View
69
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Clasificarea enzimelor
Baze de date generale
Baze de date specificeShewale – Enzyme everywere - 1996
Baze de date pentru enzime
http://www.enzyme-database.org/
Bazele de date generale
ExplorEnz
Bazele de date generale
Bazele de date generale
ExplorEnz
Bazele de date generale
https://enzyme.expasy.org/
SIB-ENZYME
Bazele de date generale
http://www.ebi.ac.uk/intenz/
IntEnz – Integrated relational Enzyme database (nomenclatura)
Bazele de date generaleIntEnz
Baze de date pentru enzime
http://www.brenda-enzymes.org/index.php
BRENDA
o clasificare și nomenclatură
Baze de date pentru enzime
BRENDA - gamă largă de proprietăți enzimatice
o structura enzimelor
o reacții și specificitate (substrate naturale/artificiale)
o parametri funcționali
o informații legate de organismul din care provin
o izolarea și prepararea
o referințe bibliografice
o aplicații și inginerie
o enzimele - responsabile pentru anumite boli
Baze de date pentru enzime
KEGG - gamă largă de proprietăți enzimatice
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/)
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MEROPS – specificitate de clivareaminopeptidase A
(Homo sapiens)
Ectoenzimă
degradează
angiotensina II
Dostal, D.E. Baker, K. M.
Circulation Research.
1999;85:643-650
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MEROPS – substrate cu relevanță fiziologică (P) sau nu (N)
substrate sintetice (S)
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MetaCyc (https://metacyc.org)
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MetaCyc
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/rebadvsearch.html)
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
REBASE
Baze de date pentru enzime
http://www.cazy.org/
CAZY – Carbohydrate-Active enZYme Database
Baze de date cu enzime specializate
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
CAZYpedia
http://bioinf.man.ac.uk/phosphabase/index.html
PhosphaBase (PhB) – baza de date pentru fosfataze
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
PhosphaBase (PhB) – baza de date pentru fosfataze
http://depod.bioss.uni-freiburg.de/
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
http://www0.nih.go.jp/mirror/Kinases/
PKR – the Protein Kinase Resource
Baze de date pentru enzime
https://randr.nist.gov/enzyme/Default.aspx
TECRDB
The Thermodynamics of Enzyme-catalyzed Reactions Database
Baze de date pentru enzime
TECRDB
Baze de date pentru enzime
http://enzymefunction.org/projects
EFI (Enzyme Function Initiative)
Scindarea legaturilor peptidice din lanturile proteinelor (enzimelor)
2. Caracterizarea enzimei3.2. Determinarea structurii primare
Proteaza Natura legaturii peptidice clivate
N-terminal -----XYZ----------C-terminal
X Y Z
Tripsina
Clostripaina
Chimotripsina
Elastaza
Papaina
Endoproteaza Glu-C
Pepsina
-
-
-
-
Phe
-
-
Lys, Arg
Arg
Trp, Tyr, Phe
Leu, Met, Ala
Lys
Glu, Asp
Phe
-
-
-
-
Leu si Trp
-
Phe, Trp, Tyr
CLASA Caracteristici inhibitor exemple functia
Serin proteaze situsul activ fluorofosfat tripsina digestia
H57, D102, S195 trombina coagulare sange
plasmina scindare cheaguri
subtilisina digestia
Cistein proteaze situsul activ iodoacetat papaina digestia
C25, H159, N175 strept. proteinaza digestia
catepsin B digestia
Acid proteaze pH optim acid diazocetone pepsina digestia
D32, D215 chimozina coagulare lapte
Metaloproteaze Zn2+, E270 o-phenanthroline carboxipeptidazele digestia
Zn2+, Ca2+ o-phenanthroline termolizina digestia
