Técnicas de inmunodetección aplicadas al campo marino

cAPÍTULO xviii

TécnicAS de inMUnOdeTección APLicAdAS AL cAMPO MARinO

sIlvIa lorEnzo-abaldE, danIEl PérEz, JUan Calvo, EvangElos sPyrakos y áfrICa gonzálEz-fErnándEz

Área de Inmunoloxía, Facultade de Bioloxía, Edificio de CC. Experimentais, Universidade de Vigo

1. ReSUMen

el uso de anticuerpos (Acs) en técnicas de detección aplicadas al campo marino permite identificar de forma específica organismos o moléculas de interés. entre las técnicas más empleadas se encuentran:

1) Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (eLiSA).2) inmunofluorescencia (if).3) Western Blot (WB).

La descripción de estos métodos, con ejemplos de aplicaciones concretas, es el objeto del presente capítulo.

La técnica más conocida y extendida, debido principalmente a su simplicidad, es el eLiSA. Permite detectar y/o determinar la concen-tración de una molécula (o antígeno) con alta sensibilidad. Se inmovi-liza el antígeno a detectar o los Acs específicos sobre el fondo de un pocillo de plástico, y, posteriormente se lleva a cabo la detección con Acs unidos a enzimas, mediante una reacción colorimétrica. esta téc-nica puede aplicarse en la identificación de especies, para evitar frau-des, para detectar sustancias tóxicas o prohibidas, etc.

La immunofluorescencia usa Acs unidos a fluorocromos y suele aplicarse para la detección de organismos enteros. Muestras de agua de mar conteniendo larvas de moluscos, dinoflagelados... pueden ser visualizadas bajo microscopio de fluorescencia o confocal, o analiza-das de forma automática, con un citómetro de flujo.

206 MéTOdOS y TécnicAS en inveSTiGAción MARinA

el Western blot consiste en la identificación de una proteína concreta en una muestra compleja, tras una separación electroforética en gel de poliacrilamida y posterior transferencia a membrana. el revelado con anticuerpos específicos conjugados a enzimas permitirá identificar la proteína de interés en la membrana. esta técnica permite diagnosticar enfermedades y adulteraciones en productos marinos, localizar una proteína en un tejido, identificar y/o diferenciar especies marinas, etc.

Las técnicas de inmunodetección pueden ser utilizadas con éxito para identificar especies sin necesidad de conocimientos taxonómicos previos, incluso en productos procesados, cocidos o subproductos que carecen de caracteres morfológicos.

2. eLiSA

La necesidad de identificar o detectar de forma rápida y específica diversos compuestos ha llevado a que las técnicas de inmunodetección utilizando Acs se estén aplicando en muchos campos científicos. de todas ellas, el eLiSA es quizás el método más empleado debido a su sencillez, sensibilidad y versatilidad. Mediante esta técnica se están llevando a cabo controles de procedencia de muchos productos, con el fin de evitar el fraude o la comercialización de especies protegidas que, una vez procesadas, no pueden ser identificadas morfológicamente (lorEnzo-abaldE et al., 2006).

2.1. dEsCrIPCIón dEl método

hay distintos tipos de eLiSAs (competitivo, sándwich, directo e indirecto) que se realizan utilizando microplacas de plástico, antíge-nos y Acs marcados con una enzima (como la peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) que reaccionará con un sustrato incoloro o cromógeno (ejemplos: ABTS, TMB, dAB) produciendo un produc-to coloreado (fig. 1). La lectura de la señal se realiza en un espectro-fotómetro equipado con un sistema de filtros que permite la lectura simultánea de todos los pocillos de la placa a una longitud de onda determinada. en los últimos años se han desarrollado técnicas seme-jantes al eLiSA, de mayor sensibilidad, utilizando agentes quimiolu-miniscentes o fluorescentes, así como el marcaje del ligando o antíge-no en vez del anticuerpo (enzimoinmunoAnálisis o eiA). Las técnicas de eLiSA son muy sensibles, detectando entre picogramos-nanogra-mos de sustancia en una muestra.

