View
4
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
BÍLKOVINY = PROTEINY Polymery aminokyselin propojených peptidovou vazbou
20 AK → 2018 variant pro peptid složený z 20 AK!!!
Průměrná bílkovina ≈ 300 AK
Relativní molekulová hmotnost (bezrozměrné číslo)
Molární hmotnost (g/mol)
Molekulová hmotnost (Mh) - jednotka Dalton (Da) resp. kDa – 1/12
hmotnosti atomu 12C
Příklad: albumin 66 438 g/mol = 66438 Da = 66,438 kDa
Klasifikace proteinů
1. Funkce – specifické, obecné
2. Chemické složení
3. Tvar molekul
1. Funkce obecné: zdroj energie a dusíku
Účinné pufry (krev, cytosol)
Přispívají významně k udržení osmotického tlaku vně i uvnitř
buněk
1. Specifické funkce proteinů
Typ proteinu Příklad Výskyt & funkce
Katalytické (enzymy) Trypsin
DNA polymerasa
Hydrolysa peptidové vazby
Synthesa DNA
Regulační (hormony) Insulin
Růstový hormon
Stimulace metabolismu glc
Stimulace růstu kostí
Ochranné Protilátky
Interferon
Vazba na cizorodé látky
Brání replikaci virů
Skladovací Kasein
Ferritin
Mléčná bílkovina
Zásoba Fe v játrech
transportní Hemoglobin
Myoglobin
Transport O2 v krvi
Transport/skladování O2 ve
svalu
Strukturní Kolagen
Ribosomální
proteiny
Vláknité pojivové tkáně
Ribosomy
Kontraktilní Myosin
Aktin
Svalová vlákna
Genetické funkční
proteiny
Histony
Represory
Asociace s DNA
v chromosomech
Blokují expresi genu
Toxické proteiny Ricin
Cholera toxin
Toxický protein z Ricinus
communis
Bakteriální toxin
2. Chemické složení
• Jednoduché
• Složené – polypeptidová + neproteinová část
Metaloproteiny
Fosfoproteiny
Glykoproteiny
Lipoproteiny
Nukleoproteiny
Enzymy s prostetickou skupinou
3. Rozdělení proteinů podle tvaru molekul
• Globulární
• Fibrilární
• Membránové
Další možné způsoby dělení proteinů:
Podle lokalizace nebo dějů ve kterých působí:
Extracelulární x intracelulární
Krevní bílkoviny
Mléčné bílkoviny
Membránové receptory
Elektrontransportní systémy
Primární struktura bílkovin
pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci
zápis: od N-konce k C-konci
Primární struktura determinuje prostorové uspořádání a funkci proteinů
ZÁKONITOSTI:
• Primární struktura je zapsána v DNA (gen)
• Neexistuje společná sekvence, ani částečně
• Kombinace AK bez omezení
• Proteiny se stejnou funkcí z jedinců jednoho druhu jsou identické ale…
• Polymorfismus bílkovin vs mutace.
• Bílkoviny jeví druhovou specifitu (sekvenční homologie) - zákon
isopolárních záměn
N-konec C-konec
Cα
Homologie proteinů
% identity
% podobnosti
URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY
A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků
(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)
B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace
disulfidických můstků)
2. Určit N-konec a C-konec
3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)
4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech
5. Sestavit primární strukturu řetězce
6. Určit způsob propojení původních řetězců
2. Určení N-koncové AK
např.:
- DNF
- dansyl chlorid
2. Určení C-koncové AK
• Specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy)
• Redukce -COOH LiBH4 na -OH, identifikace aminoalkoholu
• Hydrazinolýza (NH2-NH2) – aminoacyl hydrazidy AK
URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY
A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků
(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)
B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace
disulfidických můstků)
2. Určit N-konec a C-konec
3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)
4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda
5. Sestavit primární strukturu řetězce
6. Určit způsob propojení původních řetězců
3. Specifické štěpení polypeptidového řetězce
Trypsin – štěpí specificky za basickými aminokyselinami Lys, Arg
Chymotrypsin – štěpí za aromatickými aminokyselinami (Phe, Tyr, Trp)
(CNBr – štěpí za Met)
• Separace peptidů (chromatografie)
• Určení sekvence – Edmanovo odbourání
N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp-Lys-His-Met-Arg-Trp-Gly-C
↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
leu-val-phe-asp-lys
Glu-tyr-gly-ile-arg
Ser-phe –thr-lys
Cys-pro-ala-trp-lys
His-met-arg
Trp-gly
Leu-Val-Phe
Asp-Lys-Glu-Tyr
Gly-Ile-Arg-Ser-Phe
Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp
Lys-His-Met-Arg-Trp
Gly
URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY
A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků
(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)
B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace
disulfidických můstků)
2. Určit N-konec a C-konec
3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)
4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda
5. Sestavit primární strukturu řetězce
6. Určit způsob propojení původních řetězců
4. Edmanova reakce určení pořadí AK v kratších úsecích (peptidech)
- reakce s fenylisothiokyanátem
příslušné AK
URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY
A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků
(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)
B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace
disulfidických můstků)
2. Určit N-konec a C-konec
3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)
4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda
5. Sestavit primární strukturu řetězce
6. Určit způsob propojení původních řetězců
5. Sestavení primární struktury – hledání překrývajících se sekvencí peptidů
URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY
A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků
(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)
B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace
disulfidických můstků)
2. Určit N-konec a C-konec
3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)
4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda
5. Sestavit primární strukturu řetězce
6. Určit způsob propojení původních řetězců
Kovalentní struktura
( primární struktura + posttranslační modifikace)
1. Propojení řetězců kovalentními vazbami, disulfidové můstky
2. Odštěpení částí řetězců (./.)
3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin – nekódované AK
4. Připojení mastných kyselin
5. Glykosylace (Asn, Ser/Thr)
6. Fosforylace (dočasné či trvalé)
7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...)
8. Metaloproteiny (koordinačně kovalentní vazby různé síly)
1 - 3: jednoduché bílkoviny
4 - 8: složené bílkoviny
2. Odštěpení částí řetězců - příklad
Obecné znaky prostorového uspořádání proteinů
(obecně „organisovaných“ biopolymerů)
1. Nativní struktura odpovídá minimu Gibbsovy energie, dané
výhodností nekovalentních interakcí
2. Nativní struktura je určena kovalentní strukturou
3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s
okolím (nevazebné interakce !).
4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické (primární,
kovalentní, sekundární, terciární, kvarterní struktura)
5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformačně
dynamické systémy)
6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).
•Nativní struktura (konformace) - prostorové uspořádání, jež
umožňuje biopolymeru vykonávat biologickou funkci
- Charakter peptidové vazby – planární uspořádání!!
- Vlastnosti postranních řetězců
Prostorové uspořádání proteinů je dáno
primární (kovalentní) strukturou :
trans konfigurace
60% 40%
Konformace peptidového řetězce
Torzní úhly Φ a Ψ
Plně natažený polypeptidový řetězec,
trans konfigurace – Φ=Ψ=180º až -180 º
Sterická omezení – postranní skupiny
Sekundární struktura proteinů
obecné charakteristiky
Pravidelné nebo periodické uspořádání polypeptidového řetězce
Vzájemné prostorové uspořádání blízkých částí řetězce
Fixovány především vodíkovými můstky NH …..CO
Linus Pauling, Robert Corey (1951)
Předpoklady: • Peptidová vazba a okolní atomy Cα tvoří planární útvar a jsou v trans
konfiguraci
• Vazebné úhly a meziatomové vzdálenosti v proteinech odpovídají těmto
veličinám v malých organických molekulách
• Prostorové uspořádání proteinů vyžaduje tvorbu maximálního počtu
vodíkových můstků
α-helix a β-struktury
parametry:
Stoupání závitu: 0.54 nm
3,6 Ak zbytku/závit
Počet atomů 11
α- helix pravotočivá šroubovice
Ochota polypeptidového řetězce tvořit helikální struktury závisí na:
a) Přítomnosti AK zabraňujících tvorbě α-helixu – prolin, hydroxyprolin
b) AK s objemnými postranními řetězci
c) Iontové interakce – závisí na pH – př. polylys, polyglu
β-struktura (skládaný list)
•Stabilizace – meziřetězcové vodíkové můstky
Pozor: Pravidelné sekundární struktury netvoří celý
řetězec
β-ohyby: -X-gly-pro-Y-
X,Y – polární AK
Další pravidelné struktury
Vyšší pravidelné struktury - motivy
Vyšší pravidelné struktury - motivy
Terciární struktura
Prostorové uspořádání vzdálených částí řetězce
Fixace disulfidovými můstky a nekovalentními interakcemi!!
