Metodi elettroforetici. (SSCP, HDA, TGGE e DGGE)

Molecole di DNA a singolo filamento migrano in un gel di poliacrilammide non denaturante in maniera dipendente dalla struttura tridimensionale e quindi della loro sequenza.

Single Strand Conformation Polymorphism

(SSCP)

Fattori da prendere in considerazione per la SSCP

• amplificazione di frammenti corti (150-300 bp)• denaturazione completa• composizione della matrice del gel• composizione del tampone• lunghezza del gel e durata elettroforesi e temp.• concentrazione del DNA• Impossibile predire la mobilità elettroforetica del

SS

Esempi di SSCP

Eterozigoti

Heteroduplex analysis (HDA)

slow

Parametri importanti

• Temperatura dell’elettroforesi• Dimensioni amplificato (100-200 bp)• presenza di glicerolo• RNA-SSCP• matrice del gel• delezioni/inserzioni più facili da visualizzare• Universal Heteroduplex Generator (frammento

sintetico con delezione di 2-5 bp)

Esempio di HDA

F508

Elettroforesi capillare

Analisi di LOH mediante tipizzazione di microsatelliti

Analisi di mutazione per sequenza

Instabilità di microsatelliti

Polimorfismi determinati per sequenza

Normale

Omozigote Mut

Eterozigote Mut

SSCP-CE

Analisi di RFLP

Temperature e Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

(TGGE e DGGE)

Denaturazione

La separazione avviene in base a differenze nella temperatura di fusione delle molecole. La denaturazione causa rallentamento nel gel. Le differenze sono esaltate negli eteroduplex.

Rilevamento di Mutazioni mediante DGGE