TécnicAS de inMUnOdeTección APLicAdAS AL cAMPO MARinO 207

fIgUra 1. Procedimiento para calcular la concentración intracelular de ácido domoico (Ad) en células de Pseudonitzschia spp. mediante un eLiSA competitivo. hRP: peroxida-

sa de rábano picante. foto Pseudonitzschia spp.: e. Spyrakos.

dos ×

500 μL

–0,0

Absorbancia 450 nm

ndar A

1) ELISA directo: Los pocillos se recubren con la solución donde se encuentra el antígeno a detectar, y a continuación, la placa se incu-ba con Acs específicos frente a dicho antígeno, conjugados a una enzi-ma. Tras lavar para eliminar aquellos anticuerpos no unidos, se lleva a cabo la reacción colorimétrica. La coloración que aparece es propor-cional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.

2) ELISA indirecto: Al igual que en el caso anterior, los pocillos se recubren con el antígeno, pero primero se incuban con Acs primarios no marcados específicos frente al antígeno, y, a continuación, después de lavados, la placa se incuba con Acs secundarios frente a los prima-rios, conjugados a una enzima. Presenta mayor sensibilidad que el en-sayo directo, ya que a cada Ac primario se le pueden unir varios Acs secundarios, amplificando la señal. este ensayo es útil para la cuanti-ficación de Acs en una muestra.

3) ELISA tipo «sándwich»: esta variante utiliza dos tipos de Acs, ambos específicos frente al antígeno. Los pocillos se recubren con Acs primarios específicos. Tras bloquear y lavar la placa, se incuba con la muestra donde se encuentra el antígeno a detectar, y, tras suce-sivos lavados, se incuba con Acs conjugados a enzimas dirigidos frente a un epítope diferente del antígeno (sándwich directo), o sin conjugar, seguido de otra incubación con Acs secundarios marcados (sándwich indirecto). esta variante presenta gran especificidad y es muy útil para la detección y cuantificación de moléculas grandes.

4) ELISA competitivo: es el más sensible y versátil. en este caso, antígeno o anticuerpo se adhieren al plástico y va a existir una compe-tencia por aquellos que estén en solución, marcados o no con enzima. como ejemplo, los pocillos de la placa se recubren con antígenos co-nocidos conjugados a proteínas inertes. Posteriormente se añade una mezcla de muestra problema + una cantidad conocida y limitante de anticuerpo específico marcado con enzima. en el proceso de lavado se retiran aquellos anticuerpos que reconocen al antígeno en forma solu-ble y por tanto la señal detectada en el pocillo será inversamente pro-porcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra. es una técnica muy útil para la detección y cuantificación de moléculas pe-queñas.

en todos los tipos de eLiSA es necesario incluir controles, tanto negativos (muestra donde la sustancia a detectar está ausente), como positivos (muestra con cantidades conocidas de la sustancia a detec-tar). Para que el ensayo sea cuantitativo deben incluirse diluciones se-riadas de una muestra con concentración conocida, para realizar una curva estándar donde interpolar los datos de las muestras. Para evitar

uniones inespecíficas se requiere el bloqueo de las placas con una pro-teína inerte como albúmina sérica bovina o caseína.

entre cada paso, la placa se lava con una solución tamponada sali-na que contenga una baja concentración de un detergente suave (ej. PBS 0,001% Tween), para eliminar todas las moléculas no unidas de modo específico.

