BCM 2504J.W. Keillor - Inhibition enzymatique Enzymologie Inhibition enzymatique

BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie

Enzymologie

Inhibition enzymatique

Prof. Jeffrey W. Keillor

• courriel : jw.keillor@umontreal.ca• site-web : http://www.esi.umontreal.ca/~keillorj/

• tél : 343-6219

• local : F-516

• période de disponibilité : par rendez-vous

• notes de cours et diapos disponibles sur ma page web

Inhibition enzymatique

• inactivation d’une enzyme (ralentissement de la réaction enzymatique) par la liaison d’une petite molécule– différente que la dénaturation

Types d’inhibition

• réversible– compétitive– incompétitive– noncompétitive

• irréversible– par marqueur d’affinité– par inhibition suicide

Inhibition compétitive

• la liaison de l’inhibiteur, à l’enzyme libre, empêche la liaison du substrat

E E•S E + P k1, S k2

Inhibition compétitive alternative• la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, empêche la

liaison du substrat par encombrement stérique• la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, induit un

changement conformationnel qui empêche la liaison du substrat

Exemple de l’inhibition compétitive

• l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison :

HO2C CH2 CH2 CO2H

acide succiniqueHO2C

acide fumarique

Enz•FAD + Enz-FADH2

HO2C CH2 CO2H

acide malonique

Enz•FAD•Succ

Enz•FAD•Mal

l’oxaloacétate est aussi un inhibiteur compétitif:

HO2C-CO-CH2-CO2H

J. Biol. Chem. (2006) 281, 5965-5972.

Équations pour l’inhibition comp.

• conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•I]

• substitution en fonction de E•S :

– état stationnaire :

– constante d’inhibition :

S]•[E

[E][S]

I]•[E

]I][E[i K

120 [S]

[S]S]•[E]E[

]I[1]S[

]S[]E[

KM augmente

Graphique d’inhibition compétitive

v = Vmax = kcat [E]0

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

KMapp'

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition compétitive

]I[1]S[

pente = KM / Vmax

1 / Vmax

-1 / KM

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition compétitive

-1 / KMapp'

-1 / KMapp

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

maxmax

lignes se croisentsur l’axe-y (1/Vmax)

lignes se croisentsur l’axe-y (Vmax)

v / [S]

Graphique Eadie-Hofstee d'inhibition compétitive

pente = -KM

Vmax / KM

[I] = 0[I] = Ki[I] = 2 Ki

Vmax / KMapp

Vmax / KMapp'

pente = -KMapp

pente = -KM app

]I[1 V

[I]-Ki

Détermination de Ki (compétitive)

• équation pour l’augmentation de KM :

]I[]I[

appM K

ou les pentes LB(KM/Vmax)

Équation pour IC50 (compétitive)

• équations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 :

N.B. : IC50 > Ki

IC1]S[

i50 ]S[IC K

50M ]S[2

IC1]S[ K

Inhibition incompétitive

• l’inhibiteur est lié par le complexe E•S

EnzEnz

produits

k-i ki, I

E•S•I

ne mène pas aux produits

Exemple de l’inhibition incompétitive

• inhibition de la phosphatase alkaline par la L-phénylalanine:

5'-ADN -2O3P Enz 5'-ADN•Enz-2O3P 5'-ADNHO HOPO3-2 +

5'-ADN•Enz•Phe-2O3P

J. Mol. Biol. (2005) 350, 441–451

k-i ki, I

E•S•I

[S][E]

[S]]I[

[S][E]]S•E[

Équations pour l’inhibition incomp.

• conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I]

– état stationnaire :

– constante d’inhibition :

S]•[E

[E][S]

KM et Vmax

diminuent

I]•S•[E

]I][S•E[i K

[E]0 = [E•S] +

S]•[E

]I[S]•[E

Graphique d’inhibition incompétitive

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

KMapp'

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incompétitive

pente = KM / Vmax

1 / Vmax

-1 / KM

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition incompétitive

-1 / KMapp'

-1 / KMapp

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

1 / Vmaxapp

1 / Vmaxapp'

lignes parallèles

maxmax

lignes se croisentsur l’axe-x (Vmax/KM)

v / [S]

Graphique Eadie-Hofstee d'inhibition incompétitive

pente = -KM

Vmax / KM

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

Vmaxapp

Vmaxapp'

pente = -KMapp

pente = -KM

S][]I[1

[I]-Ki

1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki

1/Vmax

Détermination de Ki (incompétitive)

• équation pour la diminution de Vmax :

ou bien 1/KM

maxappmax ]I[

Équation pour IC50 (incompétitive)

• équations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 :

N.B. : IC50 > Ki

[S]]I[

50M [S]IC

[S]IC Mi

Inhibition non-compétitive

• l’inhibiteur est lié par l’enzyme libre et par le complexe E•S

Enz Enz

produits

I Ki'Ki

E•S•I

E•Ik1', S

Enz Enz•FBP

Enz•AMP Enz•FBP•AMP

AMP AMP

fructose-1,6-bisphosphate(FBP) H2O

Enz + fructose-6-phosphate

Exemple de l’inhibition non-comp.

• inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :

Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 12482-12486

Équations pour l’inhibition noncomp.

• conservation de masse :

[E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I] + [E•I]

– état stationnaire, constantes d’inhibition (Ki et Ki')

Vmax diminue;KM peut augmenter ou diminuer

E•S•I

E•Ik1', S

Inhibition non-compétitive simple

• l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e. Ki = Ki')

– KM n’est pas affecté

– Vmax est diminué par le facteur de

E•S•I

E•Ik1', S

Graphique d’inhibition non-compétitive simple

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple

pente = KM / Vmax

1 / Vmax

-1 / KM

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive simple

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

1 / Vmaxapp

1 / Vmaxapp'

pente = KM / Vmaxapp

pente = KM / Vmaxapp'

lignes se croisentsur l’axe-x (-1/KM)

maxmax

v / [S]

vGraphique Eadie-Hofstee d'inhibition noncompétitive simple

pente = -KM

Vmax / KM

[I] = 0[I] = Ki

[I] = 2 Ki

Vmaxapp

Vmaxapp'

Vmaxapp / KM

Vmaxapp' / KM

lignes parallèles

[I]-Ki

1/Vmax

Détermination de Ki (non-compétitive simple)

maxappmax ]I[

Inhibition non-compétitive mixte

• l’affinité de l’inhibiteur dépend de la présence de substrat (i.e. Ki Ki')

– Vmax est toujours diminué par le facteur de

– KM est affecté selon Ki et Ki'

E•S•I

E•Ik1', S

• lorsque Ki < Ki', KM augmente et l’inhibition ressemble à l’inhibition compétitive :

pente = KM / Vmax

1 / Vmax

-1 / KMapp

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive mixte

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

1 / Vmaxapp

1 / Vmaxapp'

pente = KMapp

/ Vmaxapp

pente = KMapp'

/ Vmaxapp'

Ki' = 2 Ki

-1 / KM

-1 / KMapp'

lignes se croisententre les axes

pente = KM / Vmax

1 / Vmax

-1 / KMapp

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive mixte

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

1 / Vmaxapp

1 / Vmaxapp'

pente = KMapp

/ Vmaxapp

pente = KMapp'

/ Vmaxapp'

Ki = 2 Ki'

-1 / KM

-1 / KMapp'

• lorsque Ki > Ki', KM diminue et l’inhibition ressemble à l’inhibition incompétitive :

lignes se croisenten-dessous l’axe-x

[I]-Ki

1/Vmax

Détermination de Ki' (non-compétitive mixte)

maxappmax ]I[

Détermination de Ki (non-compétitive mixte)

