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第六节 蛋白质的性质和分离、纯化 290 页. 蛋白质的性质 蛋白质相对分子质量的测定 蛋白质的分离纯化 蛋白质的含量测定与纯度鉴定. 一、蛋白质的性质. 酸碱性质 胶体性质 沉淀作用 变性作用与复性作用 蛋白质的颜色反应. (一)酸碱性质节 291 页. 1. 两性解离 ----- 多价离子 2. 蛋白质的等电点 P I---- 在等电点时溶解度最低。表 7 - 2 、 7 - 3 3. 蛋白质等离子点:在没有其它盐类干扰时,蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的 pH 称为。它是蛋白质的一个特征常数。 - PowerPoint PPT Presentation
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第六节 蛋白质的性质和分离、纯化 290 页
蛋白质的性质蛋白质相对分子质量的测定蛋白质的分离纯化蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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一、蛋白质的性质
酸碱性质胶体性质沉淀作用变性作用与复性作用蛋白质的颜色反应
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(一)酸碱性质节 291 页
1. 两性解离 ----- 多价离子2. 蛋白质的等电点 PI---- 在等电点时溶解度最低。表 7 - 2 、 7 - 33. 蛋白质等离子点:在没有其它盐类干扰时,蛋白质质子供体基团
解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的 pH 称为。它是蛋白质的一个特征常数。
4. 蛋白质电泳 ----- 用于蛋白质的分离鉴定。
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(二)蛋白质的胶体性质 299 页
1. 蛋白质溶液是胶体溶液(分散相质点: 1-100nm )2. 维持蛋白质的胶体系统稳定的因素
①1 - 100nm 大小的质点在动力学上是稳定的 .
② 某一 pH 下质点带有同种电荷,互相排斥。可构成双电层
③ 质点能与溶剂(水)形成水化层,相互间不易靠拢。
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(三)蛋白质的沉淀 当改变稳定蛋白质胶体溶液的条件时,稳定性就被破坏,
蛋白质分子相聚集而从溶液中析出,这种现象称为蛋白质的沉淀作用。
可逆沉淀与不可逆沉淀
带正电荷的蛋白质
脱水作用
OH-
H+
在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
脱水作用
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒聚集而沉淀
带负电荷的蛋白质
图 3- 10 蛋白质的沉淀作用
+ +
++
++ +
+ +
++
++ +
--
-
-----
--
-
-----
OH-
H+
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沉淀蛋白质的方法
等电点沉淀 ( 可逆,不变性 ) 强酸碱沉淀 ( 不可逆 ): 蛋白质的盐析 ( 可逆 , 不变性 ) : 有机溶剂沉淀蛋白质 ( 可逆或不可逆 ): 乙醇、丙酮或甲醇。 重金属盐和生物碱剂沉淀蛋白质(变性) Hg2 +、 Ag2 +
单宁酸、苦味酸。 加热沉淀蛋白质(变性) :
盐析、等电点、有机溶剂沉淀蛋白可用于蛋白质的分离纯化
制豆腐:加热,点盐卤( MgCl)
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(四)蛋白质的变性与复性 233 页
1. 蛋白质变性作用:
变性
复性
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可逆变性:三、四级结构被破坏。 不可逆变性:二、三、四均被破坏。 蛋白质只有在比较温和的条件下才倾向于稳定。温和条件指的是:温度为 0℃~40℃ , pH 范围为 5.5~9.0 , 没有有机溶剂。
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2. 蛋白质的复性
不是所有的变性蛋白都能复性。大部分蛋白质变性后不能恢复其原有的各种性质
复性后的蛋白质多数不能完全恢复活力。
变性
复性
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3. 导致蛋白质变性的因素
物理因素 有高温、高压、超声波、剧烈振荡、搅拌、 X
射线和紫外线等; 化学因素 强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐
( Hg2 +、 Ag+ 、 Pb2 +等)、三氯乙酸、浓乙醇等都能蛋白质变性。