E143, H231
Scindarea legaturilor peptidice din lanturile proteinelor (enzimelor)
2. Caracterizarea enzimei3.2. Determinarea structurii primare
Tripsina-scindeaza la legaturile peptidice Lys/Arg
3. Caracterizarea enzimei3.2. Determinarea structurii primare
Exemplu de proteaze
Scindarea metioninei
3. Caracterizarea enzimei3.2. Determinarea structurii primare
Scindare chimica
Enzima
puraReactii de
clivare
Etapa 1 Amestec de
fragmenteSepararea
fragmentelor
Etapa 2 Fragmente
purificate
Etapa 3
secventierea
Set de
secvente
individuale
Etapa 4
-clivarea
alternativa;
-separarea si
secventiereaSecventa
completa
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii primare
Amestec
complexProteoliza
PeptideSepararea
fragmentelor
HPLC Fragmente
purificate
LC-MS/MS
Izolare
peptidaFragmentare
(Spectru de masa)
Tripsina
Baza de date
Secvente
Complete
3. Caracterizarea enzimei3.2. Determinarea structurii primare
Pehr Edman
1972-secventa
fibrinogenului
Structura
primara
Mw
Localizare AA
Identificarea de parti functionale
Stabilirea unor relatii de evolutie
3. Caracterizarea enzimei3.2. Determinarea structurii primare
Determinarea pI
Structuri 3D determinate experimental http://www.rcsb.org/pdb/
Baze de date pentru proteine/enzime
http://www.expasy.org/proteomics
http://www.uniprot.org/ (pir.georgetown.edu)
http://www.nextprot.org/ Proteine umane
http://string-db.org/ Interactiuni dintre proteine
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Cea mai mare baza de date
5 milioane proteine
Expert Protein Analysis System ExPASy
Structura secundara descrie modalitatile de impachetare
ale lantului polipeptidic
-helix -pliata paralela
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare
Enzima/proteina noua
Secventa primara noua
Fara omologi in bazele de date
Transmembranara?
Situsuri de fosforilareStructura
secundara care
poate fi intuita
Predictia elementelor de structura secundara
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare
Elementele de tip -helix Glu, Leu, Ala >30-40%
Elementele de tip -pliat Val, Ile >40-50%
Intoarceri de tip Gly, Pro
Ser, Asp, Asn >30%
http://nptel.ac.in/courses/
Baze de date – structura secundara
http://biotools.umassmed.edu/cgi-bin/biobin/garnier
MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQE
VLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKA
SE DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIK
PLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKH
PGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG
Structura primara a mioglobinei umane P02144 (UniParc)
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare
Elementele de -helix
http://www-nmr.cabm.rutgers.edu/bioinformatics/
Proteomic_tools/Helical_wheel/
Elementele de -helix si -pliate - GARNIER
http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/
Baze de date – structura secundara
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare
JPRED
PSI PRED
http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/
COILS (elemente spiralate)
http://www.ch.embnet.org/cgi-bin/COILS_form_parser
Motivul
Michael Rossmann
Structura butoi TIM
Motivele structurale – sunt segmente scurte cu regiuni similare
Majoritatea 10-20 AA
Motivele comune → lanturi de AA → domeniile transmembranare→ situsuri de fosforilare
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare/supersecundare
Alte motivele structurale
2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare/supersecundare
Situsul activ al aspartil proteazelor