• équation pour la variation de KM :

appmax

appM ]I[

[I]-Ki

pente du graphique LB,KM

app/Vmax

KM/Vmax•Ki

KM/Vmax

app/Vmax

KM/Vmax•Ki

KM/Vmax

[I]-Ki

app/Vmax

KM/Vmax•Ki

KM/Vmax

Équation pour IC50 (non-comp. simple)

• équations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 :

N.B. : seulement Vmax est affecté par I; cet effet est indépendant de [S]

i50IC K

Graphiques de Dixon

• façon alternative pour déterminer la valeur de Ki en faisant un graphique de 1/v vs [I]

• pour l’inhibition compétitive et non- compétitive simple, les lignes se crosient où [I] = -Ki

• pour inhibition incompétitive, les lignes sont parallèles et c’est impossible de mesurer la valeur de Ki de cette façon

Graphique de Dixon (compétitive)

Graphique Dixon d'inhibition compétitive

[S] = KM

[S] = 2 KM

[S] = 3 KM

]S[]I[

lignes se croisentoù [I] = -Ki

Graphique Dixon d'inhibition noncompétitive (simple)

[S] = KM

[S] = 2 KM

[S] = 3 KM

Graphique de Dixon (non-comp. simple)

lignes se croisentoù [I] = -Ki

S][]I[1

Graphique Dixon d'inhibition incompétitive

[S] = KM

[S] = 2 KM

[S] = 3 KM

Graphique de Dixon (incomp.)

lignes ne secroisent pas

S][]I[

Mécanisme d’inhibition

• le mode d’inhibition peut donner des informations sur le mécanisme d’inhibition

• faisons l’analyse cinétique détaillée du schéma suivant :

E' E'•S E P

• état stationnaire pour E'•S :

• état stationnaire pour E' :

• alors :

• donc :

E' E'•S E P

+k7 • vitesse : v = k7 [E'S]

• conservation de masse : [E]T = [E] + [E'] + [E'•S] + [E • I]

• cste d’inhibition : 1

2i I]•[E

]I][E[

E'•S][]S[

]S[E'•S][]E[

]I][S[]I[E'•S][]I•E[

T ]I[1

]I[1]S[

E'•S][

]E[kkk

• équation Michaelis-Menten pour inhibition :

E' E'•S E P

+k7 • d’où vient :

73cat kk

7643M kkk

]S[]E[

inhibition non-compétitive!!

Vmax diminue;KM peut augmenter ou diminuer

• l’inhibiteur ne se lie pas à la forme de l’enzyme qui lie le substrat; donc, pas compétitif

• l’inhibiteur ne se lie pas au complexe enzyme-substrat; donc, pas incompétitif

• donc, l’inhibiteur est non-compétitif• on voit que les profils d’inhibition ne sont pas exclusifs

pour un seul type de mécanisme

E' E'•S E P

Inhibition de réaction avec multiples substrats

• pour élucider un mécanisme enzymatique, on peut étudier l’effet cinétique de la variation des :– substrats : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [S2];

1/v vs 1/[S2] en fonction de [S1]…

– produits : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [P1], [P2];1/v vs 1/[S2] en fonction de [P1], [P2]…

– inhibiteurs : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2];1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2]…

• le patron d’inhibition observée aide surtout à déterminer l’ordre de liaison des substrats

Inhibition d’un mécanisme ordonné

• par exemple, pour le schéma ci-dessus :– I1 est compétitif avec B et incompétitif avec A

• I1 lie la même forme de l’enzyme que B, et se lie après A

– I2 est compétitif avec A et non-compétitif avec B

• I2 lie la même forme de l’enzyme que A, et se lie avant B

E•A E•A•B

E•A•I1

E•P•Q

E•I2

Règles de Cleland

• dans le cas où I se lie à E avant S, l’inhibition est :– compétitive lorsque : i) I et S lient la même forme de E, ou

ii) I et S se lient à deux formes de E en équilibre rapide

– incompétitive lorsque : I et S se lient à des formes différentes de E séparées par

une étape irréversible– non-compétitive lorsque : I et S se lient à des formes

différentes de E reliées par une réaction réversible ou une

séquence de réactions réversibles

Règles de Cleland

• dans le cas où I se lie à E après S, l’inhibition est :– incompétitive - toujours.

