Der gegenwärtige Stand der kolorimetrischen Azidimetrie in der Gewebephysiologie

Sammelre f era t

Der gegenw~rtige Stand der kolorimetrischen Azidimetrie in der Gewebephysiologie

Eine kritisehe Umsehau unter umstrittenen Fragen

yon Hans Pfeiffer (Bremen)

(Mit 5 Textfiguren)

[Eingegangen 2. November 1926]

Es ist oft dargelegt worden, wie tier Kolloidzustand, in dem sich ein beliebiger Stoff in den ]ebenden Zellen befindet, unter anderem auch eine Funktion der Wasserstoffionenkonzentration C~ ist [Bunze l (24)1)~ F r e d and D a v e n p o r t (54), L o e b (122~ 123~, M a c D o u g a l (131), M o o r e (151)~ R o b e r t s o n (186), Z o l l e r (250) u.a.]. Da nun in den Geweben die H'. resp. OH'-Ionen~ deren Konzentration zu ermitteln ist, die Faktoren eines Gleichgewichtssystems bilden, so ist die Bestimmung des aktuellen S~ure- g r a d e s Jim Gegensatz zu S~uregehal t ; F o d o r (52),.Taufel u. W a g n e r ( 2 1 9 ) ] durch eine chemische Reaktion (z. B. Neutralisation), wie es die Titrations- methode vorsieht, a priori wegen der damit verkntipften Verschiebung des Gleiehgewichtes unmSglich2). Es mui~ zur Ermittlung der wahren Aziditat (der aktuellen Ionen, des S~uregrades) eine der physikalischen Methoden herangezogen werden, wie sie die Fotentiometrie, die Katalyse und die Kolorim etri e liefern [ L o t t e r m o s e r (125)]. Aus ~ui~ eren Grtind en der Umfangs- beschr~nkung beschaftigt sich der folgende Rtick- und Ausblick a l l e in m i t

1) Die in Klammern hinzngeffigten, kursiv gesetzten Ziffern beziehen sieh auf die gleiehen Nummern des Literaturverzeiehnisses.

2) Fodor (52, S.'428) welst darauf hin, wie eine indirekte Bestimmung der ak- taellen Azidit~t dadureh m~glieh wiirde, dal~ man die Summe der freien (aktuellen)nn~ potentiellen H'-Ionen and daneben die Proteinmenge bestimmt und aus dem S~ure- bindungsvermSgen des Proteins die urspriinglich frei gewesene H'-Ionenquantit~it be- reehnet. Es bedarf nur des Hinweises, dai~ dieses komplizierte Verfahrea nur selten angewendet werden kann.

Sammelreferat 435

den k o l o r i m e t r i s c h e n Ve r f ah ren und i h r e n R e s u l t a t e n ; ein Bericht tiber die anderen Messungsmethoden soll bald folgen.

Wenngleich zugegeben ist, dai~ der Aziditi~tsgrad der Biokolloide zu den Fundamentaleigenschaften der lebenden Gewebebausteine [ K r u y t and T e n d e l o o (110a, S. 1311)] geh~irt, so soll doch aueh nicht der Einflufl tier CH gegentiber anderen Faktoren des Gewebegeschehens tibersch~tzt werden. Wie noch anzudeuten sein wird, kntipfen sich an die Methodik und die Berechtigung ihrer Ubertragung auf biologische Fragen - - vielleicht z. T. wegen der rasehen Entwicklung, die die Forschung genommen hat - - eine Reihe s t r i t t i g e r Momente~ die in mancher Hinsicht eine kritische oder gar skeptische Zurtickhaltung empfehlen, ohne daft es indessen zu der vSlligen Ablehnung [Sca r th (196)~ K e l l e r (98~ S. 22f.) u.a.] zu kommen braucht. Wir sehen auch daran, daft die biologische Azidimetrie einen recht jungen Zweig der physikochemischen Erforsehung der Gewebe darstellt, und diirfen darum umso sicherer erwarten~ dai~ bei dem Eifer~ mit dem hier gearbeitet wird, unsere Einsieht schon bald klarere Ztige annehmen wird [vgl. auch K r u y t and T e n d e l o o (llOa, S. 1309f.)!].

