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Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática. Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq.eel.usp.br. Cinética das reações catalisadas por enzimas 1. Efeito da concentração de substrato. - PowerPoint PPT Presentation
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Aula de enzimologia
Tema Cinética enzimática
Prof. Adriane M. F. MilagresDepartamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – USPadriane@debiq.eel.usp.br
Cinética das reações catalisadas por enzimas
1. Efeito da concentração de substrato
Conteúdo:
• Cinética de uma reação simples
• Determinando Vmax e Km
• Significado de Km
• Cinética do tipo cooperativo
A atividade de uma enzima e a concentração do substrato não são, em geral, proporcionais
Qual a porcentagem dos sítios ativos estão ocupados?
Por que estudar a cinética enzimática?
• Determinar as constantes cinéticas do S e dos inibidores
• Ajudar a elucidar os mecanismos de reação
• Determinar a função de uma enzima em uma rota metabólica
• Conhecer as condições ótimas de catálise
A velocidade da reação é proporcional a S
O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar a cinética das reações catalisadas por enzimas.
O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação enzimática ocorre em dois passos:
Hipótese de equilíbrio rápido e estado estacionário
V = k3 [ES] K1 [E] [S] = K2 [ES] K2 = [E] [S]K1 [ES]
2) [Et] = [E] + [ES]
1) V = k3 [ES]
V = k3 [ES][Et] [E] + [ES]
V = K3
K2 = Ks = [E] [S] K1 [ES]
[ES] = [E] [S] ks
[E] [S] ks
Et E + [E] [S] ks
V= Vm [S] ks + [S]
ETAPA 2.Formação do produto (P) a partir do complexo ES, com recuperação da forma livre da enzima (E)
ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma enzima (E), formando um complexo intermediário (ES)
Hipótese de Briggs - Haldane
A reação do anterior está representada no equilíbrio:
onde k1, k2, k3e k4 são as constantes de velocidade de cada etapa.
Nesse caso, a da reação(V), ou seja, a velocidade de formação do produto será:
Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação:
A velocidade inicial de reação neste caso é dada por:
Na análise cinética da reação catalisada por uma enzima, consideramos apenas o ESTADO ESTACIONÁRIO, que é aquele em que, apesar de estarem mudando as concentrações de S (diminuindo) e de P (aumentando), não há variação da concentração dos intermediários da reação.
Velocidade de formação de ES =Velocidade de decomposição de ES
ou...k1[E].[S] = (k2+ k3)[ES] (eq. 3)
A equação 3 pode ser re-arranjada em:
Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante, Km, conhecida como Constante de Michaelis:
No numerador, temos duas constantes de velocidade de reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e no denominador, a constante de velocidade da FORMAÇÃO de ES.
Dessa forma, Km é uma medida da AFINIDADE da enzima pelo substrato.
Km ALTO = Baixa afinidade eKm BAIXO = Alta afinidade
Como toda a enzima que estiver na solução de reação (ETOTAL) corresponde à soma das espécies E (enzimas livres) e ES (enzimas no complexo com substrato),
Podemos substituir esta equação na da velocidade inicial da reação é Vo = k3.[ES]:
Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, atingimos a velocidade máxima de reação, ou seja, se [E]TOTAL= [ES], então a equação 10, pode ser representada por:
•Se [S]<<<Km, então: Vo = Vmax [S] Vo = K[S] Km
•E se [S] >>>> Km, Vo = Vmax V0= k3[E]TOTAL
•Se V0=Vmáx/2, temos: Km = [S].
Ou seja, Km corresponde à concentração de S necessária para se atingir a metade da velocidade máxima!
Significado de Km
• Importante parâmetro da reação enzimática e da função biológica
• Fornece uma medida da [S] para que ocorra uma catálise significativa
• Km esta relacionado as constantes de velocidade de cada etapa da reacão
Significado do kcat/KM: A Eficiência Catalitica
• É uma medida de eficiência da Enzima• Permite comparar a preferência de uma Enzima para diferentes Substratos
Significado do kcat/KM: A perfeição cinética
Diagrama Lineweaver-Burk(Duplo-Recíproco)
Determinação experimental dos parâmetros cinéticos
As concentrações de substrato escolhidas devem ser proximas do Km
Críticas ao gráfico L.B.
1) Aumentos iguais de S que fornecem pontos igualmente espaçados no grafico V x S não fornecem pontos igualmente espaçados no L.B.
2) Valores tendem a se agrupar próximo ao eixo 1/v e aparecem poucos pontos mais altos da escala e são os que devem pesar no traçado da reta
3) Pequenos erros na determinação de V se tornam maiores quando se calcula o seu recíproco.
