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1Le nucléosomeLe nucléosome
ADN et chromosomes
ADN et chromosomes
2
Plan
I - Structure et fonction de l'ADNII - ADN chromosomique et emballage
dans la fibre chromatinienne– organisation des gènes le long de la
molécule d'ADN
III - Structure globale des chromosomes– emballage de la molécule d'ADN dans
les chromosomes
3
II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre
chromatinienne1 - Le chromosome2 - Organisation des gènes sur le chromosome3 - Cycle du chromosome4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour
se dupliquer et passer d'une génération à l'autre
5 - Emballage de l'ADN6 - Régulation de l’activité de la chromatine
4
1 - Le chromosome
• L'ADN est divisé en chromosomes• Génome = 3,2 milliards de paires de
nucléotides• 24 chromosomes différents• 1 chromosome = 1 molécule d'ADN +
protéines• ADN + protéines = chromatine
5
Chromatine (Walter Flemming 1882)
• ADN + protéines• Décrit par Flemming (1882)• Colorable
6
Walter Flemming (1843-1905)
• Cytologiste allemand connu pour avoir décrit le premier la division cellulaire appelée mitose.
• Également le premier à décrire les chromosomes.
• Études de médecine et de zoologie jusqu’en 1868 dans plusieurs universités allemandes.
• Thèse sur les muscles ciliaires• Assistant, puis professeur• S'installe définitivement à Kiel comme
professeur d'anatomie et directeur de l'institut d'anatomie, jusqu'à sa retraite en 1901.
7
Walter Flemming (1843-1905)
• Vers le milieu du XIXe siècle, la connaissance de la division cellulaire était limitée par la faible qualité des lentilles des microscopes et des méthodes de coloration.
• Certains scientifiques pensaient qu'il s'agissait d'une division directe, mais d'autres postulaient l'existence de phases intermédiaires pendant lesquelles le noyau « père » se dissociait avant de reconstituer deux noyaux fils.
• Walter Flemming est le premier à décrire, dans son ouvrage Zellsubstanz, Kern, Zelltheilung, publié en 1882, les différentes phases de la division cellulaire.
8
Walter Flemming :Les différentes phases de la division cellulaire
• A cette occasion, il forge les mots mitose, chromatine, plan équatorial et achromatine.
• Il est également un des premiers cytologistes à décrire les chromosomes pendant la division cellulaire, sans pour autant expliquer leur rôle
• Il remarque la constance de leur nombre pour une espèce donnée.
9
Walter Flemming :autres travaux
• Amélioration de certains fixateurs et colorants cellulaires
• Description de l'amitose, division cellulaire directe par étranglement du corps cellulaire et du noyau, phénomène qu'il considère toutefois, de façon erronée, comme pathologique.
10
Protéines de la chromatine
• Emballage de l'ADN• Régulation de l'expression des gènes• Réplication et réparation de l'ADN
11
Chromosome bactérien
• Une seule molécule d'ADN circulaire• Protéines d'emballage différentes• Mal connu
12
Les chromosomes eucaryotes
• Chaque cellule a deux copies de chaque chromosome– une héritée du père et– une héritée de la mère
• Chromosomes homologues• Exception : chromosomes sexuels chez
le mâle– Y hérité du père– X hérité de la mère
13
Jeux chromosomiques
• Homme : 22 paires d'autosomes + X + Y• Femme : 22 paires d'autosomes + X + X• Homme : 46,XY• Femmes : 46,XX
14
Mise en évidence des chromosomes
• Hybridation• Colorants
15
Fig 4-10
• Hybridation de chromosomes humains masculins
• Caryotype spectral (peinture chromosomique)
