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Barbara Heinze, Für den qualitativen Indikatornachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln wurde eine spezifische Real-Time-PCR-Anwendung entwickelt. Nach kultureller Anreicherung der Lebensmittelprobe erfolgt die Durchführung der PCR im LightCycler®. Das entwickelte Nachweisverfahren erreicht gegenüber den konventionellen mikrobiologischen Methoden eine Spezifität von 100 % und führt mit einem zeitlichen Aufwand von maximal einem Tag bei einem Drittel der Zeit für Horizontalverfahren zum zuverlässigen Ergebnis. Überprüft wurde die Spezifität mit 92 taxonomisch definierten Bakterienstämmen sowohl der Familie Enterobacteriaceae als auch anderer, nicht zu amplifizierender Gruppen. Mit hoher Sensitivität ermöglicht der Enterobacteriaceen-Nachweis die Detektion einer einzelnen Bakterienzelle. Er eignet sich für die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln unterschiedlichster Produktgruppen sowie die Überwachung aller kritischen Prozessstufen in lebensmittelproduzierenden Betrieben. Mögliche Gesundheitsge-fährdungen durch Rekontaminationen und unzureichende Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene werden sicher nachgewiesen. Mit 72 Lebensmittelproben verschiedener Produzenten, Kategorien und Matrices wurde die Funktionalität des Nachweises im Vergleich mit den Horizontalverfahren zum qualitativen Nachweis von Enterobacteriaceae überprüft. Die Ergebnisse aller Untersuchungen stimmten mit denen der Mikrobiologie überein, 30 Proben wurden positiv auf das Vorhandensein der Markerorganismen Enterobacteriaceen getestet. Zielmolekül der Real-Time-PCR ist die für 23S rRNA codierende DNA-Sequenz der Enterobacteriaceen. Für das Nachweissystem wurden die forward- und reverse-Primer fw9 und rev10 sowie die Sonden HzFlu und HzRed generiert. Das in der PCR entstehende partielle Amplifikat der 23S rDNA hat eine Größe von 225 bp und wird zeitgleich mit seiner Amplifikation im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler® detektiert. Zum Ausschluss falsch negativer Ergebnisse wurde eine Interne Amplifikationskontrolle entwickelt. In Form einer kompetitiven PCR erfolgt die Amplifikation der Kontroll-DNA zusammen mit der Ziel-DNA mit den gleichen fw9- und rev10-Primern im selben PCR-Ansatz. Detektiert wird die Interne Amplifikationskontrolle während ihrer Entstehung anhand der generierten Sonden IAKRed und HzFlu im Kanal F3/Back-F1 des LightCycler®. In der Entwicklung der Konsensus-PCR kam es zur unerwünschten Amplifikation spezifischer DNA in PCR-Reaktionen ohne Untersuchungsprobe und damit zu falsch positiven Ergebnissen. Es wurde gezeigt, dass es sich hierbei um Amplifikationen kontaminierender DNA in allen getesteten Taq-DNA-Polymerasen diverser Hersteller handelte. Durch enzymatischen Verdau mit DNase I konnte reproduzierbar die vollständige Dekontamination der rekombinanten Taq-Polymerasen erreicht und die Entstehung falsch positiver Ergebnisse ausgeschlossen werden.
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Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems
für den spezifischen Nachweis von Enterobacteriaceae
in Lebensmitteln
vorgelegt von
Diplom-Biologin Barbara A. E. Heinze
Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. D. Knorr Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Berichterin: Dipl.-Ing. Dr. K. Berghof-Jäger Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10.09.2007
Berlin 2007 D 83
DANKSAGUNG Mein Dank gilt an erster Stelle meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit. Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger, Geschätsführerin der BIOTECON Diagnostics GmbH, danke ich für die Möglichkeit, die vorliegende Arbeit anzufertigen sowie für die ständige Hilfestellung und zielorientierte Diskussionsbereitschaft. Herrn Dr. Cordt Grönewald danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, wertvolle Anregungen, Ratschläge und Gespräche und für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Frau Astrid Schneider gilt mein herzlicher Dank für die hilfreichen fachlichen Diskussionen und auch die weniger fachlichen Gespräche sowie für das kritische Lesen des Manuskripts. Frau Astrid Seemann danke ich für ihre fachliche Unterstützung und Diskussion zu allen Fragen der Mikrobiologie. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der BIOTECON Diagnostics GmbH bin ich sehr dankbar für ihre Hilfsbereitschaft, die gute Zusammenarbeit und freundliche Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders bedanke ich mich bei Herrn Dirk Eimer für seine intensive Auseinandersetzung mit mir und meiner Arbeit, das Korrekturlesen, seine unermütliche Diskussionsbereitschaft und seine starken Nerven. Ich bedanke mich ganz herzlich für die Motivierung und Stärkung bei meiner Familie Christiane, Erika und Joachim Heinze. Frau Sonja Körber bin ich sehr dankbar für ihre entscheidende Unterstützung.
Inhalt
I
INHALT
Seite
Inhalt I Verzeichnis der Abbildungen IV Verzeichnis der Tabellen V Verzeichnis der Abkürzungen und Zeichen VI I EINLEITUNG 1 THEORETISCHER TEIL ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1 1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionskrankheiten 11.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittelinfektionen 51.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Enterobacteriaceae:
Salmonella 81.2.1.1 Enteritis-Salmonellose 91.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen 14 2 PRAKTISCHER TEIL DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN
LEBENSMITTELN 16
2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen 162.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR 182.2.1 Aspekte der PCR 212.3 Zielsetzung der Arbeit 24 II MATERIAL UND METHODEN 1 MATERIAL 26 1.1 Bakterienstämme 261.2 Nährmedien 281.3 Reagenzien 291.4 Enzyme 311.5 Reaktionskits 321.6 Primer und Sonden 321.7 Lebensmittelproben 351.8 Software 36
Inhalt
II
Seite 2 METHODEN 37 2.1 Anzucht von Mikroorganismen 372.2 Quantifizierung von Bakterienzellen 372.3 DNA-Extraktion 372.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss 382.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep 382.4 DNA-Quantifizierung 382.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer 382.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler® 392.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten 392.5 Endonukleasenverdau 392.5.1 Restriktionsverdau 392.5.2 DNase I-Verdau 392.6 Polymerase-Kettenreaktion 402.6.1 Standardbedingungen für die konventionelle PCR 402.6.2 Standardbedingungen für die Real-Time-PCR 412.6.3 Für den Nachweis von Enterobacteriaceae mittels Real-Time-
PCR optimierte Reaktionsbedingungen 432.7 Gelelektrophorese 442.7.1 Agarosegelelektrophorese 442.7.2 Präparative Gelelektrophorese 442.8 Klonierung von DNA-Amplifikaten 452.8.1 Ligation präparierter Amplifikate 452.8.2 Transformation in Escherichia coli 452.9 Präparation und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 462.9.1 Präparation von Plasmid-DNA 462.9.2 Restriktionsverdau präparierter Plasmid-DNA 462.10 Sequenzanalyse 472.10.1 DNA-Sequenzierung und Sequenzauswertung 472.10.2 Bearbeitung von DNA-Sequenzdaten 472.11 Überprüfung der Spezifität der Real-Time-PCR-Methode zum
Nachweis von Enterobacteriaceae 472.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Lebensmittelproben im Vergleich mit mikrobiologischen Methoden 48
III ERGEBNISSE 3.1 Auswahl der DNA-Zielregion 503.2 Erstellen von Sequenzalignments und Generieren möglicher
Primer für den Nachweis von Enterobacteriaceen-DNA 513.3 Amplifikation der 23S-5S-DNA von Enterobacteriaceen 533.4 Dekontamination der Taq-Polymerase 553.5 Testung der Primer für Enterobacteriaceen 56
Inhalt
III
Seite 3.6 Generieren der Primer und Sonden für das System zum
Nachweis von Enterobacteriaceae 583.7 Anwendung und Überprüfung der generierten Oligonukleotide
und der dekontaminierten Taq-Polymerase in der Real-Time-PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceen 60
3.7.1 Amplifikation 603.7.1.1 Hook-Effekt 613.7.2 Schmelzkurvenanalyse 623.8 Interne Amplifikationskontrolle 633.8.1 Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle 643.8.2 Integration der Internen Amplifikationskontrolle in das
Enterobacteriaceen-Nachweissystem 663.9 Optimierung der Reaktionsbedingungen für das
Enterobacteriaceen-Nachweissystem 663.10 Spezifität des Enterobacteriaceen-Nachweissytems 673.10.1 Inklusivität 683.10.2 Exklusivität 693.11 Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems 703.11.1 Überprüfung der Sensitivität mit genomischer DNA von Bakterien 713.11.2 Überprüfung der Sensitivität mit bakteriellen Zelllinien 743.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Lebensmittelproben 75 IV DISKUSSION 4.1 Entwicklung eines spezifischen Real-Time-PCR-Systems für den
Nachweis von Enterobacteriaceae 84
4.2 Kulturelle Anreicherung und DNA-Extraktion 864.3 Dekontamination der Taq-DNA-Polymerase 884.4 Kompetitive PCR mit Interner Amplifikationskontrolle 904.5 Spezifität und Sensitivität 914.6 Ausblick 96 V ZUSAMMENFASSUNG 98 VI LITERATUR 99
Inhalt
IV
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN Seite Abb. 1.1 Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen
kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von Amerika führten 4
Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis-Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2004 12
Abb. 3.1: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH am rRNA-Operon von Eubakterien 50
Abb. 3.2: Sequenzen der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH für die Amplifikation der 23S-5S-DNA im rRNA-Operon von Bakterien 51
Abb. 3.3: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) für die spezifische Amplifikation von Enterobacteriaceae-DNA
53
Abb. 3.4: Agarosegelelektrophorese einer PCR für die spezifische Amplifikation der 23S-5S-Region mit dem Primerpaar fw1/rev3 54
Abb. 3.5: Agarosegelelektrophorese nach PCR mit Perpetual Taq, ohne und mit DNase I-Verdau der Taq-Polymerase 56
Abb. 3.6: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Oligonukleotide für das Real-Time-PCR-System zum Nachweis von Enterobacteria-ceae-DNA 59
Abb. 3.7: Amplifikationskurven der Real-Time-PCR zum Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 61
Abb. 3.8: Schmelzkurven der Real-Time-PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 63
Abb. 3.9: Konstruktion des mutagenisierten DNA-Fragments für die Interne Amplifikationskontrolle des Enterobacteriaceen-Nachweises
65
Abb. 3.10: Fluoreszenz bei Anwendung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems während der Amplifikation von Ziel- und IAK-DNA im LightCycler® 67
Abb. 3.11: Sensitivitätstest der Real-Time-PCR für den Enterobacteria-ceen-Nachweis durch Amplifikation genomischer DNA von Serratia marcescens 72
Abb. 3.12: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems mit genomischer DNA von Bakterien 73
Abb. 3.13: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems mit bakteriellen Zelllinien 75
Abb. 3.14: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben 78
Abb. 3.15: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Säuglingsnahrung 81
Inhalt
V
VERZEICHNIS DER TABELLEN Seite Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und
Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen und Bedeutung 7
Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 8
Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitäts-tests 26
Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests 27Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des
DNA-Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon 32
Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der internen Amplifikationskontrolle 34
Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel 35Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver 36Tab. 3.1: Bakterienstämme der Familie Enterobacteriaceae, deren 23S-
5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten
52Tab. 3.2: Bakterienstämme diverser taxonomischer Gruppen, deren 23S-
5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten
52
Tab. 3.3: Spezifische Amplifikation mit den Primern fw1 – fw8 und rev1 – rev8 57
Tab. 3.4: Inklusivität: Im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-System detektierte Stämme der Familie Enterobacteriaceae 68
Tab. 3.5: Exklusivität: Alle im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-Systems mit Nicht-Enterobacteriaceen-Spezies überprüften Stämme
70
Tab. 3.6: Ergebnisse der Untersuchung von Lebensmitteln diverser Produktgruppen
79
Tab. 3.7 Ergebnisse der Untersuchung von Säuglingsnahrung und Volleipulver
82
Inhalt
VI
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND ZEICHEN °C Grad Celsius µg Mikrogramm (= 10-6 Gramm) µl Mikroliter (= 10-6 Liter) µm Mikrometer (= 10-6 Meter) µM mikromolar (= 10-6 molar) A Adenin A. Aeromonas Abb. Abbildung abs. absolut Abs. Absatz Acc. (englisch Accession) Zugang Aci Arthrobacter citreus ag Attogramm (= 10-18 Gramm) Amp Ampicillin API (englisch Analytical Profile Index) analytischer Profilindex Aqua dest. (lateinisch Aqua destillata) destilliertes Wasser ATCC American Type Culture Collection BCD BIOTECON Diagnostics GmbH BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Basenpaar BSA (englisch Bovine Serum Albumin) Rinderserumalbumin C Cytosin C. Citrobacter CASO Caseinpepton-Sojamehlpepton CP (englisch crossing point) dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat DGHM Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie dGTP Desoxyguanosintriphosphat DNA (englisch deoxyribonucleic acid) Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen dTTP Desoxythymidintriphosphat E. Escherichia Ed. Edwardsiella Ed. (englisch editor) Herausgeber EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Ent. Enterobacter Er. Erwinia et al. (lateinisch et alii) und andere EtBr Ethidiumbromid Fa. Firma FAO (englisch Food and Agriculture Organization) Welternährungsorganisation fg Femtogramm (= 10-15 Gramm) Fmax maximale Fluoreszenz fw (englisch forward) vorwärts g Gramm G Guanin GÄ Genomäquivalent h (englisch hour) Stunde H. Hafnia Hrsg. Herausgeber HS Heringssperma I Inosin IAK Interne Amplifikationskontrolle
Inhalt
VII
ICMSF (englisch International Comission on Microbiological Specifications for Foods) Internationale Kommission für mikrobiologische Lebensmittelspezifikationen
IPTG Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid K. Klebsiella Kap. Kapitel Kat. Katalog KbE Kolonie bildende Einheit LB Luria Bertani LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature m Meter M. Morganella M = A + C M molar Mae Methanococcus aeolicus mg Milligramm (= 10-3 Gramm) min (englisch minute) Minute ml Milliliter (= 10-3 Liter) mM millimolar (= 10-3 molar) Mse Micrococcus spec. NCBI National Center of Biotechnology Information NCTC National Collection of Type Cultures ng Nanogramm (= 10-9 Gramm) nm Nanometer (= 10-9 Meter) nM nanomolar (= 10-9 molar) Nr. Nummer OECD (englisch Organisation for Economic Cooperation and Development)
Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung P. Plesiomonas Pa. Pantoea p. a. (lateinisch per analysis) zur Analyse PCR (englisch Polymerase Chain Reaction) Polymerase-Kettenreaktion pg Pikogramm (= 10-12 Gramm) pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration pmol Pikomol (= 10-12 Mol) Prot. Proteus Prov. Providencia R = A + G rev (englisch reverse) rückwärts RNA (englisch ribonucleic acid) Ribonukleinsäure rpm (englisch revolutions per minute) Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale RNA S. Salmonella S Sedimentationskoeffizient Se. Serratia sek Sekunde Sh. Shigella spec. (lateinisch Species) Spezies, unbekannte Art ssp. Subspezies T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris Borat EDTA Puffer TE Tris EDTA Puffer Tm (englisch melting) Schmelztemperatur Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan tRNA transfer RNA U (englisch unit) Einheit ü. N. über Nacht
Inhalt
VIII
UNG Uracil-DNA-N-Glycosylase UV UltraViolett V. Vibrio V/cm Volt pro Zentimeter v/v (englisch volume per volume) Volumen pro Volumen VRBD (englisch Violet-red Bile Dextrose Agar) Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose) WHO (englisch World Health Organization) Weltgesundheitsorganisation w/v (englisch weight per volume) Gewicht pro Volumen w/w (englisch weight per weight) Gewicht pro Gewicht x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/s2) X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactose Y = C + T Y. Yersinia
I Einleitung
1
I EINLEITUNG 1 THEORETISCHER TEIL
ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionkrankheiten Lebensmittel sind Mittel zum Leben. Sie dienen der Lebenserhaltung und dem Genuss. Aber ebenso können Lebensmittel Überträger von Krankheitserregern des Menschen sein. Ihr Verzehr führt zu Erkrankungen, die mitunter tödlich enden. Nach Definition der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind durch Lebensmittel verursachte Erkrankungen „Krankheiten infektiöser oder toxischer Natur, verursacht durch Agenzien, die durch Nahrungsaufnahme in den Körper gelangen“ (Anonymus 2002a). Kontaminierte Lebensmittel weisen einen gesundheitsgefährdenden Befall mit Mikroorganismen und ihren Toxinen und/oder Rückständen von pharmazeutischen, umweltrelevanten und anderen Substanzen auf. Die vorliegende Arbeit richtet den Fokus auf Lebensmittelkontaminationen mit Bakterien als Ursachen für lebensmittelbedingte Erkrankungen. Durch Lebensmittel übertragene Infektionskrankheiten stellen weltweit ein wachsendes Gesundheits- und Wirtschaftsproblem dar, sowohl in Entwicklungsländern als auch in hochentwickelten Industrieländern (Elmi 2004). Bis zu 30 % der Bevölkerung in allen Industrieländern sind jedes Jahr von lebensmittelassoziierten Infektionen betroffen (Anonymus 2002a). In den USA erkranken nach einer Studie jährlich ungefähr 76 Millionen Bürger, circa 325.000 Personen werden in ein Krankenhaus eingewiesen und etwa 5.000 Erkrankte sterben an den Folgen der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten (Mead et al. 1999). In England und Wales werden pro Jahr rund 2,4 Millionen Erkrankungen, etwa 21.000 Krankenhauseinweisungen und über 700 Todesfälle als lebensmittelbedingt ermittelt (Adak et al. 2002). Nach Angaben der WHO ist davon auszugehen, dass diese Belastung in gleichem Ausmaß auf die meisten Länder der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) zutrifft (Rocourt et al. 2003a). Innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte haben lebensmittelbedingte Erkrankungen der Bevölkerung stark an Bedeutung gewonnen. Eine Reihe von Faktoren sind für diese
I Einleitung
2
Entwicklung verantwortlich: Intensive Massentierhaltung ermöglicht eine schnelle Durchseuchung der Tierbestände mit pathogenen Keimen wie Salmonellen, die zum Beispiel durch kontaminierte Futtermittel eingeführt werden (Jansen et al. 2005). Der Einsatz von Antibiotika als Masthilfsmittel moderner Tierhaltung führt zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen humanpathogener Bakterienstämme, die eine Therapie betroffener Patienten wesentlich erschweren (Klare et al. 1995, Poppe et al. 2006). Nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die mit resistenten Enterobacteriaceen kontaminiert sind, können diese in der Darmflora persistieren oder sich vermehren und die Resistenz auf weitere Bakterien einschließlich pathogene Arten übertragen. Durch das Bundesinstitut für Risikobewertung wurde in Deutschland in den letzten zehn Jahren bei Salmonella Isolaten verschiedener Serotypen aus Tieren, Lebensmitteln, Futtermitteln und der Umwelt ein Anstieg der Multiresistenz gegenüber antimikrobiell wirksamen Substanzen nachgewiesen. So wurden in den Jahren 2000 bis 2002 Stämme des Serovars Salmonella Typhimurium mit Mehrfachresistenzen gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Tetracyclin und Sulfonamiden aus Lebensmitteln isoliert (Helmuth et al. 2003). Der Verzehr von naturbelassenem, unbehandeltem Obst und Gemüse gilt heutzutage als besonders gesund. Fehlende Behandlung zur Keimreduktion sowie Einsatz natürlicher Dünger und ungeklärten Abwassers mit möglicher Kontamination für die Bewässerung in der Landwirtschaft erhöhen aber das Risiko von Infektionen (Beuchat und Ryu 1997, Tauxe et al. 1997). Zu einem größeren Krankheitsausbruch durch Toxin produzierende Citrobacter freundii kam es in einem Kindergarten in Deutschland nach dem Verzehr von Butter mit frischer Petersilie. Vehikel für die Lebensmittelinfektion war die Petersilie aus biologischem Anbau, die mit kontaminierter Schweinegülle gedüngt worden war (Tschäpe et al. 1995). Im Rahmen einer Erfassung über weltweite Krankheitsausbrüche durch mit Enterobacteriaceen kontaminierte rohe Sprossen, besonders von Alfalfa und Mungbohnen, kommen Taormina et al. (1999) zu der Empfehlung, dass Kinder, Ältere und Menschen mit eingeschränkter Immunabwehr als besonders gefährdete Personen grundsätzlich keine rohen Sprossen verzehren sollten. Im Vergleich zu frischem Obst und Gemüse stellen Sprossen ein deutlich höheres Risiko dar. Bakterien in kontaminierten Samen können sich durch den Prozess des Sprossens bei 21 °C bis 25 °C und viel Feuchtigkeit drastisch vermehren, ohne sichtbare Anzeichen von Qualitätsbeeinträchtigung zu hinterlassen (Breuer et al. 2001). Auch die Lebensmittelindustrie hat sich auf das geänderte Verbraucherverhalten eingestellt und stellt Produkte her, die keine Konservierungsstoffe mehr enthalten. Bei Nichtbeachtung entsprechender Lager- und Transportbedingungen können Keime in diese Lebensmittel gelangen und sich dort vermehren (Ammon und Bräunig 2002). Die Entwicklung der Lebensmitteltechnologie führt zu einem immer größer
I Einleitung
3
werdenden Angebot von Nahrungsmitteln, besonders sogenanntem „ready-to-eat food“. Diese Produkte werden oft als Tiefkühlware über längere Zeiträume gelagert und können zur Verbreitung kälteadaptierter pathogener Keime beitragen (Rocourt et al. 2003b). Moderne Vermarktungsstrategien und globaler Lebensmittelhandel erhöhen das Risiko, dass durch zentralisierte Herstellung und Bearbeitung der Nahrungsmittel und verlängerte Transportwege und -zeiten bei einer Kontamination eine Vielzahl von Menschen weltweit betroffen sein können, wobei die Vielfalt möglicher Krankheitserreger für jeden Einzelnen zunimmt (Rocourt et al. 2003a). In den USA handelt es sich bei dem Angebot an frischem Obst und Gemüse, welches in Lebensmittelgeschäften und Restaurants erhältlich ist, bereits zu über 75 % um importierte Ware aus aller Welt (Hedberg et al. 1994). Ständig wachsender weltweiter Tourismus führt ebenso zu einer Globalisierung lebensmittelbedingter Erkrankungen. Nach einer Studie der WHO sind 80 % bis 90 % der gemeldeten Salmonellosen in skandinavischen Ländern auf internationalen Tourismus zurückzuführen, und die Wahrscheinlichkeit, auf Reisen mit einer Lebensmittelinfektion konfrontiert zu werden, liegt, je nach Reiseziel, bei 20 % bis 50 % (Käferstein et al. 1997). Auch demographische Veränderugen – eine immer älter werdende Bevölkerung und mehr immungeschwächte Personen – führten dazu, dass die Zahl lebensmittelbedingter Infektionskrankheiten in den letzten zwei Jahrzehnten deutlich angestiegen ist (Ammon 2005). Die Vielfalt von Risikolebensmitteln, die als Überträger für Krankheitskeime dienen können, ist auffallend groß. Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel, die einem WHO-Bericht zufolge im Jahr 2000 in den USA zu 1493 Krankheitsausbrüchen führten (Rocourt et al. 2003a), sind in Abbildung 1.1 dargestellt. In 773 der Ausbrüche konnten die betroffenen Lebensmittel ermittelt werden. 101 Ausbrüche (etwa 13 % der Fälle, in denen das Lebensmittel bekannt war) wurden durch den Verzehr von Fleisch und Fleischprodukten ausgelöst. 81 Ausbrüche wurden durch kontaminiertes Geflügel, 79 Ausbrüche durch Fisch und Meeresfrüchte (jeweils rund 10 %) und 64 Ausbrüche durch Obst und Gemüse (circa 8 %) ausgelöst. In 13 Fällen (etwa 2 %) waren Getreide oder Teigwaren beziehungsweise Süßwaren kontaminiert. In 12 (rund 2 % der Ausbrüche mit bekannter Kontaminationsquelle) der Fälle war der Konsum von Ei und Eiprodukten oder von Milch und Milchprodukten Ursache für Erkrankungen. Die übrigen kontaminierten Lebensmittel dieser Studie waren in 183 Fällen der Krankheitsausbrüche Mischgerichte (etwa 23 %), 157 mal zusammengesetzte Lebensmittel (rund 20 %) und 58 mal sonstige Lebensmittel (etwa 8 %).
I Einleitung
4
Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel, die zu Krankheitsausbrüchen führten
Obst und Gemüse8%
Ei und Eiprodukte2%
Milch und Milchprodukte
2%
Süßwaren2%
Fleisch und Fleischprodukte
13%
Getreide, Teigwaren2%
Zusammengesetzte Lebensmittel
20%
Sonstige Lebensmittel8%
Fisch und Meeresfrüchte
10%
Geflügel10%
Mischgerichte23%
Abb. 1.1: Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen
kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von Amerika führten (nach Rocourt et al. 2003a)
Häufigstes Krankheitsbild lebensmittelassoziierter Erkrankungen sind Gastroenteritiden. Der Krankheitsverlauf dieser Magen-Darm-Infektionen reicht von geringer Gesundheitsbeeinträchtigung ohne Notwendigkeit ärztlicher Behandlung über Erkrankungen mit stationärer Behandlung bis hin zu schwerer systemischer Infektion und Todesfällen. Das Ausmaß der Erkrankung hängt von einer Reihe Faktoren wie gesundheitlicher Konstitution, Ernährung und Lebensalter ab. Infolgedessen sind Auftreten, Schwere der Erkrankung und Sterblichkeitsrate durch Lebensmittelinfektionen in unterschiedlichen Bevölkerungsgruppen verschieden stark vertreten. Besonders gefährdet und damit wesentlich häufiger betroffen sind Kinder, Schwangere, Immungeschwächte und ältere Menschen (Levine et al. 1991). Zum Personenkreis dieser Risikogruppe zählten in den 1990er Jahren bereits 20 % der Menschen in den USA, wobei die Tendenz deutlich steigend ist (Gerba et al. 1996, Rocourt et al. 2003a). Mishu et al. (1994) führten in den USA eine Erhebung zu Krankheitsausbrüchen durch lebensmittelbedingte Infektionen mit dem Serovar Salmonella Enteritidis in den Jahren 1985 – 1991 durch. Dabei kamen sie zu dem Ergebnis, dass die Rate der Todesfälle in Altenheimen und Krankenhäusern 70fach höher liegt als in anderen Einrichtungen.
I Einleitung
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1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittel-infektionen
Typische Keime bakterieller Lebensmittelinfektionen sind neben Campylobacter, Listeria und Vibrio häufig Vertreter der Familie Enterobacteriaceae. Salmonellosen, ausgelöst durch die Enterobacteriaceen-Gattung Salmonella, gehören zu den weltweit häufigsten lebensmittelassoziierten Infektionen und führen jährlich zu mehreren Millionen gemeldeten Erkrankungen und tausenden Todesfällen (Anonymus 2005a). Die Bakterien der Familie Enterobacteriaceae (Rahn 1937) mit der Typspezies Escherichia coli gehören zur γ-Subklasse der Proteobacteria und umfassen mehr als 200 Spezies in 46 Gattungen. Sie sind gramnegative, nicht sporulierende Stäbchen mit einer Länge von 1,0 bis 6,0 µm und einem Durchmesser von 0,3 bis 1,5 µm. Enterobacteriaceen sind fakultativ anaerob, Oxidase-negativ, fermentieren Glucose und reduzieren Nitrat zu Nitrit (Brenner 1984). Die Fähigkeit, Laktose zu vergären, differenziert Coliforme, wie zum Beispiel Vertreter der Gattungen Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, und Citrobacter von solchen Enterobacteriaceen, die keine Laktose umsetzen, wie Shigella, Proteus und fast alle Salmonellen. Molekularbiologisch wird auch Plesiomonas shigelloides trotz Oxidase-Aktivität aufgrund genetischer Verwandtschaft zu den Enterobacteriaceae gezählt (Ruimy et al. 1994). Enterobacteriaceen kommen weit verbreitet vor, als Kommensale oder Krankheitserreger im Darm (griechisch enteron: Eingeweide) von Tieren, vom Insekt bis zum Menschen, sowie ubiquitär in der Umwelt, auf Pflanzen, im Wasser und im Boden. Als fakultativ anaerobe Eubakterien tolerieren sie für ihr Wachstum sowohl positive als auch negative Redoxpotentiale und sind damit äußerst anpassungsfähig. Diverse Stämme sind humanpathogen, phytopathogen oder haben als Saprobionten beim Verderb von Lebensmitteln eine wichtige Bedeutung. Häufig treten sie als opportunistische Krankheitskeime auf, für etwa 50 % der nosokomialen Infektionen in den USA sind Enterobacteriaceen verantwortlich (Paradis et al. 2005). In diversen Lebensmitteln wie Fleisch, Geflügel, Eiprodukte, Gemüse, Getreide, Kräuter, Milchprodukte und Süßwaren wurden Enterobacteriaceae nachgewiesen. Als Kontaminant in Trockenmilch-Säuglingsnahrung ist insbesondere das Vorkommen der Enterobacteriaceae-Spezies Enterobacter sakazakii - erstmalig als neue Spezies definiert von Farmer et al. (1980) - von großer Bedeutung im Rahmen lebensmittelübertragener Erkrankungen und hat in den vergangenen Jahren für viel Aufsehen gesorgt (Anonymus 2002c, Bowen und Braden 2006). Während Ent. sakazakii grundsätzlich in den unterschiedlichsten Lebensmittelgruppen
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nachgewiesen wurde, trat der Keim ausschließlich in pulverförmiger Kindernahrung in Verbindung mit Krankheitsausbrüchen auf (Anonymus 2005c). Bei Säuglingen führen Infektionen mit Ent. sakazakii zu neonatalen Meningitiden, Septikämien und nekrotisierenden Enterocolitis-Erkrankungen mit extrem hohen Mortalitätsraten von 40 – 80 %. Das Auftreten der Erkrankungen wurde bereits in zahlreichen Ländern wie England, den Niederlanden, Griechenland, Kanada und den USA beschrieben (Nazarowec-White und Farber 1997). Selbst geringste Mengen von Enterobacter sakazakii in sprühgetrockneter Säuglingsnahrung bedeuten eine Gefährdung der Gesundheit, da sie sich während der Speisenzubereitung und Aufbewahrung der rehydrierten Nahrung rapide vermehren können (Forsythe 2005, Kandhai et al. 2006). Bisher gibt es zwar keine gesicherten epidemiologischen Untersuchungen über die minimale infektiöse Dosis (Lehner und Stephan 2004), aufgrund einer Risikobewertung durch Welternährungsorganisation und Weltgesundheits-organisation (FAO/WHO) kann aber davon ausgegangen werden, dass es bei einem Gehalt von 1 KbE/g Trockenprodukt nach Zubereitung der Kindernahrung zur Erkrankung kommen kann (Anonymus 2004a). Die Detektion von Enterobacteriaceen in Lebensmitteln spielt als Indikator für gesundheitsgefährdende Hygienemängel eine wichtige Rolle. In Tabelle 1.1 sind die häufigsten Vertreter lebensmitelassoziierter Gattungen und Spezies sowie deren häufiges Vorkommen und Bedeutung aufgeführt. Die weltweit bedeutendsten, für Lebensmittelinfektionen verantwortlichen Enterobacteriaceae sind Salmonellen und werden im Folgenden ausführlicher behandelt.
