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5/17/2018 Analyse Bacteriologique - slidepdf.com
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ANALYSEANALYSE
BACTERIOLOGIQUEBACTERIOLOGIQUED’UNE DENREED’UNE DENREE
ALIMENTAIREALIMENTAIRELa prise d’essai:
A - cas de produit solide(exemple: viande).
B -cas de produit liquide(exemple: jus).
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Références
• Norme NF V 08- 010 :règles générales pour lapréparation des dilutions en vue de l’examenmicrobiologique.
• Norme NF EN ISO 6887-1 relative à la suspensionmère et dilutions décimales;1.règle générale.
• Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire -Directives générales pour la préparation desdilutions en vue de l’examen microbiologique.
• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles généralespour le comptage des colonies et l’expression des
résultats.• Norme NF ISO 7218 :règles générales pour lesexamens microbiologiques.
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptionsgénérales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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A- Cas de produit solide.
25 gr
Peser dans un sachetstérile 3× 25 gr du produit
à analyser aseptiquement.
BALANCEBALANCE
La 1La 1èreère pesée servira aupesée servira au
contrôle bactériologique.contrôle bactériologique.
La seconde servira à laLa seconde servira à la
recherche des Salmonella etrecherche des Salmonella et
des shigella.des shigella.
La troisième servira à laLa troisième servira à larecherche de Listéria.recherche de Listéria.
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La prise d’essai pour une analysebactériologique classique:
Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit
à analyser.Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.
Verser le contenu dans le flacon de TSE.
BROYEUR TSE
10ˉ10ˉ¹¹
225225mlml
(suspension mère)
DE TYPE
STOMACHER
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La prise d’essai pour la recherchedes Salmonella et des Listéria.
Verser l’Eau Peptonée Tamponnée(Salmonella) et le bouillonFraser(Listéria) dans le sachet stérile contenant 25 gr de produità analyser.
Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.Verser le contenu dans les flacons respectives.
BROYEUR
DE TYPE
STOMACHER Eau Peptonée
tamponnéeBouillonFraser
225
ml ml
225
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B – Cas de produit liquide:Faire un mélanger de 3 à 5 unités
du produit à analyser.
Suspension mère
+1
JUS
JUS
JUS
JUS
JUS
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La prise d’essai pour les recherchesdes Salmonella et des Listéria.
5ml
25 mlPrélever
2×25 ml de la
Suspensionmère.
+1+1 EauEaupeptonnéepeptonnée
tamponnéetamponnée
25 ml
FRASERFRASER
SalmonellaSalmonellaListériaListéria
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PREPARATIONDES DILUTIONS
DECIMALES
a - cas de produit solide.b - cas de produit liquide.
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a - Cas de produit solide:Introduire 1 ml de la suspension 10ˉ¹ dans 9 ml de TSE.
Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et
l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE.1 ml
1 ml 1 ml
10ˉ² 10ˉ³
10ˉ¹
9 ml de TSE
SuspensionSuspension
mère
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b - Cas de produit liquide:Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE.
Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans9 ml de TSE,mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et
l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10³.
1 ml
1 ml 1 ml
10ˉ²
10ˉ³9 ml de TSE
10ˉ¹
1 ml
Solution mère
+1
9 ml de TSE
suspensionmère
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PARAMETRES RECHERCHES
• Recherche et dénombrement des microorganismes totaux(Flore mésophile).
• Recherche et dénombrement des levures et moisissures.• Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes
thermo tolérants et EscherichiaColi.• Recherche et dénombrement des Anaérobies Sulfito –
Réducteurs à 46°C.• Recherche et dénombrement de Clostridium Perfringens à
37°C.• Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus.• Recherche des salmonelles.• Recherche de Listéria.
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RECHERCHE ETRECHERCHE ETDENOMREMENT DESDENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PARMICROORGANISMES PARCOMPTAGE DES COLONIESCOMPTAGE DES COLONIES
OBTENUES A 30 °C,OBTENUES A 30 °C,DANS LES DENREESDANS LES DENREESALIMENTAIRES.ALIMENTAIRES.