2.2. UtIlIzaCIón

el uso de la técnica de eLiSA en el campo marino es muy amplio. Se ha empleado en programas de monitorización de calidad del agua para la detección de diferentes patógenos como bacterias, virus, hon-gos y parásitos protozoarios (sChlotEr et al., 1995). Gracias a la ele-vada sensibilidad de la técnica, y capacidad de procesar un gran nú-mero de muestras, es útil en el estudio de enfermedades víricas y bacteriológicas de peces moluscos marinos y cetáceos, así como para estudios de reproducción de peces y moluscos (kang et al., 2003). desde hace años se ha utilizado en estudios de procesos bioquímicos oceánicos y costeros y en la detección y cuantificación de especies de fitoplancton. Algunos eLiSAs permiten detectar la presencia de de-terminadas microalgas nocivas y toxinas marinas (garEt et al., 2010), lo cual tiene gran utilidad para la industria de la acuicultura y protec-ción de la salud pública. en el campo de las toxinas marinas es funda-mental encontrar métodos alternativos al bioensayo en ratón; en las últimas décadas se están desarrollando inmunoensayos enzimáticos. en la mayoría de los casos los eLiSAs pueden ser aplicados en varias matrices, incluyendo muestras de agua, extractos de algas o muestras biológicas (mariscos, líquidos corporales...). Un buen ejemplo del uso de esta técnica es la reciente validación de un eLiSA como método oficial para la detección de ácido domoico (toxina marina de la cate-goría de las amnésicas) como alternativa al método de bioensayo en ratón. Actualmente se encuentran ya comercializados diversos eLi-SAs para toxinas marinas (Tabla 1).

tabla 1Kits de ELISA comerciales para toxinas marinas

TOxinASefecTO/

cATeGORÍA*KITS ELISA DISPONIBLES

PRinciPALeS MicROALGAS

PROdUcTORAS

Saxitoxina y relacionadas

Paralizantes (PSP)/grupo saxi-toxina

- Ridaserren, (R-Biopharm, darmstadt, Germany)

- Abraxis LLc, (Warmins-ter PA, USA)

Alexandrium spp. y Gymnodinium catenatum

Ácido domoico

Amnésicas (ASP)/grupo ácido domoico

- Biosense Laboratories (Bergen, norway)

Pseudonitzschia spp.

Ácido ocadaico y derivados

diarreicas(dSP)/grupo ácido ocadaico

- UBe industries, Ltd, (Tokyo, japan)

- Rougier Bio-Tech, (Ltd of Montreal, canada)

Dinophysis spp. y Prorocentrum spp.

Yesotoxina Grupo yeso-toxina

Protoceratium reticulatum, Lingulodinium polyedrum y Gonyaulax spinifera.

Brevetoxina y análogos

neurotóxicas(nSP)/grupo breve-toxina

Karenia brevis

* PSP: Paralytic Shellfish Poisoning, ASP: Amnesic Shellfish Poisoning, dSP: diarrhetic Shellfish Poisoning, nSP: neurotoxic Shellfish Poisoning.

2.3. ElIsa: EJEmPlo dE aPlICaCIón

el ácido domoico es una ficotoxina amnésica, producida principalmen-te por varias especies de diatomeas del género Pseudonitzschia. Los sínto-mas de las toxinas amnésicas incluyen vómitos, diarrea, y en casos más gra-ves pérdida de memoria, desorientación, e incluso el coma o la muerte.

Un método oficial para la detección y cuantificación de ácido do-moico y estandarizado por la Association of Official Analytical Chemists (AOAc, 2006), se basa en un ensayo de eLiSA tipo competitivo (fig. 1). Toxina conjugada a proteína es depositada en un pocillo y la toxina presente en las muestras problema compite por la unión con el anticuerpo específico frente a la toxina, que está conjugado a una en-zima (peroxidasa).