Analyse selon les règles de Cleland

S et I lientla mêmeforme

d’enzyme?

compétitive

non S se lieavant I?

incompétitive

toutes étapesentre I et S

sont réversibles?

non nonincomp.

non-compétitive

• inhibition par inhibiteur, I

E•I1

E•P•Q•R

E•A•I2

E•A•BE•AE P Q R E + + +

E•A•B•C

E•A•B•I3

I1 I2 I3

1/v vs 1/[A] comp. incomp. incomp.

1/v vs 1/[B] non-comp. comp. incomp.

1/v vs 1/[C] non-comp. non-comp. comp.

Exercice: Ordre de liaison de substrats

• dessinez le schéma mécanistique ordonné, en précisant l’ordre de liaison des substrats A et B et de l’inhibiteur I, étant donné le patron suivant de modes d’inhibition : I1

1/v vs 1/[A] comp.

1/v vs 1/[B] incomp.

Règles de Cleland – étapes irrév.

• une étape est considérée d’être irréversible si elle implique :– la dissociation d’un produit (où [P] 0)– la liaison d’un substrat (où [S] saturante)– un grand changement d’énergie libre (où G°<<0)

• aux concentrations non-saturantes de substrats :

E•R E E•Q•RE•A•BE•A

Si I se lie à : 1/v vs 1/[A] 1/v vs 1/[B] 1/v vs 1/[C]

E comp. non-comp. incomp.

E•A incomp. comp. incomp.

E•A•B incomp. incomp. incomp.

F incomp. incomp. comp.

E•Q•R incomp. incomp. incomp.

E•R incomp. incomp. incomp.

irréversible

non-comp.

Règles de Cleland

• dans le cas où E est inhibée par les produits de la réaction ([P] 0 !), l’inhibition est :– compétitive lorsque : P et S se lient à la même forme de E– incompétitive lorsque : P et S se lient à des formes

différentes de E séparées par une étape irréversible

– non-compétitive lorsque : P et S se lient à des formes différentes de E reliées par

une réaction réversible ou une séquence de

réactions réversibles

Analyse selon les règles de Cleland

• inhibition par produit, P– vers la fin d’une réaction, où [P] 0

S et P lientla mêmeforme

d’enzyme?

compétitive

toutes étapesentre P et S

sont réversibles?

non nonincompétitive

non-compétitive

E•A E•A•B E•P•Q E E•Q

Inhibition par produit:

Substrat variable :

Profils aux conc. non-saturantes :

Si [A] est saturante :

Si [B] est saturante :

Q A comp. comp.

Q B non-comp. pas d’inhib.

P A non-comp. incomp.

P B non-comp. non-comp.

Inhibition d’un mécanisme ping-pong

Inhibition par produit:

Substrat variable :

Profils aux conc. non-saturantes :

Si [A] est saturante :

Si [B] est saturante :

Q A comp. comp.

Q B non-comp. pas d’inhib.

P A non-comp. pas d’inhib.

P B comp. comp.