Milieu utilisé:Gélose PCA
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Références
• Norme NF 08 – 051 relative au dénombrement des micro–organismes – méthode par comptage des colonies obtenues à30°C.
• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour lecomptage des colonies et l’expression des résultats.
• Norme NF V 08 – 002:Microbiologie alimentaire – Directivesgénérales pour les examens microbiologiques.
• Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directivesgénérales pour la préparation des dilutions en vue de l’examenmicrobiologique.
• Norme NF ISO 7218:règles générales pour les examensmicrobiologiques.• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage etd’essais.
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Inoculer les boites de pétri avec 1 mldes différentes dilutions.
11mlml mlml mlml
11 11
10ˉ10ˉ¹¹ 10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³
1 ml1 ml 1 ml1 ml 1 ml1 ml
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Couler la gélose PCA ≈ 15 mlrefroidie ≈ 45°C.
Mélanger et laisser solidifier.
PCAPCA PCAPCA
10ˉ10ˉ¹¹ 10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³
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Couler une deuxièmecouche de gélose blanche ≈ 4 ml.
Laisser solidifier.
GELOSEGELOSE
BLANCHEBLANCHE
GELOSEGELOSE
BLANCHEBLANCHE
10ˉ10ˉ¹¹ 10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³
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Incuber les boites couvercle en bas72 ±3h à 30°C.
Incuber 72h à 30°CIncuber 72h à 30°C
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RECHERCHE ET DENOMREMENT DESRECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGEMICROORGANISMES PAR COMPTAGEDES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.
1ère Lecture après 24h
d’incubation
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Dénombrer les colonies de formes lenticulairesqui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombrecompris entre 15 et 300.
Germes totaux Germes totaux
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RECHERCHE ET DENOMREMENT DESRECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGEMICROORGANISMES PAR COMPTAGEDES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.
2ème Lecture après 48h
d’incubation
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Dénombrer les colonies de formes lenticulairesqui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombrecompris entre 15 et 300.
Germes totaux Germes totaux
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RECHERCHE ET DENOMREMENT DESRECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGEMICROORGANISMES PAR COMPTAGEDES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.
3ème Lecture après 72h
d’incubation
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Dénombrer les colonies de formes lenticulairesqui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombrecompris entre 15 et 300.
Germes totaux Germes totaux
L i é i
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Retenir 2 dilutions successives ( plusfortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300.Appliquer cette formule:
∑ c
1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre decolonies de la 1ère dilution et c = nombre
de colonies de la 2ème dilution ).
d : le taux de dilution de la 1ère boiteretenue.
N = nombre de
micro-organismes /gr ou ml
Lecture et interprétation:
N
1 2 1
2
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RECHERCHE DES
COLIFORMES PARCOMPTAGE
DES COLONIES A 30°,35°OU 37° C DANS LES
DENREESALIMENTAIRES.
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Références
• Norme NF V 08-051:dénombrement des coliformes
par comptage des colonies,méthode de routine.• Norme NF V 08-017:dénombrement des coliformes
fécaux et d’Eschérichia Coli(annexe NF V 08-015 etNF V08-016).
• Norme NF ISO 7218:règles générales pour les
examens microbiologiques.• Norme NF V 08- 010 :règles générales pour la
préparation des dilutions en vue de l’examenmicrobiologique.
• Norme XP V 08-102:règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression desrésultats:cas des dénombrements en milieu solide.• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence deslaboratoires d’étalonnage et d’essais.
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Milieu utilisé:
VRBL: (gélose au cristal
Violet et au Rouge neutre, Biliée et Lactosée).
I l l é i d b it
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mlml
11 11
mlml
11
mlml
10ˉ10ˉ¹¹
1 ml1 ml 1 ml1 ml
Inoculer la série de boites avec1 ml des différentes dilutions.
