol 11/2--2 Tage; dann Xylol. Noch im 96%igen Alkohol wurde jedes Stiickchen in je drei Teile geteilt (AI, AH, AII_~ usw.), damit jedes ver- schieden lang fixierte Stiick mit dreierlei Paraffinsorten yon den Schmelz- punkten 1 : I. 50--540; II. 54--580; III . 62--660 C getrs werden k6nn~e.

St f i ckA

Dauer der Fixierung in 3*/oigemi~aliumbichromat

6 Stunden

A~

Tabel le 1.

Stiick B

Dal~er der Fixierung in 3~ Kaliumbichromat

46 Stunden

BI Bit BIII

Stfick C

Dauer der Fixierung in 3~ Kaliumbichromat

4 Tage

C[ CII CIIt

= .E

Als 7,5/z und dickere Schnittpr/~parate mit den dem Originalpr/~parat von KRANZ genau entsprechenden Kristallelementen fertig vorlagen, wurde das Verhalten der KristMlchen bei verschieden hoher Temperatur beobachtet. Dafiir benutzte ich den Heiztisch nach Dr. EISENBERG v o n

E. L~ITz-Wetzlar. Und zwar priifte ich zwischen gekreuzten Nikols alle Pr/iparate der Reihe nach bei steigender (bis 70 ~ und (bis Zimmer- temperatur) sinkender Temperatur und legte die Temperatur lest, bei der die Doppelbrechung der Kristalle verschwand bzw. wiederkehrte.

Die Mittelwerte der Resultate bei der Versuchsreihe A waren folgende :

Tabel le 2.

Temperat'ur, Temperatur, Pr~parat Schme]zpunkt bei der die Kris ta l le bei tier die Kristal le

yon Stiick des Paraffins schmelzen wieder auftreten

A[ A[I AIt[

5 0 - - 5 4 0 54- -580 62 - -66 0

550 650 67 *

490 50 0 65 u

1 Die S c h m e l z p u n k t e der ve r sch iedenen Para f f ine w u r d e n m i t Hilfe des Heiz- t i sehes (s. u.) b e s t i m m t .

] 18 H. Tschachmachtschian:

Die Tabelle 2 zeig4 unzweifelhaft, dab die HShe der Temperatur, bei welcher zwischen gekreuzten Nikols die Doppelbrechung der Kris~Mle erliseht bzw. wiederkehrt, d .h . also die Kristalle schmelzen oder die Schmelze kristallisiert, der HShe des Sehmelzpunktes des jeweilig benutzten Paraffins entspricht. Also: je weicher das Paraffin, um so tiefer die Temperatur, bei weleher die Kristalle in den roten Blut- kSrperchen zur Vernichtung k o m m e n - und umgekehrt.

Abb. 3. N a c h der 9/Iethode yon KRANZ hergeste l l tes n n d e n t p a r a f f i n i e r t e s P r a p a r a t yon Ochsenblu t i m gewShnl ichen Licht . I m m . */Ta, Okul . 8 x (Phot . ANKEL).

Ist es nun wirklich das Paraffin, das in den BlutkSrperchen nach dem Entparaffinieren der Schnitte noch zuriickgeblieben ist, so muB es m6glich sein, dasselbe dutch Xylol zu entfernen. Fiir diesen Zweck habe ich ein Stiickchen des in Paraffin eingebetteten Objektes in einer Schale mit Xylol in den Paraffinofen (60 ~ C) gebracht. Nach 24 Stunden wurde ein Teil von dem so behandelten Material (Ochsenblut) auf einem Objekttr~ger zerrieben und zwischen gekreuzten Nikols untersucht: es waren keinerlei doppelbrechende Partikelchen zu linden. Daneben habe ich einige Objekttri~ger mit darauf aufgeklebten Schnitten (ohne Deckglas) in Xylol gebracht und nach einer Woche diese im Xylol befindlich in den Paraffinofen gebracht. Nach mehreren Stunden aus dem Paraffinofen herausgenommene Pri~parate zeigten zwischen ge- kreuzten Nikols in den Blutk6rperchen nur ste]lenweise einige Gruppen

~ber die Kristallbildungen im Inneren der roten Blutk6rperchen. 119

yon doppelbrechenden Elementen, die meist auch bedeutend kleiner waren. Die Photogramme (Abb. 3 u. 4) zeigen dieselbe Stelle an einem solchen entparaffinierten Pr/~parat bei gleicher Optik im gewShnlichen Licht und zwischeD gekreuzten Nikols.