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Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen und Bedeutung (nach Baumgart 2006, Müller und Weber 1996)
Gattung Spezies Vorkommen und Bedeutung Citrobacter C. amalonaticus, C.
freundii, C. koseri Darm; Durchfall (Verotoxinbildung) durch einige C. freundii-Stämme
Edwardsiella Ed. tarda Darm; Durchfall durch Ed. tarda Enterobacter Ent. aerogenes, Ent.
cloacae, Ent. sakazakii Pflanzen, Darm, Wasser, Boden; Verderb von Lebensmitteln, Ent. sakazakii in Milchpulvernahrung für Säuglinge (Mortalitätsraten 40 - 80 %) sowie in Käse, Fleisch, Gemüse, Getreide, Kräutern, Gewürzen und erhitzter Milch
Erwinia Er. amylovora, Er. carotovora
Pflanzen; Verderb pflanzlicher Lebensmittel durch Pektinasen, phytopatogen (Blockade des Wasser-leitungssystems)
Escherichia E. coli, E. hermanii, E. vulneris
Darm; Durchfall, Kontamination und Verderb diverser Lebensmittel, E. coli fakultativ pathogen, Hygieneindikator, Pathovare enterovirulenter E. coli : enterohämorrhagische E. coli (EHEC), Enterotoxin bildende E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteropathogene E. coli(EPEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), diffus adhärente E. coli (DAEC)
Hafnia H. alvei Darm, Boden, Wasser; Verderb eiweißreicher Lebensmittel, Histaminbildung bei Fischen, fakultativ pathogen bei Immunsupprimierten
Klebsiella K. pneumoniae, K. oxytoca
Darm, Wasser, Boden, Luft; Verderb von Lebensmitteln, K. pneumoniae ist pathogen
Morganella M. morganii Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmittel
Pantoea Pa. agglomerans, Pa. dispersa
Weit verbreitet in der Natur; Pa. agglomerans vermehrt sich bei 4 °C und führt zum Verderb von Frischfleisch
Plesiomonas P. shigelloides Geflügel, Wasser, nachgewiesen in Muscheln, Fisch, Kot von Rind, Geflügel, Schwein, Schaf; Durchfall
Proteus Prot. mirabilis, Prot. vulgaris
Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmitttel (Bildung von Ammoniak und Ketosäuren durch oxidative Desaminierung von Aminosäuren)
Providencia Prov. alcalifaciens, Prov. stuartii
Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmittel; Durchfall
Salmonella S. enterica Darm, Lebensmittel tierischen Ursprungs, über Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und Futtermittel; pathogen, Infektionskrankheiten, Durchfall
Serratia Se. marcescens, Se. liquefaciens
Darm, Pflanzen, Insekten, Boden; Verderb tierischer Lebensmittel
Shigella Sh. boydii, Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. sonnei
Darm, Lebensmittel, Wasser; pathogen, Durchfall (Ruhr)
Yersinia Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis
Darm, Wasser, Schweinefleisch, Milchprodukte; Y. pseudotuberculosis und bestimmte Serovare von Y. enterocolitica sind Erreger intestinaler Yersiniosen des Menschen
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1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Entero-bacteriaceae: Salmonella
Salmonellen, benannt nach dem amerikanischen Bakteriologen Daniel Elmer Salmon, sind 0,7 bis 1,5 µm mal 2,0 bis 5,0 µm große Stäbchenbakterien. Mit Ausnahme von Salmonella Gallinarum und Salmonella Pullorum sind sie peritrich begeißelt und beweglich. Sie bilden Säure und Gas aus Glucose, Mannit und Maltose und sind, abgesehen von den Subspezies arizonae und diarizonae, Laktose negativ. Gewöhnlich bilden sie Schwefelwasserstoff aus Thiosulfat und assimilieren Citrat (Brenner 1984). Das Genus Salmonella gliedert sich in zwei Arten, die Typspezies S. enterica und die Spezies S. bongori und in sechs Unterarten der Spezies S. enterica. Zur Zeit sind 2541 Serovare der Gattung benannt, von denen 1504 zur Subspezies S. enterica ssp. enterica gehören (Le Minor und Popoff 1987, Popoff et al. 2004). Eine Übersicht ist in Tabelle 1.2 gegeben. Die antigenischen Bezeichnungen der Salmonella-Serotypen werden durch das WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella am Pasteur Institut in Paris festgelegt und regelmäßig aktualisiert. Neue Serovare werden in den Updates des Kauffmann-White-Schemas aufgeführt (Brenner et al. 2000).
Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und
Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 (Popoff et al. 2004, Tindall et al. 2005)
Die korrekte Bezeichnung von, zum Beispiel, dem Serovar typhimurium müsste Salmonella enterica ssp. enterica Serovar typhimurium heißen. Um derartige Namen in der Praxis zu vereinfachen, werden die Stämme der Subspezies enterica nach Le Minor und Popoff (1987) mit großem Anfangsbuchstaben und nicht kursiv geschrieben. Die Bezeichnung lautet also Salmonella Typhimurium. Die Stämme der
Taxon Bezeichnung Anzahl Serovare Genus Salmonella 2541Spezies S. enterica 2519Subspezies S. enterica ssp. enterica 1504 S. enterica ssp. salamae 502 S. enterica ssp. arizonae 95 S. enterica ssp. diarizonae 333 S. enterica ssp. houtenae 72 S. enterica ssp. indica 13Spezies S. bongori 22
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übrigen fünf Subspezies und die der Spezies S. bongori werden mit der Kurzbezeichnung und der Antigenformel benannt, zum Beispiel Salmonella IIIb 53:r:z23 (Bockemühl und Seeliger 1985). Die Angabe 53 kennzeichnet das somatische O-Antigen aus Lipopolysacchariden der Zellwand, die Bezeichnung r und z zwei Phasen des Geißelantigens H. Beide Antigene werden durch Objektträger-Agglutination mittels käuflicher Antiseren nachgewiesen. Die Einteilung der Serovare erfolgt nach dem Antigenschema von Kauffmann-White. Mit Bezug auf Pathogenese, klinischem Erscheinungsbild und Epidemiologie werden Salmonellen in die typhösen und die enteritischen Salmonellen unterteilt. Die Serovare Typhi, Erreger des Typhus, und Paratyphi A, B, C, Erreger des Paratyphus sind die typhösen Salmonellen. Alle übrigen Serovare gehören zu den enteritischen Salmonellen und verursachen beim Menschen meist Enteritiden. Alle Salmonellen gelten als pathogen, in den Industerieländern treten die Enteritis-Salmonellen besonders häufig auf. 1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose Die Salmonellose ist die häufigste und am weitesten verbreitete durch Lebensmittel übertragene Infektionskrankheit. In den USA erkranken jährlich etwa 1,4 Millionen Menschen an einer Enteritis-Salmonellose und rund 400 Erkrankte sterben an den Folgen (Voetsch et al. 2004). Im Jahr 1995 waren es in England und Wales 102.227 Einwohner, die an einer Infektion mit Enteritis-Salmonellen erkrankten, 3.412 von ihnen mussten im Krankenhaus behandelt werden und 268 der Betroffenen starben an der Erkrankung (Adak et al. 2002). Für Kalifornien erfassten Trevejo et al. (2003) in einer epidemiologischen Studie über einen Zeitraum von zehn Jahren Erkrankungen, Sterberaten und Hospitalkosten, die durch Infektionen mit Enteritis-Salmonellen verursacht wurden. Die ermittelten Kosten für Salmonellose-Behandlungen im Krankenhaus lagen in den Jahren 1990 bis 1999 bei rund 200 Millionen Dollar. Erregerreservoir dieser Zoonose ist vorwiegend der Darmtrakt zahlreicher Tiere wie Schweine, Rinder, Kälber, Geflügel, Wild, Tauben, Möwen, Muscheln, Fische, Nager und Insekten. Die Salmonella-Übertragung vom Tier auf den Menschen erfolgt überwiegend durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln tierischen Ursprungs, wobei die Tiere in den seltensten Fällen klinisch erkrankt sind. Besonders häufig betroffen sind Geflügel – Huhn, Ente, Gans und Pute – , rohe Eier und Roheispeisen – Eischäume, Cremes, Mayonnaise und Speiseeis – , rohes Fleisch und nicht oder nicht ausreichend erhitzte Fleischprodukte – Hackfleisch, Rohwurst und Fleischsalate – sowie nicht pasteurisiete Milch (Anonymus 2002b). Neben tierischen Produkten können durch Einsatz natürlicher Dünger oder
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Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und Futtermittel Salmonellen enthalten. So waren beispielsweise der Verzehr von Tomaten (Hedberg et al. 1999), Sprossen (Van Beneden et al. 1999, Mohle-Boetani et al. 2002), nicht sachgemäß zubereitetem Kräutertee (Koch et al. 2005) und Schokolade (Werber et al. 2005) Augangspunkt von Salmonella-Infektionen. Direkte Mensch-zu-Mensch-Übertragungen spielen bei Enteritis-Salmonellosen nur eine sehr untergeordnete Rolle. Nach einer Infektion des Menschen mit enteritischen Salmonellen beträgt die Inkubationszeit, abhängig von der Infektionsdosis, meist 12 - 36 Stunden, mitunter aber auch 5 - 72 Stunden. Es kommt zu Gastroenteritiden mit wässrigem, teilweise blutigem Durchfall, Leibschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Kopfschmerzen, zum Teil auch mit Fieber. Die Symptome dauern in der Regel wenige Stunden oder Tage, oft kommt ein leichter oder symptomloser Verlauf vor. Bei schweren klinischen Fällen treten Schüttelfrost, höheres Fieber, Kollaps und weitere systemische Krankheitsbilder auf. Die Keimausscheidung enteritischer Salmonellen dauert drei bis sechs Wochen, bei Säuglingen aber auch mehrere Monate (Anonymus 2002b). Während des gastroenteritischen Infektionsverlaufs überwinden die Salmonellen die Infektabwehr und gelangen über den Magen in den Darm. Dabei müssen sie gegenüber der Magensäure mit pH-Werten von 1,0 – 4,0 bestehen. So kann zum Beispiel S. Typhimurium mit der Synthese von Säureschockproteinen und Induktion von Protonenpumpenaktivität auf den Säurestress reagieren und ist damit in der Lage, in extrem saurem Milieu zu überleben (Foster und Hall 1991, Hall und Foster 1996). Im Verlauf der Pathogenese bewirken von Salmonella kodierte Faktoren wie SEP14, SEF17 und SEF21 als Adhäsine die Anhaftung der Bakterien an die Epithelzellen des Dünndarms. Somit verhindern sie ihr Ausscheiden durch die Darmperistaltik und können sich lokal vermehren. Nach dieser Kolonisation dringen sie über Invasine in die Zellen ein und es kommt zur Bildung von Toxinen. Thermolabile Exotoxine, die zum unkontrollierten Wasser- und Elektrolytverlust führen, wurden als Enterotoxin Stn und zotlike (zonula occludens toxin) Toxine beschrieben. Letztere kommen in allen Enteritis-Salmonellen vor und führen zum Abbau der „tight junctions“, die für den kontrollierten Stofftransport durch die Epithelzellen verantwortlich sind (D’Aoust 1991, Tschäpe und Prager 1995). Neben den Exotoxinen, die bereits während des Lebenszyklus der Salmonellen sekretiert werden können, wirken auch thermostabile Endotoxine, die nicht kontinuierlich in das umgebende Medium abgegeben werden. Diese Lipopolysaccharide (LPS) sind Bestandteil der äußeren Membran der Zellwand gramnegativer Bakterien, also auch aller anderen Enterobacteriaceen. Sie werden im Allgemeinen erst durch Autolyse oder artifizielle Zerstörung der Zellen als Zerfallsprodukte freigesetzt. LPS bestehen aus drei Komponenten, einem Polysaccharid (O-Antigen), einem Core-
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Oligosaccharid und einem Lipid. Die Lipid-Komponenete, bezeichnet als Lipid A, löst die Bildung von Proteinen wie Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-α) und Interleukin-1 (IL-1ß) aus und ist für die Entstehung von Entzündungen und Toxinogenität verantwortlich (Rietschel et al. 1994, Reynolds et al. 2006). Durch die ausgelösten Durchfallerkrankungen kommt es in der Regel zum Ausscheiden der enteritischen Salmonellen. Die Salmonellose tritt in Form von sporadischen Fällen, Familienerkrankungen oder als Epidemien auf und ist die nach dem Infektionsschutzgesetz (IfSG) am häufigsten in Deutschland gemeldete, durch Lebensmittel übertragene Krankheit des Menschen (Jansen et al. 2005). Nach IfSG §7 ist jeder Nachweis von Salmonellen unverzüglich, innerhalb von 24 Stunden, durch das Labor, welches den Nachweis erbracht hat, dem zuständigen Gesundheitsamt zu melden. Nach einem massiven Anstieg registrierter Fälle im Jahr 1992 ist die Salmonellose seit 1993 rückläufig. Im Jahr 2004 kam es in Deutschland aber immer noch zu 56.947 Errkankungen mit 52 Todesfällen. Unter den Verstorbenen befanden sich ein einjähriges und ein zweijähriges Kind sowie eine 41-jährige Frau, acht Personen zwischen 60 und 69 Jahren und 41 Personen im Alter von mindestens 70 Jahren. (Anonymus 2005b). Darüber hinaus ist von einer beträchtlichen Dunkelziffer an Salmonellosen auszugehen, da wegen der oft nur kurzen, leichten und selbstlimitierenden Symptomatik häufig weder ein Arzt hinzugezogen noch eine Erregerdiagnostik eingeleitet wird (Anonymus 2003a). Somit bleibt die Salmonellose weiterhin eine bedeutende lebensmittelassoziierte Infektionskrankheit. Abbildung 1.2 zeigt den quantitativen Verlauf registrierter Enteritis-Salmonellosen des Menschen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 sowie den Anteil der häufigsten krankheitsauslösenden Serovare. Die größte Bedeutung haben die Stämme der Serovare Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium. Epidemiologische Langzeitanalysen zeigen, dass europaweit seit Mitte der 1980er Jahre das Serovar Enteritidis vorherrscht, nachdem in den Jahren zuvor S. Typhimurium als häufigster Vertreter nachgewiesen wurde (Rodrigue et al. 1990). Im Rahmen einer schwedischen Studie über Salmonellenerkrankungen und dadurch verursachte Kosten in der Europäischen Union, ermittelten de Jong und Ekdahl (2006) innerhalb des Erfassungsszeitraums von 1997 bis 2003 insgesamt 13.158 Patienten in Schweden, die nach einer Europareise an einer Infektion mit Salmonella erkrankt waren. Von diesen Personen waren 10.637 (81 %) an einer Infektion mit S. Enteritidis und 1.203 (9 %) an einer Infektion mit S. Typhimurium erkrankt. In Untersuchungen zur Toxinogenität von Salmonellen wurde gezeigt, dass in allen Serovaren der Spezies S. enterica das Toxin-Gen stn im Genom lokalisiert ist, tatsächlich exprimiert wird das Gen aber vor allem in den Serovaren S. Enteritidis
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und S. Typhimurium, was die auffällige Häufung dieser Serovare in der Diagnostik erklären könnte (Prager et al. 1995). Nach Angaben des infektionsepidemiologischen Jahrbuchs meldepflichtiger Krankheiten für 2004 (herausgegeben vom Robert Koch Institut) wurden im Jahr 2004 in Deutschland für 91 % der übermittelten 56.947 Salmonellose-Fälle genaue Angaben zum Serovar gemacht. In 67 % der Fälle handelte es sich um S. Enteritidis, in 21 % um S. Typhimurium (Anonymus 2005b).
Salmonellosen in Deutschland 1991 - 2006
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S. Enteritidis in ProzentS. Typhimurium in ProzentErkrankungen in Tausend
Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis-
Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 (Quelle: Robert-Koch-Institut)
Die optimale Wachstumstemperatur von Salmonellen beträgt 37 °C, es kann aber auch bei niedrigen Temperaturen bis 2 °C und höheren Temperaturen bis 54 °C zur Vermehrung kommen. Die minimale infektiöse Dosis von Salmonella für den erwachsenen Menschen liegt im Regelfall bei 104 bis 106 Kolonie bildenden Einheiten (KbE), bei besonderer Disposition wie Abwehrschwäche auch darunter. Handelte es sich bei den kontaminierten Lebensmitteln aber um stark fetthaltige wie Käse, Salami oder Schokolade oder um Gewürze, kam es bereits bei Infektionsdosen unter 50 Keimen zu Erkrankungen (Blaser und Newman 1982, Lehmacher et al. 1995). Seit den 1960er Jahren ist weltweit immer wieder von Salmonellenerkrankungen durch den Verzehr von Schokoladenprodukten berichtet worden, wobei außerordentlich niedrige Keimzahlen ausreichten, um eine Erkrankung auzulösen (Anonymus 2001).
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Im Zeitraum Oktober 2001 bis März 2002 kam es zu einem internationalen Krankheitsausbruch durch Infektion mit dem Serovar Salmonella Oranienburg, der auf eine Kontamination deutscher Schokolade zurückzuführen war. Neben Deutschland waren zeitgleich Schweden, die Niederlande, Finnland, Dänemark, Belgien, Österreich sowie Kanada durch Erkrankungen betroffen. Nachdem durch das Bundesinstitut für Risikobewertung am 18. Dezember 2001 in den Resten von Schokolade, die ein Erkrankter gegessen hatte, S. Oranienburg nachgewiesen war, wurde öffentlich vor dem Verzehr gewarnt. In einer Rückrufaktion in Europa und Kanada wurden Schokoladen und später auch weitere Produkte des Herstellers vom Markt genommen. Sowohl in Kanada als auch in Finnland und Schweden wurden Proben zurückgezogener Schokolade positiv auf S. Oranienburg getestet. Die nachgewiesene Kontaminationsmenge der Schokolade lag zwischen 1,1 und 2,8 KbE/g. Diese niedrige krankheitsauslösende Dosis wird darauf zurückgeführt, dass die Bakterien in der fettreichen Schokolade sehr gut gegen Magensäure geschützt sind und größtenteils noch lebend in den Darm gelangen, um dort eine Infektion auszulösen. Bedingt durch niedrigen Wassergehalt und hohe Zuckerkonzentrationen in der Schokolade weisen sie außerdem eine hohe Hitzeresistenz auf und können in dem Vehikel bis zu mehrere Jahre überleben. Maßnahmen zur Keimreduktion wie Rösten der Kakobohnen oder Hitzebehandlung der Kakaomasse mit Wasserdampf führen nicht zur sicheren Abtötung der Salmonellen. Als Ursache für die Kontamination der Schokolade konnte keine Quelle ermittelt werden. In erster Linie werden bei dem Befall von Schokoladenprodukten kontaminierte Kakaobohnen oder Milchpulver, je nach Rezeptur aber auch andere Zutaten wie kontaminierte Kokosnüsse und Gewürze angenommen. Dies ist der bisher größte erfasste lebensmittelbedingte Krankheitsausbruch durch kontaminierte Schokolade. Allein in Deutschland erkrankten insgesamt 439 Menschen, von denen 29 % in einem Krankenhaus behandelt werden mussten. 21 % der Betroffenen litten nach eigenen Angaben an blutigen Durchfällen (Werber et al. 2005). Das internationale Ausmaß dieses Ausbruchs macht deutlich, wie leicht durch globalen Nahrungsmittelhandel Menschen weltweit von lebensmittelbedingten bakteriellen Infektionen gleichen Ursprungs betroffen werden können. Angesichts des bestehenden Risikos ist eine lückenlose Kontrolle der kritischen Prozessstufen seitens der lebensmittelproduzierenden Betriebe von entscheidender Bedeutung. Besonders häufig sind die Produktionsstätten selbst der Ort der Lebensmittelkontamination. In einem Überwachungsprogramm der WHO zur Kontrolle lebensmittelbedingter Infektionen wurden die Bereiche, in denen es zu einer Kontamination kam, erfasst. Im Jahr 2000 waren es in Deutschland in 87 % der Fälle die lebensmittelproduzierenden Betriebe (Anonymus 2003b). Die Detektion von Kontaminationen mit Salmonellen erfolgt in der Regel als Nachweis ihrer
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Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit. Eine Keimzahlbestimmung entfällt, da alle Salmonellen als pathogen gelten (Baumgart 2006). 1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen Markerorganismen sind nachweisbare Mikroorganismen, die Hinweise auf gesundheitsgefährdende Kontaminationen geben können. Ihr Nachweis in Lebensmitteln ist ein wichtiges Werkzeug für die Qualitätskontrolle. Mossel (1982) definiert Markerorganismen als Index- und Indikatororganismen. Eine Unterscheidung, die nicht immer auf Zustimmung stößt. Demnach weisen Indexorganismen auf potenzielle Gesundheitsgefährdung durch Anwesenheit spezifischer Krankheitserreger hin. Indikatororganismen weisen Mängel in Prozessabläufen, wie beispielsweise unzureichende Desinfektion, nach. Dabei können die gleichen Markerorganismen je nach Art der Produkte einerseits Indexorganismen, andererseits Indikatororganismen und auch beides zugleich sein. Stadhouders et al. (1982) sind der Ansicht, dass eine Unterscheidung zwischen Index- und Indikatororganismen unzweckmäßig und in vielen Lebensmitteln gar nicht möglich ist. Am Beispiel von sprühgetrocknetem Milchpulver zeigen sie, dass hygienische Sicherheit am besten durch ständige Prüfungen der kritischen Prozessstufen, in denen Kontaminationen erfolgen können, erreichbar ist. Als Markerorganismen besonders geeignet sind Darmbakterien, da sie auf fäkale Verunreinigungen hinweisen. Der Nachweis von Escherichia coli als Marker für fäkale Kontaminationen von Trinkwasser wurde bereits vor rund 100 Jahren eingeführt und wird bis heute angewandt. In den 1920er Jahren wurde er durch den Nachweis von Coliformen ergänzt und bald darauf auch in Milch, zum Beispiel zur Kontrolle auf ausreichende Behandlung durch Pasteurisation, und anderen Lebensmitteln durchgeführt. Der Nachweis von Coliformen bei verarbeiteten Produkten erwies sich als geeigneter Hinweis auf Rekontaminationen und unzureichende Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene. Seit den 1950er Jahren wird der Nachweis der gesamten Enterobacteriaceae-Familie in der Lebensmittelkontrolle und Überprüfung von Produktionsabläufen oft bevorzugt, weil er mehr signifikante Lebensmittelkeime detektiert (Mossel und Struijk 1995). Neben Laktose positiven Coliformen werden auch Laktose negative pathogene Keime wie Stämme der Gattungen Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Proteus, Yersinia, Hafnia sowie Stämme von Escherichia coli, die sehr langsam Laktose fermentieren, erfasst. Da Coliforme weniger resistent gegenüber Behandlungsverfahren von Lebensmitteln, zum Beispiel Bestrahlung, milde Erhitzung, Gefrieren und Trocknen sind als einige pathogene Enterobacteriaceen wie Salmonellen, ist der Nachweis der gesamten Familie Enterobacteriaceae besser geeignet als der Coliformen-Nachweis (Mossel et
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al. 1979). Auch Rekontaminationen von Lebensmitteln erfolgen außer durch Coliforme auch durch andere Enterobacteriaceen wie Spezies der Gattung Serratia, die oftmals bei dem Verderb von Fleisch dominieren (Stiles und Ng 1980). Häufig kommt es zur Rekontamination durch Verschleppung von Keimen im Produktionsbereich. Diese können über ihre Anreicherung im Produkt oder Nebenprodukt weitere Bereiche des Produktionsumfeldes wie Anlagenteile, Geräte, Böden, Abwasser und Luft besiedeln. Werden derartige Keime nicht detektiert und vollständig inaktiviert, stellen sie potenzielle Rekontaminationsherde dar. Die ursprüngliche Kontamination mit Enterobacteriaceen kann durch fäkale Verunreinigungen entstehen, wobei die Fäkalien von an Infektionskrankheiten erkrankten Tieren oder Menschen oder Dauerausscheidern stammen können. Direkte Kontamination kann durch Produktionsabläufe wie Schlachtung und Zerlegung von Tierkörpern, Rohmilchgewinnung oder Aufschlagen von Schaleneiern, aber auch bei ungenügender Personen- und Händehygiene durch das Personal zustande kommen. Indirekte Kontamination erfolgt über Verarbeitungsgeräte wie Metzgermesser und Fleischerhaken nach ursprünglich direkter fäkaler Verunreinigung. Für eine Vielzahl von Lebensmitteln ist der Nachweis von Kontaminationen mit den artenreichen Enterobacteriaceen, vor allem im Hinblick auf deren Markerfunktion für Gesundheitsgefährdung, besonders geeignet. Er hat in der Verarbeitungs- und Betriebshygiene, idealerweise durchgeführt in Form von mehrfachen Stufenkontrollen, einen essenziellen Stellenwert (Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988).
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2 PRAKTISCHER TEIL
DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN LEBENSMITTELN
2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen Klassische mikrobiologische Verfahren für die Identifizierung von Mikroorganismen in Lebensmitteln werden in selektiven oder unselektiven Kulturen in flüssigem Medium oder auf festen Nährböden durchgeführt. Sie kommen in sämtlichen Lebensmittelbereichen zur Anwendung und basieren auf dem Nachweis morphologischer und physiologischer Merkmale. Ist eine ausreichende Identifizierung der kultivierten Keime nicht möglich, wird in der Regel die Anwendung biochemischer Identifizierungssysteme angeschlossen. Der qualitative mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceen erfolgt gemäß der analytischen Referenzmethode ISO 21528-1 in mehreren Schritten als unselektive Voranreicherung und selektive Anreicherung in flüssigem Medium, selektive Vereinzelung auf festen Nährböden und Auswertung der Agarplatten. Bei Bedarf erfolgt eine biochemische Bestätigung beziehungsweise Ausdifferenzierung. Der erste Schritt im qualitativen Nachweisverfahren, die Bebrütung der Lebensmittelprobe in unselektivem Nährmedium, dient der Resuszitation vorhandener Enterobacteriaceen vor der Überführung in Selektivmedien. Subletal geschädigten Zellen soll die Möglichkeit der Revitalisierung gegeben werden, damit auch diese im Nachweis erfasst werden können. Zu einer Schädigung der Bakterien kann es durch Wasserverlust, Nährstoffmangel, Hitze, Kälte, Gefrieren, ionisierende Strahlung, Chemikalien, Gefriertrocknung und osmotischen Stress kommen (Webb 1969, Colwell 2000). Derartige, nicht unmittelbar zum Zelltod führende Beeinträchtigungen, äußern sich durch verlängerte lag-Phasen, Verlust von Zellbestandteilen, insbesondere Nukleinsäuren, hohe Sensitivität gegenüber Selektivmedien und erhöhten Nährstoffbedarf der Mikroorganismen. Es ist bekannt, dass Enterobacteriaceen, die in getrockneten Lebensmitteln und Trockenfutter nachgewiesen wurden, erhebliche Stoffwechselschäden aufwiesen (Sinskey und Silverman 1970). Ihre Physiologie kann derartig beeinträchtigt sein, dass sie in Selektivmedien ihre Proliferation komplett einstellen, während unbeschädigte Bakterien gleicher Spezies die üblichen Inhibitoren im Medium problemlos tolerieren (Alford und Knight 1969). Kommt es für subletal geschädigte Bakterienzellen wieder
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zu geeigneten Lebensbedingungen, können sie regenerieren und die Proliferation wieder aufnehmen. So ist es für den qualitativen Markernachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln, besonders in technologisch verarbeiteten, wichtig, diesen Schritt der Resuszitation durchzuführen, bevor die Probe in für die Bakteriengruppe selektives Nährmedium überführt wird. Nur bei mehrstündiger nichtselektiver Vorbebrütung, üblicherweise durchgeführt in CASO-Bouillon oder Pepton-Wasser, besteht die Möglichkeit, auch das Vorhandensein gestresster Zellen zu detektieren (Mossel und Ratto 1970, Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988). Im nächsten Schritt erfolgt die selektive Anreicherung der Enterobacteriaceen aus Lebensmitteln innerhalb von ein bis zwei Tagen in Mossel-Bouillon (Mossel et al. 1963, Mossel und Martin 1964), einem Medium entsprechend der Eiprodukte-Verordnung (Anonymus 1975) und der European Pharmacopeia II. Durch Brillantgrün und Ochsengalle in der Mossel-Bouillon wird die unerwünschte Begleitflora weitgehend gehemmt, während das Wachstum aller Entreobacteriaceen durch den Glucose-Gehalt begünstigt wird. Die starke Pufferung des Nährmediums verhindert das Absinken des pH-Wertes und eine dadurch bedingte Wachstumshemmung der Kultur. Für die selektive Vereinzelung der Enterobacteriaceen im nächsten Schritt wird ein Oberflächenausstrich auf Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar (VRBD-Agar) durchgeführt und mindestens einen Tag anaerob bebrütet. Agarplatten, auf denen nach einem Tag keine Kolonien gewachsen sind, werden ein bis zwei weitere Tage inkubiert, um die Abwesenheit von Enterobacteriaceae sicher zu stellen. Die Bebrütung unter anaeroben Bedingungen ist für das Wachstum der fakultativ anaeroben Enterobacteriaceen nicht notwendig, dient aber der Wachstumshemmung obligat aerober Keime in der Begleitflora, wie zum Beispiel Pseudomonaden. Aus dem ursprünglichen MacCONKEY-Agar (MacConkey 1905), einem Selektivmedium zur Isolierung von Salmonellen, Shigellen und coliformen Bakterien, entwickelten Mossel et al. (1962) VRBD-Agar für den Nachweis von Enterobacteriaceae. Sie ersetzten zunächst, dem Vorschlag von Henriksen (1955) folgend, die Laktose im MacCONKEY-Agar durch Mannitol, danach durch Glucose und schlugen für das Medium die Bezeichnung MacCONKEY-Glucose-Agar vor. Im Gegensatz zu Laktose und Mannitol wird Glucose von sämtlichen Enterobacteriaceen unter Säurebildung abgebaut. Kristallviolett und Gallensalze im VRBD-Agar hemmen weitgehend die Begleitflora. Säurebildung aus Glucose wird durch einen Farbumschlag der Kolonien nach Rot, eventuelle Ausfällung von Gallensäuren durch Bildung eines hellen Präzipitathofs um die positiven Kolonien angezeigt. Mit dieser Versuchsdurchführung sind alle Bakterien der Familie Enterobacteriacaea erfassbar. Der Auslesenährboden ist jedoch für sie nicht absolut spezifisch, da auch einige mitwachsende Begleitkeime, wie Aeromonas spp., die gleiche Reaktion zeigen können.
