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In Vitro Culture Conditions for Maintaining a Complex Population of Human Gastrointestinal Tract Microbiota.

Bong-Soo Kim, Jong Nam Kim, and Carl E. Cerniglia.

Presented by: Mariluz Laverde Manrique. ID: 000151156 Maria Camila Pelaez. ID:000172706

Students 3rd semester Medicine -UPB

MICROBIOTA:

Set of organisms that are generally associated with healthy tissues (skin, mucous membranes, etc.). The human body.

Microorganisms living in these places more or less permanent and in some cases perform specific functions.

The term flora should be abandoned because it refers to plants and microorganisms belong to the protista.

Is more appropiate to use the term microbiota such as skin or intestinal microbiota.

INTESTINAL MICROBIOTA:

The human intestinal microbiota is a complex community composed of at least several hundred different species of bacteria.

Plays a critical role in human health, is very important in:

• Colonization resistance.

• Nutrition.

• Proliferation and differentiation of intestinal mucosal epithelial cells.

• Homeostasis of the immune system.

GROWING CONDITIONS:

Here, is compared the bacterial community in three culture media with different growth supplements:

Brain heart infusion broth (BHI). High-Carbohydrate medium (HCM). Low- Carbohydrate (LCM).

GENERAL OBJECTIVE

The aim of this study is to compare the culture conditions for maintainig a community of fecal microbiota, compared with the development of intestinal microbiota.

MATERIALES Y MÉTODOS

MUESTRA

• Cada muestra fecal fue designada con una letra A- B-C-D

MUESTRAS FECALES

4 hombres

EDAD: 50-60 años

Tiempo utilizado:1 semana

EXTRACCION DE ADN: se basa en cuatro pasos

•Procedimiento de purificación que se da por medio de la lisis celular de glóbulos rojos y nuclear de glóbulos blancos.

• Aislamiento de ADN a partir de glóbulos blancos se utiliza una solución de lisis nuclear.

• Las proteínas celulares son removidas por precipitación de sales.

• El ADN genómico es concentrado y desalinizado por adición de isopropanol.

•Nota: muchas veces se necesita una RNAasa para procedimientos donde se debe eliminar el ARN

MATERIALES Y MÉTODOS

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA(PCR)

Consiste en aumentar un segmento especifico de ADN, donde se utiliza:

• Polimerasas

• Dos cebadores o iniciadores (primers)

• Los DNTp´s (Dexosirribonucleotido trifosfato)

Se debe tomar en cuenta las variaciones de la temperatura en la incubación.

MATERIALES Y MÉTODOS

ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DE DESNATURALIZACIÓN (DGGE):

•Técnica de electroforesis que se utiliza en muestras de ADN, utilizando un gel como la urea.

MATERIALES Y MÉTODOS

• Se emplea para la identificación de mutaciones en la doble cadena.

• La mutación es detectada mediante la comparación entre el patrón electroforético (desnaturalizado) y la muestra original.

PIROSECUENCIA

•Está basada en la secuenciación por síntesis, acoplando la síntesis de DNA a una reacción quimioluminiscente, lo que permite una rápida determinación de secuencias en tiempo real.

• La técnica utiliza cuatro reacciones enzimáticas que tienen lugar en un único tubo en el que se monitoriza la síntesis de la cadena complementaria de DNA, usando como molde DNA de cadena simple.

MATERIALES Y MÉTODOS

UTLIDAD DE LAS TECNICAS EN EL ESTUDIO:

DGGE: Fue utilizado para monitorear los cambios y diferencias en la comunidad de bacterias tomadas de las muestras fecales.

PCR: Este proporciono los datos numéricos de abundancia para la microbiota fecal.

PIROSECUENCIA: Este fue usado para determinar la abundancia y biodiversidad de la comunidad bacteriana en la muestra fecal y como fue su desarrollo bajo diversas condiciones.

EXTRACCIÓN DE ADN: Para la separación de DNA genómico y además de esto obtener una muestra suficiente de las heces fecales.

RESULTADOS

•El crecimiento de la microbiota intestinal mostró OD máxima a las 18 horas en LCM, BHI; mientras que el máximo OD en el medio BHI fue antes en el período de incubación. El total de gen bacteriano 16rRNA aumentó con el tiempo.

•El número de bandas y grupos dominantes eran diferentes en cada medio: en BHI y LCM había un número relativamente similar de bandas (20-22) y en HCM habían menos bandas (14).

A. Comparación de los distintos medios y el efecto del sobrenadante fecal:

•Los Bacteroides fueron más dominantes que los firmicutes en el cultivo in vitro después de 18 horas que en el tiempo cero (el predominio de Bacterioides podría afectar el crecimiento de otros phyla).

RESULTADOS

B. Optimización de la concentración del inóculo:

•La concentración del inóculo de las heces es un factor significativo en las condiciones de cultivo in vitro, porque el número y la diversidad de las bacterias pueden afectar el crecimiento.

•Los análisis de los perfiles, muestran que el 1%, 2% o 3% de las culturas inoculadas son las más similares a las del inóculo original en los individuos C y B.

•La composición de las diferentes comunidades afectan el crecimiento de cada phylum en la microbiota fecal.

RESULTADOS

C. La composición de la comunidad microbiana de inóculo fecal:

•Los phylum dominantes de las muestras de heces de cada persona se mantuvieron en condiciones de cultivo mejoradas; y la abundancia de Firmicutes disminuyó después de 18 horas (72.39%- 44.95%), mientras que los Bacterioidesincrementaron (17.14%- 39.11%)

•Los cambios generales en las muestras cultivadas fueron relativamente similares en todas las muestras; los perfiles de la comunidad de la microbiota del individuo A y C son más similares entre sí que a la del individuo B, tanto en el tiempo cero como después de 18 horas

RESULTADOS

Individuo A

RESULTADOS

Individuo B

Individuo C

DISCUSSION

DISCUSSION

CONCLUSIONS

•The DGGE profiles of culture sample from individual A, shows that the 16srRNA genes of cultural bacteria in low concentration carbohydrate (LCM) increased his proliferation compared with high concentration carbohydrate (HCM) and brain heart infusion (BHI) at 18 hours.

•The inoculum with different concentrations of fecal supernatant and without fecal supernatant didn't present a big difference on metabolic activity of microbiota or on their proliferation.

CONCLUSIONS

•Different numbers of bacteria Bacteroides and Firmicutes were found in different concentrations of inoculum, and growth was different in the same medium; this shows that individuals are unique in their fecal microbiota.

•The culture conditions developed in this investigation, are very important because it opens a new avenue for finding drugs and treatments to regulate and control the composition of our microorganisms.

MARIA CAMILA PELAEZ

MARILUZ LAVERDE MANRIQUE