3. inMUnOfLUOReScenciA

La técnica de inmunofluorescencia suele emplearse para la identi-ficación de organismos, células o tejidos. cuando la identificación morfológica a microscopía óptica y electrónica se ve dificultada, bien por el tamaño del organismo, por tener escasos caracteres específicos o por la complejidad de la muestra, se necesita recurrir a técnicas al-ternativas como es el uso de anticuerpos específicos marcados con fluorocromos. Además, el uso combinado de varios anticuerpos, cada uno marcado con un fluorocromo diferente (que emita en verde, ama-rillo, rojo...) hace que la inmunofluorescencia sea muy versátil y per-mita identificar varios marcadores de forma simultánea.

en esta técnica se emplean Acs conjugados a fluorocromos, sustan-cias que se excitan a una determinada longitud de onda y emiten a otra, pudiendo ser detectado por filtros adecuados. Así se pueden marcar or-ganismos o moléculas de forma fluorescente, pudiendo visualizarlas bajo microscopio de epifluorescencia, confocal o, si se trata de células individualizadas en solución, mediante citometría de flujo.

hay dos tipos de inmunofluorescencia:

1) Directa: en este caso el anticuerpo (normalmente monoclo-nal) ya está marcado con el fluorocromo y puede incubarse directa-mente con la muestra, con lavados posteriores para eliminar anticuer-pos no unidos. en otras ocasiones el anticuerpo está conjugado a biotina y requiere una incubación adicional con avidina o estreptavi-dina marcada con un fluorocromo.

2) Indirecta: La muestra se incuba con anticuerpos primarios es-pecíficos de antígeno no marcados. Tras realizar lavados para eliminar aquellos anticuerpos no unidos, se añaden anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos que reconocen los primarios (suelen ser de otra especie: por ejemplo, anticuerpos policlonales de conejo frente a anticuerpos de ratón). esta técnica permite amplificar la señal, ya que pueden unirse varios anticuerpos secundarios.

Uno de los fluorocromos más utilizados en aplicaciones marinas es el isocianato de fluoresceína (fiTc) que emite a 520 nm (verde), ya que la clorofila emite autofluorescencia en la banda del rojo. Para evi-tar enmascaramientos de señal en el estudio de algas debido a su auto-

fluorescencia suelen requerirse tratamientos previos con metanol (Ca-rrEra et al., 2010). La fijación de las muestras también puede condicionar el éxito de la inmunofluorescencia. fijadores como el for-mol o glutaraldehído pueden alterar el reconocimiento del antígeno (PérEz et al., 2009), y deben utilizarse alternativas como el uso de muestras frescas o congeladas. Otros condicionantes como el tiempo de incubación, permeabilización o no de las muestras, y la temperatu-ra, son muy importantes en esta técnica. en general, trabajando con células vivas se deben incubar a 4 ºc para reducir su actividad meta-bólica y evitar fenómenos de internalización proteica.

Una vez realizada la tinción, la muestra puede ser visualizada directa-mente bajo un microscopio con un módulo de epifluorescencia, un confo-cal o un citómetro de flujo. La elección del fluorocromo viene condicio-nada por la disponibilidad de filtros del microscopio y por el nivel de solapamiento cuando se analizan varios fluorocromos simultáneamente.

cuando el tamaño de la partícula a detectar (alga, larva, célula...) es inferior a 50-100 µm, y se encuentra en solución en un número ele-vado (miles por mililitro) se puede emplear la citometría de flujo. con-siste en hacer pasar la muestra por un capilar muy fino sobre el que incide un láser, lo que permite detectar cada evento y conocer su ta-maño, complejidad y fluorescencia. La incidencia del láser sobre la partícula marcada excita al fluorocromo, y la luz emitida en un ángulo de 90 ºc es recogido por detectores. con el fin de analizar varias fluo-rescencias de forma simultánea, el citómetro emplea cristales dicroi-cos consecutivos que filtran la luz a distintas longitudes de onda, per-mitiendo detectar desde 4 a incluso 15 colores en los citómetros más sofisticados. este aparato es el idóneo para el análisis de microalgas (barrEIro et al., 2006; CarrEra et al., 2010).

en el caso de partículas más grandes es posible utilizar el flowcAM. este aparato se asemeja al citómetro, pero sus capilares permiten anali-zar elementos de hasta 2 mm, así como realizar fotos individuales de cada evento. esto permite estudiar una muestra compleja, por ejemplo de plancton, fotografiar todos sus componentes por debajo de un tama-ño determinado, y cuantificar aquel organismo que interese mediante el uso de anticuerpos específicos marcados con fluorocromos.