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Ist eine ausreichende Identifizierung der Kolonien nicht möglich, müssen entsprechende Keime biochemisch ausdifferenziert werden. Die Durchführung erfolgt zum Beispiel unter Anwendung von API®20E, einem System zur Enterobacteriaceae-Diagnostik der Firma bioMérieux, oder auch mittels Cytochromoxidasetest. Enterobacteriaceen sind Oxidase-negativ. Zur Überprüfung der Oxidaseaktivität können Teststreifen mit Farbstoffindikator verwendet werden. Der Oxidasetest ist unzuverlässig, wenn er direkt auf den VRBD-Platten oder direkt mit Material von Kolonien, die auf VRBD-Agar gewachsen sind, durchgeführt wird. Die zu untersuchende Kolonie sollte vor dem Test auf ein Universalnährmedium überimpft und bebrütet werden (Baumgart 2006). Es sind kohlenhydratfreie Medien für die Subkultivierung zu wählen, da der Oxidasetest auf kohlenhydrathaltigen Nährböden wegen Säuerung des Mediums falsch negative Reaktionen zeigen kann (Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch). Der klassische mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceae leistet nur eine eingeschränkte Spezifität. Bedingt durch eine hohe Begleitflora kann auch die Sensitivität des Verfahrens wesentlich verringert werden, wenn überwachsende Begleitkeime das Wachstum der Enterobacteriaceen hemmen. In diesem Fall kann es zu falsch negativen Ergebnissen in mikrobiologischen Untersuchungen kommen. 2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR Der mikrobiologische Nachweis von Bakterien und anderen Mikroorganismen in Lebensmitteln basiert auf der Gesamtheit eines Organismus und seiner physiologischen Merkmale. Neben diesem konventionellen phänotypischen Nachweis wurden in den vergangenen Jahren vermehrt molekularbiologische Methoden für den genotypischen Nachweis bakterieller Kontaminationen durch Detektion spezifischer Nukleinsäuren entwickelt. Im Vergleich zu klassischen Verfahren handelt es sich hierbei um schnellere Methoden, deren Durchführung nicht vom Wachstumsstadium der Mikrorganismen oder Umwelteinflüssen abhängig ist. Es werden auch molekularbiologische mit mikrobiologischen Methoden kombiniert, indem vor der Detektion eine kulturelle Anreicherung erfolgt (Blackburn 1993, Olsen et al. 1995, Feng 1997). Neben der Anwendung im klinischen und ökologischen Bereich wird ebenso im Lebensmittelsektor der Nachweis bakterieller DNA- und RNA-Moleküle heute weit verbreitet durchgeführt. Die Detektion diverser enterobakterieller Spezies erfolgt bereits über den Nachweis ihrer DNA (Feng 2001). Als besonders geeignet werden häufig DNA-Sequenzen der für ribosomale RNA kodierenden Gene bevorzugt, die universell und vielfach in der
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Zelle vorhanden sind (Ward et al. 1990, Wilson et al. 1990). Die hohe Spezifität und Sensitivität dieser Nachweisverfahren sowie ein großes Potential zur Automatisierbarkeit sind entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden, die innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte eine intensive Forschung vorangetrieben haben. Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln stehen heute molekularbiologische Verfahren im Vordergrund (Mozola 2006, Seo et al. 2006). Das sensitivste und am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Selbst geringste Mengen vorhandener DNA-Moleküle werden mit dieser Methode durch wiederholte selektive Vervielfältigung nachweisbar amplifiziert. Kornberg und seine Mitarbeiter entdeckten 1955 das zelluläre Enzym DNA-Polymerase als Katalysator der DNA-Replikation und führten Versuche zur Synthese viraler DNA mittels DNA-Polymerase durch (Goulian und Kornberg 1967, Mullis 1990). Anfang der 1970er Jahre postulierten Panet und Khorana (1974) aufgrund ihrer Forschung zur DNA-Replikation die Möglichkeit, dass sich dieser Prozess auch in mehreren Zyklen wiederholen ließe. Das Verfahren der PCR als vielfache Amplifikation doppelsträngiger DNA in vitro mittels DNA-Polymerase wurde schließlich 1983 von Mullis et al. (1986) begründet. Wesentlich vereinfacht wurde die Durchführung der PCR, als man die aus Escherichia coli isolierte DNA-Polymerase durch die thermostabile Taq Polymerase aus Thermus aquaticus ersetzte (Saiki et al. 1988). Das Prinzip der PCR basiert auf der enzymatischen Amplifikation eines DNA-Bereichs, der von zwei Oligonukleotiden (Primer) flankiert wird, die jeweils am Ende der zu amplifizierenden DNA-Sequenz komplementär binden. Die zyklisch verlaufende Reaktion wird in einem so genannten Cycler durchgeführt und besteht in der Regel aus drei Phasen mit unterschiedlichen Temperaturen. In der ersten Phase werden die Wasserstoffbrückenbindungen der doppelsträngigen DNA durch Temperaturerhöhung aufgebrochen, um sie in Einzelstränge zu trennen (Denaturierung). In der nächsten Phase wird die Temperatur abgesenkt und es kommt unter Bildung von Basenpaaren zur Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen der DNA (Annealing). Eine stabile Bindung der Primer ist Voraussetzung für die Initiation der Polymerisation. In der dritten Phase wird die Temperatur wieder erhöht, unspezifisch angelagerte Primer werden denaturiert. Die DNA-Polymerase katalysiert nun, ausgehend vom 3’-Ende der gebundenen Primer, den selektiven Einbau freier Nukleotide aus dem Reaktionsansatz komplementär zur DNA-Matrize (Elongation). Jedes neu synthetisierte DNA-Fragment dient dann als Matrize für den nächsten PCR-Zyklus. Durch beliebiges Wiederholen dieses drei-Phasen-Zyklus lässt sich mit jedem Durchgang die Anzahl der Zielmoleküle verdoppeln, solange ausreichend Primer und Nukleotide für die DNA-Amplifikation
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zur Verfügung stehen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise von einem einzigen DNA-Doppelstrang theoretisch etwa eine Million Kopien. Damit können durch Anwendung der PCR geringste Ausgangsmengen, bis hin zu nur einem einzigen Molekül, vorhandener DNA detektiert werden. Der Nachweis der entstandenen DNA-Amplifikate kann mit Durchführung einer Gelelektrophorese erfolgen. Aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen lässt sich DNA im Agarosegel durch Anlegen elektrischer Spannung ihrer Größe nach auftrennen. Während der Elektrophorese wird neben den zu untersuchenden Proben ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt. Die Visualisierung der DNA erfolgt mit interkalierenden Fluoreszenz-Farbstoffen wie Ethidiumbromid unter UV-Licht. Im Vergleich mit den Banden des Standards oder einer parallel durchgeführten konkurrierenden PCR (kompetitive PCR) mit bekannter DNA-Ausgangsmenge werden Größe und Menge der in der PCR amplifizierten DNA abgeschätzt. Eine bedeutende Weiterentwicklung dieser Anwendungen mit wesentlich reduziertem Zeitaufwand ist die Durchführung einer Real-Time-PCR (Higuchi et al. 1992). Bei diesem Verfahren finden Reaktion und Detektion der Amplifikate im selben Reaktionsansatz statt. Während der Amplifikation binden unspezifische fluoreszierende Farbstoffe wie SYBR® Green I oder sequenzspezifische, mit fluoreszierendem Farbstoff modifizierte Moleküle (Sonden) komplementärer Sequenz an die DNA und werden gleichzeitig detektiert. Die entstehende DNA wird in Echtzeit als in der Intensität steigendes Fluoreszenzsignal, in Relation zur Ausgangsmenge, ermittelt und online dokumentiert. Eine Möglichkeit zur spezifischen Detektion von Amplifikaten ist die Durchführung der Real-Time-PCR mit HybProbes (Hybridisierungssonden) der Firma Roche. HybProbes sind Oligonukleotide, die nebeneinander mit einem mittleren Bereich der Template-DNA zwischen den Bindungsstellen der Primer hybridisieren. Sie tragen an den benachbarten Enden zwei Fluorophore, die über Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) miteinander interagieren können. Dabei überträgt der kurzwelligere Farbstoff Fluorescein, der mittels blauem Licht angeregt wird, seine Energie strahlungslos an den langwelligeren Farbstoff LCRed. Dieser gibt nach Anregung ein höher welliges rotes Licht ab, das detektiert wird. Das Signal kommt also nur zustande, wenn beide Sonden in räumlicher Nähe binden. Die Signalfluoreszenz ist proportional zur Menge der vorliegenden Zielsequenz. Die Reaktion wird in einem LightCycler® durchgeführt und mit entsprechender Software zeitgleich dokumentiert. Der Eintritt der Amplifikation in die exponentielle Phase wird als „Crossing Point“ dargestellt. Der Schmelzpunkt der Sonden lässt sich durch eine Schmelzkurvenanalyse ermitteln, indem nach der PCR die Temperatur unter stetiger Messung der Fluoreszenz erhöht wird. Mit steigender Temperatur nimmt die
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Fluoreszenz ab. Die gemessene Schmelztemperatur Tm ist der Wert, bei dem gebundene und abgeschmolzene Hybridisierungssonden miteinander im Gleichgewicht stehen. Differente Tm-Werte stehen demnach für unterschiedlich starke Bindungen zwischen verschiedenen Amplifikaten und Sonden. Eine hohe Sequenzübereinstimmung führt zu einer stabileren Bindung und damit zu einem höheren Tm-Wert. 2.2.1 Aspekte der PCR Die PCR ist eine hoch sensible Technik, deren Effizienz von diversen Faktoren beeinflusst wird. Mögliche Ursachen für eine Inhibition der PCR wurden mit unzureichender Zelllyse zur Extraktion der DNA, Degradieren der Nukleinsäuren oder Blockieren der Polymerase-Aktivität beschrieben (Wilson 1997). Das Zyklusprofil der PCR, die Reaktionskomponenten sowie deren Konzentration, die Qualität der nachzuweisenden DNA, die Beschaffenheit der Probenmatrix und die ausgewählten Primer sind entscheidene Faktoren für die Durchführung der Reaktion. Alle Komponenten müssen jeweils für einen optimalen Ablauf der PCR angepasst werden, um einen möglichst sensitiven und spezifischen Nachweis zu ermöglichen (Rossen et al. 1992). Eine stabile Bindung der Primer an die zu amplifizierende DNA ist Voraussetzung für die Spezifität des Systems. Die Primersequenz sollte demnach eine hohe komplementäre Übereinstimmung mit der Ziel-DNA aufweisen, um die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Bindung an anderen DNA-Abschnitten zu verringern. Nicht spezifische Primer reduzieren, wenn sie in der PCR verlängert werden, nicht nur die Anzahl der Primer, die für die Amplifikation der Ziel-DNA zur Verfügung stehen, sondern begünstigen auch die Entstehung von Artefakten sowie falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen (Kwok et al. 1990, Newton und Graham 1994). Durch Erhöhung der Annealingtemperatur lässt sich die Stringenz der PCR erhöhen und die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von „primer-template mismatches“ reduzierern (Bej et al. 1990). Auch das Vorhandensein großer Mengen unspezifischer DNA kann die Spezifität herabsetzen und zu falsch negativen Resultaten führen (Abbott et al. 1988, Rossen et al. 1992). Derartige Beeinträchtigungen können entstehen, wenn Bakterien taxonomischer Gruppen, die mit dem PCR-System nicht nachgewiesen werden sollen, im Überschuss gegenüber den nachzuweisenden Bakterien in der Probe vorhanden sind. In Lebensmitteln können Polysaccharide, Fette und Proteine zur Inhibition der PCR führen und erfordern mitunter eine Purifikation der DNA über Silikasäulen vor Durchführung der Reaktion. In vielen Fällen können Inhibitionen der
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PCR durch Zugabe unterstützender Reagenzien verringert werden. Die DNA-Präparation kann unter Zugabe des Ionenaustauschers Chelex® 100 durchgeführt werden, um die Zelllyse zu begünstigen und die Degradierung der DNA in Gegenwart von Metallionen bei hohen Temperaturen zu verhindern (Walsh et al. 1991, de Lamballerie et al. 1992). Als besonders wirkungsvoller Zusatz der PCR hat sich Rinderserumalbumin (BSA) erwiesen, durch das Inhibitoren gebunden werden und die Anlagerung der DNA-Polymerase an die DNA stabilisiert wird. Es wurde gezeigt, dass sowohl Substanzen mit phenolischen Gruppen, als auch Lipide und Anionen durch BSA gebunden werden (Kreader 1996, Forbes und Hicks 1996). Die inhibitorische Wirkung auf DNA-Polymerasen durch Proteinasen in Milch konnte durch Zugabe von BSA unterbunden werden (Powell et al. 1994, Abu Al-Soud und Rådström 2000). Um durch Inhibition bedingte falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, empfiehlt es sich, als Indikator für die Effizienz der Reaktion, in jedem PCR-Ansatz eine Interne Amplifikationskontrolle (IAK) mitzuführen (Ursi et al. 1992, Ballagi-Pordany und Belak 1996). Dabei handelt es sich um eine Kontroll-DNA, die in einer definierten Menge der PCR-Reaktion zugegeben und zeitgleich mit der zu detektierenden DNA kopiert wird. Entsteht in der PCR kein spezifisches Amplifikat der gesuchten DNA, kann durch die Amplifikation der Kontroll-DNA die grundsätzliche Funktionalität der Reaktion belegt werden. Ein falsch negatives Ergebnis kann somit ausgeschlossen werden. Idealerweise werden die zu detektierende DNA und die Kontroll-DNA von Primern mit derselben Sequenz amplifiziert, so dass sie in einer kompetitiven PCR um das gleiche Primerpaaar konkurrieren (Rosenstraus et al. 1998, Courtney et al. 1999). Bei Anwendung einer Real-Time-PCR mit markierten Sonden lassen sich die Amplifikate der nachzuweisenden DNA und der Kontroll-DNA unterscheidbar detektieren, wenn die jeweiligen Sonden mit Farbstoffen verschiedener Emmissionsfluoreszenz modifiziert wurden (Elenitoba-Johnson et al. 2001). Mit der besonders hohen Sensitivität der PCR geht eine große Anfälligkeit für Kontaminationen einher. Bei allen Schritten der praktischen Durchführung einer diagnostischen PCR müssen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen und daraus resultierenden falsch positiven Ergebnissen angewendet werden. Kwok und Higuchi (1989) beschreiben die strikte räumliche Trennung aller Arbeitsschritte. Arbeiten mit Nukleinsäuren, wie die Probenaufarbeitung, werden von denen ohne Nukleinsäuren, wie die Herstellung von Reaktionslösungen, in getrennten Laboren durchgeführt. Alle Reagenzien sollten in möglichst geringe Mengen aliquotiert werden. Erst unmittelbar vor dem Start der Reaktion wird die DNA zum Ansatz gegeben. Sämtliche Materialien und Arbeitsräume sollten, soweit möglich, zur Dekontamination mit UV-Licht bestrahlt werden (Sarkar und Sommer 1993).
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Besonders leicht kann es durch die Anwesenheit von Amplifikaten vorangegangener PCR-Reaktionen zu Kreuzkontaminationen kommen. Um diese Kontaminationen zu vermeiden, kann ein enzymatischer Verdau vorhandener Amplifikate im Reaktionsansatz mit Uracil-DNA-N-Glycosylase (UNG) erfolgen. Durch den UNG-Verdau werden Amplifikate vorangegangener PCR-Reaktionen gespalten und dienen der DNA-Polymerase nicht mehr als Matrize. Voraussetzung ist, dass in jeder PCR dTTP durch dUTP ersetzt wird, wodurch es während der DNA-Synthese zum Einbau von Uracil statt Thymin kommt. UNG hydrolysiert selektiv Uracil-glycosidische Bindungen, während sie gegenüber nativer thyminhaltiger DNA inaktiv ist (Longo et al. 1990, Rys und Persing 1993). Durch Anwendung der PCR wird sowohl von lebenden als auch von toten Bakterienzellen die DNA nachgewiesen. Ein positives Signal sagt also nichts über die Lebensfähigkeit der Zielorganismen aus. Ist in der Probe ausschließlich DNA toter Zellen vorhanden, kann dies zu einem falsch positiven Ergebnis führen. Die Möglichkeit, tote Bakterienzellen nachzuweisen, kann aber auch zu wichtigen Informationen über den hygienischen Zustand der Untersuchungsprobe führen. Im Gegensatz zu klassischen mikrobiologischen Kultivierungsmethoden werden durch Anwendung der PCR auch Bakterien im „viable but nonculturable“ Stadium nachgewiesen. Ein der Umgebung angepasster Zustand in Stresssituationen durch Nährstoffmangel, niedrige Temperaturen oder ähnliches, in dem sich auch Bakterien befinden können, von denen eine erhebliche gesundheitliche Gefährdung ausgeht, sobald sie günstigere Lebensbedingungen vorfinden (Roszak und Colwell 1987, McKay 1992, Makino et al. 2000). Für Gattungen der Familie Enterobacteriaceae, wie Escherichia (Xu et al. 1982), Salmonella (Roszak et al. 1984) und Shigella (Colwell et al. 1985, Rahman et al. 1996), wurde dieses Phänomen beschrieben. Byrd et al. (1991), die den Zustand auch für Klebsiella pneumoniae und Enterobacter aerogenes beschreiben, warnen davor, dass eine Detektion der Bakterien allein mit kulturellen Methoden nicht gewährleistet ist. Selbst nach dem Pasteurisieren können sich in Milch noch Escherichia coli im „viable but nonculturable“ Stadium befinden (Binderova und Rysanek 1999, Gunasekera et al. 2002). Entwicklung und Fortschritt der PCR-Technologie ermöglichen im Bereich der Lebensmittelhygiene und -überwachung den genotypischen Nachweis bakterieller Kontaminationen durch Detektion spezifischer Nukleinsäuren. Vergleichende Untersuchungen konventioneller mikrobiologischer Verfahren zum Nachweis lebensmittelassoziierter Bakterien mit denen der PCR belegen deutlich die höhere Nachweisrate der PCR (Swaminathan und Feng 1994, Allmann et al 1995). Während herkömmliche Methoden in ihrer Durchführung sehr zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind, werden PCR-Techniken als schnelle und zuverlässige
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Alternative mit hoher Spezifität meist bevorzugt und kontinuierlich weiterentwickelt (Hill 1996, Naravaneni und Jamil 2005). Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln entwickelte PCR-Systeme müssen auf ihre Tauglichkeit im Vergleich zu konventionellen Methoden geprüft und mit Lebensmitteln validiert werden. Wenn jedoch Standardprotokolle und Validierungen nicht gegeben sind und die Qualität von PCR-Reagenzien und Geräten unbeständig ist, kann keine Weitergabe entwickelter PCR-Nachweismethoden vom Forschungslabor zum diagnostischen Routinelabor des Anwenders erfolgen. Von Seiten der Lebensmittelindustrie wird aber ein offiziell zugelassener Standard verlangt. Um dieser Situation gerecht zu werden, begründete die Kommission der Europäischen Union 1999 das Forschungsvorhaben „Food-PCR“, ein Projekt zur Validierung und Standardisierung diagnostischer PCR-Methoden für den Nachweis pathogener Bakterien in Lebensmitteln (Malorny et al. 2003). In der Bundesrepublik Deutschland ist das Deutsche Institut für Normung (DIN) in Zusammenarbeit mit dem Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) für die Standardisierung molekularbiologischer Methoden wie der PCR verantwortlich. Auf internationaler Ebene werden diese Aufgaben vom Europäischen Komitee für Normung (CEN) und von der Internationalen Organisation für Standardisierung (ISO) übernommen. 2.3 Zielsetzung der Arbeit Im Rahmen dieser Arbeit soll ein molekularbiologisches System für die Detektion von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae entwickelt werden. Der spezifische Indikatornachweis soll mittels Real-Time-PCR erfolgen und für die Untersuchung von Lebensmitteln auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceen anwendbar sein. Für die Durchführung sind folgende Arbeitsschritte geplant: • Ermitteln geeigneter DNA-Sequenzen innerhalb des für ribosomale RNA (rRNA)
kodierenden Bereichs von Enterobacteriaceae-Spezies und Generieren von Oligonukleotiden als Primer und Sonden für die PCR. Hierfür werden die entsprechenden DNA-Sequenzen verschiedener Enterobacteriaceae-Stämme sowie anderer, nicht nachzuweisender Eubakterien-Stämme im Alignment vergleichend dargestellt. Anhand der Daten werden mögliche Primer- und Sondensequenzen abgeleitet.
• Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems. Die generierten Primer und Sonden,
alle weiteren PCR-Komponenten und entsprechende Zyklusprofile werden in der PCR getestet. Mit dem Ziel, möglichst viele lebensmittelrelevante
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Enterobacteriaceae-Spezies mit hoher Sensitivität zu amplifizieren, aber andere Eubakterien nicht zu erfassen, werden die Komponenten und Reaktionsbedingungen entsprechend modifiziert und optimiert.
• Etablierung eines Verfahrens zur Dekontamination rekombinanter DNA-
Polymerasen, falls es zur Amplifikation von Enzymkontaminationen kommt. Da rekombinante Polymerasen in Escherichia coli synthetisiert werden und über eine ausgeprägte Affinität gegenüber DNA verfügen, können sich Spuren amplifizierbarer Nukleinsäuren in der Polymerase und dem Lagerpuffer befinden. Diese würden durch das zu entwickelnde Enterobacteriaceae-Nachweissystem in der PCR amplifiziert werden und könnten zu falsch positiven Ergebnissen führen. In diesem Fall muss eine zuverlässige Dekontamination der eingesetzten DNA-Polymerasen erreicht werden.
• Überprüfung der Spezifität des entwickelten Systems, indem die Nachweisbarkeit
der lebensmittelrelevanten Enterobacteriaceae getestet wird (Inklusivität). Ebenso werden diverse Spezies anderer Bakterientaxa, die mit dem System nicht erfasst werden sollen, in der Real-Time-PCR überprüft (Exklusivität).
• Entwicklung einer Internen Amplifikationskontrolle mit spezifischer Sonde für die
Überprüfung der Negativ-Ergebnisse. Durch Coamplifikation von Kontroll-DNA und Probe, idealerweise durchgeführt als kompetitive PCR mit den gleichen Primern, werden falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen.
• Nachweis der Sensitivität des Detektionssystems. Definierte Zellzahlen
verschiedener Enterobacteriaceen sowie deren quantifizierte genomische DNA werden hinsichtlich ihrer Nachweisgrenzen getestet.
• Vergleichende Überprüfung des PCR-Systems, insbesondere unter dem Aspekt
einer schnellen, spezifischen und sensitiven Detektion, gegenüber klassischen mikrobiologischen Tests auf Abwesenheit beziehungsweise Anwesenheit von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln. Zu diesem Zweck werden von identischem Ausgangsmaterial diverser Lebensmittelproben Anreicherungen durchgeführt und auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceae sowohl durch Ösenausstrich auf Selektiv-Agar als auch durch Amplifikation ihrer DNA mit dem entwickelten Real-Time-PCR-System überprüft.
II Material und Methoden
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II MATERIAL UND METHODEN 1 MATERIAL 1.1 Bakterienstämme Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitätstests
Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
1 Budvicia aquatica DSM 5075 35 Kluyvera cryocrescens DSM 4588
2 Buttiauxella agrestis DSM 4586 36 Leclercia adecarboxylata DSM 5077
3 Cedecea davisae DSM 4568 37 Moellerella wisconsensis DSM 5076
4 Citrobacter amalonaticus DSM 4593 38 Morganella morganii DSM 30164
5 Citrobacter braakii DSM 30040 39 Pantoea agglomerans BCD 2151
6 Citrobacter diversus BCD 5366 40 Pantoea ananatis DSM 30070
7 Citrobacter freundii BCD 5893 41 Pantoea dispersa DSM 30073
8 Citrobacter koseri DSM 4595 42 Photorhabdus luminescens DSM 3368
9 Edwardsiella tarda DSM 30052 43 Plesiomonas shigelloides DSM 8224
10 Enterobacter aerogenes DSM 30053 44 Proteus mirabilis DSM 788
11 Enterobacter agglomerans BCD 8600 45 Proteus vulgaris BCD 915
12 Enterobacter amnigenus DSM 4486 46 Providencia alcalifaciens DSM 30120
13 Enterobacter cloacae ssp. cloacae DSM 30054 47 Providencia rettgeri DSM 1131
14 Enterobacter gergoviae BCD 511 48 Providencia stuartii DSM 4539
15 Enterobacter intermedius DSM 45481 49 Rahnella aquatilis DSM 4594
16 Enterobacter sakazakii DSM 4485 50 Raoultella planticola DSM 4617
17 Enterobacter sakazakii ATCC 51329 51 Raoultella terrigena DSM 2687
18 Erwinia carotovora DSM 30168 52 Salmonella Abony DSM 4224
19 Erwinia chrysanthemi DSM 4610 53 Salmonella Senftenberg BCD 6173
20 Erwinia mallotivora DSM 4565 54 Salmonella Typhimurium BCD 14285
21 Escherichia blattae NCTC 12127 55 Serratia ficaria DSM 4569
22 Escherichia coli DSM 30083 56 Serratia grimesii DSM 30063
23 Escherichia coli DSM 1576 57 Serratia liquefaciens BCD 676
II Material und Methoden
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Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
24 Escherichia coli EHEC BCD 7856 58 Serratia marcescens DSM 1636
25 Escherichia hermanii DSM 4560 59 Serratia plymuthica DSM 49
26 Escherichia hermanii BCD 8467 60 Serratia proteamaculans BCD 8916
27 Escherichia vulneris DSM 4564 61 Serratia rubidaea DSM 4480
28 Ewingella americana DSM 4580 62 Shigella boydii DSM 7532
29 Hafnia alvei DSM 30163 63 Shigella sonnei BCD 4301
30 Klebsiella oxytoca DSM 5175 64 Xenorhabdus beddingii DSM 4764
31 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 65 Yersinia enterocolitica ssp. enterocolitica DSM 4780
32 Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae DSM 2026 66 Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992
33 Klebsiella terrigena DSM 2687 67 Yokenella regensburgei DSM 5079
34 Kluyvera ascorbata DSM 4611
Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
1 Acetobacter aceti DSM 3508 26 Gluconobacter oxydans DSM 7145
2 Achromobacter spec. BCD 1193 27 Haemophilus influenzae DSM 4690
3 Acinetobacter baumanii BCD 10388 28 Helicobacter pylori DSM 4867
4 Acinetobacter calcoaceticus BCD 1209 29 Listeria monocytogenes ATCC 19118
5 Aeromonas caviae DSM 7323 30 Megasphaera cerevisiae DSM 20462
6 Aeromonas enteropelogenes DSM 6394 31 Moraxella catarrhalis DSM 9143
7 Aeromonas hydrophila ssp. anaerogenes DSM 30188 32 Pasteurella pneumotropica BCD 2891
8 Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila DSM 6173 33 Photobacterium phosphoreum BCD 5162
9 Aeromonas media DSM 4881 34 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
10 Aeromonas sobria ATCC 43979 35 Pseudomonas aeruginosa DSM 1128
11 Alcaligenes spec. DSM 2625 36 Pseudomonas stutzeri DSM 5190
12 Bacillus cereus BCD 8832 37 Psychrobacter immobilis DSM 7229
13 Brevundimonas vesicularis DSM 7226 38 Ralstonia pickettii DSM 6297
14 Burkholderia cepacia DSM 7288 39 Sphingobacterium multivorum DSM 6175
15 Burkholderia cepacia BCD 3134 40 Sphingomonas paucimobilis DSM 1098
II Material und Methoden
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Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
16 Campylobacter fetus DSM 5361 41 Staphylococcus aureus DSM 20231
17 Campylobacter jejuni BCD 15108 42 Vibrio alginolyticus DSM 2171
18 Chromobacterium violaceum DSM 30191 43 Vibrio fischeri DSM 5075
19 Clostridium perfringens BCD 8799 44 Vibrio fluvialis ATCC 33809
20 Clostridium tyrobutyricum DSM 663 45 Vibrio harveyi DSM 6904
21 Comamonas acidovorans DSM 39 46 Vibrio parahaemolyticus DSM 10027
22 Comamonas testosteroni DSM 1622 47 Vibrio proteolyticus DSM 30189
23 Enterococcus faecalis DSM 20478 48 Vibrio vulnificus DSM 10143
24 Flavobacterium resinovorum DSM 7478 49 Xanthomonas maltophila BCD 4273
25 Flavobacterium spec. BCD 2539 50 Zymomonas mobilis BCD 5724
Escherichia coli-Stamm für die Transformation XL1-blue: recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk- mk+), supE44, relA1, lac, [F´ proAB, lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)] (Fa. Stratagene, Kat. Nr. #200236).
1.2 Nährmedien Alle Nährmedien wurden, soweit nicht anders angegeben, 15 min bei 121 °C autoklaviert.
CASO-Bouillon (Merck Kat. Nr. 1.05459) 17,0 g/l Pepton aus Casein 3,0 g/l Pepton aus Sojamehl 2,5 g/l D(+)-Glukose 5,0 g/l NaCl 2,5 g/l K2HPO4 pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
CASO-Agar (Merck Kat. Nr. 1.05458) 15,0 g/l Pepton aus Casein 5,0 g/l Pepton aus Sojamehl 5,0 g/l NaCl 15,0 g/l Agar-Agar pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
II Material und Methoden
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1.3 Reagenzien Zur Herstellung der Lösungen und Puffer wurden ausschließlich Chemikalien des Reinheitsgrades p. a. verwendet, welche von den Firmen Merck, Roche Diagnostics und Sigma bezogen wurden.
LB-Medium (Sambrook et al. 1989) 10,0 g/l Bacto Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 15,0 g/l Agar-Agar (Zusatz optional) pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C Supplement (zur Analyse nach Transformation) 100 µg/ml Ampicillin 80 µg/ml X-Gal 0,5 mM IPTG
Meerwasser-Bouillon 10,0 g/l Fleischextrakt 10,0 g/l Pepton 21,1 g/l NaCl 0,58 g/l KCl 1,2 g/l CaCl2 · 2 H2O 3,6 g/l MgCl2 · 6 H2O 0,08 g/l NaHCO3 2,63 g/l MgSO4 · 7 H2O pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
SOC-Medium (Sambrook et al. 1989) 20,0 g/l Bacto Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 0,5 g/l NaCl Vor Gebrauch zugeben: 10 mM MgCl2, sterilfiltriert 10 mM MgSO4, sterilfiltriert 20 mM Glucose, sterilfiltriert pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C
MOSSEL-Bouillon (Merck Kat. Nr. 1.05394) 10,0 g/l Peptone 5,0 g/l D(+)-Glukose 20,0 g/l Ochsengalle, getrocknet 0,015 g/l Brillantgrün 8,0 g/l Na2HPO4 2,0 g/l KH2PO4 pH 7,2 ± 0,2 bei 25 °C Schonend autoklavieren, 5 min bei 121 °C.
VRBD-Agar nach MOSSEL (Merck Kat. Nr. 1.10275) 7,0 g/l Pepton aus Fleisch 3,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 10,0 g/l D(+)-Glukose 1,5 g/l Gallesalzmischung 0,03 g/l Neutralrot 0,002 g/l Kristallviolett 13,0 g/l Agar-Agar pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C Unter ständigem Rühren kochen bis zum vollständigen Lösen, nicht autoklavieren.
1x TE-Puffer 1x TBE-Puffer 10 mM Tris-HCl 90 mM Tris-Borat 1 mM EDTA 2 mM EDTA pH 8,0 pH 8,3
II Material und Methoden
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api®20 E (Fa. bioMérieux, Kat. Nr. 20100) Anaerotest® (Fa. Merck, Kat. Nr. 1.15112.0001) Anaerocult® A (Fa. Merck, Kat. Nr. 1.13829.0001) Oxidase Teststreifen (Fa. Biotest, Kat. Nr. 934260) DNA-Längenstandards DNA-Längenstandard VI (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11062590001) Größe in bp: 2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453, 394, 298, 234, 220, 154. DNA-Längenstandard 1 kb (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5207) Größe in bp: 10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000 x 2, 2.500, 2.000, 1.500, 1.000 x 2, 750, 500, 250. DNA-Längenstandard 100 bp (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5191) Größe in bp: 1000, 900, 800, 700, 600, 500 x 2, 400, 300, 200, 100.
