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DECREASED NUMBER AND IMPAIRED FUNCTIONALITY OFENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS INSUBJECTS WITH METABOLIC SYNDROME: IMPLICATIONS FORINCREASED CARDIOVASCULAR RISK.
Apresentado por:
Jemima Fuentes
DATA: 24/05/10
DECREASED NUMBER AND IMPAIRED FUNCTIONALITY OFENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS INSUBJECTS WITH METABOLIC SYNDROME: IMPLICATIONSFOR INCREASED CARDIOVASCULAR RISK.
I. Jialal, S. Devaraj, U. Singh, B.A. Huet
Atherosclerosis (2010)
The Laboratory for Atherosclerosis and Metabolic Research, Department of Medical Pathology and Laboratory Medicine, UC Davis Medical Center, Sacramento, CA, and VA Medical Center, Mather, CA, United State.
HipertensãoDislipidemia
(↓HDL, LDL,
triglicerídeos)
Glicemia basal
Lakka HM et al. JAMA 2002;288:2706-16.Grundy et al. Circulation 2005; 112 (17): 2735 – 2752. Carvalho MHC et al. Arq Bras Endocrinol Metab 2006;50 (2):304-312.
SÍNDROME METABÓLICA
Obesidade Central
_______________________________________________INTRODUÇÃO
RESISTÊNCIA À INSULINA
DISFUNÇÃO ENDOTELIAL
RISCO DE DOENÇA CARDIOVASCULAR
Insulina ação vasodilatadora,
NO.
EROs
_______________________________________________INTRODUÇÃO
Alberti KGMM et al. Circulation. 2009;120:1640-1645.
_______________________________________________INTRODUÇÃO
Alberti KGMM et al. Circulation. 2009;120:1640-1645.
_______________________________________________INTRODUÇÃO
Células progenitoras endoteliais (EPCs) - Origem
Roura S & Baynes-Genis A. Nat Rev. Cardiol. 2009; 6(9):590.
_______________________________________________INTRODUÇÃO
Células progenitoras endoteliais – Características morfofuncionais
Rafii S & Lyden D. Nature Medicine. 2003; 9: 702 – 712.
Tube formation
_______________________________________________INTRODUÇÃO
↓ EPCs ↑ EPCs
Diabetes
Obesidade
Doença renal crônica
Artrite reumatóide
↑ idade
Risco para doença arterial coronariana
Fatores que influenciam o número de células progenitoras endoteliais
Estatinas
Bloqueadores dos receptores de angiotensina
Agonistas do PPAR gama
O número de células progenitoras endoteliais circulantes é um marcador cardiovascular podendo representar uma
disfunção endotelial ou integridade vascular.
Tousoulis D, et al. Atherosclerosis 2008;201:236–47.Fadini GP, et al. Curr Diabetes Rev 2005;1:41–58.
As células progenitoras endoteliais podem estarnumericamente diminuídas e funcionalmente alteradasem homens e mulheres com Síndrome Metabólica semdiabetes ou doença arterial coronária associada e livresdo uso de medicamentos.
_______________________________________________HIPÓTESE
Avaliar o número e a atividade funcional de célulasprogenitoras endoteliais obtidas de indivíduos comSíndrome Metabólica, livres do uso de medicamentostais como: estatinas, bloqueadores do receptor deangiotensina ou agonista do PPAR gama, bem como,de diabetes e doença arterial coronária associada ecompará-los ao grupo controle.
_______________________________________________OBJETIVOS
_____________________________________________METODOLOGIA
Panfletos e anúncios nos Jornais da cidade de Sacramento
SÍNDROME METABÓLICA*
n= 46
CONTROLEn= 31
• Obesidade central• Hipertensão• Dislipidemia (baixo HDL, alto triglicerídeos)• Hipertensão com uso de anti-hipertensivos.
• ≤ 2 aspectos de SM• s/med. para pressão arterial• Glicose (<100mg/dl) • Triglicerídeos (< 200mg/dl).
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
21-70 ANOS
* Definida utilizando no mínimo 3 dos 5 critérios da NCEP/ ATP III.
Grundy et al. Circulation 2005; 112 (17): 2735 – 2752.