PROSITE
http://prosite.expasy.org/
HPTPKKLHRGGGLTSPPTLQQVLPNQDLASILPVIPLDPARRPVIKAQV
DTQTSHPKTIEALLDTG ADMTVLPIALFSNNTPLKDTSVLGAGGQTQD
HFKLTSLPVLIRLPFRTTPIVLTSCLVDTKNNWAI IGRDALQQCQGVLYL
PEAKRPPVILPIQAPAVLGLEHLPRPPEISQFPLNQNASRPCNTWSGR
PWR QAISNPTPGQEITQYSQLKKPMEPGDSSTTCGPLTL
NCBI protease, partial [Human T-lymphotropic virus 1]
Protein kinaza C –situsuri de fosforilare din proteine
ST-xRK
Determinarea structurii tertiare
Puterea catalitica
Specificitatea
enzimelor
Structura
tertiara
Structura
primara
Structura
3DDifractie
raze XRMN
Difractia cu raze X
K
Difractia cu raze X
Determinarea structurii proteinelor prin difractie cu raze X:
1. Cristalizarea proteinei
2. Imprestierea radiatiei X de catre planurile cristalului
3. Din diagrama de difractie este modelata harta densitatii electronice
4. Contruirea unui model de proteina pe baza densitatii electronice
Difractia cu raze X
Deducerea fazei razelor imprastiate
Insertie
atomi
grei
Hg
U
Pt
Densitate
electronic
a mare
E-CH2-SH + CH 3-Hg-NO3
E-CH2— —OH + I2 E-CH2— —OH
I
+ HI
E-CH2-S-Hg- CH3 + NO3- + H+
catena laterala
a cisteinei
catena laterala
a tirozinei
Imprastierea
razelor X
Harta densitatii electronice a complexuluiProteina talomera-ADN
Cristalografie cu raze XHarta tridimensionala
de densitate electronica
Harta de densitate electronica a moleculeler
unghi de refractie mic Rezolutie modesta (5-6 Å)Forma
generala
Spoturi cu unghi
de refractie mai mareRezolutie medie (3,5 Å)
Traseu lant
polipetidic
Spoturi cu unghi
de refractie mai mareRezolutie medie (3 Å)
Catena
laterala
Spoturi cu unghi
de refractie mai mareRezolutie buna (2,5 Å) Determinarea
pozitiei atomilor
±0,4 Å
Spoturi cu unghi
de refractie mai mare
cristal omogenRezolutie mare (1,9 Å) Pozitia atomilor
±0,2 Å
Harta densitatii electronice
Structura primara
Legaturi
amidice
Resturi din
catena laterala
Structura tridimensionala
Structura quasistatica
rotatii vibratii
hexokinaza
Legarea ligandului
la substrat
Modificari
conformationale
Structura oxi- si deoxihemoglobinei
Accesul oxigenului la hemul hemoglobinei
Difractia cu raze X
Atomi de H
Pozitia atomilor de H
Densitate
de e- redusa
Difractie cu
neutroni
Imprastierea
neutronilor
Localizarea atomilor de H
Sincroton-producerea de neutroni
The beam makes about 104 orbits inside the synchrotron as it is accelerated before being kicked in a single
revolution into the extracted proton beam line, delivering 4 μC of protons in two 100 ns long pulses to a tungsten
spallation target. The entire acceleration process is repeated 50 times per second, so that a mean current of 200 μA
is delivered to the target, with a neutron yield of about 30 n/proton.
Determinarea structurii in solutie
Stingerea fluorescentei
Schimb izotopic (H-D)
RMN
Structuri
flexibile
Dicroism circular
in solutie
Tripsinogen Tripsina
Clivare
proteolitica
N-terminal
Lant flexibil
Difractie cu
neutroni
Mioglobina
In 95%D2O
Modificarea
legaturilor
amidice
RMN
tirozina
fenilalanina
Structura 3D
a enzimelor
Modele teoretice
Mecanisme de reactie
Similaritati structurale
Motivul Rossman Caseta de legare
a nucleotidelor
alcool dehidrogenazalactate dehidrogenaza
Motiv
Rossman
Resturi implicate
cataliza
stabilitate
Structura cuaternara
Interactiuni dintre monomeri
Neuramidaza
tetramerAldolaza KDPG
trimer
Insulina hexamer Kinaza-octamer
Interactiuni dintre monomeri
Subunități diferite – situsuri diferite
Aspartat carbamoilaza R6C6
http://oregonstate.edu/
Freeman, Biochemistry, 2012
10-20% din volumul total al enzimei