HSTE-Puffer 1x PBS-Puffer 10 mM Tris-HCl 137 mM NaCl 0,5 mM EDTA 2,7 mM KCl 0,01 g/l Heringssperma-DNA 4,3 mM Na2HPO4 1,4 mM KH2PO4 pH 7,3
Ladepuffer für Agarosegele 0,25 % (w/w) Bromphenolblau 0,25 % (w/w) Xylencyanol FF 30,0 % (w/w) Glycerin
II Material und Methoden
31
1.4 Enzyme Alle Enzyme wurden mit den dazugehörigen 10x Reaktionspuffern eingesetzt. Taq-DNA-Polymerasen Perpetual Taq DNA Polymerase mit monoklonalem anti-Taq Antikörper (Fa. Roboklon GmbH, Kat. Nr. E2700-01) HotStarTaq™ DNA Polymerase (Kit, Fa. Qiagen, Kat. Nr. 203203) FastStart Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 12158264001) Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11146165001) LightCycler®-FastStart DNA Master Hybridization Probes (Kit, Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03003248001) Restriktionsendonukleasen Aci I (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0551S) HpyCH4 IV, Isoschizomer: Mae II (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0619S) Mse I (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0525S) Desoxyribonuklease DNase I (Kit, Fa. Sigma, Kat. Nr. AMP-D1) Uracil-DNA-Glycosylase LightCycler® Uracil-DNA-Glycosylase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 3 539 806)
II Material und Methoden
32
1.5 Reaktionskits QIAquick Gel Extraction Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 28704) QIAprep Spin Miniprep Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 27104) High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11796828001) ShortPrep foodproof II Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001) pGEM®-T Vector System I (Fa. Promega, Kat. Nr. A3600) PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kat. Nr. P-7589) 1.6 Primer und Sonden Die Synthese der eingesetzten Primer erfolgte durch die Firma MWG Biotech. Die mit LCRed 640 beziehungsweise LCRed 705 am 5’-Ende oder Fluorescein am 3’-Ende markierten Sonden wurden von der Metabion GmbH synthetisiert. Die Buchstaben R, K, V und H stehen für Basengemische: R = A + G, K = G + T, V = A + G + C, H = A + C + T. Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des DNA-
Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
fw 1.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1.2 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1.3 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1.4 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1 II.1 18 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1 II.2 18 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1 II.3 18 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 2.1 23 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 2.2 23 mer 23S-Gen forward-Primer
II Material und Methoden
33
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
fw 3.1 17 mer 5S-Gen forward-Primer
fw 3.2 17 mer 5S-Gen forward-Primer
fw 4.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 4.2 21 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 5.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 6.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 7.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 8.1 17 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 9.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 9.2 22 mer 23S-Gen forward-Primer
rev 1.1 27 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.2 27 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.3 26 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.4 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.5 24 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.6 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.7 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.8 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 2.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 3.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 3 II .1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 4.1 23 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
rev 4.2 24 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
rev 5.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 6.1 18 mer Spacer-5S-Gen reverse-Primer
rev 7.1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 8.1 16 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 9.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 10.1 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
rev 10.2 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
II Material und Methoden
34
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
Flu 1 33 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde
Red 1 LCRed 640 - 30 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde
HzFlu 31 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde
HzRed LCRed 640 - 32 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde
Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der
Internen Amplifikationskontrolle
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
IAKrev 45 mer 23S-Gen reverse-Primer
IAKfw 49 mer 23S-Gen forward-Primer
IAKRed LCRed 705 - 28 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde
Primer der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH zur Amplifikation der 23S-5S-DNA fw23S, forward: 5’ – GGT ACG CGA GCT GGG TTT AGA ACG – 3’ rev5S, reverse: 5’ – GGC RRT KHC CTA CTC TCV C – 3’ Etablierte Primer zur Amplifikation der 16S-DNA (Barry et al. 1990) 41F, forward: 5’ – GCT CAG ATT GAA CGC TGG CG – 3’ 1066R, reverse: 5’ – ACA TTT CAC AAC ACG AGC TG – 3’ Primer für die Sequenzierung durch Firma GATC Biotech AG M13-FP, forward: 5’ – TGT AAA ACG ACG GCC AGT – 3’ M13-RP, reverse: 5’ – CAG GAA ACA GCT ATG ACC – 3’
II Material und Methoden
35
1.7 Lebensmittelproben Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel
Nr. Produkt Nr. Produkt
1 Kinder-Eis Piraten Mix, Krokodil 26 Himbeer-Käse-Sahnetorte
2 Eismann Minis/Riegel Mix, Karamell 27 Tiramisu-Eisriegel
3 Butter-Tee-Gebäck, helle Teigmischprobe 28 Suppengemüse
4 Grünkohl 29 Gemüse-Reispfanne
5 Porree/Lauch 30 Kräutermischung mit Bärlauch
6 Buntes Gartengemüse 31 Petersilie
7 Asia Pfanne Bombay 32 Schnittlauch
8 Pangasiusfilet 33 Knoblauch-Würfel
9 Lachsforelle Ammerländer Art 34 Kaiserschmarrn, Vanillesoße
10 Garnelen in Knusperteig 35 Garnelensnack
11 Fleischtopf Toscana 36 Schollenfilet
12 Lammmedaillons 37 Wiener Würstchen
13 Gnocci 38 Original Thüringer Rostbratwurst
14 Westfälischer Grünkohl mit Räucherwurst 39 Cevapcici
15 Blätterteigkörbchen Schinken Käse 40 Donuts
16 Blumenkohl-Broccoli-Gratinos 41 Bunte Tortenmischung, Nuss-Sahne
17 Marinierte Gänsekeulen 42 Hähnchenkeule
18 Ente Classic 43 Hähnchenbrustfilet paniert
19 Marinierte Entenpfanne 44 Reibekuchen
20 Markklößchen 45 Suppenklößchen
21 Kartoffelgratin 46 Donauwelle
22 Tex Mex Box, Mozzarella Sticks 47 Herzoginkartoffeln
23 Bratapfelplunder 48 Lachstulpe, Lachs und Gemüse
24 Pizza Schinken Champignon 49 Hähnchenbrustfilet unpaniert
25 Mini Sahnewindbeutel 50 Eddy's Fisch, Seefisch
II Material und Methoden
36
Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver
Nr. Produkt Hersteller/Vertrieb
1 Milasan Milchbrei Früchte, nach dem 4. Monat Milasan GmbH
2 Getreidebrei BIO 3-Korn, milchfrei, nach EG-Öko-Verordnung, ab dem 6. Monat Milupa GmbH
3 Milasan Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Milasan GmbH
4 BEBA Sensitive Spezialnahrung, diätetisches Lebensmittel, von Geburt an Nestlé Deutschland AG
5 Milumil 1, Dauermilch, von Geburt an Milupa GmbH
6 Alete Anfangsmilchnahrung PRE, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH
7 Alete Hypoallergene Anfangsnahrung H.A.1, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH
8 Folgemilch 3, prebiotisch, ab dem 8. Monat Humana GmbH
9 Aptamil Pre Säuglingsmilchnahrung, von Geburt an Milupa GmbH
10 Babydream Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH
11 BEBA Start Anfangsmilchnahrung Pre, von Geburt an Nestlé Deutschland AG
12 HiPP Bio-Anfangsmilch, von Geburt an HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG
13 HiPP Folgemilch 3, ab dem 8. Monat HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG
14 Babydream Folgemilch 2, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH
15 Bebivita, Baby-Aktiv Folgemilch, ab dem 8. Monat Bebivita GmbH
16 Humana Anfangsmilch PRE, von Geburt an Humana GmbH
17 Pre Milasan Säuglings-Milchnahrung, von Geburt an Milasan GmbH
18 Milasan 2 Folgemilch, nach dem 4. Monat Milasan GmbH
19 Alete Abendmilchbrei Banane mit Milchreis, ab dem 8. Monat Nestlé Nutriton GmbH
20 Bebivita Abendmilchbrei Grieß-Vanille, nach dem 4. Monat Bebivita GmbH
21 Milasan BIO Milchgrießbrei m. Vanille, nach EG-Öko-Verordnung, nach 4. Monat Milasan GmbH
22 Volleipulver Sanovo Eiprodukte GmbH & Co KG
1.8 Software Apilab Version V 4.0 api®20 E (Fa. bioMérieux) Vector NTI® Suite Version 7.1 (Fa. InforMax®, Inc.) MeltCalcPro Version 2.06 (Fa. MeltCalc© Software GbR)
II Material und Methoden
37
Chromas Version 1.45, Copyright© 1996-1998 Conor McCarthy, School of Health Science, Griffith University, Gold Coast Campus, Southport, Queensland, Australia LightCycler® Software Version 3.5 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.) LightCycler® Software Version 4.0 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.) 2 METHODEN 2.1 Anzucht von Mikroorganismen Die meisten Mikroorganismen wurden in CASO-Bouillon angezogen, Vibrio-Arten in Meerwasser-Bouillon (Kap. II 1.2). Die Kultivierungsbedingungen entsprachen der jeweiligen Spezies. In der Regel erfolgte die Anzucht aerob für ein bis zwei Tage bei 30 °C bis 37 °C. 2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen Die Quantifizierung der Bakterienzellen erfolgte in einer Thomakammer mit 400 Kleinquadraten und einer Tiefe von 0,1 mm unter dem Mikroskop. Es wurden pro Quantifizierung vier Großquadrate à 16 Kleinquadrate in einer Diagonale ausgezählt. Die Zahl der Zellen pro ml (N) wurde nach der Formel N = (Zahl der Zellen pro Großquadrat · 106) / 4 berechnet. Jede Zählung wurde einmal mit neu gefüllter Kammer wiederholt. Durch Ausplattieren und Inkubation auf CASO-Agar (Kap. II 1.2) wurde die Lebendkeimzahl überprüft. 2.3 DNA-Extraktion Für die DNA-Extraktion wurde 1 ml einer Bakterienzellkultur für 5 min in einer Tischzentrifuge (Eppendorf 5415C) bei 10.000 x g sedimentiert. Je nach benötigtem Reinheitsgrad wurde die DNA nach verschiedenen Verfahren extrahiert und direkt weiterverwendet oder bei –20 °C gelagert.
II Material und Methoden
38
2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss Präparation und Reinigung der Bakterien-DNA über Silikasäulen erfolgte mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 1796828). Zusätzlich wurden phosphatgepufferte Saline (PBS, Kap. II 1.3), Lysozym (Fa. Sigma, Kt. Nr. L6876), RNase A (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 109142), Isopropylalkohol abs. und Tris EDTA-Puffer (TE, Kap. II 1.3) verwendet. Die sedimentierten Bakterienzellen wurden in 200 µl PBS resuspendiert. Für die Zelllyse und den RNA-Verdau erfolgte eine Inkubation mit je 10 µl Lysozym (10 mg/ml in Tris-HCl, pH 8,0) und RNase A (10 mg/ml) bei 37 °C für 20 min. Der Proteinverdau wurde mit 40 µl Proteinase K (20 mg/ml) in 200 µl Bindungspuffer bei 72 °C für 10 min durchgeführt. Nach Zugabe von 100 µl Isopropylalkohol abs. wurde die DNA auf der Säule entsprechend den Anweisungen des Kit-Herstellers gereinigt. Die Elution der DNA erfolgte mit 100 µl TE-Puffer. 2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep Die Aufarbeitung der genomischen DNA erfolgte mit dem ShortPrep foodproof II Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Nach Inkubation bei 95 °C für 5 min, 2 sek vortexen und 1 min Zentrifugation bei 13.000 x g befindet sich die Bakterien-DNA im Überstand des Resuspensionspuffers. 2.4 DNA-Quantifizierung Die Quantifizierung präparierter DNA (Kap. II 2.3.1) erfolgte photometrisch oder im LightCycler®. Die Menge von Amplifikationsprodukten der PCR wurde durch Visualisierung im Geldokumentationsgerät ermittelt. 2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer Die DNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm mit dem Gene Quant II Photometer (Fa. Pharmacia) quantifiziert. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine optische Dichte (OD) von 1 einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Eine mögliche Verunreinigung durch Proteine wurde durch die OD280nm ermittelt. Der Quotient aus OD260nm/ OD280nm für reine DNA sollte bei 1,8 bis 1,9 liegen (Sambrook et al.1989).
II Material und Methoden
39
2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler® Die Quantifizierung der DNA im LightCycler® 2.0 Instrument erfolgte mit dem Programm „Nucleic Acid Quantification“ der LightCycler® Software Version 4.0 unter Verwendung des PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kap. II 1.5) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Fluoreszenz des in DNA interkalierenden Farbstoffs PicoGreen® wurde bei 530 nm gemessen. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität ist über einen DNA-Konzentrationsbereich von 25 pg/ml bis 1 µg/ml linear und wurde über eine Standardgerade bestimmt. Als Standard diente der PicoGreen® Lambda-DNA-Standard (100 µg/ml) aus dem Kit. 2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten Die Quantifizierung von Amplifikationsprodukten erfolgte nach deren Auftrennung im Agarosegel (Kap. II 2.2.7). Die mit Ethidiumbromid markierten DNA-Banden wurden unter UV-Licht visualisiert, mit dem Geldokumentationssystem E.A.S.Y. Win32 (Fa. Herolab) dokumentiert und mit der integrierten Software ausgewertet. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich der Lichtemissionsintensitäten der Amplifikatbanden mit den Banden des mitgeführten DNA-Molekulargewichtsstandard. 2.5 Endonukleasenverdau 2.5.1 Restriktionsverdau Der Restriktionsverdau von DNA erfolgte mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease (Kap. II 1.4) und dem dazugehörigen 10x Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 bis 150 µl und bei der für das Enzym geeigneten Reaktionstemperatur. Die Reaktion wurde in 1 bis 3 h oder über Nacht durchgeführt. Gestoppt wurde die Restriktion durch Zugabe von 5 mM EDTA oder Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65 °C für 20 min. 2.5.2 DNase I-Verdau Der DNA-Verdau wurde mit DNase I (Kap. II 1.4) und dazugehörigem 10x Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 bis 200 µl bei 24 °C oder 37 °C in 1 bis 6 h katalysiert. Das Enzym wurde durch Zugabe von 5 mM EDTA und Inkubation bei 70 °C für 10 min denaturiert.
II Material und Methoden
40
2.6 Polymerase-Kettenreaktion Das Pipettieren der PCR-Reagenzien, die Zugabe der DNA, die Durchführung der PCR und der Nachweis der PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese wurden jeweils in getrennten Räumen durchgeführt. Sämtliche PCR-Reagenzien, in geringen Mengen aliquotiert, und Proben wurden mit gestopften Pipettenspitzen pipettiert. Als Ausgangsmaterial für die PCR diente quantifizierte DNA (Kap. II 2.4) oder ShortPrep-DNA (Kap. II 2.3.2). Es wurden die DNA-Polymerasen Perpetual Taq DNA Polymerase mit monoklonalem anti-Taq Antikörper, HotStarTaq™ DNA Polymerase, FastStart Taq DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase oder LightCycler®-FastStart DNA Master Hybridization Probes mit dazugehörigem 10x Reaktionspuffer und MgCl2-Lösung eingesetzt (Kap. II 1.4). BSA (Kat. Nr. 735 078), Nukleotide (dATP Kat. Nr. 1 934 511, dCTP Kat. Nr. 1 934 520, dGTP Kat. Nr. 1 934 538, dTTP Kat. Nr. 1 934 546, dUTP Kat. Nr. 1 934 554) und Uracil-DNA-Glycosylase (UNG, Kat. Nr. 3 539 806) zur Spaltung uracilhaltiger Amplifikate wurden von Fa. Roche Diagnostics bezogen. Als Wasser wurde Aqua ad iniectabilia (Fa. B. Braun Melsungen AG) eingesetzt. Die Durchführung der konventionellen PCR erfolgte im Thermocycler GeneAmp® 9700 (Fa. Perkin Elmer), die Durchführung der Real-Time-PCR im LightCycler®. 2.6.1 Standardbedingungen für die konventionelle PCR Standard PCR-Ansatz
Für die Herstellung von Amplifikaten zur Klonierung wurden im dNTP-Mix dTTP-, für alle weiteren PCR-Reaktionen dUTP- statt dTTP- Nukleotiden eingesetzt.
Reagenz Volumen Endkonzentration
10x PCR-Puffer 2,5 µl 1x
MgCl2 (50 mM) 1,0 µl 2,0 mM
dNTP (40 mM) 0,5 µl 800 µM
Primer forward (10 µM) 1,0 µl 400 nM
Primer reverse (10 µM) 1,0 µl 400 nM
Taq DNA-Polymerase (5 U/µl) 0,1 µl 0,5 U
DNA variabel variabel
Aqua ad iniectabilia ad 25 µl -
II Material und Methoden
41
Standardtemperaturprofil PCR
2.6.2 Standardbedingungen für die Real-Time-PCR Standard Real-Time-PCR-Ansatz
Die PCR wurde entweder mit dTTP im dNTP-Mix durchgeführt, oder die dTTP wurden durch dUTP ersetzt. Bei Durchführung der PCR-Reaktionen mit dUTP wurden 0,1 U UNG für die Spaltung uracilhaltiger Amplifikate dem Reaktionsansatz zugegeben. Der UNG-Verdau erfolgte vor dem Start der PCR bei 37 °C für 10 min, im Anschluss wurde das Enzym während der initialen Denaturierung bei 95 °C hitzeinaktiviert.
Temperatur Zeit
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min
Denaturierung 95 °C 30 sek
Annealing variabel 45 sek 30 Zyklen
Elongation 72 °C 45 sek
Finale Elongation 72 °C 5 min
Reagenz Volumen Endkonzentration
10x PCR-Puffer 2,0 µl 1x
MgCl2 (50 mM) 1,5 µl 3,75 mM
BSA (3 %) 1,0 µl 0,15 %
dNTP (40 mM) 0,8 µl 1,6 mM
Primer forward (10 µM) 1,0 µl 500 nM
Primer reverse (10 µM) 1,0 µl 500 nM
Fluorescein-Sonde (10 pmol/µl) 0,2 µl 100 nM
LCRed-Sonde (10 pmol/µl) 0,3 µl 150 nM
Taq DNA-Polymerase (5 U/µl) 0,2 µl 1,0 U
DNA variabel variabel
Aqua ad iniectabilia ad 20 µl -
II Material und Methoden
42
Standardtemperaturprofil Real-Time-PCR
Standardtemperaturprofil Schmelzkurve
Die Auswertung der PCR-Läufe erfolgte mit der LightCycler® Software Version 3.5 (Kap. II 1.8).
Temperatur Zeit
Initiale Denaturierung 95 °C 2 min
Denaturierung 95 °C 5 sek
Annealing variabel 20 sek 35 Zyklen
Elongation 72 °C 35 sek
Temperatur Zeit Transition Rate
95 °C 10 sek 20 °C/sek
45 °C 20 sek 20 °C/sek
70 °C 0 sek 0,20 °C/sek
99 °C 0 sek 0,20 °C/sek
II Material und Methoden
43
2.6.3 Für den Nachweis von Enterobacteriaceae mittels Real-Time-PCR optimierte Reaktionsbedingungen
Real-Time-PCR-Ansatz
Die Entstehung des Amplifikats der Ziel-DNA mit komplementärer Sequenz der LCRed 640-Sonde und des Amplifikats der Internen Amplifikationskontrolle mit komplementärer Sequenz der LCRed 705-Sonde werden parallel in getrennten Fluoreszenzkanälen F2/Back-F1 und F3/Back-F1 gemessen. Temperaturprofil Real-Time-PCR
Reagenz Volumen Endkonzentration
10x PCR-Puffer 2,0 µl 1x
MgCl2 (50 mM) 2,0 µl 5 mM
BSA (3 %) 1,0 µl 0,15 %
dNTP (40 mM) 0,8 µl 1,6 mM
Primer fw 9.1 (10 µM) 1,26 µl 630 nM
Primer fw 9.2 (10 µM) 0,24 µl 120 nM
Primer rev 10.1 (10 µM) 1,26 µl 630 nM
Primer rev 10.2 (10 µM) 0,24 µl 120 nM
Fluorescein-Sonde HzFlu (10 pmol/µl) 0,2 µl 100 nM
LCRed 640-Sonde HzRed (10 pmol/µl) 0,3 µl 150 nM
LCRed 705-IAK-Sonde IAKRed (10 pmol/µl) 0,3 µl 150 nM
Perpetual Taq DNA Polymerase (1,5 U/µl) 1,0 µl 1,5 U
IAK (10 fg/µl) 0,2 µl 2,0 fg
Probe variabel variabel
Aqua ad iniectabilia ad 20 µl -
Temperatur Zeit
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min
Denaturierung 95 °C 5 sek
Annealing 58 °C 40 sek 35 Zyklen
Elongation 72 °C 35 sek
II Material und Methoden
44
Temperaturprofil Schmelzkurve
2.7 Gelelektrophorese 2.7.1 Agarosegelelektrophorese DNA-Fragmente wurden ihrer Größe nach durch Elektrophorese im Agarosegel aufgetrennt. Die Konzentration der Agarose (Fa. Biozym, Kat. Nr. 870056) lag, je nach zu erwartender Größe der DNA-Fragmente, bei 1 bis 2 % (w/v). Für die spätere Visualisierung unter UV-Licht wurde das Gel mit Ethidiumbromid (0,3 µg/ml) in TBE-Puffer (Kap. II 1.3) versetzt. Den zu trennenden Nukleinsäureproben wurde zum Auftragen 1/10 (v/v) Ladepuffer (Kap. II 1.3) zugegeben. Die Auftrennung erfolgte in TBE-Puffer bei einer Spannung von 5 bis 15 V/cm. Die fluoreszenzmarkierten DNA-Banden wurden unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 312 nm mit dem Geldokumentationssystem E.A.S.Y. Win32 (Fa. Herolab) visualisiert, fotografiert, dokumentiert und ausgewertet. Während der Gelelektrophorese wurde der DNA-Längenstandard VI, 1 kb oder 100 bp (Kap. II 1.3) mitgeführt. 2.7.2 Präparative Gelelektrophorese DNA-Amplifikate für die Klonierung oder die Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle wurden mittels präparativer Gelelektrophorese aufgearbeitet. Dafür wurde die DNA nach elektrophoretischer Auftrennung (Kap. II 2.7.1) als Bande im Agarosegel unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 365 nm mittels eines Skalpells präpariert. Es folgte die Elution und Aufreinigung der DNA unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (Kap. II 1.5) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
Temperatur Zeit Transition Rate
95 °C 0 sek 20 °C/sek
40 °C 45 sek 20 °C/sek
75 °C 0 sek 0,10 °C/sek
II Material und Methoden
45
2.8 Klonierung von DNA-Amplifikaten 2.8.1 Ligation präparierter Amplifikate DNA-Amplifikate wurden wie in Kap. II 2.7.1 beschrieben aufgearbeitet und unter Verwendung des pGEM®-T Vector System I (Kap. II 1.5) nach Anweisung des Herstellers in den Vektor pGEM®-T ligiert. Das Insert wurde gegenüber dem Vektor etwa im Molaritätsverhältnis 3:1 eingesetzt. Die Ligation erfolgte mit 2,4 U T4 DNA Ligase und 20 ng Vektor in einem Gesamtvolumen von 10 µl bei 4 °C in 15 bis 20 h. 2.8.2 Transformation in Escherichia coli Zur Herstellung transformationskompetenter Zellen wurden aus einer 10 ml LB-Medium-Kultur (Kap. II 1.2) über Nacht gewachsener Escherichia coli XL-1 blue (Kap. II 1.1) 0,5 ml in 50 ml LB-Medium überimpft. Die Zellen wurden bei 37 °C unter Schütteln bei 150 rpm bis zu einer OD550nm von etwa 0,5 inkubiert. Es folgte eine Inkubation auf Eis für 15 min und anschließende Zentrifugation der Zellen bei 5000 x g für 10 min bei 4 °C. Das Sediment wurde in 20 ml einer 4 °C kalten 0,1 M MgCl2-Lösung aufgenommen und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml einer 4 °C kalten 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert, für 20 min auf Eis inkubiert und bei 5000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml einer 4 °C kalten 0,1 M CaCl2-Lösung aufgenommen und mit 250 µl 87 % (v/v) Glycerin versetzt. Aliquots dieser Zellen von je 100 µl wurden direkt für die Transformation eingesetzt oder bei –80 °C gelagert. Zur Transformation der Plasmid-DNA wurden 100 µl kompetente Zellen auf Eis aufgetaut, mit 5 µl Ligationsansatz (Kap. II 2.8.1) versetzt und für 20 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei 42 °C für 2 min wurde der Ansatz für 10 min auf Eis inkubiert, mit 500 µl SOC-Medium (Kap. II 1.2) versetzt und bei 37 °C mit 120 rpm für 1 h geschüttelt. 100 µl des Transformationsansatzes wurden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin/IPTG/X-Gal (Kap. II 1.2) ausplattiert und bei 37 °C über Nacht bebrütet. Die Identifizierung rekombinanter und nicht rekombinanter Klone von Escherichia coli erfolgte anhand der blau-weiß Färbung der Kolonien.
II Material und Methoden
46
2.9 Präparation und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 2.9.1 Präparation von Plasmid-DNA Eine transformierte weiße Enzelkolonie (Kap. II 2.8.2) wurde von einer Agarplatte in 2 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin (Kap. II 1.2) überimpft und bei 37 °C mit 150 rpm über Nacht unter Schütteln inkubiert. Der Zellsuspension wurde 1 ml entnommen und 5 min bei 5000 x g sedimentiert. Aus den pelletierten Zellen erfolgte die Präparation und Aufreinigung der Plasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kit (Kap. II 1.5) nach Anweisung des Herstellers. Mit 50 µl Elutionspuffer wurde die DNA von der Säule eluiert. 2.9.2 Restriktionsverdau präparierter Plasmid-DNA Zur Überprüfung des Plasmids auf das Vorhandensein des Inserts erfolgte ein analytischer Verdau (siehe unten) von 5 µl Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym Sac I im dazugehörigen Reaktionspuffer unter Zugabe von BSA (Fa. New England BioLabs, Kat. Nr. R0156S). Der Ansatz wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µl bei 37 °C für 2 h inkubiert. Handelte es sich bei der klonierten DNA um eine Interne Amplifikationskontrolle für PCR-Reaktionen, so wurde diese linearisiert und präpariert (präparativer Verdau). Unter Zugabe von Sac I wurden 40 µl der Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 60 µl bei 37 °C über Nacht verdaut. Reaktionsansatz
Nach dem Verdau wurde die DNA mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und ihre Größe anhand des mitgeführten DNA-Längenstandard VI bestimmt (Kap. II 2.7.1). Der Vektor pGEM®-T hat eine Größe von 3000 bp, bei Vorhandensein des Inserts ist die DNA-Bande im Gel entsprechend größer, sofern sich keine Restriktionsschnittstelle für Sac I in der ligierten DNA befindet.
Reagenz Analytischer Verdau Präparativer Verdau
Plasmid-DNA 5 µl 40 µl
Sac I (20 U/µl) 0,5 µl 4 µl
10x NEBuffer 1 2 µl 6 µl
BSA (10 mg/ml) 0,2 µl 0,6 µl
Aqua ad iniectabilia 12,3 µl 9,4 µl
II Material und Methoden
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Plasmid-DNA für die Amplifikationskontrolle wurde durch präparative Gelelektrophorese (Kap. II 2.7.1) aufgearbeitet und unter Verwendung des PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit quantifiziert (Kap. II 2.4.2). 2.10 Sequenzanalyse 2.10.1 DNA-Sequenzierung und Sequenzauswertung Die Sequenzierung von DNA erfolgte durch die GATC Biotech AG. Es wurden jeweils beide Stränge klonierter DNA-Amplifikate unter Verwendung der Primer M13-FP und M13-RP (Kap. II 1.6) sequenziert. Die Auswertung der Sequenzdaten wurde mit dem Computerprogramm Chromas Version 1.45 (Kap. II 1.8) durchgeführt. 2.10.2 Bearbeitung von DNA-Sequenzdaten Das Editieren von Sequenzdaten erfolgte mit dem Computerprogramm Vector NTI® Suite Version 7.1 (Kap. II 1.8). Ebenfalls mit dieser Software wurden sämtliche Sequenzalignments entsprechend dem Needleman-Wunsch-Algorithmus (Needleman und Wunsch 1970) erstellt und mögliche Restriktionsschnittstellen von Endonukleasen ermittelt. Berechnungen für Schmelztemperaturen von Primern und Sonden wurden mit dem Programm MeltCalcPro Version 2.06 (Kap. II 1.8) durchgeführt (Schütz und von Ahsen 1999). 2.11 Überprüfung der Spezifität der Real-Time-PCR-Methode
zum Nachweis von Enterobacteriaceae Getestet wurde die Spezifität mit genomischer DNA aus Reinkulturen taxonomisch klassifizierter Bakterienstämme. Dabei handelte es sich um Enterobacteriaceae-Stämme aller lebensmittelrelevanter Gattungen (Tab. 2.1). Desweiteren wurden Stämme anderer lebensmittelrelevanter Eubakterien getestet, die mit dem entwickelten Nachweissystem nicht erfasst werden dürfen (Tab. 2.2). Ausgewählt wurden dafür insbesondere den Enterobacteriaceen taxonomisch nah verwandte, aber auch andere lebensmittelrelevante Bakterien. Die Untersuchungen wurden mit gereinigter, RNA-freier DNA (Kap. II 2.3.1) oder mit DNA aus ShortPrep-Extraktionen (Kap. II 2.3.2) durchgeführt. Negativ getestete Proben, die in der PCR nicht
II Material und Methoden
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amplifiziert wurden, wurden mit spezifischen Primern für den Nachweis von 16S-DNA (Kap. II 1.6) hinsichtlich ihrer Amplifizierbarkeit geprüft. 2.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems
in der Untersuchung von Lebensmittelproben im Vergleich mit mikrobiologischen Methoden
Für die Überprüfung der Real-Time-PCR-Methode zum Nachweis von Enterobacteriaceae beziehungsweise zum Ausschluss deren Vorhandenseins in Lebensmittelproben wurden vergleichende Untersuchungen mit mikrobiologischen Verfahren durchgeführt. Die kulturellen Methoden für den qualitativen Nachweis von Enterobacteriaceae wurden entsprechend der von der Kommission der Europäischen Gemeinschaften (EU) erlassenen Verordnung Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel, gültig seit dem 1. Januar 2006, durchgeführt. Die Lebensmittelsicherheitskriterien der Verordnung schreiben die Feststellung der Abwesenheit von Enterobacteriaceae, gemäß der analytischen Referenzmethode ISO 21528-1, in getrockneter Säuglingsanfangsnahrung und getrockneten diätetischen Lebensmitteln vor. Es erfolgten vergleichende Untersuchungen mit 72 Lebensmitteln diverser Produktgruppen (Tab. 2.5 und Tab. 2.6). Für die Versuchsdurchführung wurde jeweils 1 g der Lebensmittelprobe eingewogen und in 9 ml CASO-Bouillon (Kap. II 1.2) homogenisiert. Zur Resuszitation eventuell vorhandener subletal geschädigter Bakterienzellen folgte eine Inkubation des Homogenisats in einer 100 ml SCHOTT DURAN® Laborglasflasche bei 36 °C für 3 h. Nach Versetzen der Voranreicherung mit 90 ml Mossel-Bouillon (Kap. II 1.2) wurde die Probe bei 36 °C für 42 h anaerob inkubiert. Für die Überprüfung in der PCR (Kap. II 2.6.3) wurden nach 16 h und nach 42 h jeweils 200 µl aus dem Überstand der Probe entnommen, mittels ShortPrep-Extraktion (Kap. II 2.3.2) aufgearbeitet und als Aliquot von 2,5 µl in die PCR-Reaktion (Kap. II 2.6.3) eingesetzt. Nach Abschluss der Anreicherung folgte ein Vereinzelungsausstrich aus der Probe mit steriler Impföse auf VRBD-Agar (Kap. II 1.2) und anaerobe Bebrütung der Agarplatte bei 36 °C für 18 bis 20 h. Platten, auf denen nach der Inkubation keine sichtbaren Bakterienkolonien gewachsen waren, wurden für weitere 24 bis 48 h bei 36 °C anaerob bebrütet. Proben mit roten bis hellroten Kolonien mit hellrötlichem Präzipitathof galten als positiv für Enterobacteriaceae. Kolonien, die sich nicht sicher identifizieren ließen, wurden biochemisch ausdifferenziert. Dafür wurde ein api®20 E-Test (Kap. II 1.3) nach Angaben des Herstellers durchgeführt und unter Verwendung des numerischen Identifikationsschlüssels mit dem Computerprogramm Apilab Version V 4.0 (Kap. II 1.8) ausgewertet.
II Material und Methoden
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Innerhalb der Versuchsdurchführung zur Spezifitätsprüfung wurden sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen mitgeführt. Für die Positivkontrollen wurden die Stämme Escherichia coli DSM 1576 und Enterobacter sakazakii ATCC 51329, für die Negativkontrollen die Stämme Pseudomonas aeruginosa DSM 1128 und Aeromonas caviae DSM 7323 eingesetzt. Für den Kontrollversuch wurde die Lebensmittelprobe durch 1 ml einer 5 h bei 36 °C gewachsenen Bakterienzellkultur (Kap. II 2.1) ersetzt und der Versuch wie oben beschrieben durchgeführt.