3.2. UtIlIzaCIón

La inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos frente a un organismo es una técnica sencilla y rápida que supone una alter-nativa a métodos tradicionales como la microscopía óptica o electróni-

ca. Además no requiere de personal con experiencia en conocimientos taxonómicos y permite analizar muchas muestras simultáneamente. esta técnica se utiliza para diagnosis (ej., cuantificación de virus en peces mediante citometría), para la identificación de organismos ma-rinos (ej., bivalvos de interés comercial), control de aguas (ej., detec-ción de microalgas causantes de mareas rojas como Gymnodinium nagasakiense, Prorocentrum sp., Alexandrium minutum)

3.3. EJEmPlo dE aPlICaCIón

en nuestro laboratorio hemos desarrollado anticuerpos monoclo-nales específicos que posibilitan la identificación, mediante if, de lar-vas de bivalvos, como mejillón (abaldE et al., 2003; lorEnzo-abal-

fIgUra 2. esquema de inmunofluorescencia indirecta (ifi) aplicada a la identifica-ción de algas marinas y de larvas de mejillón y posterior análisis mediante citometría de

flujo y microscopía de fluorescencia, respectivamente.

MUeSTRA

centrifugación

incubaciones

Anticuerpo primario

citometro de flujo

histograma

células marcadas

descongelación centrifugación

fijación Metanol –20 ºc

centrifugaciónen gradiente congelación

a –80 ºc

Anticuerpo secundariomarcado con fiTcMicroscopio de

epifluorescenciao confocal

Larvas marcadasfluorescentemente

eliminaciónde la clorofila

dE et al., 2005) y de microalgas causantes de mareas tóxicas como Alexandrium minutum (barrEIro et al., 2006; CarrEra et al., 2010). dos anticuerpos dirigidos frente a larvas de mejillón Mytilus galloprovincialis fueron patentados por la Universidade de vigo y la xunta de Galicia y se usan de forma rutinaria por la fundación ceTMAR para la detección de larvas de mejillón en las rías gallegas desde el año 2009 utilizando este método (fig. 2).

el dinoflagelado Alexandrium minutum es una especie causante de mareas rojas tóxicas con una distribución global. Las toxinas que pro-ducen son del tipo paralizante y en la actualidad son varios los estu-dios que se están llevando a cabo para su correcta identificación y de-tección. desde el punto de vista morfológico son semejantes a otros dinoflagelados, lo que hace necesario detectarlos de forma específica. en la figura 2 se muestran los pasos para la detección mediante in-munofluorescencia indirecta del dinoflagelado y de larvas de mejillón y posterior análisis por citometría de flujo y microscopía confocal, respectivamente.

4. WESTERN BLOT

el WB es una técnica que permite identificar y/o cuantificar, median-te el uso de Acs, proteínas específicas en mezclas proteicas complejas. Ofrece información sobre el tamaño de las proteínas y su expresión. Tras una separación electroforética, las proteínas se transfieren a una membrana donde se lleva a cabo la inmunodetección.

Electroforesis

Las proteínas se pueden separar en función de su estructura, carga y tamaño (condiciones nativas), exclusivamente de su carga (isoelec-troenfoque), de su tamaño (electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico o SDSPAGE) o mediante una combinación de estos parámetros (electroforesis en dos dimensiones).

el método electroforético más empleado para la posterior realiza-ción de WB es el SDSPAGE. Se pueden procesar organismos enteros (larvas de mejillón, microalgas…), fragmentos de tejido, fluidos (sue-ro, líquido extrapaleal, hemolinfa…), que se lisan a 4 ºc, en solución tamponada con detergente e inhibidores de proteasas.