16
Fig 4-11
• Chromosomes humains masculins
• Coloration au Giemsa– chaque
chromosome a un marquage longitudinal spécifique qui permet de le reconnaître
17
Caryotype
• Affichage des 46 chromosomes à la mitose
• Mise en évidence des anomalies
18
Caryotype féminin normal
19
Fig 4-12
• Anomalie chromosomique– (A) Coloration au Giemsa– (B) Peinture chromosomique
4 12 4 12
N tN t
20
2 - Organisation des gènes sur le chromosome
• Un gène – protéine– ARN
21
Complexité d'un organisme nombre de gènes
• Corrélation positive• Bactérie : 500• Humain : 30 000• Beaucoup d'ADN
– sans information– dépotoir (!)– expression des
gènes
22
Table I-1
• Génomes ayant été totalement séquencés– (A) Eubactéries
23
Table I-1
• Génomes ayant été totalement séquencés– (B) Archae
24
Table I-1
• Génomes ayant été totalement séquencés– (C) Eucaryotes
25
Fig 4-13
• Génome de Saccharomyces cerevisae• 16 chromosomes• Couleurs fonctions du pays qui a séquencé• 12 147 813 nucléotides• 6000 gènes
26
Complexité d'un organisme génome ( ADN)
• Corrélation non systématique• Génome humain = 200 X génome de
Saccharomyces cerevisae• Certaines plantes ou amphibiens = 30 X
génome humain• Amibe = 200 X humain• Certains organismes proches les uns
des autres = 100 X en raison de l'ADN en excès (même nombre de gènes)
27
Variation du nombre de chromosomes
• Homme : 46• Certains cervidés : 6• Certaines carpes : >100• Espèces très proches de Muntjac
• Pas de relations simple entre– nombre de chromosomes– complexité de l'espèce– taille du génome
28
Fig 4-14• Fusion de
chromosomes
29
Analyse du séquençage du génome
• 1999 Séquençage du chromosome 22 (le plus petit)
30
Fig 4-15
1,5% du génome1,5% du génome
31
Analyse du séquençage du génome
• Science et Nature février 2001• Human Genome Project (2001)
32
Table 4-1
• Données statistiques du chromosome 22 et de tout le génome humain
33
Génome humain
• 25 fois plus gros que tous les génomes séquencés précédemment
• 8 fois la somme de tous les génomes séquencés précédemment
• Séquençage à 1000 nucléotides par seconde
• A fait reconsidérer toute la biologie• 4ème édition du livre entièrement revue
34
Fig 4-16
• Échelle du génome– (A) si 1 mm entre
deux bases… – (B) génome =
3 200 km– un gène codant pour
une protéine tous les 300 mètres
– un gène 30 mètres
35
Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans
le chromosome
1 - Quelques % codent pour des protéines ou de l'ARN de structure ou catalytiqueLe reste = petits morceaux d'ADN mobiles
qui se sont incorporés dans le chromosome au cours de l'évolution
36
Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans
le chromosome2 - Taille moyenne d'un gène élevée
– une protéine moyenne = 430 acides aminés 1 300 paires de nucléotides
– or un gène moyen = 27 000 paires de nucléotides– beaucoup d'ADN non codant qui s'intercale dans
l'ADN codant : introns / exons– Alternance exons / introns dans les gènes– Pas d'introns dans les organismes à génome
compact moins d'ADN– Séquences régulatrices d'ADN des dizaines de
milliers de paires de nucléotides
37
Fig 4-17
• Séquence nucléotidique du génome humain– LINES, SINES, retro-viral like elements, DNA only
transposons : éléments génétiques mobiles qui se sont multipliés et insérés en différents endroits du génome
38
Fig 4-17
• Séquence nucléotidique du génome humain– Segmental duplications : gros blocks (1 000 à 200 000
nucléotides) présents à 2 ou plus endroits du génome– Simple sequence repeats (< 14 nucléotides) répétés