Amostra
CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO:
Diabetes Aterosclerose clínica (CAD, PAD, CVD) Fumantes Hipo ou Hipertireoidismo Má – absorçãoTerapia com anticoagulantes Terapia com esteróidesDrogas anti-inflamatóriasEstatinas e outras drogas hipolipidêmicasAgentes hipoglicemiantesBloqueador do receptor de angiotensinaTriglicerídeos ≥ 400 mg/dl (SM)Contraceptivos oraisUso de suplem anti-oxidantes (últimos 6 meses)GravidezContagem de células sanguíneas anormalConsumo de álcool > 1 dose/diaConsumo de N-3-PUFA
_____________________________________________METODOLOGIA
Pós-menopausa ou em terapia hormonalFeridasRetinopatiaCirurgia recenteDoença inflamatória ou com malignidadeCRP > 10mg/lExercício físico de alta intensidade (> 100min/semana)
_____________________________________________METODOLOGIA
Contagem sanguínea Perfil lipídico e lipoproteico Uréia Creatinina Aspartato aminotransferase Alanina aminotransferase Glicose TSH Dosagem de insulina - ELISA HOMA – IR (glicose/insulina)
Exame físico
Exame Bioquímico
História pregressa
O estudo foi aprovado pelo ConselhoInstitucional da Universidade daCalifórnia.Todos participantes assinaram o TCLE. Os indivíduos selecionados voltarampara a coleta de sangue.
Protocolo
_____________________________________________METODOLOGIA
Quantificação de EPCs por Citometria de Fluxo
1ml
100 µl
Agente bloqueador
Fc
TAMPÃO DE LISE
KDR/PE
CD34/PECy5
CD34+
KDRCONT
FIXAÇÃO EM 1% DE PARAFORMALDEÍDO
AQUISIÇÃO FACScan (FACS array flow)
• Em duplicata• Coeficiente de variação de 11%• C, n=30 e SM, n=46
Sangue heparinizado
Isolamento e Cultura de Células
_____________________________________________METODOLOGIA
4x106
células
20ml
•Revestidas com Fibronectina•Meio 199 +20%SFC+ 100ng/ml VEGF+100U/ml penicilina+100µg/ml streptomicina•48h
Cultura de Células
_____________________________________________METODOLOGIA
•Revestidas com Fibronectina•Meio 199 +20%SFC+ 100ng/ml VEGF+100U/ml penicilina+100µg/ml streptomicina• 7 dias• Triplicata•Troca de meio – 3 dias• Análise citoquímica com Ulex/FITC, Dil – LDL, KDR e CD 31
Células não aderentes
106céls/poço
replaqueadascentrifugadas ressuspensas
Ensaio de unidade formadora de
colônia –Capacidade clonogênica
Ensaio de migração –Capacidade migratória/
angiogênese
Ensaio de formação de tubo –
Capacidade formação de novos
vasos
_____________________________________________METODOLOGIA
Análise Clonogênica – Ensaio unidade formadora de colônia
7 dia106céls/poço
3 poços por indivíduo
Cont, n = 25, SM, n=43
Hamed et al. Cardiovascular Diabetology. 2009;8:56
Ensaio formação de tubo
• Cont, n = 15, SM, n=15
•Placa de 48 poços revestida com matrigel – 30 min a 37 C
• EPCs coradas com Dil-LDL e misturadas a HAEC
• Incubação à 37 C overnight c/ meio de cultura
• Resultado: número de células incorporadas.
Placa 24 poços
Membrana com poro de 8 µm
100 ng/ml de VEGF humano
EPCs (4 x106 céls) marcadas com CFDA (10 uM)
Ensaio de migração – Técnica da câmara de Boyden modificada
_____________________________________________METODOLOGIA
Incubação por 12 hLavagem com PBSLado inferior TRIS – TRITON para lise das células migratórias
Câmara
Cont, n = 16, Mets, n=36
Resultados expressos em MFI
_____________________________________________METODOLOGIA
Análise Estatística
•Dados: média ± SD, mediana e diferença interquatílica (não paramétricos)
• A transformação de LOG foi aplicada antes das análises paramétricas.
• O coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para avaliar aassociação entre fatores de risco metabólico, o número de EPC e suafuncionalidade.
• Modelo de regressão múltipla foi utilizado para análise dos preditores davariável dependente EPC. As variáveis independentes analisadas foram:idade, IMC, cintura abdominal, pressão sanguínea, glicose plasmática,triglicerídeos, HOMA-IR, LDL-C, HDL-C e PCR.
• Versão 9.1.3 do SAS (SAS Institute, Cary, NC, E.U.A.).
FL-2-CD34+
CD34+KDR+
FL-2-CD34+
FL-1
-KD
R+
CD34+KDR+
1
Control MetS
Supplement Fig 1: Scatterplots for CD34+KDR+ EPCs from Control and Met S Subjects
CD34-
KDR-CD34+KDR-
CD34-
KDR+
CD34-
KDR-CD34+KDR-
CD34-
KDR+CD34+KDR+
CD34+KDR+
FL-2
-KD
R+
_____________________________________________RESULTADOS
Supplement Figure 2a: Staining for Ulex Lectin and DiI-LDL Uptake in EPCs
_____________________________________________RESULTADOS
Hipertensão1
Hiperglicemia1
Obesidade1
Dislipidemia1
Síndrome metabólica2
Aterosclerose1
Inflamação2
Tabagismo1
Disfunção EndotelialDisfunção Endotelial ↓ Número de EPCs↓ Número de EPCs
[1] Vasa M, et al. Circ Res 2001;89:E1–7.[2] Fadini GP, et al. Metab Syndr Relat Disord 2009;7:5–10. [3] Pompilio G et al. Int. J. Cardiol. (2009) 131: 156–167[4] Lipsic E, et al. J Am Coll Cardiol 2006;48:2161–7.[5] Sandri M, et al. Circulation 2005;111:3391–9.[6] Schnatz PF. Obstet Gynecol Surv Oct 2006;61:673–81.