Terciární struktura
Karbonanhydrasa
•Prostorové uspořádání všech částí
polypeptidového řetězce
•Správné uspořádání je podmínkou
funkce (biologické aktivity)
•Zahrnuje:
nevazebné interakce
disulfidové můstky
nebílkovinné složky
rentgenostrukturní analysa
• globulární – nižší obsah sek. struktur, core x obal,
• fibrilární – vláknité, tyčovité, dlouhé úseky sekundárních struktur
Kvarterní struktura uspořádání podjednotek
Domény
Příklady bílkovin s kvarterní strukturou
Bílkovina Rel.mol.hm
oligomeru
(Da)
Počet
podjed-
notek
Charakter, funkce
hemoglobin (lidský) 64 500 4 2 + 2 podjednotky dvou typů (22
tetramer), přenos kyslíku
-amylasa (lidská) 97 600 2 identické podjednotky, enzym
(hydrolytické štěpení škrobu)
alkoholdehydrogenasa (kvasinky) 150 000 4 enzym (katalysuje redukci acetaldehydu
na ethanol)
ferritin (lidský) 480 000 20 skladování železitých iontů
glutaminsynthetasa (E.coli) 592 000 12 enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité
podjednotky tvoří 2 šestiúhelníky umístěné
nad sebou
pyruvátdekarboxylasa (E.coli) 4 400 000 72 enzymový komplex, podjednotky 3 typů,
každá katalysuje jednu dílčí reakci
hemocyanin (plži) 8 000 000 160 metaloprotein obsahující Cu2+; přenos O2;
dutý válec 40x40 nm
virus tabákové mozaiky 39 300 000 2130 helikálně uspořádané identické
podjednotky (rel.m.h. 17 500) tvořící
komplex s RNA
Levinthal‘s Paradox:
We assume that there are three conformations for each amino acid (ex. α-helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is
3100 = 515377520732011331036461129765621272702107522001 ≒ 5 x 1047.
If 100 psec (10-10 sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require
5 x 1047 x 10-10 sec ≒ 1.6 x 1030 years.
However, folding of proteins takes place in msec to sec order.
Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process.
Skládání (svinování) proteinů
Skládání (svinování) proteinů
- neprobíhá náhodným způsobem
- probíhá postupně:
1. malé dočasné periodické struktury
2. supersekundární struktury, strukturní
domény a "roztavená" glubule
3. Nativní struktura - závěrečné úpravy za
účasti enzymů (peptidylprolin-cis-trans-
isomerasa, proteindisulfid-isomerasa)
- Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky?
Chaperony
Vlastnosti proteinů
Nábojové vlastnosti
Rozpustnost – v závislosti na pI
Denaturace – ztráta nativní konformace
Kooperativita (denaturační přechod)
Příklad: teplotní denaturace
Jsou málo stabilní - denaturují
Faktory způsobující denaturaci
•Fyzikální – teplo, záření
•Chemické – organická rozpouštědla,
soli, kyseliny, zásady, chaotropní činidla
(močovina, quanidin HCl), detergenty
Kooperativita (příklad hemoglobin x myoglobin)
aneb jak struktura ovlivňuje funkci proteinů
Myosin – molekulární motor – aktomyosinový komplex –
kontrakce svalu
Aktin
Příklady struktury některých proteinů
•Imunoglobuliny = protilátky •Funkce – obraný, imunitní systém
•Základní pojmy: antigen,
hapten, epitop
α-Keratin
•Protofibrily propojeny S-S můstky
Gly, ser, cys
α-helix
β-keratin (fibroin z hedvábí) – skládaný list
• 1/3 Gly, 1/5 Pro nebo Hypro
• Triplet Gly-X-Pro (nebo Gly-X-Hyp)
se často opakuje
• Levotočivá šroubovice, 3 AK zbytky
/otáčku
• Superšroubovice pravotočivá ze 3
levotočivých helixů
LH RH
Kolagen
Recommended