encore et encore
39
Fig 4-17
• Séquence nucléotidique du génome humain– Plus de la moitié des séquences uniques sont des
gènes– Le reste probablement des séquences régulatrices
40
Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans
le chromosome
3 - Grand désordre dans l'information– grande pagaille, fouillis, désordre– beaucoup d'ADN dépotoir– information importante répartie dans tout ce
désordre– on n'a jamais rien éliminé
41
Problèmes posés par l'étude des gènes
• La plupart de l'ADN est probablement sans importance
• Un exon 145 nucléotides en moyenne (petit)
• Exon flotte dans une mer d'ADN inutile• Nombreux réarrangements
42
Solutions pour l'étude des gènes• Basées sur l'observation : les séquences qui ont
une fonction sont conservées pendant l'évolution
• Comparaison homme / souris : l'homme et la souris ont divergé d'un ancêtre commun il y a 100 millions d'années
• Les régions semblables sont celles dans lesquelles les mutations ont éliminé l'animal porteur par sélection naturelle : ce sont les régions conservées ( non conservées)
• Les expériences de la nature permettent de mettre en lumière les régions les plus intéressantes du génome
43
Fig 4-18(AB)
Conservation de la synténie (ordre de gènes) entre l'homme et la souris
HOMME
SOURIS
44
Fig 4-19
Histoire de notre chromosome 3 par comparaison avec celui d'autres mammifères
Un changement tous les 5 à 10 millions d'années
45
Muller,S2000p206PNAS (fig1)
46
Muller,S2000p206PNAS (fig2)
47
Muller,S2000p206PNAS (fig3)
48
Muller,S2000p206PNAS (fig4)
49
Muller,S2000p206PNAS (fig5)
50
3 - Cycle du chromosome
• Cycle cellulaire• Interphase : réplication
chromosome interphasique• Mitose : condensation et séparation
chromosomes mitotiques : bien visibles
51
Fig 4-20
Cycle cellulaireInterphase
synthèse protéiqueréplication de l'ADN et duplication des chromosomes
Phase MMitoseDivision cellulaire
52
Fig 4-21
Chromosome interphasiqueChromosome interphasique Chromosome métaphasiqueChromosome métaphasique
53
4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et
passer d'une génération à l'autre
• Origines de réplication– séquence d'ADN spécialisée– kinétochore– jusqu'à 100 000 paires de nucléotides chez
l'homme
• Télomères 2 par chromosome• Centromère
54
Fig 4-22
• les trois séquences d'ADN nécessaires pour le maintien d'un chromosome
55
5 - Emballage de l'ADN• L'ADN est compacté en chromosomes• eg : chromosome 22 = 48 millions
paires de nucléotides– ADN étiré = 1,5 cm– interphase plus court– métaphase = 2 m compaction = 10 000
• Protéines de compaction• En interphase compaction = 1 000
56
Aspect dynamique du chromosome
• En fonction du cycle cellulaire• En fonction de l'activité du chromosome
– accès aux séquences spécifiques– expression des gènes– réplication de l'ADN
57
a) La fibre nucléosomale
• Chromatine– ADN (50 %)– Protéines (50 %)
• histones (60 millions de molécules de chaque classe par cellule)
• protéines chromosomiques non histones
• Nucléosome
58
Fig 4-23
Fibre de 30 nm
Après traitement : collier de perles
Nucléosomes en microscopie électronique
Cordon = ADN, perle = cœur nucléosomal
59
b) Noyau nucléosomal
• De l'ADN (146 pn)... • enroulé autour d'un noyau protéique
formé de 8 histones 2 X (H2A, H2B, H3, H4)
• Premier niveau d'emballage de l'ADN (compacte l'ADN de 1/3)
60
Fawcett
61
Fawcett
62
Cook
63
Cook200?p?
• Digestion de la chromatine par les nucléases qui coupent l'ADN entre les nucléosomes– cf. Cook
64
Cook,P2001p?