Situsul activ al enzimelor
Interactiunea enzima-substrat in absenta sau prezenta cofactorului
Bugg, T.-Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry,Blackwell Publishing, 2004
“Deschizatura” hidrofoba
O retea de grupari din
catena laterala a aminoacizilor
Situsul activ
4 tipuri de interactiuni enzima-substrat
Situsul activ al enzimelor
Interactiuni electrostatice
Rest de acid dicarboxilic
Rest de acid dicarboxilic Substrat-Grupare (+)
Legaturi de hidrogen
Substrat/ligandul
grupari polate
Luciferaza luciferin-AMP
http://photobiology.info/
Interactiuni enzima-substrat
Situsul activ al enzimelor
Interactiuni nepolare (Van der Waals, distante mici 2-4 A)
Interactiuni hidrofobe
http://faculty.samford.edu/ Interactiuni ale izoniazidei (gri) cu
arilamin N-Acetil transferaza
Areej M. et al. Probing the architecture of
the Mycobacterium marinum arylamine
N-acetyltransferase active site,
Prot Cell, 2010, 1(4): 384-392
Mentinerea structurii tertiare
Grupari din situsul catalitic
Situsul activ al enzimelor
Situsul activ al fosfatazei alcaline din Ecoli
Millab-Mammalian Alkaline Phosphatase,Willey, 2006
Obtinerea de enzime mutante
https://www.neb.com/
1982
Beta-lactamaza
Tirozil-transfer
ARN sintaza
Mutageneza Proprietatile enzimelor
stabilitate
Modificarea
specificitatiiEficienta catalitica
kcat/Km
Temolizin proteaza
Stabilizarea enzimelor
B.Strearothermophilus
Mutatii specifice: A4T, T56A, G58A, T63F, S65P, A69P
Introducere 2 cisteine: N60C si G8C
Van den Burg et al. PNAS 95 (1998)
8 mutatii specifice temperatura optima 58 0C
37 0C (nativa)
Stabilizarea enzimelor
McGrath-Directory of therapeutic enzymes-CRC Press-2006
O noua xiloz-izomeraza
producerea siropului de fructoza
Stabila in solutie 60–70°C
Mai putin susceptibila la glicozilare (T)
t1/2 (60°C) >1550h
nativa 607 h.
Whiterhouse-Enzyme in food technology-CRC Press-2002
Stabilizarea enzimelor
McGrath-Directory of therapeutic enzymes-CRC Press-2006
Structura enzimei
Primara
Secundara
Super-secundara
Tertiara
Cuaternara
indol + 3-glicerol-fosfatindol-3-glicerol-fosfatSubunitatea
Subunitatile 2indol + serina triptofan
Triptofan sintaza
Subunități diferite – situsuri diferite
Busch,F. et al., Ancestral Tryptophan Synthase Reveals
Functional Sophistication of Primordial Enzyme
Complexes, Cell Chemical Biology, 23, 1-7, 2016
Hur,O., Leja, C., Dunn, MF., Biochemistry,
35, 7378-7386,1996.
Complexul piruvat dehidrogenazei - purtator grupe acil
Complex multienzimatic - 60 subunitati:
24 - dihidrolipoil transacetilaza
24 - piruvat dehidrogenaza
12 - dihidrolipoil dehidrogenaza
Diagrama de reacție catalizată de complexul enzimatic
al piruvat dehidrogenazei (L- gruparea lipoamidica)
Complexul piruvat dehidrogenazei - purtator grupe acil
E2 dihidrolipoil transacetilaza
8 trimeri aranjati dupa o simetrie cubica
Complexul din biosinteza pirimideinelor
Trei enzime:
CPSaza – carbamil fosfat sintetaza
GLN activitate amido trensferazica/glutamina
SYN activitate sintetazica
ATCaza – Aspartat transcarbamilaza
DHOaza - dihidrorotaza
Alte complexe enzimatice
Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GPDH)
Fosfoglicerat kinaza (PGK)https://encrypted-tbn2.gstatic.com/
Difuzia rapida a intermediarului de la o enzima la alta
Canalizarea compusilor de-a lungul complexului
Protejarea intermediarilor instabili
Transfer intermolecular rapid
Avantajele complexelor multienzimatice
http://www.frontiersin.org
Evitarea reactiilor nedorite
Toate reactiile au loc in cadrul aceluiasi complex
Recommended