Metodi di conta batterica

MICROBIOLOGIA CRESCITA BATTERICA

by P.L.

Aspetto delle colonie batteriche

Le colonie batteriche di ogni specie cresciute in un terreno solido sono descritte per:

1. dimensione;2. aspetto;3. consistenza;4. presenza di pigmento.

1. Le dimensioni delle colonie batteriche, in condizioni di sviluppo favorevole, sono di solito uniformi nell'ambito della specie. (Ad esempio, quelle degli streptococchi sono piccole, circa 1 mm di diametro, mentre quelle degli stafilococchi e delle Enterobatteriaceae sono più larghe, e quelle delle specie Bacillus lo sono ancora di più)

2. L'aspetto è determinato dal bordo e dallo spessore della colonia. Il bordo può essere liscio (continuo) o irregolare e frastagliato. Se la colonia è più spessa al centro che ai bordi è detta rilevata, oppure se è discretamente uniforme - di aspetto simile ad un disco.

3. La consistenza della colonia può variare da un aspetto asciutto e friabile (facilmente disaggregabile) a cremosa (simile a burro) o collosa e la superficie può essere liscia, umida, asciutta o granulare.

4. Alcuni microrganismi producono colonie pigmentate, che possono essere di aiuto nella procedura d'identificazione {Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens).


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Definizioni utilizzate per morfologia della colonia

Aspetto circolare, irregolare, raggiato, rizoide

Rilievo diffuso, rilevato, poco convesso, convesso, cupuliforme, mammellonato, con o senza margine smussato

Superficie liscia, rugosa, raggiata, opaca o luccicante, inglobata, asciutta o umida

Margine continuo, ondulato, lobato, seghettato, eroso, ondulato, diffuso

Forma filiforme, diffusa, rizoide

Dimensione diametro in millimetri

Struttura amorfa, granulare, filamentosa, ondulata

Colore da luce riflessa o trasmessa

Opacità trasparente, traslucido, opaco

Consistenza cremosa, mucosa, friabile, membranosa

MICROBIOLOGIA CRESCITA BATTERICA: divisione batterica

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MICROBIOLOGIA CRESCITA BATTERICA: velocità di crescita

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Velocità di crescita:si intende la variazione del numero di cellule o della massa per unità di tempo.

Generazione: È l`intervallo di tempo durante il quale si formano due cellule a partire da un singolo individuo

Tempo di generazione. il tempo necessario a una cellula per duplicarsi.

•Molti batteri hanno tempi di generazione di compresi tra 1 e 3 ore, •alcuni microrganismi che crescono molto velocemente, dividendosi in una decina di minuti,•altri hanno tempi di generazione di parecchie ore o addirittura di giorni

Velocità di crescita:si intende la variazione del numero di cellule o della massa per unità di tempo.

Generazione: È l`intervallo di tempo durante il quale si formano due cellule a partire da un singolo individuo

Tempo di generazione. il tempo necessario a una cellula per duplicarsi.

•Molti batteri hanno tempi di generazione di compresi tra 1 e 3 ore, •alcuni microrganismi che crescono molto velocemente, dividendosi in una decina di minuti,•altri hanno tempi di generazione di parecchie ore o addirittura di giorni

MICROBIOLOGIA CRESCITA BATTERICA : metodi di conta

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Metodi di conta battericaMetodi di conta batterica

1. conta al microscopio2. camera di Petroff- Hauser3. coulter Counter4. metodi turbidimetrici (torbidità, assorbanza)5. misura del peso (biomassa)

• peso umido• peso secco

6. conteggio vitale in piastra (UFC)7. MPN8. determinazione mediante filtrazione su membrana


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Conta vitale in piastra (UFC)Conta vitale in piastra (UFC)

Figura 4.9 Tecnica della piastra per inclusione. Il campione originale è sottoposto a diluizioni seriali, in modo da ridurre in misura sufficiente il numero delle cellule microbiche presenti. I campioni con la diluizione più alta vengono poimescolati con agar caldo, quindi la miscela viene versata in piastre di petri. Le cellule isolate crescono formando colonie e possono essere usate per costituire colonie pure. Le colonie in superficie sono circolari, quelle al di sotto della superficie in genere hanno forma lenticolare.

MICROBIOLOGIA CRESCITA BATTERICA: metodi di conta

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Conta vitale in piastra (UFC)Conta vitale in piastra (UFC)

ColonieColonie• Ogni colonia è originata da una Ogni colonia è originata da una

singola cellula vitalesingola cellula vitale• Una cellula in grado di formare Una cellula in grado di formare

colonia viene indicata come Unità colonia viene indicata come Unità Formante Colonia (UFC)Formante Colonia (UFC)

• Il numero delle colonie contate sulla Il numero delle colonie contate sulla piastra corrisponde al numero di UFC piastra corrisponde al numero di UFC nell’inoculonell’inoculo


MICROBIOLOGIA CRESCITA BATTERICA: aspetto colonie

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Aspetto colonie

Aspetto colonie

Margine

Margine

Profilo

Profilo

Superfic

ie Superfic

ie


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Le crescita dei batteri in un terreno solido.