• Digestion faible : l'ADN exposé entre les noyaux nucléosomaux (= ADN de liaison) (linker DNA) est dégradé
65
Fig 4-24hautNoyau nucléosomal =
146 paires de nucléotides+octamère d'histones
66
Fig 4-24bas
• Cœur protéique = octamère d'histones
67
ADN de liaison (linker DNA)
• Variable, de quelques paires de nucléotides à 80 paires de nucléotides environ
• en théorie, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal + 1 ADN de liaison adjacent
• en pratique, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal
• En gros, il y a un nucléosome tous les 200 paires de nucléotides
68
Dans une cellule
• 6,4 milliards paires de nucléotides 200 30 millions de nucléosomes
69
Structure du noyau nucléosomal
• Résolu en 1997• 1,65 tours d'ADN autour de l'octamère
d'histones
70
Fig 4-25
Noyau nucléosomal (diffraction des rayons X)
71
• 1 histone 102 ~ 135 acides aminés• Structure commune : 3 hélices reliées
par 2 boucles
c) Histones
72
Fig 4-26
Dimère H2A-H2B en "poignée de main"Motif des 4 histones
• Organisation structurale des histones du cœur protéique
73
Formation du noyau protéique
• Formation d'un dimère H3 - H4• Formation d'un dimère H2A - H2B• (Dimère H3 - H4) + (Dimère H3 - H4) =
(Tétramère H3 - H4)• Tétramère H3 - H4 + 2 (Dimère H2A -
H2B) = noyau protéique
74
Fig 4-27haut
• Assemblage d'un octamère d'histone
75
Fig 4-27bas
• Assemblage d'un octamère d'histone• Les 8 extrémités -N font saillie
Dimère H3 - H4 Dimère H2A - H2B
76
Interface ADN / histones
• 142 liaisons H entre ADN et histones• Histones riches en lys et arg (+) ADN
chargé (-)• Longue queue N terminal
modifications covalentes
77
Conservation des histones
• Parmi les plus conservées des protéines des eucaryotes
• H4 petit pois et H4 de la vache ne diffèrent que à 2 positions sur 104
• Il existe des variants
78
d) Position des nucléosomes sur l'ADN
• Flexibilité de l'ADN• Liaison d'autres protéines
79
Flexibilité de l'ADN
• Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe)
• Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours compression du sillon mineur
• AT est plus facile à courber que GC
80
Fig 4-28
Compression du petit sillon autour du nucléosome
81
Flexibilité de l'ADN
• Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe)
• Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours compression du sillon mineur
• AT est plus facile à courber que GC• Certains nucléosomes ont une position
très précise• En général position approximative
82
Liaison d'autres protéines
• Favorise la liaison du nucléosome• Obstacle à la liaison du nucléosome• En fait tout est très dynamique
83
e) Fibre chromatinienne d'ordre supérieur
• "Collier de perles" = rare dans la cellule vivante
• Fibre de 30 nm beaucoup plus probable
84
Nombreux schémas de fibres de 30 nm
• Zigzag… • et ses variations : "mosaïque fluide de
variations sur le modèle zigzag"• Éléments qui interviennent
– l'ADN de liaison– protéines de liaison à l'ADN– séquence de l'ADN
85
Bednar,J1998(fig1)
86
Bednar,J1998(fig2)
87
Bednar,J1998(fig3)
88
Fig 4-29
• Variations sur le modèle de la fibre de 30 nm en zigzag
Interconversion des modèles les uns dans les autres
89
Fig 4-30
• Irrégularités de la fibre de 30 nm– régions avec des protéines de liaison à l'ADN– ADN sans nucléosomes
90
Formation de la fibre de 30 nm
• Histone H1• Queues des histones
91
Histone H1
• Mal conservée• Liaison avec l'ADN et les protéines• Grande importance du point de sortie
de l'ADN hors du nucléosome
92
Fig 4-31
• Rôle de H1 sur le nucléosome
93
Queues des histones
• Liaisons des nucléosomes les uns aux autres
94
Fig 4-32
• Rôle hypothétique des queues d'histones dans la formation de la fibre de 30 nm– les queues aident à la
formation de la fibre de 30 nm
– contact entre les queues et le nucléosome adjacent en diffraction de rayons X
– liaison entre queue et ADN
95