Noch mehr iiberzeugt man sich yon der Natur der Kristallbildungen in den EryShrocyten, wenn man dieselben mit Paraffinkristallen vergleieht.

~kbb. 4. N a c h tier !Ylethode y o n t~RANZ herges te l l tes u n d en tpa r~ f f in i e r t e s P r a p a r & t Yon O c h s e n b l u t zwischen g e k r e u z t e n Nikols . Das P r f i p a r a t zoigt dieselbe Stel le wie in A b b . 3.

I m m , 1/,a, Okul . 8 • (Phot . ANKEL).

Auf SeRe 265 seiner Arbeit gibb uns KRANZ folgende Charakteristika der Kristalle der roten BlutkSrperchen: ,,Diese rechteckigen St/~bchen zeigten nun eine ausgesprochene Liingserstreckung in einer Richtung. Ihre AustSschung war orientiert, der optische Charakter der L/~ngs- richtung negativ".

Und wie sind die Kristalle von Paraffin ? Bei langsamer Erstarrung geschmolzenen Paraffins auf einem Objekt-

tr/~ger bilden sich sehr feine und lange Nadeln, die sich bald zu einem Netzwerk zusammenschlieBen. Wei~erhin wachsen die Kristalle zu mehr oder weniger breiten Gebilden aus, die regellos in verschiedenen Richtungen iibereinander liegen (vgl. Abb. 5). SchlieBlich liegt eine voll- kommen geschlossene kristalline Paraffinschicht vor. Diese Paraffin- kristalle zeigen langgestreckte Form mit verjfingten Enden, 15schen der

120 H. Tschachmachtschian:

Lgnge nach aus und sind in bezug auf diese I~iehtung optiseh negativ. ~ ber- einstimmende Angaben fiir Paraffinkristalle finden wir bei P. GAV]~ERT: ,,Ils s'6teignent suivant leur longueur, sont s allongement optique n6gatif . . . . . . (S. 327, 1910). Bedenkt man, dag die Kristalle im Inneren der roten BlutkSrperehen unter anderen Raumverh~ttnissen sieh zu bi lden hatten als die Paraffinkristalle auf dem Objekttr~ger, so ist es klar, dab man von verjtingten Enden der oben besehriebenen Paraffin- kristalle absehen und dieselben als ,,reehteckige .St~ibchen" betrachten

Abb . 5. Pa ra f f ink r i s t a i l e , herges te l l t d u t c h E r s t a r r e n "geschmolzene~ P a r a f f i n s zwischen ObJekttr~tger u n 4 Deckg las u n t e r g e r i n g e m D r u c k . Obj. 3, Okul . 8, Pe r ipL (Pho t . A ~ - L ) .

kann. Somit s t immt die yon KRANZ oben angefiihrte Charakteristik auch fiir die Paraffinkristalle und umgekehrt.

Zwischen gekreuzten Nikols zeigt ein auf einem Objekttr/tger unter dem Deckglas zur Erstarrung gebrachtes Paraffinprs (Abb. 5) Stellen, die zwischen gekreuzten Nikols unter allen Azimuten dunkel bleiben und, konoskopiseh untersucht, ein einachsiges Achsenbild mit Interferenzfarben bis Blau I I . 0. geben (Abb. 6). Betrachtet man ein solches Pr/~parat unter sgarken Objektiven zwischen gekreuzten Nikols, so sieht man, dab die langges~reckten Paraffinkristalle tats~ch- ]ich Plat ten sind, die mehr oder minder gegen die Ebene des 0bjekt- tr/igers geneigt sind, bzw. ihr parallel liegen.