III Ergebnisse
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III ERGEBNISSE 3.1 Auswahl der DNA-Zielregion Für den Nachweis von Bakterienstämmen der Familie Enterobacteriaceae durch Amplifikation ihrer genomischen DNA wurde eine Zielsequenz ausgewählt, die in sämtlichen Enterobacteriaceen vorhanden und weitestgehend konserviert ist. Gegenüber allen anderen Eubakterien musste aber aufgrund von Sequenzvariationen innerhalb der DNA eine sichere Differenzierung möglich sein. Als besonders gut geeignet bezüglich dieser Anforderungen sind bakterielle DNA-Sequenzen der für ribosomale RNA codierenden Gene bekannt (Fox et al. 1980, Lane et al. 1985). Diese sind mit gleicher Funktion in allen Eubakterien vorhanden und zeichnen sich in ihrer Sequenz sowohl durch hoch konservierte als auch sehr variable Domänen aus. Die drei bakteriellen rRNA-Gene für 16S rRNA, 23S rRNA und 5S rRNA, schematisch dargestellt in Abbildung 3.1, sind Teil eines ribosomalen Operons und werden gemeinsam mit tRNA-Sequenzen und hypervariablen nicht codierenden Spacersequenzen als funktionelle Einheit cotranskribiert. Die Detektion anhand ihrer rRNA-Gene eignet sich sowohl für den Nachweis aller Eubakterien, aber auch für die Differenzierung verschiedener Klassen und wird für phylogenetische Analysen und Speziesidentifizierungen genutzt (Cilia et al. 1996). Abb. 3.1: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der universellen Primer
fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH am rRNA-Operon von Eubakterien
Schematisch dargestellt sind cotranskribierte DNA-Bereiche für rRNA, sowie Spacer und tRNA-Sequenz des Operons rrnB von Escherichia coli. Im 5'-Bereich vor den Strukturgenen liegen die Tandempromotoren P1 und P2, im 3'-Bereich hinter dem 5S rRNA-Gen die Terminatoren T1 und T2 (Ellwood und Nomura 1982, Condon et al. 1995, Asai et al. 1999). Eine PCR mit genomischer DNA des Typstammes Escherichia coli DSM 30083 und den Primern fw23S und rev5S führt zu einem Amplifikat mit einer Länge von 542 bp. Die Abbildung ist nicht maßstabgerecht.
16S rRNA tRNA / Spacer 23S rRNA Spacer 5S rRNA
fw23S
rev5S
III Ergebnisse
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Als Ziel-DNA für die Suche nach geeigneten Oligonukleotidbindungsstellen für den Enterobacteriaceae-Nachweis dienten Sequenzen, die mit den universellen Primern fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH amplifiziert worden waren. Die etablierten Primer binden an hoch konservierten bakteriellen DNA-Bereichen, der forward-Primer fw23S innerhalb der 23S-Sequenz und der reverse-Primer rev5S am 3’-Bereich der 5S-Sequenz. In Abbildung 3.1 sind die Bindungspositionen der Primer dargestellt, Abbildung 3.2 gibt die Sequenzen beider Primer an. Genomische DNA E. coli 5' -GGT ACG CGA GCT GGG TTT AGA A- 3' Primersequenz fw23S 5' -GGT ACG CGA GCT GGG TTT AGA A- 3' Genomische DNA E. coli (antisense) 5' -GGC AGT TCC CTA CTC TCG C- 3' Primersequenz rev5S 5' -GGC RRT KHC CTA CTC TCV C- 3'
Abb. 3.2: Sequenzen der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma
BIOTECON Diagnostics GmbH für die Amplifikation der 23S-5S-DNA im rRNA-Operon von Bakterien
Dargestellt sind im Vergleich die Sequenzen der genomischen DNA von Escherichia coli K-12 MG1655, Acc. Nr. U00096, Positionen 4169232 bis 4169255 (fw23S) und 4169773 bis 4169755 (rev5S).
3.2 Erstellen von Sequenzalignments und Generieren
möglicher Primer für den Nachweis von Enterobacteriaceen-DNA
Mit den DNA-Sequenzen der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH, amplifiziert mit den Primern fw23S und rev5S, von Bakterienstämmen der Familie Enterobacteriacea als auch anderer taxonomischer Gruppen, wurden vergleichende Alignments mit dem Computerprogramm Vector NTI® Suite Version 7.1 (Kap. II 2.10.2) erstellt. Die einzelnen Bakterienstämme, deren Sequenzen aligniert wurden, sind in den Tabellen 3.1 und 3.2 aufgeführt. Die Größen der amplifizierten DNA-Fragmente variieren je nach Bakterienstamm wegen unterschiedlicher Länge der Spacerregion und liegen bei 450 - 750 bp.
III Ergebnisse
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• Budvicia aquatica DSM 5075 • Morganella morganii DSM 30164
• Cedecea davisae DSM 4568 • Pantoea dispersa DSM 30073
• Citrobacter diversus BCD 5366 • Plesiomonas shigelloides DSM 8224
• Citrobacter freundii BCD 5893 • Proteus mirabilis DSM 788
• Enterobacter amnigenus DSM 4486 • Proteus vulgaris BCD 915
• Enterobacter cloacae ssp. DSM 30054 • Providencia rettgeri DSM 1131
• Enterobacter sakazakii DSM 4485 • Providencia stuartii DSM 4539
• Erwinia carotovora DSM 30168 • Rahnella aquatilis DSM 4594
• Erwinia chrysanthemi DSM 4610 • Raoultella planticola DSM 4617
• Erwinia mallotivora DSM 4565 • Salmonella Typhimurium BCD 14285
• Escherichia blattae NCTC 12127 • Serratia marcescens DSM 1636
• Escherichia coli Acc. Nr. U00096 • Serratia plymuthica DSM 49
• Escherichia hermanii BCD 8467 • Serratia proteamaculans BCD 8916
• Escherichia vulneris DSM 4564 • Shigella boydii DSM 7532
• Hafnia alvei DSM 30163 • Shigella sonnei BCD 4301
• Klebsiella oxytoca DSM 5175 • Yersinia enterocolitica ssp. DSM 4780
• Klebsiella pneumoniae ssp. DSM 2026 • Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992
• Kluyvera cryocrescens DSM 4588
Tab. 3.1: Bakterienstämme der Familie Enterobacteriaceae, deren 23S-5S-
Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten
Tab. 3.2: Bakterienstämme diverser taxonomischer Gruppen, deren 23S-5S-
Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten
• Acinetobacter calcoaceticus BCD 1209 • Pseudomonas stutzeri DSM 5190
• Aeromonas hydrophila ssp. DSM 6173 • Ralstonia pickettii DSM 6297
• Alcaligenes spec. DSM 2625 • Sphingobacterium multivorum DSM 6175
• Burkholderia cepacia DSM 7288 • Sphingomonas paucimobilis DSM 1098
• Campylobacter jejuni BCD 15108 • Staphylococcus aureus DSM 20231
• Clostridium tyrobutyricum DSM 663 • Vibrio alginolyticus DSM 2171
• Enterococcus faecalis DSM 20478 • Vibrio fischeri DSM 5075
• Flavobacterium resinovorum DSM 7478 • Vibrio harveyi DSM 6904
• Haemophilus influenzae DSM 4690 • Vibrio parahaemolyticus DSM 10027
• Helicobacter pylori DSM 4867 • Vibrio proteolyticus DSM 30189
• Moraxella catarrhalis DSM 9143 • Zymomonas mobilis BCD 5724
• Pasteurella pneumotropica BCD 2891
III Ergebnisse
53
Anhand der Daten aus den Alignments wurden Sequenzen für die forward-Primer fw1 - fw8 und die reverse-Primer rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) generiert, um diese hinsichtlich der spezifischen Amplifikation von Enterobacteriaceae-DNA in der PCR zu testen. Orientierung und Position der Primer sind in Abbildung 3.3 angegeben. Wegen sehr häufiger Sequenzübereinstimmungen zwischen Enterobacteriaceen und den nicht zu amplifizierenden Vibrionen war bei der Auswahl der Primersequenzen, insbesondere in deren 3’-Bereich, besonders darauf zu achten, mögliche Sequenzabweichungen der Gattung Vibrio für die Differenzierung zu nutzen. Abb. 3.3: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Primer fw1 - fw8 und rev1
- rev8 (Kap. II 1.6) für die spezifische Amplifikation von Enterobacteriaceae-DNA
Die Positionen der generierten Primer liegen innerhalb des Amplifikationsbereichs der universellen Primer fw23S und rev5S (Kap. II 1.6)
3.3 Amplifikation der 23S-5S-DNA von Enterobacteriaceen Die für die spezifische Amplifikation von Enterobacteriaceae-DNA generierten Primer (Kap. II 1.6) wurden mit quantifizierter DNA (Kap. II 2.4) oder ShortPrep-DNA (Kap. II 2.3.2) von Escherichia coli DSM 30083 als Template in der PCR (Standardbedingungen für die konventionelle PCR, Kap. II 2.6.1, Annealingtemperatur 55 °C) mit dem Enzym FastStart Taq DNA Polymerase (Kap. II 1.4) überprüft. Als Negativkontrolle wurde für jede Versuchsdurchführung parallel eine PCR mit Aqua ad iniectabilia (Kap. II 2.6) anstelle eines DNA-Templates durchgeführt. Die Proben wurden mittels Gelelektrophorese (Kap. II 2.7.1) aufgetrennt. Die Auswertung zeigte, dass außer in den Versuchen mit DNA-Template auch in den Negativkontrollen Amplifikate gleicher Größe entstanden waren. So
23S rRNA
rev8
Spacer 5S rRNA
fw3 fw2 fw1
fw23S
fw5 fw6 fw4
fw8 fw7
rev5 rev4 rev1 rev6 rev3 rev2
rev7
rev5S
III Ergebnisse
54
wurden beispielsweise bei Durchführung einer PCR mit dem Primerpaar fw1/rev3 sowohl in der Positivprobe als auch in der Negativkontrolle DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 455 bp amplifiziert (Abb. 3.4). In PCR-Versuchen mit allen anderen Primerkombinationen entstanden ebenfalls Amplifikate in den Negativkontrollen. Auch bei Erhöhung der Annealingtemperatur bis 64 °C kam es zu dem gleichen Ergebnis. Da eine Kontamination mit Nukleinsäuren während der Versuchsdurchführungen weitestgehend ausgeschlossen werden konnte (Kap. II 2.6), war davon auszugehen, dass in der Taq Polymerase kontaminierende DNA vorhanden war, die in der PCR amplifiziert wurde. So wurden bereits bakterielle DNA-Kontaminationen in Taq Polymerasen und ihren Lagerpuffern beschrieben, die in der PCR zu falsch positiven Ergebnissen führten (Böttger 1990, Schmidt et al. 1991). Insbesondere bei rekombinanten Taq Polymerasen, die in Escherichia coli synthetisiert werden, besteht ein hohes Risiko für Kontaminationen mit der DNA dieses Bakteriums. Es wurden aber auch Kontaminationen, sowohl rekombinanter als auch nativer Taq Polymerasen, mit bakterieller DNA anderer bekannter und auch unbekannter Gattungen nachgewiesen (Rand und Houck 1990, Hughes et al. 1994). Aufgrund der ausgesprochen hohen Affinität der DNA-Polymerase zu DNA ist es grundsätzlich sehr schwierig, derartige produktionsbedingte Kontaminationen zuverlässig zu entfernen. Zumeist bleiben selbst bei physikalischer, chemischer oder enzymatischer Behandlung der DNA-Polymerase Spuren der kontaminierenden DNA vor den Verfahren geschützt (Corless et al. 2000). Darüber hinaus kommt es durch Behandlungen dieser Art in der Regel zu wesentlichen Einschränkungen der Polymeraseaktivität und damit zu einer geringeren Sensitivität der PCR (Klaschik et al. 2002, Heininger et al. 2003). Besonders groß ist die Wahrscheinlichkeit für eine Amplifikation kontaminierender DNA immer dann, wenn eine Konsensus-PCR zum Nachweis hoch konservieter bakterieller DNA-Sequenzen durchgeführt wird.
VI N E. c.
455 bp
Abb. 3.4: Agarosegelelektrophorese einerPCR für die spezifischeAmplifikation der 23S-5S-Region mit dem Primerpaarfw1/rev3 DNA spezifischer Größe wird sowohlin der Positivprobe (E. c.) als auch inder Negativkontrolle (N) amplifiziert. VI: DNA-Längenstandard VI N: PCR-Negativkontrolle E. c.: Escherichia coli DSM 30083,PCR von 10 pg genomischer DNA
III Ergebnisse
55
Als Alternative zu der hier eingesetzten wurden andere Taq Polymerasen diverser Hersteller und Chargen in der PCR getestet, um zu einem kontaminationsfreien Enzym zu gelangen. Es zeigte sich aber, dass auch alle getesteten Chargen der Perpetual Taq DNA Polymerase mit monoklonalem anti-Taq Antikörper, HotStarTaq™ DNA Polymerase, FastStart Taq DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase und LightCycler®-FastStart DNA Master Hybridization Probes (Kap. II 1.4) mit Nukleinsäuren kontaminiert waren, so dass in den Negativkontrollen Amplifikate entstanden. Es bestanden lediglich Unterschiede in der Stärke der Amplifikatbanden im Agarosegel. Dies ist wahrscheinlich auf verschieden starke Kontaminationen der jeweiligen DNA-Polymerase zurückzuführen, wie sie schon von Hilali et al. (1997) beschrieben wurden. 3.4 Dekontamination der Taq Polymerase Um falsch positive Ergebnisse in der PCR zu vermeiden, musste die kontaminierende DNA in der Taq Polymerase vollständig degradiert werden. Hierfür wurden die Polymerasen mit dem jeweiligen Lagerpuffer einem DNase I-Verdau (Kap. II 2.5.2) unterzogen. Die Versuchsdurchführungen erfolgten jeweils bei 20 °C und 37 °C und über einen Zeitraum von 15 min, 45 min, 2 h, 4 h, 6 h und über Nacht mit anschließender Inaktivierung der DNase I durch Zugabe von 5 mM EDTA und Inkubation bei 70 °C für 10 min. Die so behandelte Taq Polymerase wurde direkt in die PCR-Reaktion eingesetzt. Nach Durchführung von PCR und Gelelektrophorese wie unter Abschnitt 3.3 beschrieben wurden die Versuchsreihen ausgewertet. In PCR-Reaktionen mit den Polymerasen HotStarTaq™ DNA Polymerase, FastStart Taq DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase und LightCycler®-FastStart DNA Master Hybridization Probes waren auch nach dem DNase I-Verdau noch Amplifikate in der Negativkontrolle entstanden. Lediglich bei zwei von fünf Chargen (#10735221 und #11384920) der Taq DNA Polymerase LightCycler®-FastStart DNA Master Hybridization Probes ließen sich die Stärken der Amplifikatbanden etwas reduzieren. Die Perpetual Taq hingegen wurde in allen getesteten Chargen durch einen DNase I-Verdau für 4 h bei 37 °C vollständig dekontaminiert, so dass kein Amplifikat mehr in der Negativkontrolle entstand. Abbildung 3.5 zeigt die Agarosegelelektrophorese nach Durchführung zweier PCR-Reaktionen im Vergleich. Eingesetzt wurde die Perpetual Taq sowohl unverdaut als auch nach DNase I-Verdau. Durchgeführt wurden die Versuche mit DNA von Escherichia coli und Spezies der den Enterobacteriaceen genetisch nah verwandten Gattungen Vibrio und Aeromonas sowie Aqua ad iniectabilia als Negativkontrolle. Ohne DNase I-Verdau der Perpetual Taq kam es in jeder Probe zur Bildung eines Amplifikats spezifischer Größe, während nach dem Verdau mit DNase I in den Proben mit nicht zu amplifizierender
III Ergebnisse
56
Vibrio- oder Aeromonas-DNA und Aqua ad iniectabilia kein Amplifikat mehr entstand. Die DNA von Escherichia coli wurde wie gewünscht amplifiziert.
Abb. 3.5: Agarosegelelektrophorese nach PCR mit Perpetual Taq, ohne und mit
DNase I-Verdau der Taq-Polymerase
Die PCR wurde mit dem Primerpaar fw1/rev1 durchgeführt. Als Template diente ShortPrep-DNA (SP) oder 10 pg aufgereingte DNA (10 pg). Die gestrichelte Linie kennzeichnet den Zusammenschnitt zweier Teile eines Gels. VI: DNA-Längenstandard VI 1: Escherichia coli DSM 30083, SP 2: Vibrio fischeri DSM 5075, SP 3: Aeromonas caviae DSM 7323, SP 4: Escherichia coli DSM 30083, 10 pg N: Negativkontrolle
Aufgrund der Ergebnisse wurde für alle weiteren PCR-Reaktionen in dieser Arbeit als DNA-Polymerase Perpetual Taq mit monoklonalem Antikörper (Kap. II 1.4) nach Dekontaminationsbehandlung mit DNase I für 4 h bei 37 °C und anschließender Denaturierung der DNase I eingesetzt. 3.5 Testung der Primer für Enterobacteriaceen Für den gezielten Nachweis von Enterobacteriaceen-DNA durch Amplifikation mittels PCR müssen die eingesetzten Primer wesentliche Anforderungen erfüllen. So muss es möglich sein, mit ihnen spezifisch Stämme der Familie Enterobacteriaceae zu amplifizieren, während alle anderen Spezies, also insbesondere auch genetisch nah verwandte Stämme, in der PCR nicht nachgewiesen werden. Ebenso soll mit der gewählten Primerkombination die höchst mögliche Sensitivität des Systems erreicht werden. Zusätzliche unspezifische Amplifikationen neben den Zielamplifikaten, die zur Verminderung der Sensitivität führen, müssen vermieden werden.
220
B: Perpetual Taq mit DNase I-Verdau
VI 1 2 4 3 N
220
1 2 3 4 VI N
A: Perpetual Taq ohne DNase I-Verdau
III Ergebnisse
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Die für den Nachweis generierten Primer fw1 – fw8 und rev1 – rev8 (Abb. 3.3 und Kap. II 1.6) wurden in allen miteinander einsetzbaren Kombinationen auf ihre Eignung bezüglich der genannten Anforderungen in der PCR (Standardbedingungen für die konventionelle PCR, Kap. II 2.6.1, Annealingtemperatur 55 °C) getestet. Als Enterobacteriaceen-DNA wurde die von Escherichia coli, als genetisch nah verwandte Nicht-Enterobacteriaceen-DNA die von Vibrio fluvialis und Aeromonas hydrophila vorgelegt. Nach anschließender Gelelektrophorese (Kap. II 2.7.1) wurde die Versuchsreihe vergleichend ausgewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst. Grundsätzlich wurde die DNA sämtlicher nicht amplifizierter Stämme hinsichtlich ihrer generellen Amplifizierbarkeit durch PCR (Standard-bedingungen, Kap. II 2.6.1, Annealingtemperatur 58 °C) mit den Primern 41F und 1066R (Barry et al. 1990, Kap. II 1.6) für Konsensusbereiche der 16S-DNA überprüft.
Tab. 3.3: Spezifische Amplifikation mit den Primern fw1 – fw8 und rev1 – rev8
Es wurden PCR-Reaktionen mit allen einsetzbaren Primerkombinationen durchgeführt und nach Gelelektrophorese ausgewertet. Als Template diente ShortPrep-DNA von Escherichia coli DSM 30083 und den Nicht-Enterobacteriaceen-Stämmen Vibrio fluvialis ATCC 33809 und Aeromonas hydroplila DSM 6173. Angegeben sind: + = PCR mit Amplifikat, - = PCR ohne Amplifikat und ... = PCR ist mit dieser Kombination
Spezies Primer rev1 rev2 rev3 rev4 rev5 rev6 rev7 rev8
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw1 + - -
+ + +
+ - +
+ + +
+ + -
+ + +
+ - +
+ + +
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw2
... + + +
+ + +
...
...
+ + -
+ + -
+ - -
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw3
...
... + + -
...
...
...
...
...
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw4 + + +
+ + +
+ + +
+ + +
- - -
+ + -
+ + -
+ - -
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw5 + - -
+ + +
+ + +
+ + +
...
+ - -
+ + -
+ + -
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw6 + + +
+ - +
+ - +
+ - +
+ + +
+ - -
+ + +
+ - +
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw7 + + +
+ + +
+ - -
+ - -
...
+ + +
+ + +
+ + +
Escherichia coli Vibrio fluvialis Aeromonas hydrophila
fw8 + + -
+ + +
+ - +
+ + -
- - -
+ - +
+ - +
+ - -
III Ergebnisse
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nicht durchführbar aufgrund der Primerpositionen zueinander. Primerkombinationen, mit denen die DNA von E. coli amplifiziert wird, die von V. fluvialis und A. hydrophila jedoch nicht, sind grau hinterlegt.
Von 52 möglichen Primerkombinationen kam es in 41 Fällen neben der Amplifikation von Escherichia coli auch zur unerwünschten Amplifikation von Vibrio fluvialis oder Aeromonas hydrophila, häufig wurden auch beide Stämme amplifiziert. In neun der 52 Fälle, mit den Primerkombinationen fw1/rev1, fw2/rev8, fw5/rev1, fw5/rev6, fw6/rev6, fw7/rev3, fw7/rev4 und fw8/rev8, wurde nur die DNA von Escherichia coli amplifiziert. Dennoch waren die Ergebnisse der PCR-Reaktionen mit diesen Primerkombinationen noch nicht zufrieden stellend. Häufig entstanden entweder außer den spezifischen auch unspezifische Amplifikate oder die Sensitivität für den spezifischen Nachweis war noch zu gering. In PCR-Versuchen, in denen die Spezifität der Primerkombinationen auch für weitere Stämme der Familie Enterobacteriaceae (Kap. II, Tab. 2.1) überprüft wurden, zeigte sich, dass nicht alle getesteten Spezies amplifizierbar waren. So war es nicht möglich, mit der Kombination fw1/rev1 Erwinia carotovora, Providencia alcalifaciens oder Plesiomonas shigelloides zu amplifizieren, während Citrobacter freundii, Enterobacter sakazakii, Hafnia alvei, Klebsiella oxytoca, Pantoea ananatis, Proteus mirabilis, Salmonella Senftenberg, Serratia marcescens, Shigella boydii und Yersinia enterocolitica zufrieden stellend amplifiziert wurden. 3.6 Generieren der Primer und Sonden für das System zum
Nachweis von Enterobacteriaceae Durch Positionsverschiebungen der Primer fw6 und rev1 entlang der Sequenzalignments wurden die Primer fw9.1, fw9.2 und rev9 (Kap. II 1.6) generiert und in der PCR (Standardbedingungen für die konventionelle PCR, Kap. II 2.6.1, Annealingtemperatur 55 °C) getestet. Die Stämme der Enterobacteriaceen ließen sich mit diesen Primern sensitiv amplifizieren. In Versuchen zur Exklusivität zeigte sich aber, dass auch Stämme der Gattung Vibrio amplifiziert wurden. Im Austausch zu rev9 wurden durch Positionsverschiebung von rev4 die Primer rev10.1 und rev10.2 (Kap. II 1.6) generiert und in Kombination mit den fw9-Primern in der PCR unter gleichen Bedingungen getestet. Sowohl die fw9- als auch die rev10-Primer hybridisieren innerhalb der für 23S rRNA codierenden DNA-Sequenz, wobei im 5’-Bereich der rev10-Primer die letzten sechs Basen im Spacer zwischen 23S und 5S binden. Der Primer rev10.1 ist durch Basenvariationen degeneriert. In seiner Sequenz an Basenposition sieben befinden sich zu je 50 % Adenin oder Cytosin. An Position 24 wurde Inosin integriert, um trotz vierfacher Basenvariationen in der DNA-
III Ergebnisse
59
23S rRNA Spacer 5S rRNA
fw9
rev10 HzRed HzFlu
Sequenz von Enterobacteriaceen die Hybridisierung des Primers zu stabilisieren. Gemeinsam flankieren die Primer einen Amplifikationsbereich von ca. 225 bp. Die Hybridisierungspositionen der Primer sind in Abbildung 3.6 dargestellt. In Übereinstimmung mit den Sequenzdaten wurden für die PCR je 630 nM der Primer fw9.1 und rev10.1 und lediglich je 120 nM der Primer fw9.2 und rev10.2 eingesetzt, da die Sequenzen der Primer fw9.1 und rev10.1 wesentlich häufiger als die von fw9.2 und rev10.2 in der DNA von Enterobacteriaceen vorkommen.
Abb. 3.6: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Oligonukleotide für das
Real-Time-PCR-System zum Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA
Durch PCR mit der Primerkombination fw9/rev10 und genomischer DNA von Escherichia coli DSM 30083 als Template wird ein Fragment mit einer Länge von 225 bp amplifiziert.
Bei Durchführung der PCR-Reaktionen ließ sich mit der fw9/rev10-Primerkombination die DNA von Enterobacteriaceen spezifisch und sensitiv amplifizieren, während die DNA anderer Spezies nicht amplifiziert wurde. Das Nachweissystem mit den finalen fw9/rev10-Primern wurde von der konventionellen PCR zur Real-Time-PCR weiterentwickelt. Anhand der Sequenzalignments wurden die Fluoreszenz-markierte Sonde HzFlu und die LCRed 640-markierte Sonde HzRed (Abb. 3.6) für die Amplifikation und Detektion als Real-Time-PCR im LightCycler® generiert. Die Sonden binden, im Abstand von zwei Basen zueinander, am selben Strang wie die rev10-Primer mit einem Abstand von 110 Basen zu diesen in Richtung 5’. Beide Sonden sind an je vier Positionen durch Basenvariation degeneriert.
III Ergebnisse
60
3.7 Anwendung und Überprüfung der generierten Oligonukleotide und der dekontaminierten Taq-Polymerase in der Real-Time-PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceen
Dem Versuchsansatz der Real-Time-PCR wurde für eine stabilere DNA/Protein-Bindung 0,15 % BSA zugesetzt. Die MgCl2-Menge wurde von 2 auf 3 mM, die von dNTP von 800 µM auf 1,6 mM, die Menge der fw9- und rev10-Primer von je 400 auf 500 nM und die der Perpetual Taq von 0,5 auf 1 U pro Reaktion erhöht. Von der HzFlu-Sonde wurden 100 nM, von der HzRed-Sonde 150 nM eingesetzt (Kap. II 2.6 und 2.6.2, Annealingtemperatur 58 °C). Als Template dienten 2,5 µl ShortPrep-DNA (Kap. II 2.3.2) der Enterobacteriaceen-Stämme Enterobacter sakazakii DSM 4485 und Escherichia coli DSM 30083. Für die Durchführung der Negativkontrollen wurden 2,5 µl Aqua ad iniectabilia zur Reaktion gegeben. Die Perpetual Taq wurde sowohl unbehandelt als auch dekontaminiert nach Verdau mit DNase I eingesetzt. Damit sollte überprüft werden, ob sich die Ergebnisse der Amplifikation in den Negativkontrollen bei Durchführung der konventionellen PCR (Abschnitt 3.3) bestätigen würden und ob es sich tatsächlich um eine spezifische Amplifikation handelte. Die Detektion erfolgte im Fluoreszenzkanal F2/Back-F1 des LightCycler®. Das Reaktionsprofil war mit 45 Zyklen sehr lang, um die Sensitivität zu erhöhen und somit auch kleinste Mengen kontaminierender DNA zu erfassen. 3.7.1 Amplifikation Mit dem Real-Time-PCR-System für den Enterobacteriaceen-Nachweis ließ sich die DNA beider eingesetzter Stämme, Enterobacter sakazakii DSM 4485 und Escherichia coli DSM 30083, amplifizieren. Bei Eintritt der Amplifikation in die exponentielle Phase wurde der Crossing Point (CP) ermittelt. Die CP-Werte variierten, da es sich bei dem eingesetzten Template um nicht quantifizierte DNA handelte. Der CP-Wert für Ent. sakazakii lag bei 23, der für E. coli bei 13. Bei Einsatz nicht dekontaminierter Taq-DNA-Polymerase entstand auch in der Negativkontrolle ein Amplifikat, dessen CP-Wert bei 33 lag. Nach Behandlung der Taq-Polymerase mit DNase I (Abschnitt 3.4) wurde kein Amplifikat mehr in der Negativkontrolle nachgewiesen. Da die Amplifikation der Ent. sakazakii-DNA auch mit der dekontaminierten Taq-Polymerase mit einem CP von 23 erfolgte, ist davon auszugehen, dass es durch einen DNase I-Verdau unter den beschriebenen Bedingungen nicht zu einem Aktivitätsverlust des Enzyms und damit einhergehender Sensitivitätsminderung des Nachweises kommt. In Abbildung 3.7 sind die Amplifikationskurven der Ent. sakazakii-DNA und der Negativkontrolle bei
III Ergebnisse
61
Durchführung der PCR mit unbehandelter und mit DNase I-verdauter Perpetual Taq dargestellt. Abb. 3.7: Amplifikationskurven der Real-Time-PCR zum Nachweis von
Enterobacteriaceae-DNA
Durchgeführt wurden die PCR-Reaktionen in 45 Zyklen mit unbehandelter Perpetual Taq und mit DNase I-verdauter Perpetual Taq. Als Template dienten 2,5 µl ShortPrep-DNA des Stammes Enterobacter sakazakii DSM 4485, für die Negativkontrolle wurden 2,5 µl Aqua ad iniectabilia eingesetzt. Dargestellt sind die Amplifikationskurven im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler®.
3.7.1.1 Hook-Effekt Wie Abbildung 3.7 zeigt, kam es bei Durchführung der Experimente zu einer Abnahme des Fluoreszenzsignals nach der exponentiellen Phase der PCR. Die Amplifikationskurve zeigt in ihrem Verlauf eher einen Peak als ein Plateau. Dieser gelegentlich in PCR-Reaktionen auftretende sogenannte Hook-Effekt scheint darauf hinzudeuten, dass die Menge des PCR-Produkts während der finalen Phase der PCR abnimmt, was aber tatsächlich nicht der Fall ist. Zu beobachten ist dieses Phänomen in Abhängigkeit von der ursprünglich vorhandenen DNA-Menge. Je höher die Konzentration der Template-DNA, desto wahrscheinlicher ist es, das es zur Ausbildung einer Amplifikationskurve mit Scheitelpunkt kommt. Ebenso verhält es sich bei hoher MgCl2-Konzentration. Selbst wenn für die Katalyse der Amplifikation eine Taq-DNA-Polymerase ohne Exonukleaseaktivität eingesetzt wird, um ein mögliches Degradieren der Probe zu verhindern, kann es zu dem Phänomen
Enterobacter sakazakii
Negativkontrolle
Enterobacter sakazakii
Negativkontrolle
Taq-Polymerase ohne DNase I-Verdau Taq-Polymerase mit DNase I-Verdau
III Ergebnisse
62
kommen. Bei Überprüfung der Amplifikate in der Gelelektrophorese wird keine Minderung der Amplifikatmenge festgestellt. Es handelt sich demnach nicht um eine enzymatisch oder chemisch bedingte Reduktion des PCR-Produkts, auf das das schwächer werdende Signal hindeutet. Zugrunde liegt dem Hook-Effekt vielmehr eine Konkurrenzreaktion während der späten PCR-Phase zwischen der Reassoziierung einzelsträngiger PCR-Produkte nach dem Denaturieren und der Hybridisierung der Sonden mit ihrer Zielsequenz. Ist das PCR-Produkt in großer Menge vorhanden, reassoziieren die komplementären DNA-Stränge schneller, als die Sonden an der Zielsequenz binden können. Da der Hook-Effekt erst auftritt, nachdem die Amplifikation in die exponentielle Phase eingetreten ist und die CP-Werte generiert wurden, ist er letztlich ohne Einfluss auf die PCR-Analyse (Anonymus 1999). 3.7.2 Schmelzkurvenanalyse In der Schmelzkurvenanalyse nach DNA-Amplifikation wurden für Enterobacter sakazakii DSM 4485 und Escherichia coli DSM 30083 jeweils maximale Schmelztemperaturen (Tm) von etwa 63 °C ermittelt, bei denen gebundene und abgeschmolzene HzFlu- und HzRed-Sonden miteinander im Gleichgewicht stehen. Das gleiche galt für das Amplifikat in der Negativkontrolle bei PCR mit Perpetual Taq, die noch nicht mit DNase I behandelt war, wie in Abbildung 3.8 zu erkennen ist. Es ist davon auszugehen, dass es sich bei diesem Amplifikat, welches sich nicht über eine Schmelzkurvendifferenzierung von Amplifikaten der Enterobacteriaceen-DNA unterscheiden lässt, tatsächlich um eine spezifische Amplifikation von DNA mit komplementärer Sequenz zu den eingesetzten Primern handelt. Wahrscheinlich liegt eine produktionsbedingte Kontamination der rekombinanten Taq-Polymerase mit DNA des Escherichia coli-Stammes vor, in dem das Enzym synthetisiert wurde. Nach Dekontamination der Perpetual Taq mit DNase I (Abschnitt 3.4) kam es zu keiner Amplifikation mehr in der Negativkontrolle und damit auch zu keiner Ausbildung einer Schmelzkurve.