E•Q E E-X•PE•A E

E-X E-X•B

Inhibition de liaison lente

• parfois l’équilibre de liaison d’inhibiteur est lent à atteindre– pour les inhibiteurs lents, ça prend des

secondes ou minutes pour atteindre l’état stationnaire, plutôt que des millisecondes

– l’affinité peut quand même être forte (Ki faible) mais les constantes de vitesses pour les étapes de liaison et dissociation sont petites

E I E•I +k1

Ki = k1

Effet cinétique de la liaison lente

• établissement lent de l’équilibre entre l’enzyme libre et le complexe E•I :

sans I

Sans pré-incubation avec inhibiteur; réaction initiée avec enzyme

Enzyme pré-incubée avec inhibiteur; réaction initiée avec substratFormation

de E•I

Dissociationde E•I

(cf liaison rapide)

Inhibition par liaison lente à forte affinité

• inhibition classique : – ça prend beaucoup de I– [I] et [S] >> [E]– [I] [I] ajoutée (équilibre rapide et constant)– v [E], en absence et en présence de l’inhibiteur

• inhibition de forte affinité : – ça prend peu de I– [I] [E]– [I] [I] ajoutée (la formation de E•I réduit [I] libre)

– v vs [E] n’est pas linéaire+ E•I I E

Exemple de l’inhibition lente à forte affinité

• les enzymes effectuent la catalyse en stabilisant l’état de transition d’un réaction; alors, elles ont beaucoup d’affinité pour des analogues d’état de transition

• 5'-méthylthioadenosine/S-adenosylhomocystéine nucléosidase (MTAN) catalyse l’hydrolyse du nucléoside en base et thioribose :

• des études mécanistiques suggèrent l’allure que devrait avoir l’état de transition de la réaction, et la modélisation a aidé la conception des analogues :

• des analogues d’état de transition donnent souvent l’inhibition lente parce que l’enzyme ajuste sa conformation comme elle ferait lors de la catalyse :

E•I E*•I

EE•S P+ S +

K i =[E][I]

[E•I]

K i* =[E][I]

[E*•I]

très stable

J. Biol. Chem. 2005, 280, 18274

Identification de l’inhibition à forte affinité

1. les concentrations (mesurées) de l’enzyme et de l’inhibiteur sont similaires

2. le Ki est très faible et/ou la régénération de l’enzyme est lente (petite k-i)

3. l’inhibiteur est difficile à séparer de l’enzyme (par dialyse ou filtration de gel)

4. le degré d’inhibition varie avec la concentration d’enzyme (IC50 avec [E])

5. les courbes de Ackermann-Potter (v vs [E]) ne sont pas linéaires

Exemple de l’inhibition de forte affinité

• le methotrexate est un analogue de l’acide folique qui inhibe très fortement et de manière compétitive la réductase de dihydrofolate (DHFR)

• Ki est de 6 × 10-11 M et la demi-vie de E•I est de plusieurs heures in vivo

DHFR•MTX

DHFR•DHF DHFR THF +

methotrexate

acide folique, DHF

à calculer !

J. Mol. Biol. (2000) 295, 307-323

Courbes de Ackermann-Potter

Inhibition classique[I]>>[E] ;

à [I] constante, v [E]

Ki élevé

[I]=0[I]=x

Ki très faible

+ E•I I EKi

perte d'activité dueà la formation de E•I

[I]>[E]

[I][E]

[I]<[E]

Inhibition de forte affinité[I][E] ;

à [I] constante, v vs[E] non-linéaire à cause du déplacement de l'équilibre

concs. similaires

• à Ki > [E] et [I], faible déviation de la linéarité :

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

Ki = 6 nM

[I] = 0 nM 1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM

• à Ki < [E] et [I], forte déviation de la linéarité :

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

Ki = 0.6 nM

[I] = 0 nM

1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM

• à Ki << [E] et [I], très forte déviation de la linéarité :

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

Ki = 0.06 nM

[I] = 0 nM

1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM

• à Ki <<< [E] et [I], on a le titrage stoechiométrique :

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

Ki = 0.006 nM

[I] = 0 nM

1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM

pas d’inhibition;v [E] à [E]>[I]

ligne décaléepar [I]

Équations pour IC50 (forte affinité)

• équations pour les trois modes d’inhibition réversible :

N.B. : IC50 ½ [E]T

150 ]S[]E[IC K

[S]]E[IC Mi

50 ]E[IC K

Mode d’inhibition Équation

compétitif

incompétitif

non-compétitif (simple)