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4. 常用的变性剂
① 尿素:与多肽主链竞争氢键;增加非极性侧链在水中的溶解度,从而降低疏水相互作用。 8mol/L 尿素
CC
CN NH H
HH
O
OO蛋白质肽链
尿素分子
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②十二烷基硫酸钠( sodium dodecyl sulfate SDS )
破坏蛋白质分子内的疏水相互作用,使非极性基团暴露于介质中。并可以负离子形式与松散的肽链结合。
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5. 变性蛋白质的特点 ① 生物活性丧失:② 某些物理化学性质改变:
易与相应的试剂起化学反应;溶解度降低,易形成沉淀析出;结晶能力丧失;分子不对称性加大;粘度增加;紫外吸收光谱有所改变;肽键易被酶水解和消化。
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(五)蛋白质的颜色反应
蛋白质分子中某些氨基酸的侧链基团和肽键,可发生一些颜色反应。它们可用于某氨基酸的鉴定、蛋白质定性试验和定量测定。
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蛋白质的颜色反应反应名称 主要试剂 颜色 反应基团 有此反应的蛋白质或氨基酸
双缩脲反应 NaOH+ Cu2SO4 紫红 凡含两个或两个以上肽键结构的化合物
所有蛋白质均具此反应
米伦反应
(Mi l l on) HgNO3及 Hg(NO3) 2 红色 酚基 用于鉴定酪氨酸、酪蛋白
黄色反应 浓硝酸及碱 黄色 苯基 用于鉴定苯丙氨酸和酪氨酸
乙醛酸反应 乙醛酸 紫色 吲哚基 色氨酸
茚三酮反应 茚三酮 蓝色 自由氨基及羧基 α -氨基酸、所有蛋白质
酚试剂反应
(Fol i n)
碱性硫酸铜及
磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 酪氨酸、色氨酸
坂口反应
(Sakaguchi)
α -萘酚、
氯酸钠 红色 胍基 精氨酸
考马斯亮蓝 考马斯亮蓝 蓝色 疏水基团 所有蛋白质均具此反应
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考马斯亮蓝 (R250/ G250)
与蛋白的亲和力强,灵敏度高反 , 应呈蓝色
-------考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
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(六)蛋白质的紫外吸收
大多数蛋白质在 280nm 附近显示强的吸收。 ---紫外吸收法测定蛋白质浓度。
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二、蛋白质相对分子质量的测定 291页
根据化学组成测定最低相对分子质量渗透压法测定相对分子质量 蛋白质的扩散和扩散系数 沉降分析法(超速离心法)凝胶过滤法测定相对分子质量(分子筛层析) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量
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1.凝胶过滤法测定相对分子质量(分子筛层析) 297 页
凝胶过滤的介质:多孔网状凝胶珠。经常使用的凝胶:
交联葡聚糖( Sephadex)琼脂糖( Sepharose)
排阻极限:
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①凝胶过滤的原理
当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外;比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。
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② 测定方法 测几种标准蛋白质(已知Mr
和斯托克半径)的 Ve(洗脱体积)。以相对分子质量对数( logM )对 Ve 作图,得标准曲线。
再测出未知样品洗脱体积〔 Ve〕
从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量
标准蛋白质和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的 Mr。
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练习题
变性蛋白质溶解度降低是因为蛋白质分子的电荷被中和以及除去了蛋白质外面的水化层所引起的。
大多数蛋白质在 nm 附近显示强的吸收。实验室常用到的蛋白质变性剂是 和 。 为了充分还原核糖核酸酶,除了应用 β-巯基乙醇外,还需
A.过甲酸 B. 尿素 C.调 pH到碱性 D.调 pH到酸性想得到有活性的蛋白采用什么沉淀方法?想通过凝胶过滤法测定某蛋白质相对分子质量?
