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Cuantificación del contenido de azúcares reductores
XIII Congreso de Fitomejoramiento:
Contribuyendo al sostenimiento de la vida a través del fitomejoramiento 6 - 8 de noviembre, Corpoica, Tibaitatá – Mosquera, Cundinamarca
Cuantificación del contenido de azúcares reductores y no reductores y su asociación genética con marcadores
SNPs en Solanum tuberosum grupo Phureja (Resultados preliminares)
Diana Duarte-Delgado, Luz Patricia Restrepo, Ajjamada Kushalappa y Teresa Mosquera
Incremento en la demanda de alimentos
procesados (FAO, 2009)
Cambios en los hábitos de consumo a nivel
mundial (FAO, 2009)
Oportunidad: Papa criolla (Solanum tuberosum grupo Phureja)
Incrementar valor agregado
Contribuir a la seguridad alimentaria en
comunidades vulnerables
Introducción
Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela:
necesita desarrollo
Problema: contenido de azúcares reductores
Werij et al., 2012
Contenido de azúcares reductores
amino acid
+
Reductores
+
No reductores
Reacción de Maillard
Nader, 2011
Degradación del almidón en células de almacenamiento
Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela:
necesita desarrollo
Problema: contenido de azúcares reductores
Calidad de procesamiento en hojuela: rasgo complejo
Werij et al., 2012
Contenido de azúcares reductores
Basic science
Molecular maps
Function maps for pathogen resistance
and tuber traits Comparative maps
Genome structure and evolution
Application
Markers for introgression
breeding
R-gene cloning Candidate genes
Genomic sequencing
*omics
Diagnostic markers for population-based
MAS
Engineering agronomic traits
Precision breeding
The molecular basis of complex traits
Biodiversity, haplotypes
Association studies
Ch. Gebhardt MPIZ
Balding, 2006
Mapeo por asociación
Phenotypic trait
Cuello de botella…
Pregunta de investigación ¿Cuáles regiones del genoma de papa se asocian al contenido de azúcares reductores y no reductores en una población natural de Solanum tuberosum grupo Phureja, al emplear marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos?
Objetivo General
Explorar la variación alélica de Solanum tuberosum grupo Phureja y su asociación genética con contenidos de azúcares reductores y no reductores
1.Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. 2.Caracterizar fenotípicamente la Colección Central Colombiana (CCC) de grupo Phureja y otros genotipos por su contenido de azúcares. 3.Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos.
Objetivos específicos
Mapeo por Asociación
10 genes candidatos: Diseño y amplificación de
primers Identificación de SNPs
Aproximación GWAS: Metodología GBS
110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)
4 Cultivares comerciales Caracterización fenotípica del contenido de
azúcares : Latice rectangular triple
8 accessiones IPK German Germplasm Bank
• Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo
Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex Detector: Índice de refracción Shodex Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase movil: Ácido sulfúrico 10 mM
Condiciones cromatográficas
Métodos de extracción de azúcares
Ajustes para el análisis del contenido de
azúcares
Materiales y métodos
Mapeo por Asociación
10 genes candidatos: Diseño y amplificación
de Primers Identificación de SNPs
Aproximación GWAS: Metodología GBS
110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)
4 Cultivares comerciales Caracterización fenotípica del contenido de
azúcares : Latice rectangular triple
8 accessiones IPK German Germplasm Bank
• Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo
Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex Detector: Índice de refracción Shodex Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase móvil: Ácido sulfúrico 10 mM
Condiciones cromatográficas
Métodos de extracción de azúcares
Ajustes para el análisis del contenido de
azúcares
Materiales y métodos
Objetivo específico 1 Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. • Condiciones cromatográficas:
Condiciones cromatográficas
Temperatura de la columna 18°C
Temperatura del detector 35°C
Fase móvil Ácido sulfúrico 10mM
Fase de almacenamiento Ácido sulfúrico 5mM
Fase de limpieza Acetonitrilo 2,5% en ácido sulfúrico 5mM
Flujo 0,3ml/min
Volumen de inyección 20 µl
Tiempo por muestra 35 min
Resultados
• Selección de la metodología para extracción de azúcares: Análisis
de un DCA y pruebas de Tukey
Método Concentración promedio sacarosa (ppm)
Agua (Cunningham et al., 1988) 2566,22 a
Doble tratamiento con MeOH (Karkacier et al., 2003) 4925,64 c
MeOH con carbón activado (Marangoni et al., 1997) 3479,68 ab
MeOH con reflujo (Arevalo & Sastoque, 1999) 4322,76 b
• Validación del método de cuantificación
Reproducibilidad Repetibilidad Linealidad Promedio (ppm) CV (%) Promedio (ppm) CV (%) Promedio R² SD
Glucosa 40.08 1.21 52.06 4.61 0.9998 0.00015 Fructosa 40.42 0.83 41.33 3.67 0.9997 0.00021 Sacarosa 40.41 0.72 40.49 4.44 0.9997 0.00016
Límite de
detección (ppm) Límite de
cuantificación (ppm) % de Recuperación
Glucosa 4 5 111.47 Fructosa 2 3 103.10 Sacarosa 2 2 96.13
a. Cromatograma de patrones en mezcla b. Cromatograma de Col 102
a. b.
Cromatogramas de patrones y de tubérculo crudo
Cromatogramas de genotipos contrastantes a. Col 52 b. IPK-170031
a. b.
Cromatogramas para azúcares en tubérculo crudo
Objetivo específico 3 Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos.
Genes candidatos seleccionados para diseño de primers
Gen Candidato Función Cromosoma
InvGE Apoplastic invertase IX Pain-1 Vacuolar acid invertase III Stp23 Plastidic starch phosphorylase III StpL Plastidic starch phosphorylase V AGPaseS-a ADP-glucose pyrophosphorylase I SssI Soluble starch synthase III GWD Glucan-water dikinase V UGPase UDP-glucose pyrophosphorylase XI Sps Sucrose phosphate synthase VII G6pdh Glucose-6-phosphate dehydrogenase II
Nader, 2011
Degradación del almidón en células de almacenamiento
• Se ha ajustado una metodología cromatográfica precisa, reproducible y repetible para la cuantificación de azúcares en tubérculos de grupo Phureja.
• Los resultados obtenidos revelan variabilidad en el contenido de azúcares de genotipos de grupo Phureja.
• Una vez se cuenten con los datos fenotípicos completos, el análisis
de asociación será llevado a cabo a partir de SNPs con el propósito de identificar regiones genómicas con influencia en la calidad de fritura, en este importante grupo de papas cultivadas para Colombia.
Conclusiones y perspectivas
Seguridad Alimentaria y Nutrición
Proyecto desarrollado con el apoyo financiero del International Development Research Centre (IDRC), www.idrc.ca, y el Gobierno de Canadá, a través del Department of Foreign Affairs, Trade and Development Canada (DFATD), Canada, www.international.gc.ca
El mejoramiento de la producción de papa como contribución a la seguridad alimentaria en comunidades nativas en Colombia
Agradecimientos
Contrato de acceso al recurso genético RGE0069
Grupo: Genética de rasgos de interés agronómico
¡Gracias por su atención!
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