III Ergebnisse
63
Abb. 3.8: Schmelzkurven der Real-Time-PCR für den Nachweis von
Enterobacteriaceae-DNA
Durchgeführt wurden die PCR-Reaktionen in 45 Zyklen mit unbehandelter Perpetual Taq und mit DNase I-verdauter Perpetual Taq. Als Template dienten 2,5 µl ShortPrep-DNA des Stammes Escherichia coli DSM 30083, für die Negativkontrolle wurden 2,5 µl Aqua ad iniectabilia eingesetzt. Dargestellt sind die Schmelzkurven im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler®.
Die Entstehung mehrerer Peaks während einer Schmelzkurvenanalyse ist darauf zurückzuführen, dass im Real-Time-PCR-System für den Enterobacteriaceen-Nachweis die integrierten Sonden HzFlu und HzRed degeneriert sind. Aufgrund ihrer Sequenzvariationen schmelzen die Sonden innerhalb einer PCR-Reaktion bei unterschiedlichen Temperaturen und werden dementsprechend detektiert. 3.8 Interne Amplifikationskontrolle Zur Vermeidung falsch negativer Ergebnisse wurde für das Real-Time-PCR-System zur Detektion von Enterobacteriaceen, entsprechend vielfacher Beschreibungen über Kontrollamplifikationen in der Literatur (Jin et al. 1994, Stöcher und Berg 2002, Hoorfar et al. 2004), eine Interne Amplifikationskontrolle (IAK) entwickelt und in das System integriert. Für die Durchführung der Kontrolle wird jeder PCR-Reaktion die IAK als kloniertes DNA-Fragment beigefügt. Die Größe des Fragments entspricht in etwa der zu amplifizierenden Ziel-DNA und wird von den gleichen Primerbindungs-sequenzen flankiert wie die Ziel-DNA. Bei Amplifikation der DNA von Escherichia coli DSM 30083 entsteht ein Amplifikat von 225 bp, bei Amplifikation der IAK beträgt die
Escherichia coli
Negativkontrolle
Escherichia colii
Negativkontrolle
Taq-Polymerase mit DNase I-Verdau Taq-Polymerase ohne DNase I-Verdau
III Ergebnisse
64
Größe 221 bp. Während der PCR-Reaktion konkurrieren die Systemprimer fw9 und rev10 miteinander um die komplementären Bindungsstellen. Zeitgleich werden Ziel-DNA, falls vorhanden, und IAK-DNA mittels kompetetiver PCR coamplifiziert. Die Differenzierung der etwa gleich großen Ziel- und IAK-Amplifikate während ihrer Entstehung erfolgt anhand der unterschiedlich markierten Systemsonden LCRed 640-HzRed und LCRed 705-IAKRed (Kap. II 1.6). Die LCRed 640-Sonde bindet komplementär innerhalb der Ziel-DNA-Sequenz und die LCRed 705-Sonde hybridisiert mit dem IAK-Konstrukt. Die Detektion der Sonden erfolgt in getrennten Fluoreszenzkanälen F2/Back-F1 (LCRed 640-HzRed ) und F3/Back-F1 (LCRed 705-IAKRed). Durch Amplifikation der IAK in jeder PCR-Reaktion lässt sich bei einem negativen Versuchsergebnis überprüfen, ob die Durchführung der PCR grundsätzlich funktioniert hat. Ein falsch negatives Ergebnis durch Inhibition der PCR kann somit ausgeschlossen werden. 3.8.1 Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle Für die Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle wurden die Primer IAKfw und IAKrev (Kap. II 1.6) generiert. Sie tragen an ihren 5’-Enden komplementär zueinander die Sequenz der IAK-Sonde IAKRed. Mit ihren 3’-Enden hybridisieren sie jeweils mit der nativen DNA-Sequenz, die den Bereich der geplanten Sondensequenz flankiert. Die Synthese der IAK erfolgte mittels mehrerer PCR-Reaktionen (Abb. 3.9) und anschließender Klonierung. Zunächst wurden zwei Teilamplifikate mit Sequenzabschnitten für die IAK-Sonde synthetisiert. Das eine durch PCR mit dem Primerpaar fw23S/IAKrev, das andere durch PCR mit dem Primerpaar IAKfw/rev4 (Kap. II 2.6.1, Annealingtemperatur 58 °C). Als Template dienten 50 pg gereinigte genomische DNA (Kap. II 2.3.1) des Stammes Salmonella Senftenberg BCD 6173. Die Teilamplifikate wurden aufgereinigt (Kap. II 2.7.2) und im Verhältnis 1:1 als Template unter Hybridisierung ihrer komplementären 3’-Enden für den abschließenden PCR-Schritt eingesetzt. Mit den fw1II- und rev10-Primern erfolgte die Amplifikation der mutagenisierten DNA-Sequenz und damit die Synthese der DNA für die Interne Amplifikationskontrolle. Das fertige Konstrukt mit spezifischen Bindungsstellen für die IAK-Sonde sowie für die Systemprimer fw9 und rev10 wurde durch Ligation in den Vektor pGEM®-T und Transformation in Escherichia coli XL-1 blue kloniert (Kap. II 2.8), sequenziert (Kap. II 2.10.1) und bei –80 °C gelagert. Aliquots der IAK wurden durch Verdau mit der Restriktionsendo-nuklease Sac I linearisiert, aufgereinigt, quantifiziert (Kap. II 2.9.2) und bei –20 °C für die Anwendung im Enterobacteriaceen-Nachweissystem aufbewahrt.
III Ergebnisse
65
Abb. 3.9: Konstruktion des mutagenisierten DNA-Fragments für die Interne
Amplifikationskontrolle des Enterobacteriaceen-Nachweises
Durchführung getrennter PCR-Reaktionen mit den Primerkombinationen fw23S/IAKrev und IAKfw/rev4 zur Synthese zweier Halbamplifikate. Zusammenlagerung der Halbamplifikate durch Hybridisierung ihrer komplementären 5’-Bereiche und Elongation ihrer 3’-Enden mittel PCR mit den Primern fw1II und rev10. Anschließend Klonierung des fertigen Konstrukts mit spezifischen Bindungsstellen für die IAK-Sonde sowie die fw9- und rev10-Primer des Enterobacteriaceen-Nachweissystems.
5' 5'
fw23S
rev4
IAKfw
IAKrev
Bindung der Primer an genomische DNA von Salmonella Senftenberg BCD 6173
IAKfw und IAKrev am 5’-Ende mit Sequenzen für die IAK-Sonde
Separate Amplifikationen zweier DNA-Fragmente
Hybridisierung und Elongation der komplementären Einzelstränge
fw1II rev10
Amplifikat mit spezifischer Bindungsstelle für die IAK-Sonde fw9
rev10
III Ergebnisse
66
3.8.2 Integration der Internen Amplifikationskontrolle in das Enterobacteriaceen-Nachweissystem
Die Interne Amplifikationskontrolle wird jedem PCR-Reaktionsansatz zugegeben und muss in ihrer eingesetzten Kopienzahl genau auf das entwickelte PCR-System abgestimmt sein. Sie muss ausreichen, um deutlich detektierbar zu sein, darf aber nicht in zu großer Menge vorhanden sein, so dass sie die Amplifikation und Detektion der Ziel-DNA von Enterobacteriaceen negativ beeinflusst. Ist in der zu untersuchenden Probe die Ziel-DNA nur sehr gering, die IAK-DNA aber in verhältnismäßig großer Menge vorhanden, kommt es zum sogenannten Quenching, wodurch kein oder ein zu geringes Fluoreszenzsignal für die Amplifikation der Ziel-DNA gemessen wird. Im umgekehrten Fall findet eine derartige Beeinflussung auch statt, ist aber für die Funktion der Internen Amplifikationskontrolle nicht relevant, da diese nur auszuwerten ist, wenn keine amplifizierbare Ziel-DNA in der Probe vorhanden ist. Die geeignete Menge IAK-DNA für das Enterobacteriaceen-Nachweissystem wurde mittels PCR-Versuchsreihen (Kap. II 2.6.2, Annealingtemperatur 58 °C) unter Zugabe verschiedener Mengen sowohl IAK- als auch Enterobacteriaceen-DNA ermittelt. Es wurden je 100 ag (ca. 30 Kopien), 500 ag, 1 fg, 2 fg, 5 fg und 10 fg durch Sac I-Verdau linearisierte, aufgereinigte IAK-DNA (Abschnitt 3.8) und je 5 µl aufgereinigter DNA (Kap. II 2.3.1) von Escherichia coli DSM 30083 aus quantifizierten Zellsuspensionen (Kap. II 2.2) mit 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104 und 1 x 105 KbE (Kolonie bildenden Einheiten) pro ml miteinander getestet. In Übereinstimmung mit den Versuchsergebnissen wurde das System auf die Zugabe von 2 fg (ca. 600 Kopien) IAK-DNA und 150 nM IAK-Sonde IAKRed in Kombination mit 100 nM der Sonde HzFlu pro PCR-Reaktion eingestellt. Bei Einsatz dieser Menge lässt sich in einer PCR mit negativem Ergebnis die Amplifikation der IAK mit einer Fluoreszenz von 0,037 gut detektieren, während sie selbst nicht zum Quenching der Fluoreszenz bei Amplifikation geringer Mengen Ziel-DNA wie 1 x 102 KbE/ml führt. 3.9 Optimierung der Reaktionsbedingungen für das
Enterobacteriaceen-Nachweissystem Für die Optimierung der Reaktionsbedingungen zum Enterobacteriaceen-Nachweis mittels Real-Time-PCR im LightCycler® wurden gegenüber den entwickelten Standardbedingungen die Mengen von MgCl2 auf 5 mM und die der Perpetual Taq auf 1,5 U erhöht, die Annealingtemperatur auf 58 °C festgelegt und das Temperaturprofil der Schmelzkurve modifiziert (Kap. II 2.6.3). In Abbildung 3.10 ist
III Ergebnisse
67
der Fluoreszenzverlauf bei Durchführung von Real-Time-PCR-Reaktionen zum Nachweis von Enterobacteriaceen mit umgerechnet 0,5 - 500 kbE Escherichia coli als DNA-Template in Gegenwart von 2 fg IAK-DNA grafisch dargestellt. Mit Erhöhung der DNA-Ausgangsmenge kommt es zu einem kontinuierlichen Anstieg der während der Amplifikation gemessenen Fluoreszenz ohne hemmende Wirkung durch Amplifikation der mitgeführten IAK-DNA.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0 0,5 5 50 500
KBE Escherichia coli
Fmax
Kan
al 6
40 E
. col
i
0,0000,0050,0100,0150,0200,0250,0300,0350,040
Fmax
Kan
al 7
05 IA
K
E.coli 2 fg IAK
Abb. 3.10: Fluoreszenz bei Anwendung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems
während der Amplifikation von Ziel- und IAK-DNA im LightCycler®
Es wurden PCR-Reaktionen für den Enterobacteriaceen-Nachweis im LightCycler® mit 5 µl DNA von Escherichia coli DSM 30083 aus Zellsuspensionen mit 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104 und 1 x 105 KbE/ml sowie ohne DNA in Gegenwart von 2 fg IAK-DNA durchgeführt. An der linken y-Achse der Grafik ist die Fluoreszenz bei Amplifikation von E. coli-DNA, gemessen im Fluoreszenzkanal F2/Back-F1 (Kanal 640) des LightCycler®, an der rechten y-Achse die Fluoreszenz bei Amplifikation der IAK-DNA, gemessen im Fluoreszenzkanal F3/Back-F1 (Kanal 705) des LightCycler®, aufgetragen. An der x-Achse ist die absolute Menge der eingesetzten 0 - 500 KbE von E. coli aufgetragen. Mit steigender Menge der Template-DNA erhöht sich die maximale Fluoreszenz durch Amplifikation von E. coli-DNA, ohne dass es durch die Anwesenheit von 2 fg IAK-DNA zum Quenching der Fluoreszenz kommt.
3.10 Spezifität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems Mit dem entwickelten Real-Time-PCR-System sollen möglichst viele Spezies der Familie Enterobacteriaceae nachgewiesen werden, während andere Arten nicht erfasst werden sollen. Um zu überprüfen, inwieweit diese Anforderungen erfüllt werden, wurden Untersuchungen zur Spezifität des Systems durchgeführt. Mit der fw9/rev10-Primerkombination, der Internen Amplifikationskontrolle IAK, den Sonden
III Ergebnisse
68
HzFlu, HzRed und IAKRed und der DNA von Enterobacteriaceen-Stämmen und solchen anderer Bakterientaxa wurde das Real-Time-PCR-System im LightCycler® getestet (Kap. II 2.6.3). 3.10.1 Inklusivität Zur Überprüfung der Spezifität gegenüber Enterobacteriaceen wurde die extrahierte DNA (Kap. II 2.3) aus 56 Stämmen von 26 Gattungen der Familie Enterobacteriaceae in der Real-Time-PCR eingesetzt. Alle 55 in Tabelle 3.4 aufgeführten Stämme wurden positiv getestet und mit CP-Werten zwischen 13 und 27 spezifisch amplifiziert. Tab. 3.4: Inklusivität: Im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-System detektierte
Stämme der Familie Enterobacteriaceae • Budvicia aquatica DSM 5075 • Leclercia adecarboxylata DSM 5077
• Buttiauxella agrestis DSM 4586 • Moellerella wisconsensis DSM 5076
• Cedecea davisae DSM 4568 • Morganella morganii DSM 30164
• Citrobacter amalonaticus DSM 4593 • Pantoea agglomerans BCD 2151
• Citrobacter braakii DSM 30040 • Pantoea ananatis DSM 30070
• Citrobacter koseri DSM 4595 • Pantoea dispersa DSM 30073
• Edwardsiella tarda DSM 30052 • Proteus mirabilis DSM 788
• Enterobacter aerogenes DSM 30053 • Proteus vulgaris BCD 915
• Enterobacter agglomerans BCD 8600 • Providencia alcalifaciens DSM 30120
• Enterobacter amnigenus DSM 4486 • Providencia rettgeri DSM 1131
• Enterobacter cloacae ssp. DSM 30054 • Providencia stuartii DSM 4539
• Enterobacter gergoviae BCD 511 • Rahnella aquatilis DSM 4594
• Enterobacter intermedius DSM 45481 • Raoultella planticola DSM 4617
• Enterobacter sakazakii DSM 4485 • Raoultella terrigena DSM 2687
• Erwinia carotovora DSM 30168 • Salmonella Abony DSM 4224
• Erwinia chrysanthemi DSM 4610 • Salmonella Senftenberg BCD 6173
• Escherichia blattae NCTC 12127 • Serratia ficaria DSM 4569
• Escherichia coli Acc. Nr. U00096 • Serratia grimesii DSM 30063
• Escherichia coli EHEC BCD 7856 • Serratia liquefaciens BCD 676
• Escherichia hermanii DSM 4560 • Serratia marcescens DSM 1636
• Escherichia vulneris DSM 4564 • Serratia plymuthica DSM 49
• Ewingella americana DSM 4580 • Serratia proteamaculans BCD 8916
• Hafnia alvei DSM 30163 • Serratia rubidaea DSM 4480
• Klebsiella oxytoca DSM 5175 • Shigella boydii DSM 7532
III Ergebnisse
69
• Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 • Y. enterocolitica ssp. enterocolitica DSM 4780
• Klebsiella terrigena DSM 2687 • Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992
• Kluyvera ascorbata DSM 4611 • Yokenella regensburgeri DSM 5079
• Kluyvera cryocrescens DSM 4588
Die Gattung Plesiomonas, vertreten durch den Stamm DSM 8224 der einzigen Spezies Plesiomonas shigelloides, ließ sich mit dem PCR-System nicht detektieren. Zur Überprüfung der grundsätzlichen Amplifizierbarkeit wurde die DNA von P. shigelloides in der PCR (Kap. II 2.6.1, Annealingtemperatur 58 °C) mit den Primern 41F und 1066R (Barry et al. 1990, Kap. II 1.6) für Konsensusbereiche der 16S-DNA eingesetzt und ließ sich amplifizieren. Das negative Ergebnis für P. shigelloides im Enterobacteriaceen-Nachweis stimmt mit den Daten aus dem Sequenzalignment der 23S-5S-Region überein. In der Sequenz der fw9-Primer (fw9.1 und fw9.2) befindet sich an der äußersten 3’-Position in Übereinstimmung mit den anderen Enterobacteriaceen-Sequenzen ein Adenin, während sich an dieser Stelle in der DNA-Sequenz von P. shigelloides ein Guanin befindet. Noch weniger Übereinstimmung findet sich in dem für eine sichere Bindung und Elongation wichtigen 3’-Bereich der rev10-Primer und der P. shigelloides-Sequenz. Die 3`–Sequenz des rev10.1-Primers hat die Folge ITC – 3’, die von rev10.2 GTC – 3’. Für eine Hybridisierung mit der DNA von P. shigelloides müsste sie aber GCA – 3’ heißen. Würde man Primer mit entsprechender Sequenz für die Amplifikation von P. shigelloides in das Enterobacteriaceen-System integrieren, käme es dadurch auch zur Amplifikation diverser Spezies der Nicht-Enterobacteriaceen-Gattungen Vibrio und Aeromonas. So ist bei einem Vergleich der Sequenzalignments von Enterobacteriaceen und anderen Bakteriengattungen in den 23S- und 5S-Regionen ganz generell eine auffallend hohe Sequenzübereinstimmung der Gattungen Plesiomonas, Vibrio und Aeromonas festzustellen. Auch bei Entwicklung der rev1-Primer wurde erst durch Generieren des zusätzlichen Primers rev1.5 die Amplifikation von P. shigelloides ermöglicht, hatte aber zur Folge, dass auch Vibrio fluvialis ATCC 33809, Vibrio harveyi DSM 6904 und Aeromonas enteropelogenes DSM 6394 detektiert wurden. Daraus resultierend wurde das Real-Time-PCR-System als Enterobacteriaceen-Nachweis ohne Detektion der Gattung Plesiomonas entwickelt. 3.10.2 Exklusivität Die Spezifität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems gegenüber nicht zu detektierenden lebensmittelrelevanten Bakterien wurde in PCR-Reaktionen mit hochkonzentrierten DNA-Präparationen (Kap. II 2.3.2) aus 36 Stämmen, aufgeführt
III Ergebnisse
70
in Tabelle 3.5, getestet. Um die Sensitivität zu steigern, wurde das PCR-Profil auf 45 Zyklen verlängert. Zur Überprüfung insbesondere auch der genetisch nah verwandten Gattungen Vibrio und Aeromonas wurden von Vibrio sieben und von Aeromonas sechs Stämme verschiedener Spezies eingesetzt. Sämtliche getesteten Bakterienstämme wurden mit dem Real-Time-PCR-System nicht detektiert. Die grundsätzliche Amplifizierbarkeit der DNA aller Stämme wurde durch PCR (Kap. II 2.6.1, Annealingtemperatur 58 °C) mit den Primern 41F und 1066R (Barry et al. 1990, Kap. II 1.6) für Konsensusbereiche der 16S-DNA positiv überprüft. Tab. 3.5: Exklusivität: Alle im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-Systems mit
Nicht-Enterobacteriaceen-Spezies überprüften Stämme
Keiner der überprüften Stämme wurde detektiert. • Acetobacter aceti DSM 3508 • Enterococcus faecalis DSM 20478
• Achromobacter spec. BCD 1193 • Gluconobacter oxydans DSM 7145
• Acinetobacter baumanii BCD 10388 • Listeria monocytogenes ATCC 19118
• Aeromonas caviae DSM 7323 • Megasphaera cerevisiae DSM 20462
• Aeromonas enteropelogenes DSM 6394 • Moraxella catarrhalis DSM 9143
• A. hydrophila ssp. anaerogenes DSM 30188 • Photobacterium phosphoreum BCD 5162
• A. hydrophila ssp. hydrophila DSM 6173 • Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
• Aeromonas media DSM 4881 • Psychrobacter immobilis DSM 7229
• Aeromonas sobria ATCC 43979 • Staphylococcus aureus DSM 20231
• Bacillus cereus BCD 8832 • Vibrio alginolyticus DSM 2171
• Brevundimonas vesicularis DSM 7226 • Vibrio fischeri DSM 5075
• Burkholderia cepacia DSM 7288 • Vibrio fluvialis ATCC 33809
• Campylobacter fetus DSM 5361 • Vibrio harveyi DSM 6904
• Campylobacter jejuni BCD 15108 • Vibrio parahaemolyticus DSM 10027
• Chromobacterium violaceum DSM 30191 • Vibrio proteolyticus DSM 30189
• Clostridium perfringens BCD 8799 • Vibrio vulnificus DSM 10143
• Comamonas acidovorans DSM 39 • Xanthomonas maltophila BCD 4273
• Comamonas testosteroni DSM 1622 • Zymomonas mobilis BCD 5724 3.11 Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems Die Bestimmung der Sensitivität des entwickelten Real-Time-PCR-Sytems erfolgte in zwei Verfahren mit PCR-Reaktionen unter den optimierten Bedingungen (Kap. II 2.6.3) und Zugabe von 2 fg (ca. 600 Kopien) linearisierter DNA der Internen Amplifikationskontrolle (Abschnitt 3.8). Zum einen sollte mit aufgereinigter,
III Ergebnisse
71
quantifizierter genomischer Bakterien-DNA als Matrize die kleinste nachweisbare Menge an bakteriellen Genomäquivalenten ermittelt werden. Zum anderen wurden lebende Bakterienzellen eingesetzt, um zu bestimmen, wieviele Kolonie bildende Einheiten (KbE) nach ShortPrep-Aufarbeitung ihrer DNA nachweisbar sein würden. Durchgeführt wurden die Reaktionen mit den Enterobacteriaceen-Stämmen Enterobacter sakazakii ATCC 51329, Proteus mirabilis DSM 788, Serratia marcescens DSM 1636 und Escherichia coli DSM 1576. Für die Auswahl der Spezies war relevant, dass sie in ihren DNA-Sequenzen im Bereich der Bindungsstellen für die Primer und Sonden untereinander weitestgehend variieren. Dadurch sollte überprüft werden, ob sich die Stämme trotz Sequenzabweichungen mit ähnlicher Sensitivität detektieren lassen. 3.11.1 Überprüfung der Sensitivität mit genomischer DNA von
Bakterien Die DNA von Enterobacter sakazakii, Proteus mirabilis und Serratia marcescens wurde aufgereinigt (Kap. II 2.3.1), quantifiziert (Kap. II 2.4.2) und als dekadische Verdünnungsreihen mit absoluten Mengen von 5 fg – 500 pg in die PCR eingesetzt. Zusätzlich wurden PCR-Reaktionen mit den gleichen Mengen DNA von Ent. sakazakii unter Zusatz von jeweils 3 ng DNA des Stammes Vibrio fluvialis ATCC 33809 durchgeführt. Durch Zugabe der DNA eines Nicht-Enterobacteriaceen-Stammes im Überschuss sollte die mögliche Auswirkung von in einer Lebensmittelprobe vorhandenen Nukleinsäuren der Begleitflora untersucht werden. So wird von Abbott et al. (1988) und Rossen et al. (1992) die Möglichkeit einer massiven Beeinträchtigung der Sensitivität von PCR-Systemen bishin zur kompletten Inhibition der PCR durch Anwesenheit unspezifischer DNA in Untersuchungsproben beschrieben.
III Ergebnisse
72
Abb. 3.11: Sensitivitätstest der Real-Time-PCR für den Enterobacteriaceen-
Nachweis durch Amplifikation genomischer DNA von Serratia marcescens
Die PCR-Reaktionen wurden mit 5 fg bis 500 pg genomischer DNA, etwa 1 bis 105
GÄ, von Serratia marcescens DSM 1636 durchgeführt. Die Negativkontrolle erfolgte mit Aqua ad iniectabilia. Dargestellt sind die Amplifikationskurven im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler®.
Am Beispiel der Real-Time-PCR mit genomischer DNA von Serratia marcescens sind in Abbildung 3.11 die Amplifikationskurven mit dazugehörigen CP-Werten bei unterschiedlichen DNA-Ausgangsmengen dargestellt. Mit der größten getesteten Menge von 500 pg genomischer DNA wird ein CP-Wert von 16 erreicht. Mit Verringerung der DNA-Ausgangsmenge steigt der CP kontinuierlich an. Bei der geringsten eingesetzten Ausgangsmenge von nur 5 fg DNA wird noch ein CP von 32 erreicht. Dabei entspricht die Menge von 5 fg DNA einem Genomäquivalent (GÄ) des Bakterienstammes. Für die Berechnung des GÄ wurden die Angaben der Genomgröße von Escherichia coli in der Literatur zugrunde gelegt. Die Größe wird mit 4639 kb für E. coli K-12 (Blattner et al. 1997) und 5499 kb für E. coli EHEC O157:H7 (Hayashi et al. 2001) angegeben, was einer Menge von etwa 4,6 fg und 5,5 fg DNA entspricht. Vereinfachend wurden 5 fg DNA mit einem Genom von E. coli und anderen Enterobacteriaceen gleichgesetzt.
500 pg DNA,
50 pg DNA,
5 pg DNA,
500 fg DNA,
50 fg DNA,
5 fg DNA,
Negativkontrolle
CP 16,27
CP 19,80
CP 23,54
CP 26,68
CP 29,53
CP 31,56
III Ergebnisse
73
10
15
20
25
30
35
Enterobacter sakazakii Proteus mirabilis Serratia marcescens Enterobacter sakazakii+ Vibrio fluvialesBakterienspezies
CP-
Wer
te5 fg 50 fg 500 fg 5 pg 50 pg 500 pg
Abb. 3.12: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems
mit genomischer DNA von Bakterien Es wurden PCR-Reaktionen mit 5 fg - 500 pg genomischer DNA (1 x 100 – 1 x 105
GÄ), von Enterobacter sakazakii ATCC 51329, Proteus mirabilis DSM 788 und Serratia marcescens DSM 1636, sowie von Ent. sakazakii unter Zugabe von je 3 ng DNA des Stammes Vibrio fluvialis ATCC 33809 durchgeführt. Dargestellt sind als Säulendiagramm die CP-Werte der Amplifikationen, gemessen im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler®. Sämtliche PCR-Reaktionen wurden in Gegenwart von 2 fg IAK-DNA durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde für jede Versuchsreihe parallel eine PCR mit Aqua ad iniectabilia anstelle von DNA durchgeführt. In keiner der Negativkontrollen entstand ein Amplifikat.
Auch von Enterobacter sakazakii und Proteus mirabilis ließ sich die DNA mit hoher Sensitivität nachweisen. Bei der kleinsten eingesetzten DNA-Menge von 5 fg lagen die CP-Werte jeweils bei 31, für 50 fg bei 29. Bei der größten getesteten Ausgangsmenge von 500 pg DNA trat die Amplifikation der Zielsequenz beider Stämme bereits mit einem CP von 16 in die exponentielle Phase. In den Negativkontrollen mit Aqua ad iniectabilia anstelle von DNA entstanden keine Amplifikate. Vergleichend dargestellt sind die gemessenen CP-Werte der durchgeführten Real-Time-PCR-Reaktionen mit genomischer bakterieller DNA in Abbildung 3.12. Bei Durchführung der Reaktion mit DNA von Ent. sakazakii unter Zugabe von 3 ng DNA des Stammes Vibrio fluvialis wurden die gleichen CP-Werte erreicht wie im Versuchsansatz ohne DNA einer möglichen Begleitflora.
III Ergebnisse
74
In der Sensitivitätsüberprüfung mit quantifizierter genomischer DNA von Bakterien als Matrize wurde als kleinste nachweisbare Menge ein Genomäquivalent ermittelt. Alle getesteten Spezies wurden trotz Sequenzvariationen der DNA im Bereich der Bindungsstellen für die Primer und Sonden mit etwa gleicher Nachweisempfindlichkeit detektiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von zusätzlichen Nukleinsäuren anderer Bakterienstämme in der Probe, selbst in einer Größenordnung von 6 x 105 Genomäquivalenten (3 ng DNA), nicht zu einer Beeinträchtigung der Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems führt. 3.11.2 Überprüfung der Sensitivität mit bakteriellen Zelllinien Zellen der Stämme Escherichia coli, Enterobacter sakazakii, Proteus mirabilis und Serratia marcescens wurden über Nacht in CASO-Bouillon angezogen, quantifiziert und als dekadische Vedünnungsreihen eingestellt. Die Quantifizierung der Zellen erfolgte durch Auszählen in der Thomakammer und wurde durch Ausplattieren und Inkubation aller Verdünnungsstufen auf CASO-Agar kontrolliert (Kap. II 2.1 und 2.2). Von jeder Verdünnung wurde aus 1 ml die genomische DNA mit dem ShortPrep foodproof II Kit präpariert (Kap. II 2.3.2). Von jeweils 1 x 105, 1 x 104, 1 x 103 und 1 x 102 KbE/ml wurden 5 µl in die Real-Time-PCR eingesetzt. Dies entspricht absoluten Mengen von 500, 50, 5 und 0,5 KbE. Für die Negativkontrollen wurden parallel PCR-Reaktionen mit Aqua ad iniectabilia anstelle von DNA durchgeführt. In Abbildung 3.13 sind die Fluoreszenzwerte der Ergebnisse grafisch dargestellt. Mit ähnlicher Sensitivität lassen sich alle getesteten Bakterienstämme in der PCR nachweisen. Durch Erhöhung der Ausgangsmenge Kolonie bildender Einheiten kommt es zu einer Steigerung der Fluoreszenz während der Amplifikation. Bei den eingesetzten Mengen von 0,5, 5, 50 und 500 KbE liegen die Fluoreszenzwerte für Escherichia coli und Enterobacter sakazakii jeweils zwischen 0,03 und 0,26, für Proteus mirabilis zwischen 0,02 und 0,28 und für Serratia marcescens zwischen 0,01 und 0,25. Bei Durchführung der Negativkontrollen entstanden keine Amplifikate, Fluoreszenzwerte waren nicht messbar.
III Ergebnisse
75
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Escherichia coli Enterobacter sakazakii Proteus mirabilis Serratia marcescens
Bakterienspezies
Fluo
resz
enz
0,5 KBE 5 KBE 50 KBE 500 KBE
Abb. 3.13: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems
mit bakteriellen Zelllinien Es wurden PCR-Reaktionen mit 1 x 102 – 1 x 105 KbE/ml (500 – 0,5 KbE absolut)
nach Aufarbeitung mit dem ShortPrep foodproof II Kit (Kap. II 2.3.2) von Escherichia coli DSM 1576, Enterobacter sakazakii ATCC 51329, Proteus mirabilis DSM 788 und Serratia marcescens DSM 1636 durchgeführt. Dargestellt sind als Säulendiagramm die Werte der maximalen Fluoreszenz während der Amplifikationen, gemessen im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler®. Sämtliche PCR-Reaktionen wurden in Gegenwart von 2 fg IAK-DNA durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde für jede Versuchsreihe parallel eine PCR mit Aqua ad iniectabilia anstelle von DNA durchgeführt. In den Negativkontrollen kam es nicht zur Bildung von Amplifikaten, so dass keine Fluoreszenz messbar war.