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2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 (简称 SDS- PAGE)
电泳过程中有 3 种物理效应:样品的浓度效应;对被分离分子的筛选效应;电荷效应。
迁移率大小:分子大小分子形状净电荷(荷质比)
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用途:用于测定蛋白质样品的纯化程度、蛋白质的相对分子质量和蛋白质中多肽亚基的数量。
β-巯基乙醇: HO – CH2 – CH2 - SH 能打开二硫键 . SDS:是蛋白质变性剂,可使蛋白质变性(肽链伸展), SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合,形成 SDS- 蛋白质复合物,每 2~3 个氨基酸残基结合一个 SDS分子。
结果:均带负电,且荷质比相同,具有相似的构象。 在电场中移向正级。分子量大的泳动慢,小的泳动快。
-- - ----- -
- - - - - - - - --
- - - - ---
------ - - - ---
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测定方法
用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。
测出待测样品的迁移率。从标准曲线上查出样品的
相对分子质量。
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三、蛋白质的分离纯化 300 页
(一)分离原理与程序(二)蛋白质的分离纯化方法
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(一)分离原理与程序
原理:利用欲分离蛋白质的溶解度、分子大小、电荷、吸附性质、对配体分子的特殊的亲和力。从混杂蛋白质中分离出一个特殊蛋白质。
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程序
前处理: 选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离心。 注: pH 、温度、酶的抑制剂等条件;要保证蛋白质的稳定。 粗分级分离: 盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离,离心。 细分级分离: 层折法、电泳法 结晶:结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化。
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(二)蛋白质的分离纯化方法
根据分子大小不同的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法根据电荷不同的纯化方法利用选择性吸附的纯化方法利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 高效液相层析和快速蛋白液相层析
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1.根据分子大小不同的纯化方法 301 页
①透析和超过滤 加压、抽滤和离心
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②凝胶过滤(分子排阻、凝胶过滤层析、凝胶渗透层析)
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2.利用溶解度差别的纯化方法
在同一的特定外部条件下,不同蛋白质具有不同的溶解度。分子所带电荷的性质和数量;亲水基团与疏水基团的比例,以及它们在蛋白质分子表面的排列。
方法:盐析与等电点沉淀有机溶剂分级分离法
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① 蛋白质的盐析 305 页
盐析:当中性盐浓度较高时,降低蛋白质的溶解度,使蛋白质发生沉淀。这种现象称为。盐析沉淀的蛋白质保持着它的天然构象,能再溶解。
中性盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠)对蛋白质的溶解度有显著的影响 .
原因:
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② 有机溶剂分级分离法
与水互溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。蛋白质在有机溶剂中的溶解度随温度、 pH 和离子强度而变化。在一定温度、 pH 和离子强度条件下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同。
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3.根据分子电荷不同的纯化方法 307 页
根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物电泳离子交换层析
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① 聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称 PAGE,圆盘电泳) 309页
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②醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素(二乙酸纤维素)薄膜具有匀一的泡沫状结构,渗透性强,对分子移动无阻力,用它作区带电泳的支持物,具有用样量少,分离清晰,无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。
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③ 离子交换层析 310 页
基本原理:略,同氨基酸分离,蛋白质的分离基于它的总净电荷。支持介质:纤维素离子交换剂和交联葡聚糖离子交换剂。
阴离子交换层析:用于带负电荷蛋白质的分离。 DEAE -纤维素或 DEAE -葡聚糖 Sephadex)阳离子交换层析:用于带正电荷蛋白质的分离。 CM -纤维素或 CM -葡聚糖
蛋白质对离子交换剂的结合力取决于:彼此间相反电荷基团的静电吸引与溶液的 pH 有关保持洗脱液不变、分段洗脱、梯度洗脱、改变 pH对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先被洗脱下来
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④利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 309页
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层析系统图示
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四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一)蛋白质的含量测定①凯氏定氮法② 双缩尿法③ Folin-酚试剂法④紫外吸收法⑤考马斯亮蓝结合法等。
(二)蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、 HPLC 和溶解度分析等。
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思考题 蛋白质的等电点?酸碱性质?蛋白质紫外吸收? 维持蛋白质胶体溶液的稳定因素?使蛋白质沉淀因素有?其原理?哪些方法可获得不变性的沉
淀蛋白质? 蛋白质变性与复性?常用变性剂?变性蛋白有何特点?凝胶过滤法测定相对分子质量(分子筛层析)和 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量的原理?
蛋白质的盐析及原理? 蛋白质的分离纯化步骤?常用的纯化方法及各自原理? 蛋白质的含量测定的方法有?其原理?317 页书后习题: 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10
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