Tableau sommaire des inhibiteurs réversibles

Classe d’inhibiteur

Relation entre

[E]T et [I]T

Atteint de l’équilibre entre E,

I et E•I

Traites caractéristiques

classique [I]T >> [E]T rapide · IC50 ne dépend pas de

[E]T ; v vs [E]T linéaire

· [P] vs temps linéaire

« tight-binding » [I]T [E]T rapide · IC50 dépend de [E]T ;

v vs [E]T non-linéaire

· [P] vs temps linéaire

« slow-binding » [I]T >> [E]T lent · IC50 ne dépend pas de

[E]T ; v vs [E]T linéaire

· [P] vs temps non-linéaire

« slow, tight-binding »

[I]T [E]T lent · IC50 dépend de [E]T ;

v vs [E]T non-linéaire

· [P] vs temps non-linéaire

Inhibition irréversible

• pour des inhibiteurs réversibles, on utilise le Ki comme un indice de l’efficacité de l’inhibition

• pour les inhibiteurs irréversibles, on utilise le kinact et le KI

• il y a deux types d’inhibiteurs irréversibles :– réactifs du site actif (marquage par affinité)– inhibiteurs basés sur le mécanisme

(substrats « suicide »)

Marqueurs par affinité

• démontrent la spécificité envers un groupement fonctionnel des acides aminés du site actif– analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans

les site actif– comprennent aussi un groupement réactif

(pharmacophore) – typiquement un électrophile qui réagit avec un nucléophile dans le site actif

• possèdent un seul site saturable et réagissent de manière stœchiométrique (1 mol de I/mol de E)

Marquage par affinité

• l’enzyme est protégée contre cette inhibition par le substrat (ou co-facteur)

• la perte d’activité suit une cinétique de premier ordre, parce que l’enzyme est consommée comme un réactif pendant la réaction

• l’inhibition est accompagnée de la modification covalente de l’enzyme :– l’enzyme demeure inactive après la séparation de

l’excès de l’inhibiteur– l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou

filtration sur gel (ou sur membrane) même après la dénaturation de l’enzyme

Exemples de marquage par affinité

TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)• ressemble un amide de la phénylalanine, mais le

groupement chlorométhyle cétone effectue l’alkylation de la His57 de la chymotrypsine :

DIFP (diisopropyl phosphofluoridate)

• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine :

PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)

• utilisé pour inhiber des protéases et réagit aussi avec des résidus de sérine :

Exemples de marquage par affinité Autres exemples :

H2C HO

OPO3-2

OPO3-2 O

OPO3-2

OCH2OH

OCH2CH

Ile-tRNAIle

Ile-tRNAIle CH2C Br

Enzyme Substrat Marqueur par affinité

Triosephosphate isomerase

Lysozyme

Isoleucyl-tRNA synthetase

Marquage par photoaffinité

• on utilise des inhibiteurs qui sont stables en absence de lumière et activés par la photolyse après association avec l’enzyme

• deux exemples :– les groupes diazo qui génèrent des carbènes :

– les azotures qui génèrent des nitrènes :

carbone à six électrons

azote à six électrons

hvN3 R NR

Réactions du groupement nitrène

(peut réagir avec n’importe quoi !!)

Analyse cinétique

• liaison rapide à l’équilibre de l’inhibiteur suivie de la formation lente et irréversible d’un complexe inactif :

k1 k-1KI =

E I E•I E I+k1

kinact

complexe covalentinactif

• la proportion d’enzyme sous forme E•I augmente avec la concentration de I

• E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre

Mesure de kinact

• kinact peut être déterminée en mesurant la perte d’activité en fonction du temps (kobs) à différentes concentrations d’inhibiteur :

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Temps (min)