Gráfico de Eadie-HofsteeNão envolve o recíproco de V e podem tornar mais precisos
[S]
vm
Kmax
Vv
Vmax
Km
v -KmInclinação =
v[S]
Vmax
Gráfico de Hanes-WoolfMais indicado para dados obtidos com aumentos iguais de S
[S]
[S] v
-Km
KKmm
VVmaxmax
1Vmax
Inclinação =
[S]max
V
1
maxV
mK
v
[S]
Exercício:1) Os seguintes dados foram obtidos para uma enzima que catalisa a
reação S-P. As concentrações de substrato abrangem uma faixa bastante ampla para nos permitir utilizar qualquer um dos gráficos lineares. Trace os gráficos e determine Km e Vmax.
[S] (M) V (nmoles/L/min)
8,33 10-6 13,8
1 10-5 16
1,25 10-5 19
1,67 10-5 23,6
2 10-5 26,7
2,5 10-5 30,8
3,33 10-5 36,3
4 10-5 40
5 10-5 44,4
6 10-5 48
8 10-5 53,4
1 10-4 57,1
2 10-4 66,7
INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO
Este gráfico mostra como varia a velocidade inicial de uma reação com o aumento da concentração de substrato:
Ou seja,Vmáx e Km podem ser calculados quando V0 é medida em função de várias concentrações de substrato.
1) Quando [S] é muito grande – V = Vmax P = Vmax . t
Ordem da reação
2) Quando S é muito pequeno
Vo = Vmax [S] Vo = K[S] Km
K é uma constante de primeira ordem (min -1)
0
0log3,2 ttkS
S
dtS
Sdk
1
-dS = kS dt
Exercício:
1) Uma enzima teve sua atividade determinada a uma concentração inicial de [S] de 2 x 10-5 M. Em 6 min, metade do substrato foi utilizado. O Km para o substrato é de 5 x 10 -3 M . Calcule a) k, b) Vmax, c) concentração de produto formado em 15 min.
Enzimas Alostéricas
• Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten• Quanto maior a [S] maior será a atividade da E até esta alcançar o Vmax• A curva da V versus [S] e sigmóide • Segue modelo da curva de saturação da Hemoglobina com O2• Sistema cooperativo
Ativador alostérico Inibidor alostérico
Enzimas alostéricas
possuem uma região diferente do sítio ativo e se liga um efetor ou modulador alostérico. A mudança conformacional decorrente da ligação do efetor alostérico se propaga pela molécula e afeta o sítio ativo, ativando-o ou inibindo-o.
Gráfico V x S é uma curva sigmóide
Enzimas tipo V: efetores alostéricos alteram a Vmax - hiperbólica Enzimas tipo K: efetores alostéricos alteram o Km - Cinética sigmoidal(indica cooperatividade)
Enzimas com sítios múltiplos
1) Sitios independentes (hiperbólica)2) Sítios interdependentes (Sigmoidal)
k’ k3E + hS ------ ESh ------- ESh-1 + P
V = k3 [ESh] (1)Et = [E] + [ESh] [ESh] = [E] [S]h / k’
V = k3 [ESh] Et [E] + [ESh]
V = k3 [E] [S]h / k’Et [E] + [E] [S]h / k’
V = k3 [S]h
[Et] k’ + [S]h V = Vm [S]h
K’ + [S]h
Equações de V x [S]
[S] é a concentração de substrato
S50 é a concentração de substrato para a qual a enzima está hemisaturada e em que a velocidade é metade de Vmax.
h é o coeficiente de Hill e é uma medida do grau de cooperatividade (ou sigmoidicidade): quando h=1 a equação acima simplifica e é igual à equação de Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade).
V = Vm [S]h K’ + [S]hRearranjando:
vK’ + v[S]h = Vm [S]h
Vk’ = Vm[S]h –v[S]h
Vk’ = (Vm – v) [S]h
V = [S]h
Vm – V k’
Log ( V ) = h log [S] - log k’ (Equação de Hill) ( Vm – V )
A equação de Hill também é linearizável:
Exercício:
Determine se a enzima obedece uma cinetica hiperbólica ou sigmoidal e calcule ou estime as constantes cinética apropriadas (Km, Vmax ou K’ [S]0,5 , nap e Vmax)
[S] (M x 104) V (micromoles/L/min) 6,5 1,5412,5 5,88 25 20 50 50100 80200 94,12400 98,46800 99,61
1) O estudo cinético de uma enzima nos informa sobre o modo como a atividade da enzima se modifica quando se alteram as condições do meio em que esta é ensaiada.
2) O estudo cinético de uma enzima é importante para caracterizar essa enzima, desta maneira distinguindo-a funcionalmente das demais enzimas inclusive das que podem catalisar a mesma reação.
3) O desenho de condições de ensaio adequadas à dosagem de uma enzima numa preparação biológica complexa é feita com base em estudos de cinética.
Considerações finais:
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