Bei der Sensitivitätsüberprüfung mit bakteriellen Zelllinien konnte selbst eine kleine Menge von nur 0,5 KbE noch mit geringer Fluoreszenz nachgewiesen werden. Damit stimmen die Ergebnisse mit denen aus den Sensitivitätstests mit quantifizierter genomischer DNA von Bakterien überein. Die Negativkontrollen blieben in beiden Fällen ohne Amplifikat. Mit den getesteten Bakterienstämmen wurde gezeigt, dass die Detektionsgrenze des Real-Time-PCR-Systems zum Nachweis von Enterobacteriaceen bei einer Bakterienzelle liegt. 3.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems
in der Untersuchung von Lebensmittelproben Die Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems mittels Real-Time-PCR in der Untersuchung von Lebensmittelproben erfolgte im Vergleich mit
III Ergebnisse
76
konventionellen mikrobiologischen Nachweisen (Kap. II 2.12). Von identischem Ausgangsmaterial diverser Lebensmittelproben wurden Anreicherungen durchgeführt und auf das Vorhandensein beziehungsweise die Abwesenheit (Presence/Absence-Test) von Enterobacteriaceae sowohl durch Ösenausstrich auf Selektiv-Agar als auch durch Amplifikation in der Real-Time-PCR überprüft. Es wurden 72 verschiedene Nahrungsmittel in die Untersuchungen einbezogen. 50 Proben waren tiefgekühlte Lebensmittel unterschiedlichster Produktgruppen, da Enterobacterieceen als ubiquitär bekannt sind und in fast allen Nahrungsmitteln vorkommen können. Gemäß der Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), entsprechend der Internationalen Kommission für mikrobiologische Lebensmittelspezifikationen (ICMSF), gelten für Lebensmittel häufig Richtwerte von maximal 1 x 102 oder 1 x 103 KbE Enterobacteriaceae/g Lebensmittel und Warnwerte von 1 x 103 oder 1 x 104 KbE/g (Anonymus 2006). Desweiteren wurden 21 Proben von Säuglingsnahrung, 18 mal zu lösendes Milchpulver oder milchfreies Pulver und drei mal verzehrfertiger Brei unterschiedlicher Hersteller sowie eine Probe Volleipulver auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceen überprüft. Insbesondere das Vorkommen von Enterobacter sakazakii als Lebensmittelkeim in Trockenmilch-Säuglingsnahrung ist von besonderer Relevanz (Kandhai et al. 2004, Bowen und Braden 2006). Mit dieser Enterobacteriaceae-Spezies kontaminierte Säuglingsnahrung führte international zu zahlreichen schweren Erkrankungen und Todesfällen (Gurtler et al. 2005, Drudy et al. 2006). Pasteurisiertes sprühgetrocknetes Volleipulver wurde auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceen untersucht, weil es durch Hühnerkot an der Eischale leicht mit Darmbakterien kontaminiert worden sein kann. In der Produktspezifikation des Herstellers wird zur Mikrobiologie angegeben, dass Enterobacteriaceen nicht nachweisbar in 0,1 g sind. Zum Beginn der Untersuchungen erfolgte eine unselektive Voranreicherung jeder Lebensmittelprobe zur Resuszitation eventuell vorhandener subletal geschädigter Bakterienzellen. Jeweils 1 g Lebensmittel wurde eingewogen, in 9 ml CASO-Bouillon (Kap. II 1.2) homogenisiert und bei 36 °C für 3 h inkubiert. Für die selektive Anreicherung wurde die Probe mit 90 ml Mossel-Bouillon (Kap. II 1.2) versetzt und bei 36 °C für 42 h anaerob bebrütet. Durch anaerobe Wachstumsbedingungen sollten möglicherweise vorhandene obligat aerobe Keime wie Pseudomonaden in der Begleitflora in ihrem Wachstum gehemmt werden. Für die selektive Isolierung von Enterobacteriaceen erfolgte ein Vereinzelungsausstrich von ca. 2 µl der Probe mit steriler Impföse auf VRBD-Agar (Kap. II 1.2). Die Agarplatten wurden bei 36 °C für 18
III Ergebnisse
77
– 20 h anaerob bebrütet. Wenn keine sichtbaren Bakterienkolonien gewachsen waren, wurden die Platten weitere 24 – 48 h bebrütet. Zusätzlich wurden aus den Proben ohne Bakterienwachstum 100 µl, also das etwa 50fache Volumen der Vereinzelung, auf Agar ausplattiert, inkubiert und auf Bakterienwachstum kontrolliert. Proben, in denen rote bis hellrote Kolonien mit hellrötlichem Präzipitathof auf dem Medien gewachsen waren, wurden als positiv für Bakterien der Familie Enterobacteriaceae bewertet. Bei unsicherer Identifizierung erfolgte eine biochemische Ausdifferenzierung mit api®20 E-Test (Kap. II 1.3) und Auswertung durch das Computerprogramm Apilab Version V 4.0 (Kap. II 1.8). Zur Überprüfung der angewandten Versuchsbedingungen wurden sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen parallel durchgeführt. Für Positivkontrollen wurden die Stämme Escherichia coli DSM 1576 und Enterobacter sakazakii ATCC 51329, für Negativkontrollen Pseudomonas aeruginosa DSM 1128 und Aeromonas caviae DSM 7323 eingesetzt. Zur Durchführung der Versuchskontrollen wurde die Lebensmittelprobe jeweils durch 1 ml einer 5 h bei 36 °C gewachsenen Kultur (Kap. II 2.1) ersetzt und der Versuch wie oben beschrieben durchgeführt. Für die Überprüfung des entwickelten Real-Time-PCR-Systems wurde von allen Lebensmittelproben sowie von den Positiv- und Negativkontrollen während der Inkubation in Mossel-Bouillon zweimal eine Probe von je 200 µl aus dem Überstand entnommen. Die erste Entnahme erfolgte nach 16 h, die zweite nach 42 h der Inkubationszeit. Die 200 µl-Probe wurde als ShortPrep-Extraktion (Kap. II 2.3.2) aufgearbeitet und 2,5 µl der Präparation wurden in die PCR-Reaktion (Kap. II 2.6.3) eingesetzt. Am Beispiel der tiefgekühlten Lebensmittelproben Petersilie, Hähnchenkeule und Wiener Würstchen sind in Abbildung 3.14 die Amplifikationskurven der PCR-Ergebnisse dargestellt. In Petersilie und Hähnchenkeule wurde die Anwesenheit von Enterobacteriaceen nachgewiesen, in Wiener Würstchen waren keine Bakterien der Familie Enterobacteriaceae vorhanden. Diese Ergebnisse stimmen mit denen der mikrobiologischen Referenzmethode überein. Dasselbe gilt für die anderen 47 tiefgefrorenen Lebensmittelproben sowie die Positiv- und Negativkontrollen, die Übereinstimmung beträgt 100 %. Dabei spielte es keine Rolle, ob die Probenaufarbeitung für die Real-Time-PCR bereits nach 16 h, oder nach 42 h selektiver Anreicherung erfolgte. In Tabelle 3.6 sind die Untersuchungsergebnisse aller tiefgekühlten Lebensmittelproben diverser Produktgruppen zusammengefasst.
III Ergebnisse
78
Abb. 3.14: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Lebensmittelproben
Es wurden jeweils 1 g tiefgekühlte Lebensmittelprobe von Petersilie, Hähnchenkeule und Wiener Würstchen in 9 ml CASO-Bouillon homogenisiert und für 3 h bei 36 °C unselektiv angereichert. Nach Zugabe von 90 ml Mossel-Bouillon wurde bei 36 °C selektiv angereichert. Nach 16 h wurden 200 µl aus dem Überstand der Probe entnommen, durch ShortPrep-Extraktion aufgearbeitet und als Aliquot von 2,5 µl in die Real-Time-PCR-Reaktion eingesetzt. Abgebildet sind die Amplifikationskurven der Real-Time-PCR im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler®.
Petersilie
Hähnchenkeule
Wiener Würstchen
III Ergebnisse
79
Nr. Produkt PCR Mibi Nr. Produkt PCR Mibi
1 Eis Piraten Mix, Krokodil - - 26 Himbeer-Käse-Sahnetorte - -
2 Riegel Mix, Karamell + + 27 Tiramisu-Eisriegel - -
3 Gebäck, helle Teigmischprobe + + 28 Suppengemüse - -
4 Grünkohl + + 29 Gemüse-Reispfanne + +
5 Porree/Lauch - - 30 Kräutermischung Bärlauch - -
6 Buntes Gartengemüse + + 31 Petersilie + +
7 Asia Pfanne Bombay + + 32 Schnittlauch + +
8 Pangasiusfilet + + 33 Knoblauch-Würfel - -
9 Lachsforelle Ammerländer Art + + 34 Kaiserschmarrn, Vanillesoße - -
10 Garnelen in Knusperteig - - 35 Garnelensnack - -
11 Fleischtopf Toscana - - 36 Schollenfilet + +
12 Lammmedaillons + + 37 Wiener Würstchen - -
13 Gnocci + + 38 Thüringer Rostbratwurst - -
14 Grünkohl mit Räucherwurst - - 39 Cevapcici - -
15 Blätterteig Schinken-Käse + + 40 Donuts - -
16 Blumenkohl-Broccoli-Gratinos + + 41 Tortenmischung Nuss-Sahne + +
17 Marinierte Gänsekeulen + + 42 Hähnchenkeule + +
18 Ente Classic + + 43 Hähnchenbrustfilet paniert + +
19 Marinierte Entenpfanne + + 44 Reibekuchen - -
20 Markklößchen + + 45 Suppenklößchen + +
21 Kartoffelgratin - - 46 Donauwelle - -
22 Mozzarella Sticks + + 47 Herzoginkartoffeln - -
23 Bratapfelplunder + + 48 Lachs und Gemüse + +
24 Pizza Schinken Champignon + + 49 Hähnchenbrustfilet unpaniert + +
25 Mini Sahnewindbeutel + + 50 Eddy's Fisch, Seefisch + +
Tab. 3.6: Ergebnisse der Untersuchung von Lebensmitteln diverser
Produktgruppen
Die Lebensmittel wurden im Vergleich mit dem Real-Time-PCR-System und konventionellen mikrobiologischen Verfahren auf die Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit von Enterobacteriaceen getestet. Von jeder Lebensmittelprobe wurde 1 g in 9 ml CASO-Bouillon homogenisiert und für 3 h bei 36 °C unselektiv, nach Zugabe von 90 ml Mossel-Bouillon für 42 h bei 36 °C
III Ergebnisse
80
selektiv angereichert. Es folgte ein Vereinzelungsausstrich mit steriler Impföse auf VRBD-Agar und Inkubation für 18 – 20 h bei 36 °C. Platten, auf denen noch keine sichtbaren Bakterienkolonien gewachsen waren, wurden für weitere 24 – 48 h inkubiert. Proben mit roten bis hellroten Kolonien mit hellrötlichem Präzipitathof wurden als positiv (+) für Enterobacteriaceae im konventionellen mikrobiologischen Nachweis bewertet (Tabellenspalte Mibi = Mikrobiologie). Für die Real-Time-PCR-Reaktionen wurde nach 16 h und nach 42 h selektiver Anreicherung jeweils 200 µl aus dem Überstand der Probe entnommen, durch ShortPrep-Extraktion aufgearbeitet und als Aliquot von 2,5 µl in die Reaktion eingesetzt. Proben mit positiver Amplifikationskurve wurden als positiv (+) für Enterobacteriaceae im PCR-Nachweis (Tabellenspalte PCR) bewertet. Da die PCR-Ergebnisse nach 16 h und 42 h zu 100 % übereinstimmten, werden sie in der Tabelle nicht getrennt aufgeführt. Die Lebensmittel diverser Produzenten wurden tiefgekühlt bezogen. + = Enterobacteriaceen vorhanden, - = keine Enterobacteriaceen vorhanden
Auch die PCR-Ergebnisse der Untersuchungen von Säuglingsnahrung und Volleipulver stimmen zu 100 % mit denen der Horizontalverfahren überein, sie sind in Tabelle 3.7 zusammengefasst. In keiner der untersuchten Proben wurden Enterobacteriaceen nachgewiesen. Es wurden aber in allen negativen Proben die Internen Amplifikationskontrollen korrekt amplifiziert, so dass falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen werden konnten. Begleitkeime wurden durch das mikrobiologische Nachweisverfahren ebenfalls nicht detektiert. Neben den oben beschriebenen Positiv- und Negativkontrollen wurden weitere Positivkontrollen parallel durchgeführt. 1 g Probe von Trockenmilch-Säuglingsnahrung wurde in 9 ml CASO-Bouillon gelöst, mit 1 ml einer für 5 h bei 36 °C gewachsenen Kultur (Kap. II 2.1) von Enterobacter sakazakii ATCC 51329 inokuliert und nach gleichem Protokoll wie die Lebensmittelproben behandelt. So wurde die grundsätzliche Nachweisbarkeit von Enterobacteriaceen in der Säuglingsnahrung überprüft und bestätigt. In Abbildung 3.15 sind exemplarisch die Amplifikationskurven der PCR einer Probe von Trockenmilch-Säuglingsnahrung und der Positivkontrolle mit der beimpften Probe des gleichen Produkts abgebildet.
III Ergebnisse
81
Abb. 3.15: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Säuglingsnahrung
Es wurde 1 g Alete Anfangmilchnahrung PRE in 9 ml CASO-Bouillon gelöst und für 3 h bei 36 °C unselektiv angereichert. Nach Zugabe von 90 ml Mossel-Bouillon wurde bei 36 °C selektiv angereichert. Nach 16 h wurden 200 µl aus dem Überstand der Probe entnommen, durch ShortPrep-Extraktion aufgearbeitet und als Aliquot von 2,5 µl in die Real-Time-PCR-Reaktion eingesetzt. Um die Nachweisbarkeit von Enterobacteriaceen in der Probe zu überprüfen, wurde als Positivkontrolle in einer Parallelprobe die Voranreicherung der Anfangsmilchnahrung mit 1ml einer 5 h bei 36 °C gewachsenen Kultur von Enterobacter sakazakii ATCC 51329 versetzt und nach gleichem Protokoll behandelt. Abgebildet sind die Amplifikationskurven der Real-Time-PCR beider Proben im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler®.
Alete Anfangsmilchnahrung PRE
Alete Anfangsmilchnahrung PRE + Enterobacter sakazakii
III Ergebnisse
82
Nr. Produkt Hersteller/Vertrieb PCR Mibi
1 Milchbrei Früchte, nach 4. Monat Milasan GmbH - -
2 Getreidebrei BIO 3-Korn, milchfrei, ab 6. Monat Milupa GmbH - -
3 Milchbrei Grieß, nach 4. Monat Milasan GmbH - -
4 BEBA Sensitive Spezialnahrung, diätetisches Lebensmittel, ab Geburt Nestlé Deutschland AG - -
5 Milumil 1, Dauermilch, von Geburt an Milupa GmbH - -
6 Alete Anfangsmilchnahrung PRE, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH - -
7 Alete Hypoallergene Anfangsnahrung, ab Geburt Nestlé Nutriton GmbH - -
8 Folgemilch 3, prebiotisch, ab 8. Monat Humana GmbH - -
9 Aptamil Pre Säuglingsmilchnahrung, ab Geburt Milupa GmbH - -
10 Babydream Milchbrei Grieß, nach 4. Monat Rossmann GmbH - -
11 BEBA Start Anfangsmilchnahrung Pre, ab Geburt Nestlé Deutschland AG - -
12 Bio-Anfangsmilch, ab Geburt HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG - -
13 Folgemilch 3, ab 8. Monat HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG - -
14 Babydream Folgemilch 2, ab 4. Monat Rossmann GmbH - -
15 Baby-Aktiv Folgemilch, ab 8. Monat Bebivita GmbH - -
16 Anfangsmilch PRE, ab Geburt Humana GmbH - -
17 Pre Säuglings-Milchnahrung, ab Geburt Milasan GmbH - -
18 Folgemilch, nach 4. Monat Milasan GmbH - -
19 Alete Milchbrei Banane mit Milchreis, ab 8. Monat Nestlé Nutriton GmbH - -
20 Abendmilchbrei Grieß-Vanille, nach 4. Monat Bebivita GmbH - -
21 BIO Milchgrießbrei mit Vanille, nach 4. Monat Milasan GmbH - -
22 Volleipulver Sanovo Eiprod. GmbH & Co KG - -
Tab. 3.7: Ergebnisse der Untersuchung von Säuglingsnahrung und Volleipulver
Die Lebensmittel wurden im Vergleich mit dem Real-Time-PCR-System und konventionellen mikrobiologischen Verfahren auf die Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit von Enterobacteriaceen getestet. Von jeder Lebensmittelprobe wurde 1 g in 9 ml CASO-Bouillon homogenisiert und für 3 h bei 36 °C unselektiv, nach Zugabe von 90 ml Mossel-Bouillon für 42 h bei 36 °C selektiv angereichert. Es folgte ein Vereinzelungsausstrich mit steriler Impföse auf VRBD-Agar und Inkubation für 18 – 20 h bei 36 °C. Platten, auf denen noch keine sichtbaren Bakterienkolonien gewachsen waren, wurden für weitere 24 – 48 h inkubiert. Alle Probenergebnisse waren negativ (-), Proben mit roten bis hellroten Kolonien mit hellrötlichem Präzipitathof wären als positiv für Enterobacteriaceae im
III Ergebnisse
83
konventionellen mikrobiologischen Nachweis bewertet worden (Tabellenspalte Mibi = Mikrobiologie). Für die Real-Time-PCR-Reaktionen wurde nach 16 h und nach 42 h selektiver Anreicherung jeweils 200 µl aus dem Überstand der Probe entnommen, durch ShortPrep-Extraktion aufgearbeitet und als Aliquot von 2,5 µl in die Reaktion eingesetzt. Alle Probenergebnisse waren negativ (-) ohne Amplifikatbildung (Tabellenspalte PCR). Da die PCR-Ergebnisse nach 16 h und 42 h zu 100 % übereinstimmten, werden sie in der Tabelle nicht getrennt aufgeführt.
In der vergleichenden Überprüfung des Real-Time-PCR-Systems gegenüber klassischen mikrobiologischen Untersuchungsverfahren zur Feststellung der Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae in Lebensmitteln wurde gezeigt, dass die PCR-Ergebnisse zu 100 % mit denen der mikrobiologischen Verfahren übereinstimmen. Selbst bei Vorhandensein einer hohen Begleitflora, wie beispielsweise zahlreichen Laktobazillen in käsehaltigen Lebensmittelproben wie Pizza, Mozzarella Sticks und Blätterteig Schinken-Käse, wurden eindeutige Ergebnisse durch Amplifikation der Enterobacteriaceen-DNA erzielt. Auf den Agarplatten dieser Proben war neben Enterobacteriaceen-Kolonien die Begleitflora mit starkem Wachstum vertreten. Der mikrobiologische qualitative Nachweis von Enterobacteriaceen umfasst einen Zeitaufwand von mindestens 63 h, bestehend aus insgesamt 45 h unselektiver und selektiver Anreicherung und 18 h für die Isolierung. Kommt es zu keinem Wachstum von Enterobacteriaceen, muss die Inkubation der Agarplatten noch verlängert werden, um deren Vorhandensein sicher ausschließen zu können. Demgegenüber liegt das Ergebnis bei Anwendung des entwickelten molekularbiologischen Real-Time-PCR-Systems bereits nach 21 h vor. Der Zeitbedarf dieses Verfahrens liegt im Einzelnen bei 3 h für die Voranreicherung, 16 h für die selektive Anreicherung, 0,5 h für die DNA-Isolierung und 1,5 h für die Durchführung und Auswertung der PCR. Im Resultat handelt es sich hierbei um eine wesentlich schnellere, hoch spezifische und sensitive Detektion von Enterobacteriaceen in Lebensmittelproben, die eine Alternative gegenüber herkömmlichen Qualitätskontrollen von Lebensmitteln darstellt.
IV Diskussion
84
IV DISKUSSION 4.1 Entwicklung eines spezifischen Real-Time-PCR-Systems
für den Nachweis von Enterobacteriaceae Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein spezifisches qualitatives Nachweissystem für Enterobacteriaceen in Lebensmitteln auf Grundlage der Real-Time-PCR entwickelt. Klassische Nachweisverfahren zur Feststellung der Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit der Familie Enterobacteriacea in Lebensmitteln basieren auf Grundlage mikrobiologischer Methoden und bedienen sich der Bakterienidentifizierung anhand morphologischer und physiologischer Merkmale. Der zeitliche Aufwand derartiger Verfahren bis zum aussagekräftigen Ergebnis beträgt mindestens drei Tage. Die vorliegende Arbeit präsentiert als alternative Methode einen molekularbiologischen Nachweis der Familie Enterobacteriaceae durch Amplifikation und Detektion ihrer DNA nach vorheriger kultureller Anreicherung der Keime. Mit 21 Stunden liegt der zeitliche Aufwand zur Durchführung dieses Indikatornachweises bei nur einem Drittel der Zeit und erreicht im Vergleich mit den konventionellen mikrobiologischen Anwendungen eine Spezifität von 100 %. Vergleichbare Methoden auf Basis der Real-Time-PCR wurden für den Nachweis bakterieller Genera oder Spezies publiziert. Für den qualitativen Nachweis der Enterobacteriaceen-Gattung Salmonella in Lebensmitteln wurden beispielsweise Real-Time-PCR-Systeme zur Untersuchung von unbehandelter Milch (Van Kessel et al. 2003), Huhn, Rinder- und Schweinehackfleisch, Fisch und Rohmilch (Malorny et al. 2004) und Geflügel einschließlich der gesamten Nahrungskette dieser Tiere (Szmolka et al. 2006) in der Literatur beschrieben. Auch die Anwendung dieser Nachweissysteme ist mit einem deutlich verringerten Zeitaufwand gegenüber klassischen Versuchsdurchführungen verbunden. Während traditionelle Horizontalverfahren für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Salmonella in Lebensmitteln gemäß internationalem Standard ISO 6579:2003 mindestens drei Tage bis zum Ergebnis benötigen (Anonymus 2003c), sind die Real-Time-PCR-Untersuchungen bereits nach 24-30 Stunden abgeschlossen. Die Anwendung des hier entwickelten Enterobacteriaceen-Systems eignet sich als Indikatornachweis für die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln unterschiedlichster Produktgruppen. Sowohl das fertige Produkt als auch sämtliche Prozessstufen in lebensmittelproduzierenden Betrieben lassen sich mit dem Detektionssystem überprüfen. Dabei ist zu beachten, dass besonders häufig die Produktionsstätte
IV Diskussion
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selbst der Ort der Lebensmittelkontamination ist und somit schnelle, zuverlässige Nachweise unzureichender Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene von großer Bedeutung sind. Einer WHO-Studie über lebenmittelbedingte Infektionen zufolge waren in Deutschland im Jahr 2000 fast 90 % der Kontaminationsquellen von Lebensmitteln die herstellenden Betriebe (Anonymus 2003b). Der Nachweis der artenreichen Enterobacteriaceae in Lebensmitteln stellt als Indikator für gesundheitsgefährdende Hygienemängel eine wichtige Funktion dar (Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988, Mossel und Struijk 1995). Die von der Kommission der Europäischen Gemeinschaften (EU) erlassene Verordnung Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel, gültig seit dem 1. Januar 2006, gilt unmittelbar verbindlich in jedem Mitgliedstaat des Europäischen Wirtschaftsraumes (EWR). Mit der Verordnung werden die mikrobiologischen Kriterien für bestimmte Mikroorganismen sowie die Bestimmungen festgelegt, die von den Lebensmittelunternehmen bei der Durchführung allgemeiner und spezifischer Hygienemaßnahmen einzuhalten sind. Durch die zuständigen Behörden wird die Einhaltung der festgelegten Bestimmungen und Kriterien überprüft. Die Lebensmittelsicherheitskriterien der Verordnung schreiben die Feststellung der Abwesenheit von Enterobacteriaceae in getrockneter Säuglingsanfangsnahrung und getrockneten diätetischen Lebensmitteln vor. In 10 g der Lebensmittelprobe dürfen, gemäß Durchführung der analytischen Referenzmethode ISO 21528-1, keine Enterobacteriaceen nachweisbar sein. Werden in einer Probeneinheit Enterobacteriaceae nachgewiesen, ist die Partie auf Enterobacter sakazakii und Salmonella zu untersuchen. Die Hersteller der genannten Lebensmittel haben, wie unter Punkt 2 der spezifischen Bestimmungen über Probenahme und Untersuchung (Artikel 5) festgelegt, im Rahmen ihres Probenahmeplans auch die Verarbeitungsbereiche und Ausrüstungsgegenstände auf Enterobacteriaceae zu untersuchen. Dazu heißt es unter Punkt 17 der Gründe für die Verordnung: „Das Wissenschaftliche Gremium für Biologische Gefahren (BIOHAZ) der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) veröffentlichte am 9. September 2004 ein Gutachten über die mikrobiologischen Risiken in Säuglingsanfangsnahrung und Folgenahrung [Anonymus 2004b]. Darin kommt das Gremium zu dem Schluss, dass Salmonella und Enterobacter sakazakii diejenigen Mikroorganismen in Säuglingsanfangsnahrung, Folgenahrung und Nahrung für besondere medizinische Zwecke sind, die am meisten Anlass zur Sorge geben. Das Vorhandensein dieser Krankheitserreger stellt ein erhebliches Risiko dar, wenn die Bedingungen nach der Aufbereitung der Nahrung eine Vermehrung ermöglichen. Enterobacteriaceae, die häufiger vorhanden sind, könnten als Risikoindikator herangezogen werden. Die EFSA empfiehlt sowohl für die Herstellungsumgebung als auch für das Endprodukt die Überwachung und Untersuchung auf Enterobacteriaceae. Neben krankheitserregenden Arten umfasst die Familie der Enterobacteriaceae jedoch auch
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Kommensalen, die häufig im Umfeld der Lebensmittelherstellung auftreten, ohne jedoch eine Gefahr für die Gesundheit darzustellen. Daher kann die Familie der Enterobacteriaceae zur Routineüberwachung herangezogen werden, und sofern Enterobacteriaceae nachgewiesen werden, kann mit der Untersuchung auf spezifische Krankheitserreger begonnen werden.“ Das in der Verordnung vorgeschriebene mikrobiologische Horizontalverfahren zum qualitativen Nachweis von Enterobacteriaceae nach ISO 21528-1 umfasst eine 24-stündige unselektive Voranreicherung, eine 24-stündige selektive Anreicherung sowie eine 24-stündige Isolierung der Keime und anschließende Bestätigungstests wie Fermentationstest und Oxidasetest. Bei Anwendung des Real-Time-PCR-Systems für den Enterobacteriaceen-Nachweis könnte das Ergebnis bereits nach einem Tag vorliegen. 4.2 Kulturelle Anreicherung und DNA-Extraktion Das vorgestellte Verfahren zum Nachweis von Enterobacteriaceen in Lebensmitteln beinhaltet die Schritte der Anreicherung, DNA-Extraktion und Durchführung der Real-Time-PCR mit zeitgleicher Auswertung. Zur Resuszitation in der Lebensmittelprobe vorhandener Keime erfolgt zunächst eine unselektive kulturelle Anreicherung für drei Stunden in CASO-Bouillon. Eventuell anwesenden subletal geschädigten Enterobacteriaceen wird damit die Möglichkeit der Revitalisierung gegeben. Es folgt eine selektive Anreicherung über Nacht in für Enterobacteriaceae spezifischer Mossel-Bouillon, um deren Keimzahl zu erhöhen und damit eine sichere Detektion auch ursprünglich geringster Bakterienmengen zu gewährleisten. Auch für beschriebene PCR-Systeme zum qualitativen Nachweis von Salmonella beginnen die Anwendungsprotokolle mit dem Schritt der kulturellen Anreicherung. Während Löfström et al. (2004) und Hein et al. (2006) unselektive Anreicherung und Oliveira et al. (2003) und Van Kessel et al. (2003) selektive Anreicherung als Methode angeben, wird von Myint et al. (2006) die Kombination aus unselektiver und anschließender selektiver Anreicherung favorisiert. Von Letztgenannten wird bei ausschließlich unselektiver Anreicherung in gepuffertem Peptonwasser ein signifikanter Sensitivitätsverlust des PCR-Nachweises um 15 % gegenüber der Kombination von unselektiver Anreicherung in gepuffertem Peptonwasser und selektiver Anreicherung in Rappaport-Vassiliadis- und Tetrathionat-Bouillon beschrieben. In jedem Fall muss für den qualitativen Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln vorab eine kulturelle Anreicherung durchgeführt werden, um auch die Abwesenheit der gesuchten Keime mit Sicherheit aussagen zu können. Desweiteren kommt es durch die Anreicherung zu einer Ausdünnung
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eventuell vorhandener für die PCR inhibitorischer Substanzen (Tsai und Olson 1992, Sharma und Carlson 2000) und die Wahrscheinlichkeit, DNA von toten Zellen zu detektieren, wird verringert (Löfström et al. 2004). Bei Anwendung der PCR ist grundsätzlich zu bedenken, dass im Gegensatz zum klassischen mikrobiologischen Nachweis neben lebenden Bakterien auch tote Zellen nachgewiesen werden können, da es sich um die Detektion ihrer Nukleinsäuren handelt. Dieser Nachweis von toten Keimen kann durchaus zu wichtigen Aussagen über die hygienische Beschaffenheit der Untersuchungsproben führen. Auch Bakterien, die sich im sogenannten „viable but nonculturable“ Zustand befinden und eine Gesundheitsgefährdung darstellen können, lassen sich mittels PCR-Nachweis detektieren. Bakterien verharren aufgrund von Stress und ungeeigneten Lebensbedingungen in diesem Stadium, aus dem sie unter günstigeren Verhältnissen wieder in einen aktiven Lebenszyklus übergehen können (Oliver und Bockian 1995, Steinert et al. 1997). Bei Anwendung rein kultureller Nachweismethoden bleiben Mikroorganismen in diesem Zustand unerkannt (Lleò et al. 1998, Gunasekera 2002). In einer Untersuchung zur mikrobiologischen Qualitätskontrolle von Grundwasser verglichen Lleò et al. (2005) konventionelle mikrobiologische und molekularbiologische Methoden miteinander. Die Wasserproben wurden durch den Nachweis der bakteriellen Indikatoren Escherichia coli und Enterococcus faecalis auf Kontaminationen mit Fäkalien überprüft. Dabei kamen sie zu dem Ergebnis, dass 50 % der untersuchten Proben, in denen keine kultivierbaren Keime detektierbar waren, in der spezifischen PCR zum Nachweis von Enterococcus faecalis positiv getestet wurden. Die Studie belegt, dass gebräuchliche mikrobiologische Standardmethoden nicht geeignet sind, Bakterien, die nicht kultivierbar, aber lebensfähig in Grundwasser vorhanden und in der Lage sind, humanpathoge Faktoren zu exprimieren, ausreichend zu detektieren. Konklusiv weisen die Autoren darauf hin, dass es zum Schutz der Gesundheit von Menschen notwendig ist, Methoden zu entwickeln und anzuwenden, welche sowohl nicht kultivierbare als auch kultivierbare Bakterien zuverlässig nachweisen. Nach Anreicherung der Keime folgen Extraktion und Amplifikation der DNA. Für die Detektion mit dem entwickelten Enterobacteriaceen-Nachweissystems besteht keine Notwendigkeit, die zu amplifizierende bakterielle DNA durch enzymatischen Zellaufschluss zu präparieren und über Silikasäulen aufzureinigen. In entsprechenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass sich die DNA nach einer wesentlich schnelleren, mechanisch-thermischen ShortPrep-Aufarbeitung aus dem Überstand durch das Real-Time-PCR-System mit gleicher Zuverlässigkeit und ohne Sensitivitätsverlust nachweisen lässt wie nach ihrer Purifikation.