_____________________________________________DISCUSSÃO
Estatinas1
Hipoglicemiantes orais2
Agonistas PPAR2
ARBs2
Exercício5
Inibidores da ECA3
Eritropoitina4
Estrogênio6
Função Endotelial/
↑ Mobilização M.Óssea
Função Endotelial/
↑ Mobilização M.Óssea ↑ Número de EPCs↑ Número de EPCs
Número de EPCs circulantes é um indicador independente da saúde cardiovascular.
EPCs X Risco Cardiovascular
•Poucos autores tem analisado o número reduzido de CP e EPCs em indivíduoscom SM. Fadini et al. 2005 em diabéticos e Westerweel et al. 2008 em machosobesos.
•Os indivíduos com síndrome metabólica apresentaram descréscimo do númerode EPCs, não eram usuários de estatinas, ARBs nem agonitas do PPAR gama.Não apresentavam diabetes, doença arterial coronariana nem hipercolesterolemiae eram em sua maioria mulheres (77%).
Satoh et al. 2008 encontrou aumento de EPCs em indivíduos com SM (apósevento coronário agudo). EPCs tinham decréscimo do comprimento do telômeroe aumento do dano oxidativo no DNA, sugerindo uma EPC disfuncional.
[1] Fadini GP, et al. J Am Coll Cardiol 2005;45(9):1449–57.[2] Westerweel PE, et al. Eur Heart J 2008;29:2808–17.[3] Satoh M, et al. Atherosclerosis 2008;198:347–53.
_____________________________________________DISCUSSÃO
Porque escolher as células progenitoras CD34+KDR+ ?
Dois estudos de seguimento:
Werner et al. 2005 - 519 pacientes com DAC (12 meses).
Schmidt-Lucke et al. 2005 – Indivíduos saudáveis e pacientes com eventocardiovascular.
O número de células CD34+KDR+ apresenta correlação negativa com a funçãoendotelial sendo considerado um preditor independente para eventoscardiovasculares, progressão da aterosclerose e morte por complicaçõescardiovasculares.
Glicose plasmática, triglicerídeos e a PCR são variáveis preditoras de reduçãodo número de EPCs (CD34+KDR+).
[1] Werner N, et al. N Engl J Med 2005;353:999–1007[2] Schmidt-Lucke C, et al. Circulation 2005;111:2981–7.
_____________________________________________DISCUSSÃO
Caracterização Funcional da EPCs
Pioneiro na avaliação funcional (ensaios de UFC, migração, tubulogênese) das EPCs em indivíduos com SM x Controles.
↓ número de UFC (SM X Controle)Análise de multivariância: IMC, HDL-C, PCR são preditores independentes para a redução do número de colônias.
George et al., 2004 – Correlação negativa PCR X UFC de EPCs em pacientes com angina instável.
↓ incorporação de EPCs à células endoteliais (tubulogênese) em SM x Controles. ↓ reparo endotelial e da angiogênese em indivíduos com SM.
Análise multivariância: PCR preditor independente para a redução da tubulogênese.
[1] George J, et al. Eur Heart J 2004;25:1003–8.
_____________________________________________DISCUSSÃO
_____________________________________________DISCUSSÃO
PCR
(Biomarcador inflamatório)
Desregulação das EPCs (↓ número e ↓ tubulogênese)
Disfunção endotelial/ altera a atividade eNOS1
↓ Reparo endotelial e regeneração
Contribui para Aterosclerose
Biomediador do processo da doença.
↑ PCR → Disfunção da EPC?
(↓ sobrevida, ↓ função e ↓ diferenciação das EPCs - ↑ EROs) 1
[1] Verma S, et al. Circulation 2004;109:2058–67.
_____________________________________________CONCLUSÃO
O estudo demonstrou pela primeira vez que, indivíduos de ambos ossexos, não tabagistas, usuários somente de medicação anti-hipertensiva, com SM porém sem diabetes, hipercolesterolemia oudoença arterial coronária associada, apresentam diminuição do númeroe alteração da função das células endoteliais progenitoras (EPCs)quando comparado ao grupo controle. Este estudo preenche umalacuna científica sobre a atividade funcional das EPCs em indivíduoscom SM e explica em parte o risco cardiovascular aumentado emindivíduos com SM.
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