6 - Régulation de l’activité de la chromatine
• a) Les complexes de remodelage de la chromatine
• b) Modifications des queues des histones
96
a) Remodelage de la chromatine : complexes de remodelage chromatinien
• Machines protéiques qui hydrolysent de l'ATP
• pour changer temporairement la structure des nucléosomes
• et l'ADN est lié moins fort au noyau protéique du nucléosome
• Mouvements de H2A H2B dans le noyau protéique
97
Conséquences du remodelage des nucléosomes
• Accès de protéines aux nucléosomes– expression des gènes, réplication,
réparation de l'ADN– Le nucléosome peut rester dans un état
remodelé même après la dissociation du complexes de remodelage chromatinien mais liaisons ADN-protéines relâchées
• Possibilité de changement de la position des nucléosomes le long de l'ADN
98
Fig 4-33
Modèle de mécanisme de certains complexes de remodelage chromatinien
Les contacts ADN - histones sont faibles
99
SWI-SNF-B chromatin-remodeling complex
• A member of the SWI/SNF family of ATP-dependent chromatin-remodeling complexes ;
• A multi-subunit complex that contains BRG1, BAF170, BAF155, BAF60a, BAF57, BAF53, actin, hSNF5/INI1, and BAF18
100
AbréviationsBAF Brg1/Brm-associated factor;
BAP Brm-associated protein;
ChIP chromatin immunoprecipitation;
HDAC histone deacetylase;
HMG high mobility group;
MNase micrococcal nuclease;
RSC remodels the structure of chromatin;
SAGA Spt–Ada–Gcn5–acetyltransferase;
SWI/SNF mating type switching/sucrose non-fermenting;
TBP TATA-binding protein
101
Nature Reviews Cancer 4, 133-142
(2004)THE SWI/SNF COMPLEX —
CHROMATIN AND CANCER
Charles W. M. Roberts & Stuart H. Orkin
• Chromatin consists of DNA wrapped around nucleosomes in progressively higher-order structures. Histone acetyltransferases (HATs) are an example of complexes that covalently modify DNA and lead to relaxation of chromatin structure. SWI/SNF uses ATP hydrolysis to slide nucleosomes along the DNA helix and expose the DNA to transcription factors. Often, these two types of complex work in concert to regulate transcription.
102
Kingston,RE1999p2339(fig1)
103
Kingston,RE1999p2339 (fig2)
• Composition de différents complexes de remodelage chromatinien ATP-dépendent
Famille de complexes SWI/SNF en pourpre
Homologues ISWI en rouge
104
Kingston,RE1999p2339 (fig3)
105
Kingston,RE1999p2339 (fig4)
106
Complexes de remodelage chromatinien
• Gros complexes protéiques de plus de 10 sous-unités
• Permettent l'accessibilité à l'ADN quand nécessaire
• Reformation des nucléosomes• Contrôle étroit par la cellule• Inactivés par phosphorylation pendant
la mitose compaction
107
Fig 4-34
Mécanisme cyclique de perturbation et reformation des nucléosomes
108
Travers,A1999p311(fig1)
109
Travers,A1999p311(fig2)
110
Travers,A1999p311(fig3)
111
b) Modifications des queues d'histones
• Acétylation des lysines• Méthylation des lysines• Phosphorylation des sérines• Ubiquitinylation
112
Fig 4-35(A)
• Modifications connues des 4 queues d'histones
113
Modifications des queues d'histones
• Avant ou après leur synthèse• En général après l'assemblage en
nucléosome• Enzymes nucléaires
– HAT (Histone Acétyl Transférase)– HDAC (Histone DéACétylase)
114
Modifications des queues d'histones
• Agit peu sur le nucléosome• Agit sur la stabilité se la fibre de 30 nm :
eg acétylation déstabilise la chromatine• Attraction de protéines spécifiques• Modifications code d'étirement de la
chromatine à la cellule
115
Fig 4-35(B)
Code de modifications des histones
116
Code de modifications des histones
• Nombreuses combinaisons de modifications
• Exemple :– vient d'être répliqué– ne pas transcrire
117
Conclusion : dynamisme de la chromatine
• Complexes de remodelage chromatinien
• Modifications des queues d'histones• Compaction / décompaction
permanente• Coopération des deux mécanismes
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