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Lehrerfortbildung Juli 2011
Schülerversuch Geninduktionam Beispiel des lac-Operons von E.coli
Prof. Dr. Andreas Beyer
cand. stud. Yvonne Floer
cand. stud. Karina van den Broek
Ein Schul-tauglicher Versuch zur Untersuchung genetischer Regulation bei Bakterien: – Induktion und Repression –
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RNA
-Pol
Das lac-Operon
lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs
trans-Ac
lac-Permease
ßGalLac tose
Gal
Glc+
lacZ,Y,A-mRNA
4
RNA
-Pol
RNA
-Pol
Das lac-Operon: Der Repressor
lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs
lacI TermPromotor
trans-Ac
lac-Permease
ßGal
lacZ,Y,A-mRNA
LacR
lacI-mRNA
6
RNA
-Pol
RNA
-Pol
Das lac-Operon: Der Repressor
lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs
lacI TermPromotor
trans-Ac
lac-Permease
ßGal
lacZ,Y,A-mRNA
LacR
lacI-mRNA Lac tose
8
RNA
-Pol
RNA
-Pol
RNA
-Pol
Das lac-Operon: Glc-Repression
lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs
cAMP-RP TermPromotor
trans-Ac
lac-Permease
ßGal
lacZ,Y,A-mRNA
CRP-mRNA
LacRLac tose
CRP
cAMP
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Regulation des lac-Operons
• negatives Regulations-Element im Promotor:lacR bindet an Operator blockiert Transkription in Abwesenheit vom LaktoseInduktor Laktose bindet an lacR LacR kann nicht mehr binden, Transkription ist entblockt
• positives Regulations Element im Promotor:aAMP-CRP komplex bindet an CRP-Bindestelle Transcriptionslevel wird erheblich gesteigert
(Mechanismus der Katabolit-Repression)
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Regulation des lac-Operons
lac-Operon
lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs
LacR
Lac tose
XXCRP cAMP
++ ++
Transkription des lac-Operons
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Das Versuchsprinzip
lacZ ß-Gaslactosidase als Reporter:Quantifizierung des Aktivitätsstatus‘ des lac-Operons
über Aktivitätsmessung der ß-Gal. via Chromogen:
proportionale Umsetzung von oNPG durch das Enzym
Quelle: chemgapedia
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Zeit t in Minuten
Ext
ink
tion
Vorversuch: Wachstumskinetik
14
Vorversuch: Wachstumskinetik
Glycerin verworfen
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Setup des Versuchs• E.coli H3000: intaktes lac-Operon• Sicherheitsstamm (keine S-Stufe!)• frische Übernacht-Kultur Standard-Medium LB• 1:5 Verdünnung mit div. C-Quellen (Kinetik über 1h):
- nur LB- Glucose- Laktose- Glucose + Laktose
• Zentrifugation, Zellaufschluss• Zugabe von oNPG definierte Zeit Stopp• optische Auswertung (semiquantitativ)• Analyse: Korrelation mit den C-Quellen
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Setup des Versuchs
1:5 Verdünnung bei t=0
E.coli H3000: frische Übernacht-Kultur
(Standard-Medium LB)
nur LB …+Glc …+Lact …+Glc +Lakt
Probennahme alle 20min
Zellaufschluss (Lysozym)
Farb-test
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Ergebnis
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semiquantitative Auswertung
(Semi-)Quantifizierung mit Photoshop
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