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4.3 Dekontamination der Taq-DNA-Polymerase Durch Anwendung der Real-Time-PCR als hochsensitives Detektionsverfahren lassen sich selbst geringste Mengen bis hin zu nur einem vorhandenen DNA-Molekül nachweisen. Demnach können auch minimalste Kontaminationen mit Nukleinsäuren in der PCR-Reaktion zu unerwünschten Amplifikationen und damit zu falsch positiven Ergebnissen führen. Es ist von großer Bedeutung, dass sämtliche eingesetzten PCR-Komponenten frei von Nukleinsäuren sind. Insbesondere bei Durchführung einer Konsensus-PCR mit Amplifikation hoch konservierter DNA-Sequenzen weitreichender taxonomischer Gruppen besteht ein hohes Risiko der Detektion von Kontaminationen. Üblicherweise sind in Taq-DNA-Polymerasen und deren Lagerpuffern derartige Verunreinigungen mit Nukleinsäuren, die zu falschen PCR-Ergebnissen führen, vorhanden und wurden häufig in der Literatur dokumentiert (Rand und Houck 1990, Böttger 1990, Sharma et al. 1992). Auch während der Entwicklung des hier beschriebenen Real-Time-PCR-Systems kam es bei Durchführung von PCR-Reaktionen ohne Template-DNA zur unerwünschten Amplifikation von DNA-Kontaminationen der Taq-Polymerase. Weil Taq-Polymerasen in der Regel rekombinant in Escherichia coli synthetisiert oder als natives Protein aus Thermus aquaticus isoliert werden, sind oftmals Nukleinsäuren dieser Bakterienspezies die Ursachen der Kontaminationen. Darüber hinaus wird aber auch die Anwesenheit exogener DNA in kommerziellen Taq-Polymerasen beschrieben. In einigen Studien wurde gezeigt, dass es sich bei der Kontamination weder um DNA von Escherichia coli noch um solche von Thermus aquaticus handeln kann (Maiwald et al. 1994, Hughes et al. 1994). Die nachgewiesenen Quellen der exogenen Kontaminationen in Taq-DNA-Polymerasen reichen von Bakterien (Böttger 1990, Corless et al. 2000) über Phagen (Newsome et al. 2004) bis zu Kontaminationen mit sowohl Prokaryonten als auch Eukaryonten (Schmidt et al. 1991). In Untersuchungen zur Konsensus-PCR mittels partieller Amplifikation eines in allen Eubakterien in seiner DNA-Sequenz weitgehend konservierten „Housekeeping-Gens“ wurde nachgewiesen, dass es sich bei den Kontaminationen der Taq-Polymerasen um eine Vielfalt von DNA-Molekülen handelte (unveröffentlichte Daten der Autorin). Mit allen getesteten Taq-Polymerasen diverser Hersteller waren in PCR-Reaktionen ohne Template-DNA spezifische Amplifikate gleicher Größe entstanden. Um die kontaminierende DNA zu identifizieren, wurden die Amplifikate im Vektor pGEM®-T kloniert und sequenziert. Die Auswertung der Daten zehn verschiedener Klone führte zu zehn verschiedenen Nukleotidsequenzen. Keine der Sequenzen stimmte mit denen von Thermus aquaticus oder Escherichia coli überein. Mit Hilfe des BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) über NCBI (National Center for Biotechnology
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Information) wurden die Daten mit allen bekannten Genomsequenzen und Sequenzabschnitten verglichen. Für keine der Amplifikatsequenzen konnte eine vollständige Übereinstimmung mit bekannten Nukleinsäuresequenzen ermittelt werden. Es ergaben sich lediglich unterschiedlich hohe Übereinstimmungen zwischen 87 und 95 % mit den Sequenzen der Housekeeping-Gene verschiedener Spezies der Bakterienklassen Alpha-, Beta-, Gamma-Proteobacteria und der Abteilung Firmicutes. Keine der DNA-Kontaminationen konnte identifiziert werden. Interessanterweise wurde eine Beobachtung dieser Art auch schon von Hughes et al. (1994) beschrieben. Die Wissenschaftler untersuchten ebenfalls eubakterielle Kontaminationen aus Taq-Polymerasen verschiedener Hersteller, nachdem sie in PCR-Durchführungen für hoch konservierte 16S rRNA Gensequenzen spezifische Amplifikate in Reaktionen ohne Template-DNA nachgewiesen hatten. Sie klonierten und sequenzierten die Amplifikate und ermittelten für fünf unterschiedliche Klone fünf verschiedene DNA-Sequenzen, die nicht identifiziert werden konnten. Die Klone wiesen Übereinstimmungen zwischen 75 und 98 % mit bekannten Sequenzen auf und entsprachen nicht den Sequenzen von Thermus aquaticus oder Escherichia coli. Auch hier wird von den Autoren eine große Vielfalt an DNA-Kontaminationen in Taq-DNA-Polymerasen postuliert. Während der Enzymproduktion in Betrieben können Kontaminationen aus der Umgebung, aus Pufferlösungen oder von den Chromatographiesäulen während der Aufreinigung der Taq-Polymerasen eingeschleppt werden (Rand und Houck 1990). Letztlich bleibt aber der Ursprung der DNA-Kontamination meist unklar. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt scheint es jedenfalls nicht möglich zu sein, eine kommerzielle Taq-DNA-Polymerase zu erhalten, die mit Sicherheit frei von jeglicher Kontamination mit Nukleinsäuren ist. Ein Schritt effektiver Beseitigung derartiger Verunreinigungen sollte insbesondere bei Durchführung einer Konsensus-PCR daher immer durchgeführt werden (Heininger et al. 2003). Die extrem hohe Affinität der Taq-Polymerase zur DNA kann aber die DNA davor schützten, durch enzymatische, physikalische oder chemische Behandlungen degradiert zu werden und erschwert eine wirkungsvolle Dekontamination (Rand und Houck 1990, Corless et al. 2000, Datta und LiCata 2003). Verschiedene Möglichkeiten des DNA-Abbaus wie Verdau mittels Restriktionsendonukleasen (Sharma et al. 1992, Carroll et al. 1999), UV-Bestrahlung (Ou et al. 1991, Frothingham et al. 1992), DNase I-Verdau (Rochelle et al. 1992, Song et al. 2006) und Psoralen-Behandlung (Jinno et al. 1990, Meier et al. 1993) wurden in der Literatur beschrieben. Häufig geht aber die Behandlung zum Abbau kontaminierender DNA mit einer Verringerung der PCR-Sensitivität einher (Klaschik et al. 2002, Heininger et al. 2003). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang es, DNA in rekombinanten Taq-DNA-Polymerasen durch Hydrolyse mittels DNase I vollständig zu degradieren, ohne dass
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es dadurch in der Real-Time-PCR zur Verringerung der Sensitivität kam. Mit allen geprüften kommerziellen Taq-Polymerasen war es in den PCR-Negativ-Kontrollen ohne Untersuchungsprobe zur Amplifikation kontaminierender DNA gekommen. Nachdem Taq-Polymerasen erfolgreich mit einem DNase I-Verdau behandelt wurden, konnten diese ohne Einschränkung ihrer katalytischen Aktivität in der PCR zum Nachweis von Enterobacteriaceen eingesetzt werden. Sämtliche Reaktionen ohne vorgelegte Template-DNA waren frei von Amplifikaten (Kap. III, Abb. 3.5, 3.7 und 3.8). Die Aktivität kommerzieller Taq-DNA-Polymerasen ist häufig blockiert, um die Entstehung unspezifischer Amplifikate durch Primerextension vor dem Start der eigentlichen PCR-Reaktion zu verhindern. Erst durch eine Temperaturerhöhung werden die so genannten „Hot-Start“-Polymerasen zum Beginn der PCR in ihren aktiven Zustand überführt. Die Inaktivierung des Enzyms wird üblicherweise durch reversible Bindung eines monoklonalen Antikörpers (Sharkey et al. 1994, Kellogg et al. 1994) oder chemische Modifikation des Proteins (Moretti et al. 1998, Schwab und McDevitt 2003) erreicht. In den hier beschriebenen Untersuchungen wurden sowohl chemisch inaktivierte als auch durch Antikörper blockierte Taq-Polymerasen mit dem Ziel ihrer Dekontamination behandelt. Während die DNA-Moleküle in chemisch modifizierten Taq-Polymerasen nicht oder nur unvollständig degradiert wurden, konnten Taq-Polymerasen, die mit einem Antikörper reversibel blockiert waren durch Verdau mit DNase I restlos dekontaminiert werden. Möglicherweise ist die DNA in durch Antikörper blockierten Polymerasen besser zugänglich für die katalytische Aktivität von DNasen während die Bindung der kontaminierenden DNA an Taq-Polymerasen ohne Antikörper stabiler ist. 4.4 Kompetitive PCR mit Interner Amplifikationskontrolle Die Durchführung des spezifischen Enterobacteriaceen-DNA-Nachweises mittels Real-Time-PCR und zeitgleicher Auswertung erfolgt im LightCycler®. Für die Überprüfung des PCR-Systems wurde mittels PCR-Mutagenese eine Interne Amplifikationskontrolle konstruiert und in das System integriert. Die DNA der Amplifikationskontrolle verfügt über komplementäre Bindungssequenzen für die Systemprimer und wird in jeder PCR-Reaktion zeitgleich mit eventuell vorhandener Ziel-DNA und identischen Primern als Startmoleküle coamplifiziert. Die Größen der Ziel- und Kontroll-Amplifikate sind fast kongruent, sie differieren um lediglich 4 bp. Durch diese Kontrolle mittels kompetitiver PCR lassen sich falsch negative Untersuchungsergebnisse, die aufgrund inhibitorischer Wirkungen etwa durch Probenmatrices und zugesetzte Substanzen oder mangelnde Enzymaktivität
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auftreten können, ausschließen (De Wit et al. 1993, Bretagne et al. 1995, Ieven und Goossens 1997). Für den Nachweis der Kontroll- und Zielamplifikate wurden mit LCRed-Farbstoffen verschiedener Emmissionsfluoreszenz markierte spezifische Sonden generiert, die in getrennten Fluoreszenzkanälen des LightCycler® detektiert werden. Dadurch ist es möglich, die beiden fast gleich großen Amplifikate während ihrer Entstehung zu differenzieren. Die Implementierung Interner Amplifikationskontrollen in diagnostische PCR-Anwendungen zur Überprüfung der grundsätzlichen Funktionalität der Reaktion und damit zum sicheren Ausschluss falsch negativer Versuchsergebnisse ist als zwingend erforderlich zu sehen und Voraussetzung für die Qualitätssicherung der Anwendung. Das Europäische Komitee für Normung (CEN), in Zusammenarbeit mit der Internationalen Organisation für Standardisierung (ISO), schlägt allgemeingültige Richtlinien für PCR-Systeme vor, welche die Anwesenheit einer Internen Amplifikationskontrolle in jedem Amplifikationsassay verlangen (Hoorfar et al. 2003). Den PCR-Reaktionsansätzen wurden 0,15 % Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt, um die Funktionalität des Nachweissystems zu stabilisieren. In Gegenwart von BSA kommt es zu einer festeren Bindung der Taq-DNA-Polymerase an die DNA und Amplifikationsinhibitoren wie Lipide, Anionen und Phenole werden gebunden (Kreader 1996, Abu Al-Soud und Rådström 2001). Darüber hinaus wird die Zugabe von BSA bei Durchführung der PCR im LightCycler® von Autoren empfohlen, weil es die Wände der Kapillaren beschichtet und damit die Möglichkeit der Anhaftung von DNA, Oligonukleotiden, Polymerasen und SYBR® Green I an den Reaktionsgefäßen reduziert (Wittwer et al. 1997, Ririe et al. 1997). 4.5 Spezifität und Sensitivität Spezifische PCR-Nachweissysteme basieren auf der Amplifikation und Detektion bestimmter Nukleinsäuren. Diese müssen charakteristisch für die zu detektierenden Organismen und zuverlässig in ihrem Genom vorhanden sein. Die Zielsequenzen zum Nachweis von Enterobacteriaceae müssen in allen Bakterien dieser Familie möglichst hoch konserviert vorliegen und sich gegenüber anderen Eubakterien sicher differenzieren lassen. Zur Entwicklung des Real-Time-PCR-Nachweises von Enterobacteriaceen wurden für die Amplifikation DNA-Sequenzen der für ribosomale Bakterien-DNA codierenden Gene gewählt. Diese drei bakteriellen rRNA-Gene für 16S rRNA, 23S rRNA und 5S rRNA und dazwischenliegende Spacer-Regionen sind zur Differenzierung gut
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geeignet, da sie in ihrer Sequenz sowohl stark konservierte als auch hoch variable Domänen aufweisen. Ebenso ist für ihre Detektion von Vorteil, dass es sich hierbei um sogenannte „multi-copy“ Gene handelt, die in Eubakterien als Bestandteile ribosomaler Operons meist mehrfach vorhanden sind (Lane et al. 1985, Woese 1987). Im Genom von Enterobacteriaceen wie der Typspezies Escherichia coli (Kenerley et al. 1977, Kiss et al. 1977) und Salmonella Typhimurium (Lehner et al. 1984) wurden sieben dieser ribosomalen Operons nachgewiesen. Für andere Bakterienspezies wie den grampositiven Clostridium perfringens (Garnier et al.1991) und Bacillus subtilis (Bott et al. 1984, LaFauci et al. 1986) wurde das Genom mit zehn, für Lactococcus lactis ssp. lactis (Beresford und Condon 1991, Tulloch et al. 1991) mit sechs ribosomalen Operons beschrieben. Üblicherweise wird die Heterogenität ribosomaler DNA-Sequenzen, insbesondere die der für 16S rRNA codierenden Gene, für molekulare phylogenetische Analysen bakterieller Gruppen genutzt (Wilson et al. 1990, Cilia et al. 1996, Klappenbach et al. 2001). Es wird aber auch von Wissenschaftlern wie Fox et al. (1992) in ihrer Publikation „How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity“ und von Christensen et al. (2007) kritisch diskutiert, inwieweit es ausreichend sei, die Identität einer Spezies aufgrund von Übereinstimmungen der 16S rRNA-Sequenzen sicher zu bestimmen. Die Autoren weisen darauf hin, dass für genetische Bestimmungen die Möglichkeit zusätzlicher sensitiverer Methoden wie die der DNA-DNA-Hybridisierung herangezogen werden können und prinzipiell auch phänotypische Analysen erstellt werden sollten. In einer Studie zum Nachweis und zur Differenzierung von Legionella-DNA aus klinischen respiratorischen Proben mittels Real-Time-PCR im LightCycler®
amplifizierten Rantakokko-Jalava und Jalava (2001) Fragmente der 16S rDNA als Zielsequenz. Sie bevorzugen die 16S rDNA gegenüber der 5S rDNA als wesentlich variablere Region und damit besser geeignete Sequenz mit Primerbindungsstellen für Genus- und Spezies-spezifische PCR-Anwendungen. Das erste beschriebene PCR-System zur Detektion des Genus Legionella aus ökologischen Wasserquellen basiert auf der Amplifikation von 5S rDNA, detektiert aber außerdem einige Spezies der Gattung Pseudomonas (Mahbubani et al. 1990). Auch im Zusammenhang mit der Entwicklung eines Legionella-Nachweissystems für human- und veterinär-medizinische Urinproben mittels 5S rDNA-PCR wurden Spezifitätsprobleme berichtet (Maiwald et al. 1995). Lehner et al. (2004) nutzten die 16S rDNA-Sequenz zur Identifizierung und Differenzierung verschiedener Enterobacter sakazakii-Isolate untereinander sowie zur Unterscheidung von Enterobacter sakazakii gegenüber anderen nah verwandten Enterobacteriaceae-Spezies wie Enterobacter cloacae. Sie isolierten die pathogenen
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Stämme aus Lebensmitteln inklusive Säuglingsnahrung, klinischen Patientenproben und Proben aus lebensmittelproduzierenden Betrieben und untersuchten sie mittels PCR und Sequenzanalysen. Iversen et al. (2006) beschrieben die vier phylogenetischen Clustergruppen von Enterobacter sakazakii ebenfalls anhand genotypischer Analysen partieller 16S rDNA-Sequenzen. Sie untersuchten 189 aus Lebensmitteln und klinischen Proben isolierte Stämme und definierten eine neue 16. Biogruppe neben den bis dahin bekannten 15 Biogruppen (Farmer et al.1980) der Spezies. Nakano et al. (2003) beschreiben die Entwicklung einer Konsensus-PCR zur Detektion der Familien Vibrionaceae und Enterobacteriaceae mit Ausnahme von Proteus mirabilis anhand von Sequenzabschnitten ihrer 16S rRNA-Gene. Der qualitative PCR-Nachweis dient der Untersuchung von Lebensmitteln und führt bei positivem Ergebnis zur Amplifikation eines ca. 420 bp großen DNA-Fragments. Die Autoren weisen darauf hin, dass die eingesetzten Primer an hoch konservierten bakteriellen DNA-Sequenzen binden und dadurch das Risiko besteht, Spuren bakterieller DNA in Taq-DNA-Polymerasen zu detektieren. Zur Vermeidung solcher falsch positiven Ergebnisse wird angegeben, ein relativ kurzes PCR-Protokoll mit 30 Amplifikationszyklen durchzuführen. Hunt et al. (2006) erläutern in einer vergleichenden Untersuchung von 23S rRNA- und 16S rRNA-Genbanken, dass 23S rRNA-Gene mit gleichbleibender Funktion, universellem Vorkommen sowie konservierten und variablen Regionen dieselben Vorteile wie 16S rRNA-Gene bieten. Darüber hinaus verweisen die Autoren auf die Sequenzlänge der für 23S rRNA codierenden Gene, die im Vergleich zu 16S rRNA-Genen wesentlich umfangreicher sind, charakteristische Insertionen und Deletionen sowie größere Sequenzvariationen (Ludwig und Schleifer 1994, Antón et al. 1999) und damit verbundene Vorteile von 23S rRNA- gegenüber 16S rRNA-Genen für Untersuchungen zur Diversität. Außer den für rRNA codierenden Sequenzen werden oft auch die DNA-Spacer-Regionen zwischen den rRNA-Genen für PCR-Analysen von Genera, Spezies und Subspezies der Bakterien herangezogen. Den Spacer zwischen 16S rRNA- und 23S rRNA-Genen nutzen Clementino et al. (2001) für Untersuchungen von Enterobacter cloacae-Stämmen und Xiong et al. (2006) zur Differenzierung 34 verschiedener Spezies der Gattung Mycobacterium. Jado et al. (2006) identifizieren Rickettsia-Spezies durch partielle PCR-Amplifikation des Spacer zwischen 23S rRNA- und 5S-rRNA-Genen und Grattard et al. (2006) analysieren genetische Abweichungen innerhalb der Gattung Legionella anhand von Sequenzierungen der DNA-Spacer-Region. In der vorliegenden Arbeit wurden codierende DNA-Sequenzen für 23S rRNA, 5S rRNA sowie dazwischen liegende Spacer von diversen Bakterienstämmen
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untersucht und ausgewertet. Als geeignete DNA-Sequenz zur Detektion der Familie Enterobacteriaceae mittels Amplifikation in der Real-Time-PCR wurde ein Fragment der für 23S rRNA codierenden Sequenz ermittelt. Die generierten forward- und reverse-Primer des Nachweissystems hybridisieren beide innerhalb der für 23S rRNA codierenden DNA-Sequenz, wobei im 5’-Bereich der reverse-Primer die letzten sechs Basen im Spacer zwischen 23S rDNA und 5S rDNA binden. Das in der PCR mit DNA von Escherichia coli DSM 30083 entstehende Amplifikat hat eine Größe von 225 bp. Mit dem entwickelten PCR-System konnte eine Spezifität von 100 % gegenüber konventionellen mikrobiologischen Verfahren erreicht werden. Überprüft wurde die Spezifität mit 92 taxonomisch definierten Bakterienstämmen sowohl der Familie Enterobacteriaceae als auch anderer, nicht zu amplifizierender Gruppen und mit Präparationen aus 72 angereicherten Lebensmittelproben unterschiedlicher Produktgruppen und Matrices. Es wurden keine falsch negativen oder falsch positiven Ergebnisse der Real-Time-PCR im Vergleich mit Horizontalverfahren erzielt. Die DNA aus 55 taxonomisch definierten Stämmen von 26 Gattungen der Familie Enterobacteriaceae wurde spezifisch nachgewiesen, 36 Stämme anderer, nicht zu detektierender Bakteriengruppen wurden nicht amplifiziert. Auch die Gattung Plesiomonas wurde in der PCR nicht detektiert, was der Spezifität mikrobiologischer Methoden entspricht. Dennoch ist hierbei zu berücksichtigen, dass der Genus Plesiomonas, vertreten durch die Spezies Plesiomonas shigelloides, genetisch zu den Enterobacteriaceen gehörend klassifiziert wird. Während Plesiomonas shigelloides aufgrund seiner Oxidase-Aktivität mikrobiologisch nicht zur Familie der Enterobacteriaceae gehört, wird die Spezies wegen Sequenzübereinstimmungen in der für 16S rRNA codierenden DNA molekularbiologisch den Enterobacteriaceen zugeordnet (Martinez-Murcia et al. 1992, Ruimy et al. 1994). In den Sequenzalignments, die innerhalb der vorliegenden Arbeit erstellt wurden, lässt sich erkennen, dass in der DNA-Sequenz für 23S rRNA, 5S rRNA und dem dazwischen liegenden Spacer Übereinstimmungen von Plesiomonas shigelloides mit den übrigen 33 Enterobacteriaceen-Sequenzen bestehen, eine noch höhere Übereinstimmung aber mit den DNA-Sequenzen der Gattungen Vibrio und Aeromonas vorliegt. Die generierten DNA-Daten führten in der Konsequenz zur Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems für den Nachweis von Enterobacteriaceen ohne Detektion der Gattung Plesiomonas in Übereinstimmung mit dem Nachweis der Familie Enterobacteriaceae bei Anwendung konventioneller Methoden. Bei Untersuchungen von Lebensmitteln auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceen ist grundsätzlich zu berücksichtigen, dass in den zu
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überprüfenden Proben neben den gesuchten Mikroorganismen auch Begleitkeime in einer vielfachen Größenordnung vorhanden sein können. Erfolgt der spezifische Bakteriennachweis durch Anwendung der PCR, kann sich der Einfluss von Fremd-Bakterien und damit von Fremd-DNA negativ auf die Sensitivität auswirken, es kommt mitunter zur Inhibition der PCR durch „nontarget DNA“ (Lienert und Fowler 1992, Tebbe und Vahjen 1993, Alvarez et al. 1994, Wilson et al. 1994). Für die vorliegende Arbeit wurde die Spezifität des entwickelten Systems bei Vorhandensein von Fremd-DNA in der Real-Time-PCR überprüft. PCR-Reaktionen mit je 5 fg, 50 fg, 500 fg, 5 pg, 50 pg und 500 pg genomischer DNA des Enterobacteriaceen-Stammes Enterobacter sakazakii ATCC 51329 als Template und 2 fg Interner Amplifikationskontrolle wurden in einem Parallelansatz jeweils 3 ng genomischer DNA von Vibrio fluvialis ATCC 33809 als Fremd-DNA zugegeben. Die im Überschuss eingesetzte „nontarget DNA“ entspricht einer Menge von etwa 6 x 105 Genomäquivalenten von V. fluvialis. Im Ergebnis konnte gezeigt werden, dass sich die Ziel-DNA trotz Anwesenheit zusätzlicher Nukleinsäuren einer möglichen Begleitflora mit unverändert hoher Sensitivität nachweisen lässt. Selbst bei einer 6 x 105-fachen Menge Fremd-DNA (3 ng) gegenüber einer minimalen Menge von nur 5 fg zu detektierender DNA wurde die Enterobacteriaceae-DNA mit dem entwickelten PCR-System mit gleicher Spezifität und Sensitivität amplifiziert wie im Reaktionsansatz ohne Fremd-DNA. Tatsächlich zeigte sich in den parallel zur Real-Time-PCR durchgeführten mikrobiologischen Untersuchungen der 72 Lebensmittelproben, dass mehrfach Begleitkeime vorhanden waren. In den entsprechenden Proben kam es nach Ausplattieren auf festem Nährmedium und anschließender Bebrütung zum Wachstum von Nicht-Enterobacteriaceen. Üblicherweise ist in käse- und milchhaltigen sowie in pflanzlichen Lebensmitteln mit einer ausgeprägten Begleitflora von Laktobazillen zu rechnen und auch in Fisch und Gewürzen sind häufig zahlreiche Keime unterschiedlichster taxonomischer Gruppen vertreten. So waren die Lebensmittelproben Pizza Schinken Champignon, Blätterteig Schinken Käse, Himbeer-Käse-Sahnetorte, Lachs und Gemüse und Lachsforelle deutlich mit Begleitkeimen überwachsen. In diesen Fällen wurden die Proben ausverdünnt und nocheinmal ausplattiert. Bei Vorhandensein einer sehr hohen Begleitflora kann es beispielsweise durch Laktobazillen zur Übersäuerung des Mediums und damit zur Minderung des Wachstums von Enterobacteriaceae kommen. Die Folge kann ein falsch negatives Ergebnis in der mikrobiologischen Untersuchung sein. Die Anreicherung der Keime vor dem Ausplattieren in einem Selektivmedium nach vorheriger unselektiver Voranreicherung ist also besonders wichtig. Unabhängig von Begleitkeimen in den Lebensmittelproben und unabhängig von den unterschiedlichsten Lebensmittelmatrices kam es in der Real-Time-PCR zu keinen
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falschen Ergebnissen. Die Enterobacteriaceen wurden mit hoher Sensitivität und Spezifität gegenüber der Begleitflora detektiert. In den Untersuchungen zur Sensitivität konnte gezeigt werden, dass mit dem entwickelten Real-Time-PCR-System der Nachweis von nur einem bakteriellen Genomäquivalent möglich ist. Durchgeführt wurden die Sensitivitätstests mit den Enterobacteriaceae-Stämmen Serratia marcescens DSM 1636, Enterobacter sakazakii ATCC 51329, Proteus mirabilis DSM 788 und Escherichia coli DSM 1576 (Kap. III, Abb. 3.11, 3.12 und 3.13). 4.6 Ausblick Molekularbiologische Real-Time-PCR-Methoden für den Nachweis bakterieller Kontaminationen in Lebenmitten werden sich weiterhin gegenüber konventionellen mikrobiologischen Verfahren behaupten. Die Möglichkeiten schneller, spezifischer und sensitiver diagnostischer Anwendungen sowie ein großes Potential zur Automatisierbarkeit sind entscheidende Parameter, die die Entwicklung von PCR-Systemen für die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln durch intensive Forschung kontinuierlich vorantreiben. In der Entwicklung eines Real-Time-PCR-Nachweissystems sollte grundsätzlich eine Interne Amplifikationskontrolle implementiert werden, die in jedem Reaktionsansatz zeitgleich mit der zu detektierenden DNA amplifiziert wird, um falsch negative Ergebnisse ausschließen zu können. Idealerweise erfolgt die Amplifikation von Ziel- und Kontroll-DNA durch Elongation von Primern identischer Sequenz, die in einer kompetitiven PCR miteinander konkurrieren. Ebenso müssen falsch positive Ergebnisse in der diagnostischen PCR ausgeschlossen werden, indem eine höchst mögliche Stringenz der Amplifikationsreaktion erreicht wird und Kontaminationen durch Nukleinsäuren ausgeschlossen werden. Insbesondere bei Entwicklung von Konsensus-PCR-Reaktionen sollte immer der Einsatz kontaminationsfreier DNA-Polymerasen, Reagenzien und sonstiger Materialien sichergestellt werden. Erfolgt der Nachweis von Bakterien durch Amplifikation ihrer DNA mittels PCR, können sowohl lebende als auch tote Mikroorganismen detektiert werden. Wenn, je nach Applikation, der Nachweis ausschließlich lebender Keime erwünscht wird, so ist in diesem Fall die Entwicklung einer RT-PCR zu bevorzugen. Bei dem in seiner Durchführung gegenüber der PCR aufwändigeren und kostenintensiveren Verfahren ist die Zielsequenz ein mRNA-Molekül, das mittels katalytischer Aktivität einer Reversen Transkriptase zunächst revers in DNA transribiert und im zweiten Schritt durch eine PCR-Reaktion amplifiziert wird. mRNA-Moleküle sind sehr instabil und werden nach Absterben einer Bakterienzelle schnell abgebaut. Es ist also davon
IV Diskussion
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auszugehen, dass bei Durchführung einer RT-PCR im Gegesatz zur PCR nur Nukleinsäuren lebender Zellen nachgewiesen werden. Oftmals werden für den Nachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln quantitative Ergebnisse anstatt qualitativer Ergebnisse zur Feststellung der Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit der Bakterienfamilie gefordert. Gemäß der Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), entsprechend der Internationalen Kommission für mikrobiologische Lebensmittel-spezifikationen (ICMSF), gelten für Lebensmittel häufig Richtwerte von maximal 1 x 102 oder 1 x 103 KbE Enterobacteriaceae/g Lebensmittel und Warnwerte von 1 x 103 oder 1 x 104 KbE/g (Anonymus 2006). Zur Erfassung dieser Richt- und Warnwerte bietet das hier beschriebene Real-Time-PCR-System für den Nachweis von Enterobacteriaceae das Potential für die Weiterentwicklung zur quantitativen Detektion. Bei der Quantifizierungsanalyse mittels Real-Time-PCR werden die so genannten Crossing Points dazu genutzt, die Konzentration einer Ziel-DNA in unbekannten Proben durch Amplifikation zu ermitteln. Der Crossing Point (CP) einer PCR-Reaktion bezeichnet den Zyklus, bei dem die Fluoreszenz der Probe aus dem Hintergrund hervortritt und hängt direkt von der Ausgangskonzentration der DNA ab. Bei geringer Ausgangsmenge der Ziel-DNA werden also mehr Amplifikationszyklen benötigt und der ermittelte CP-Wert liegt höher als bei höherer Ausgangskonzentration und niedrigerem CP-Wert. Um die Konzentration der unbekannten Probe anhand ihres CP-Wertes zu bestimmen, wird eine Standardkurve erstellt, in der die Konzentrationen von Standards gegen die Crossing Points aufgetragen sind. In jedem Fall sollte immer eine Validierung und Standardisierung der Real-Time-PCR-Systeme für den diagnostischen Nachweis bakterieller Kontaminationen in Lebensmitteln erfolgen, um als bevorzugte Alternative gegenüber konventionellen mikrobiologischen Verfahren höchsten Ansprüchen gerecht zu werden.
V Zusammenfassung
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V ZUSAMMENFASSUNG Für den qualitativen Indikatornachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln wurde eine spezifische Real-Time-PCR-Anwendung entwickelt. Nach kultureller Anreicherung der Lebensmittelprobe erfolgt die Durchführung der PCR im LightCycler®. Das entwickelte Nachweisverfahren erreicht gegenüber den konventionellen mikrobiologischen Methoden eine Spezifität von 100 % und führt mit einem zeitlichen Aufwand von maximal einem Tag bei einem Drittel der Zeit für Horizontalverfahren zum zuverlässigen Ergebnis. Überprüft wurde die Spezifität mit 92 taxonomisch definierten Bakterienstämmen sowohl der Familie Enterobacteriaceae als auch anderer, nicht zu amplifizierender Gruppen. Mit hoher Sensitivität ermöglicht der Enterobacteriaceen-Nachweis die Detektion einer einzelnen Bakterienzelle. Er eignet sich für die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln unterschiedlichster Produktgruppen sowie die Überwachung aller kritischen Prozessstufen in lebensmittelproduzierenden Betrieben. Mögliche Gesundheitsge-fährdungen durch Rekontaminationen und unzureichende Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene werden sicher nachgewiesen. Mit 72 Lebensmittelproben verschiedener Produzenten, Kategorien und Matrices wurde die Funktionalität des Nachweises im Vergleich mit den Horizontalverfahren zum qualitativen Nachweis von Enterobacteriaceae überprüft. Die Ergebnisse aller Untersuchungen stimmten mit denen der Mikrobiologie überein, 30 Proben wurden positiv auf das Vorhandensein der Markerorganismen Enterobacteriaceen getestet. Zielmolekül der Real-Time-PCR ist die für 23S rRNA codierende DNA-Sequenz der Enterobacteriaceen. Für das Nachweissystem wurden die forward- und reverse-Primer fw9 und rev10 sowie die Sonden HzFlu und HzRed generiert. Das in der PCR entstehende partielle Amplifikat der 23S rDNA hat eine Größe von 225 bp und wird zeitgleich mit seiner Amplifikation im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler® detektiert. Zum Ausschluss falsch negativer Ergebnisse wurde eine Interne Amplifikationskontrolle entwickelt. In Form einer kompetitiven PCR erfolgt die Amplifikation der Kontroll-DNA zusammen mit der Ziel-DNA mit den gleichen fw9- und rev10-Primern im selben PCR-Ansatz. Detektiert wird die Interne Amplifikationskontrolle während ihrer Entstehung anhand der generierten Sonden IAKRed und HzFlu im Kanal F3/Back-F1 des LightCycler®. In der Entwicklung der Konsensus-PCR kam es zur unerwünschten Amplifikation spezifischer DNA in PCR-Reaktionen ohne Untersuchungsprobe und damit zu falsch positiven Ergebnissen. Es wurde gezeigt, dass es sich hierbei um Amplifikationen kontaminierender DNA in allen getesteten Taq-DNA-Polymerasen diverser Hersteller handelte. Durch enzymatischen Verdau mit DNase I konnte reproduzierbar die vollständige Dekontamination der rekombinanten Taq-Polymerasen erreicht und die Entstehung falsch positiver Ergebnisse ausgeschlossen werden.
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