•I batteri, seminati in un terreno solido agarizzato si riproducono formando ammassi rotondeggianti, talvolta pigmentati, detti colonie.

•Ogni colonia origina da una singola cellula batterica

•Di norma le colonie diventano visibili dopo almeno 15-18 ore di incubazione, quando si raggiunge una carica di almeno 106 cellule.


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Membrane filtranti

Metodo.1. Un volume noto di campione liquido viene filtrato su membrane a pori predefiniti (0,45 -

0,22 µm); 2. la membrana è deposta sulla superficie di un terreno di coltura in capsula di Petri; 3. dopo incubazione si esegue la conta colonie4. Vantaggio: conteggio di microrganismi presenti in scarsa concentrazione in campioni

liquidi

Metodo.1. Un volume noto di campione liquido viene filtrato su membrane a pori predefiniti (0,45 -

0,22 µm); 2. la membrana è deposta sulla superficie di un terreno di coltura in capsula di Petri; 3. dopo incubazione si esegue la conta colonie4. Vantaggio: conteggio di microrganismi presenti in scarsa concentrazione in campioni

liquidi


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Si pongono tali filtri sulla superficie di terreni in

piastra.



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Conta mediante Contatore Coulter

Le cellule sono cattive conduttrici di elettricità

1. la sospensione cellulare è fatta passare in una fessura sottilissima con ai lati degli elettrodi;

2. le cellule passando interrompono il campo elettrico con conseguente caduta di voltaggio, proporzionale al volume della cellula, che è registrato dallo strumento

3. Numero e forma degli impulsi sono in relazione con il numero e le dimensioni delle cellule

Svantaggi:• conta totale • possibili errori per presenza particelle inanimate

Conta mediante Contatore Coulter

Le cellule sono cattive conduttrici di elettricità

1. la sospensione cellulare è fatta passare in una fessura sottilissima con ai lati degli elettrodi;

2. le cellule passando interrompono il campo elettrico con conseguente caduta di voltaggio, proporzionale al volume della cellula, che è registrato dallo strumento

3. Numero e forma degli impulsi sono in relazione con il numero e le dimensioni delle cellule

Svantaggi:• conta totale • possibili errori per presenza particelle inanimate


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Camera di Petroff- Hauser


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Camera di Petroff- Hauser

Vantaggi: •rapidità, •fornisce conta totale, •permette di osservare la morfologia

Svantaggi: •non differenzia cellule vive e morte; •i batteri sono difficilmente osservabili perché trasparenti

Vantaggi: •rapidità, •fornisce conta totale, •permette di osservare la morfologia

Svantaggi: •non differenzia cellule vive e morte; •i batteri sono difficilmente osservabili perché trasparenti


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Metodo MPNMetodo MPN

Il metodo MPN (Most Probable Number) è una prova presuntiva che si effettua inoculando il campione in una serie di tubi contenenti terreno liquido.Il sistema più utilizzato impiega lo stesso numero di tubi per ogni diluizione del campione in esame (solitamente si usano 3 o 5 tubi per diluizione)I tubi con il campione e il terreno appropriato dopo incubazione vengono letti identificando i tubi positivi di tre diluizioni successive significative (la positività dipende dal terreno e dalla reazione richiesta). A questi si assegna il valore 1 mentre a quelli negativi si da valore 0, dopodichè si sommano i valori ottenuti per ogni gruppo di 3 o 5 tubi alla stessa diluizione e si confrontano con le tabelle di Mac Crady. Esse riportano il valore dell’indice MPN che indica il limite inferiore e superiore entro i quali ci si può attendere la densità reale dei batteri, con una probabilità del 95%. Moltiplicando il valore corrispondente delle tabelle per l'inverso del fattore di diluizione si risale al numero presuntivo di colonie presenti nel campione iniziale espresso in MPN/g o ml.

Il metodo MPN (Most Probable Number) è una prova presuntiva che si effettua inoculando il campione in una serie di tubi contenenti terreno liquido.Il sistema più utilizzato impiega lo stesso numero di tubi per ogni diluizione del campione in esame (solitamente si usano 3 o 5 tubi per diluizione)I tubi con il campione e il terreno appropriato dopo incubazione vengono letti identificando i tubi positivi di tre diluizioni successive significative (la positività dipende dal terreno e dalla reazione richiesta). A questi si assegna il valore 1 mentre a quelli negativi si da valore 0, dopodichè si sommano i valori ottenuti per ogni gruppo di 3 o 5 tubi alla stessa diluizione e si confrontano con le tabelle di Mac Crady. Esse riportano il valore dell’indice MPN che indica il limite inferiore e superiore entro i quali ci si può attendere la densità reale dei batteri, con una probabilità del 95%. Moltiplicando il valore corrispondente delle tabelle per l'inverso del fattore di diluizione si risale al numero presuntivo di colonie presenti nel campione iniziale espresso in MPN/g o ml.

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Metodi turbidimetrici

MICROBIOLOGIA CRESCITA BATTERICA: colture continue

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ChemostatoChemostato

Sistema aperto•Apporto di terreno sempre nuovo •Allontanamento di cataboliti (tossici o prodotti utili)•Allontanamento di batteri in eccesso (molti già morti)

Education

Metodi di conta batterica