DaB nun tatss Paraffinkris~alle als Pl/ittchen auftreten k6nnen, erkennt man am besten, wenn man das Paraffin aus einer XylollSsung

I)ber die Kristallbitdungen im Inneren der roten Blutk6rperchen. 121

auf dem Objekttr/~ger unter dem Deokglas auskristallisieren tggt, wie das GA~BI~RT (S. 327) angibt. Das Photogramm (Abb. 7) gibt uns ein derartiges Prs zwischen gekreuzten Nikols wieder und zeigt verschieden gelagerte rundlich bis elliptische Pl~ttchen. Die auf der Kante stehenden oder geneigten Platten zeigen Ausl6schung und op- tisch nega~iven Charakter in bezug auf die Ls Flach liegende Platten dagegen b]eiben orthoskopisch unter allen Azimuten dunkel. Diese dunklen Stellengeben im konvergenten Licht Achsenbil- der, aus denen man auf den positiv einaehsigen Charakter der Paraf- finkristalle sehliegen kann. Diese .~bb. 6. Aehsenbi ld der zentra l gelegenen Befunde finden ihre Best/~tigung bei schwarzen Stelle des in Abb. 5 darges te l l ten

Prf~parates. (Phot. ANKEL,)

Abb. 7. Rundl ich bis elliptische p la t tenfSrmige Paraff inkr is ta l le . Herges te l l t aus Xylol- 15sung auf dem Objekttr/ ' tger un t e r dem Deckglas. Obj. 3, Okul. 8 • (Phot. -~NKEL).

GROTH (1910): ,,Die hochsiedenden Kohlenwasserstoffe, deren Gemenge das Paraffin, sowie das natiirliche Erdwachs (Ozokerit) bildet, scheinen in optisch einachsigen Bl/ittchen yon sehr /~hnlichen Eigenschaften zu

]22 H. Tschachmachtschian: l~ber die Kristallbfldungen usw.

krystallisieren . . . . " (S. 524). GAUBERT (1910) spricht hingegen von optisch ein- und zweiachsigen Paraffinkristallen. Er weist aber ausdriick- lich darauf hin, dab die optisch zweiachsigen Kristalle einen sehr vari- ablenAchsenwinkelbesitzenkSnnen (S. 330). ZweiachsigeKonoskopbilder habe auch ich beobachten kSnnen, und zwar an Stellen, wo die Kristall- platten am wenigsten deutlich und typisch ausgebildet waren. Diese verschieden deutlich erscheinenden zweiachsigen Achsenbilder kSnnen wohl nur durch ein Zusammenwirken verschiedener geeignet gelagerter einachsiger Plat ten zustande gekommen sein.

l~achdem Plattenform (optische Achse senkrecht zur F1/iche) fiir die Paraffinkristalle mit Sicherheit festgestellt ist, 1/i~t sich leicht verstehen, warum die in den roten BlutkSrperchen yon KRA~Z gefundenen tafeligen Gebilde ,,keine Doppelbrechung zeigten" (S. 265), d .h . zwischen ge- kreuzten Nikols unter allen Azimuten sich dunkel verhielten. Dieser Umstand, wie auch die Reihe der oben vorgelegten Tatsachen zwingt uns zu der folgenden

Schlullfolgerung. Die yon KRA~Z beschriebenen Kristallbildungen in den roten Blut-

kSrperchen sind Paraffinkristalle, die beim Entparaffinieren der Schnitt- pr/iparate als mehr oder minder umf/ingliche Reste zurfickbleiben k5nnen.

Mit Freude ergreife ich die Gelegenheit, an dieser Stelle Herrn Prof. W. J. SCHMIDT, dcm Direktor des zoologischen Insti tutes in GieBen, meinen herzlichsten Dank auszusprechen fiir die Freundlichkeit, mit der er mir einen mit Optik, Literatur und Chemikalien wohl ausgerfisteten Arbeitsplatz zur Vefffigung gestellt hat.

Literaturverzeichnis. Kranz, H. W.: Kristallbildungen im Inneren der roten Blutk6rperchen. Z. Biol.

87, 258--268 (1928). -- Gaubert, M. Faul: Sur les cristaux mous. Bull. Soci(~t6 fran~. Min6ral. Paris 33~ 326--335 (1910). -- Groth, P.: Chemische Krystallo- graphie. 3. Teil. Leipzig: Wilhelm Engelmann 1910.