La muestra se solubiliza en tampón con un detergente aniónico (SdS) que desnaturaliza las proteínas, dotándolas de carga negativa. Pueden añadirse agentes reductores (ej. b-mercaptoetanol) para elimi-nar puentes disulfuro.

Las muestras, una vez hervidas y en presencia de un colorante y glicerol, se cargan en el gel, incluyendo en un pocillo controles de peso molecular. Terminada la separación, los geles se pueden teñir con coo masie o nitrato de plata, o bien visualizar mediante el empleo de instrumentos, usando métodos fluorescentes o quimioluminiscentes.

Transferencia y bloqueo

Las proteínas del gel se transfieren a una membrana de nitrocelu-losa o de Pvdf. el procedimiento de transferencia se realiza entre dos electrodos situando el gel en contacto con la membrana y se rodean de papel de filtro empapado en tampón de transferencia.

Posteriormente, para evitar que los Acs se unan inespecíficamente a la membrana, ésta se bloquea con proteínas inertes (albúmina bovi-na, gelatina o leche desnatada), y en los lavados se incorporan deter-gentes como el Tween 20. el tiempo de bloqueo depende de la tempe-ratura, pudiendo efectuarse en 1-2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 ºc.

Incubación con Acs

Para llevar a cabo el reconocimiento del antígeno, la membrana se incuba en agitación con Acs primarios específicos (usualmente mono-clonales) frente a la proteína de interés.

Tras una serie de lavados, la membrana se incuba con Acs policlo-nales secundarios que reconocen al primario, conjugados a enzimas (fosfatasa alcalina, peroxidasa) o a fluorocromos.

Visualización

Tras el lavado de la membrana, la señal puede ser detectada inme-diatamente (en el caso de emplear Acs marcados con fluorocromos) o requerir un paso de revelado, añadiendo un sustrato determinado para cada enzima. Otra alternativa es la detección mediante quimiolu-miniscencia o quimiofluorescencia, utilizando sustratos como el lumi-nol, que en presencia de peróxido de hidrógeno provoca emisión de luz, detectable en una película fotosensible.

4.2. UtIlIzaCIón

en el campo marino, la técnica de Western blot está ampliamente difundida como herramienta diagnóstica (ej. detección de virus y bac-terias), para la caracterización de proteínas específicas y estudios de su expresión en peces y moluscos (ejs. vitelogenina y proteína similar a la fibronectina), para analizar diferencias de una misma proteína (ej. miosina) en distintas especies de peces, así como para estudios de de-sarrollo en peces, estudios enzimáticos o análisis de alérgenos.

4.3. EJEmPlo dE aPlICaCIón

Uso de la técnica de Western blot para la caracterización del Ag re-conocido por un Ac monoclonal frente a larvas de mejillón, obtenido en nuestro laboratorio (abaldE et al., 2003).

Gracias a la aplicación de esta técnica, pudo confirmarse que la masa molecular del antígeno reconocido por este anticuerpo es de aproximadamente 100 kda.

fIgUra 3. esquema con los pasos de la técnica de WB blot aplicada a la caracteriza-ción antigénica.

SdS-PAGe

BLOqUeO

LAvAdO

LAvAdO LAvAdO

ReveLAdO

TRAnSfeRenciA

Muestrasa procesar

Tinciónde cOnTROL

incUBAciónAnTicUeRPO PRiMARiO

incUBAciónAnTicUeRPO SecUndARiO

5. RefeRenciAS

abaldE, S. L.; fUEntEs, j., y gonzálEz-fErnándEz, A. (2003): «identification of Mytilus galloprovincialis larvae from the Gali-cian rías by mouse monoclonal antibodies», Aquaculture, vol. 219, pp. 545-559.

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Técnicas de inmunodetección aplicadas al campo marino

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