1 ml1 ml
10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³
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Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml,refroidie à la température ≈ 45± 1 °C.
Mélanger et laisser solidifier.
VRBL VRBL
I b l é i d b it 24 ± 2 h à
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Incuber la série de boites 24 ± 2 h à30°,35° ou 37°C pour la recherche
des coliformes.
2424 ± 2 h± 2 h à 37°Cà 37°C 2424 ± 2 h± 2 h à 37°Cà 37°C2424 ± 2 h± 2 h à 37°Cà 37°C
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Dénombrer les colonies rouges qui poussenten masse , noter la dilution correspondante.
Tenir compte des boites ayant un nombrecompris entre 15 et 150.
Colonies rouges Colonies rouges
L t t i t ét ti
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Retenir 2 dilutions successives ( plusfortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150.Appliquer cette formule:
∑ c
1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre decolonies de la 1ère dilution et c = nombrede colonies de la 2ème dilution retenues).
d : le taux de dilution de la 1ère boiteretenue.
N = nombre de
Lecture et interprétation:
N
1 2 1
2
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RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DESCOLIFORMES
THERMOTOLERANTSET ESCERICHIA COLIDANS LES DENREES
ALIMENTAIRES.
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Milieu utilisé:
VRBL: (gélose au cristal
Violet et au Rouge neutre, Biliée et Lactosée).
I l l é i d b it
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mlml
11 11
mlml
11
mlml
10ˉ10ˉ¹¹
1 ml1 ml 1 ml1 ml
Inoculer la série de boites avec1 ml des différentes dilutions.
1 ml1 ml
10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³
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Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml,refroidie à la température ≈ 45± 1 °C.
Mélanger et laisser solidifier.
VRBL VRBL
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Incuber la série de boites24 ± 2 h à 44°C.
2424 ± 2 h± 2 h à 44°Cà 44°C 2424 ± 2 h± 2 h à 44°Cà 44°C2424 ± 2 h± 2 h à 44°Cà 44°C
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Dénombrer les colonies rouges qui poussenten masse , noter la dilution correspondante.
Tenir compte des boites ayant un nombrecompris entre 15 et 150.
Colonies rouges Colonies rouges
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LECTURE ETINTERPRETATION
Comptage des
coliformestermotholérants.
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Retenir 2 dilutions successives ( plusfortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150.Appliquer cette formule:
∑ c
1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre decolonies de la 1ère dilution et c = nombre
de colonies de la 2ème dilution ).
d : le taux de dilution de la 1ère boiteretenue.
N
1 2 1
2
N = nombre de coliformes
termotholérants /gr ou ml.
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Recherche etdénombrementd’Escerichia Coli:
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Repiquer 3 à 5 colonies caractéristiques sur lemilieu Urée Indole.
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Ensemencer le milieu Urée Indole.
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Incuber le milieu Urée Indoleensemencé 24 h à 37°C.
UREE
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Lecture du milieu Urée Indole.
Production d’indole
= formation
d’un anneau rouge.
indole +
-KOVACS KOVACS
E.Coli: urée -Indole +
indole
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Lecture et interprétation.
Formule: a =b x c
A
b :Nombre de colonies caractéristiques indole +
Nombre total de colonies caractéristiques sur
la boite.c :
A : Nombre de colonies caractéristiquesrepiqués.
a : Nombre d’Escherichia Coli identifiés.
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Retenir 2 dilutions successives( plus fortes dilutions) oū le nombrede colonies dénombrées soit : 15
≤ c ≤ 150.Appliquer cette formule:
∑ a =N
Nombre d’Escherichia Coli identifiés.
d : le taux de dilution correspondant à la 1ére
dilution retenue.
∑ a
1,1 x d
N = nombre d’Escherichia Coli /gr ou ml.