[I] = 0

[I] = 0.2 × KI

[I] = 0.5 × KI

[I] = 2 × KI

[I] = KI

constante de vitesse = kobs

Mesure de kinact

• l’activité qui reste à un moment donné est proportionnelle à la concentration totale des formes d’enzyme qui ne sont pas inactivées : = [E] + [E•I]

• vitesse d’inactivation :

• constante d’inhibition :

• alors et

• après intégration :

I]•[E

]I][E[

]I•E[t inactk

]I[1I]•[EI]•[E

I]•[E II KK

I]•[EIK

]I[1 I

inactobs

kk relation hyperbolique;

cf équation M-M

-1 0 1 2 3 4 5

1/kinact

pente = KI / kinact

Mesure de kinact

• forme double réciproque :

• graphique linéaire :

inactobs

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Temps (min)

en absence de substrat

en présence de substrat

Mécanisme d’inactivation• si la cinétique d’inactivation est de seconde ordre,

l’inactivation se fait entre E et I en solution• si la cinétique d’inactivation est de premier ordre,

l’inactivation a lieu à partir du complexe E•I• si l’enzyme est protégé par le substrat, l’inhibiteur

se lie au site actif de l’enzyme :

protection partielle;inhibition irréversible

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

mole de I par mole de E

Modification sélective• indiquée par :

– la formation d’un complexe stœchiométrique (1:1) entre E et I

– correspondance entre les cinétiques d’inhibition et le degré d’incorporation covalente de l’inhibiteur sur l’enzyme :

Inhibiteurs basés sur le mécanisme

• aussi appelés des « substrats suicides », ils doivent être activés par l’enzyme :

E I E•I E•I* E I +kcat rapide

• la plupart ont des kcat de 103 à 105 fois plus faibles que le substrat naturel (étape lente)

• même cinétiques de saturation et la réaction d’inactivation du premier ordre que celles des réactifs du site actif (marqueurs par affinité)

Démonstration de kcat au mécanisme

• deux critères pour impliquer le mécanisme d’action d’une enzyme au mécanisme d’inactivation :

1. l’inactivation est dépendante de la présence de cofacteur ou d’un deuxième substrat

2. d’autres informations mécanistiques de la réaction d’inactivation concordent avec celles déterminées pour la réaction normale du substrat naturel– par exemple : effets isotopiques, profil pH-vitesse,

Groupements activésC l a s s e S t r u c t u r e

a c é t y l è n e R R

o l é f i n e s ( a l c è n e s ) C H C H R R

s u b s t r a t s c o n t e n a n t d e s h a l o g è n e s R X

c y c l o p r o p a n e s R R

q u i n o n e s O O

a n a l o g u e s d e p é n i c i l l i n e N

C O O N a

c o m p o s é s t h i o n o ( = S ) C

typiquementélectrophiles

Exemple de réactions « suicide »

• inhibition de la déshydrase de thiolester -hydroxydécanoyle par un analogue acétylène :– réaction normale avec son substrat:

H2O-CR

thiolestertrans-,-décènoyle

réarrangementallylique

• inhibition de la déshydrase de thiolester -hydroxydécanoyle par un analogue acétylène :– réaction suicide avec un analogue acétylène:

même effet isotopique;même mécanisme

sérine du site actif

hydrolysenormale

piégeagecovalent

enzyme inactive

• inhibition de la -lactamase par des analogues de pénicilline :

• inhibition des transaminases par un analogue d’acide aminé :

formesinactives

Inhibition et formation de produit

• typiquement, une certaine quantité d’inhibiteur est transformée en produit, sans inactivation de l’enzyme

• le rapport r = k3/k4 représente la proportion molaire pour l’inactivation; le nombre de fois que le substrat est transformé en produit pour chaque fois qu’il inhibe plutôt

• r est constante et indépendante de la concentration de substrat ou d’enzyme; elle représente le partage d’un intermédiaire commun, E•I

E•I*E•II E E P +k1

Tableau sommaire des modificateurs chimiques

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