HERCHE DES SALMONEL
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HERCHE DES SALMONELDANS LES DENREES
ALIMENTAIRES.
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Références
• Norme NF V 08 6- 052 relative à la méthodede routine pour la recherche des Salmonella.
• Norme EN 12824 relative à la recherche des
Salmonella.• Norme NF ISO 17025 relative aux
prescriptions générales concernant lacompétence des laboratoires d’étalonnage etd’essais.
A Cas de prod it solide
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A - Cas de produit solide:Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile
contenant 25 gr de produit.Broyer l’aliment.
Verser le contenu dans le flacon d’E.P.Tamponnée.
BROYEUR
DE TYPE
STOMACHER
EauEau
peptonnéepeptonnée
tamponnéetamponnée
flaconflacondede
225 ml225 ml
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B - Cas de produit liquide.
11
mlml
25 ml
Introduire dans
225 ml d’Eau Peptonée
TamponnéePrélever 25 ml de la
Suspension
mère
(+1)(+1)EauEau
peptonnéepeptonnée
tamponnéetamponnée
+1+1
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Étape de pré enrichissement:
Incuber la solution ensemencéed’Eau Peptonée Tamponnée
16-20h à 37°C.
INCUBER 16- 20h à 37°CINCUBER 16- 20h à 37°C
peptonnéepeptonnée
tamponnéetamponnée
EauEau
Étape d’enrichissement:
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Étape d’enrichissement:Ensemencer les bouillons de Rappaport Vassiliadis et
de sélénite à partir de la solution pré enrichie.
EauEau
peptonnéepeptonnée
tamponnéetamponnée
0,1 ml 2 ml2 ml
BouillonBouillon
RappaportRappaport
VassiliadisVassiliadis RAPPA-RAPPA-
PORTPORT
SFBSFB
S/CS/C
Solution pré enrichieSolution pré enrichie
Incuber 18- 24h à 42°CIncuber 18- 24h à 42°C Incuber 18- 24h à 37°CIncuber 18- 24h à 37°C
BouillonBouillon
sélénitesélénite
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Étape d’isolement:
Milieux utilisés:Gélose Hektoen
Gélose au VertBrillant et au Rouge
de Phénol.
Isoler par des stries :
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Isoler par des stries :a- Ensemencer une boite de gélose
Hektoen à partir du tube SFB.
b- Ensemencer une boite de géloseau Vert Brillant et au rouge de phénol
à partir du tube de Rappaport Vassiliadis.
37°C37°C 42°C42°C
Anse de platine Anse de platine
SFBSFB
S/CS/C
RAPPA-RAPPA-
PORTPORT
18-24 h à 37°C
R i 5 l i t i d
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Repiquer 5 colonies typiques deSalmonella sur le milieu TSI.
...
Colonies ayant un contour régulier.
Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou
sans centre noir sur la gélose Hektoen.
Colonies de couleur rose sur la gélose V.BR.RP
R i 5 l i t i d
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Repiquer 5 colonies typiques deSalmonella sur le milieu TSI.
Stries
Anse de platine
Isoler par
des stries
faire une
piqûre centrale.
Incuber 24h à 37°C
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Aspect d’un TSI de Salmonella.
TSI TSI TSI
Pente
Rouge
CulotNoir
Gaz +Pente
Rouge
Culot
Jaune
H2S +
Gaz
Pente
Rouge
Jaune
Culot
H2S
Gaz +
S.Typhi S.Paratyphi AAutres Salmonella
H2S+
Ensemencer une galerie
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Ensemencer une galeriebiochimique.
.
LDCTEMOIN ODC ADH ONPG UREE GN
CITRATE DE SIMMONS
CLARK ET
LUBS
Lecture de la
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Lecture de lagalerie biochimique.
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CLARK ET
LUBS
KOVACS RM
VP1
VP2
+ - -
Citrate de SIMMONS +
L t d l’i d l t d l TDA
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