Ein groi~er Teil des Manuskripts war bereits fertiggestellt~ als auf der V. H a u p t v e r s a m m l u n g der Ko l lo id -Ges . (23.--26. September 1926 in Dt i sse ldor f ) die Frage tier S~turewirkung und Wasserstoffionenkonzen- tration in der reinen und angewandten Kolloidchemie zum Hauptverhandlungs- thema gemacht wurde. Immerhin liefien sich die dort vorgetragenen Resultate und Bedenken noch vielfach an passender Stelle verwerten. Die groi~e Reich- haltigkeit der vorliegenden Literatur, sowie der Umstand, daft sie zum grof~en Teil in ausli~ndisehen, oft schwer erreichbaren Zeitsehriften niedergelegt ist, rechtfertigen wohl die Absieht, neben den im Druck erscheinenden Vortriigen der Kolloid-Ges. und aui~er der ktirzlich erschienenen Schrift yon Re iss (182) eine zeitgem~fie~ miiglichst kritische Zusammenfassung fiber das Gesamtgebiet zu geben, wenn die Darstellung einerseits die Grundlagen der Methodik scbarf herausarbeitet, andererseits zu den Literaturquellen heranffihrt. Lexi- katorische Vollstiindigkeit wurde dabei weder erstrebt, noeh erreicht~ ist es doch nicht einmal gegltickt~ s~mtlicher dem Titel naeh bekannt gewordener Untersuchungen rechtzeitig habhaft zu werden 1). Um einen miiglichst klaren Einblick in die kolorimetrische Azidimetrie zu gew~thrleisten, wird der Stoff in mehreren Kapiteln geboten~ die nacheinander yon den theoretischen Grundlagen des Gebietes, yon den bisherigen ~ethoden und den dadureh erzielten Resultaten handeln und schliefllich die Ziele und Aussichten des Gebietes darlegen.

1) Fiir Ubersendung yon Sonderabdrucken zur Verwendung bei einem spiiteren Nachtrage will der Verf. hier im voraus seinen Dank ausdriicken.

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I. Die theoretischen Grundlagen der kolorimetrischen Azidimetrie

1. Es eriibrigt sich, hier die theoretischen Grundlagen der Azidimetrie tiberhaupt, sowie die Bedeutung der antibaten Funktion pH (SSrensenzahl, Wasserstoffexponent) darzulegen; denn in dieser Beziehung kann auf die umfassenden Ausfiihrungen yon SSrensen (209--211), P r i d e a u x (174), Cole (33), Michael is (144, S. 20f. u. a.), HSber (82, S. 111f), Ko l tho f f (105, S. 3f), Reiss (182, S. 15f.), Legendre (116, S. 44f), Clark (30, S. 26f.) u. a. verwiesen werden. Es gentigt vielmehr, die Grundzt ige der kolori- me t r i s chen Verwendung der Indikatorenfarbstoffe kurz zu skizzieren [SSrensen (210, S. 204f.)]. Dabei kann es auch nicht unsere Aufgabe sein, zwischen den Theorien tiber den Farbumschlag der Indikatoren eine Ent- scheidung zu treffen. Denn es bleibt praktisch ohne Bedeutung, ob wit dabei mit Wi. Os twald (160) annehmen, daf der Farbumschlag eines In- dikators yon dem ?Jbergang in seine Ionenformen und umgekehrt bedingtl), resp. [nach Wo. Os twald (161)] yon einer Anderung im Dispersitiitsgrade des Farbstoffes begleitet wirdU), oder ob wir mit Hantzsch (73) die yon B e r n t h s e n und F r i e d l a n d e r sehon angedeutete chromophore Theorie annehmen wollen, nach der der Farbumsehlag durch eine Anderung der mole- kularen Konstitution hervorgerufen wird, oder ob wir schliefllich mit S t i eg l i t z (214) eine Verbindung der Ionentheorie Wi. Ostwalds mit der Hantzsehen Anschauung herzustellen bestrebt sind. Eine Entscheldung ist auch schon deshalb unn0tig, weil die naeh der Ionentheorie abgeleiteten Gleichungen ohne Anderung auch ffir die chromophore Theorie Geltung besitzen [1Kiehaelis (144, S. 31), K o l t h o f f (105, S. 210)].

2. Das Grundpr inz ip der k o l o r i m e t r i s c h e n Az id ime t r i e besteht bekanntlich in der Beurteilung der pH-Werte aus der Farbennuance der Indikatorenfarbstoffe. Setzt man HA ftir eine Indikatorens~ure (fiir Basen waren ganz ~hnliche Formeln abzuleiten, worauf hier aber nicht eingegangen werden soll), somit CEA fiir die Konzentration der undissoziierten S~ture, deren Dissoziationskonstante K ~ sei, CH. und CA, ftir die Konzentration der H-Ionen und S~urerestanionen, so ist aus dem Massenwirkungsgesetze abzuleiten, daft

C~.. CA, - - KHA . . . . . . . . . (I)

CA, K~A oder. C H t , - CH. " . . . . . . . . (2)

1) S. die Eiuw~inde bei Thiel (220, 8. 48), ferner Kolthoff (105, S. 198)! J) Vgl. dagegen Kruyt und Kolthoff (110) und Prideaux (174).

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ist, d. h. das Verhaltnis zwischen der alkalischen und sauren Form eines Indikators ist eine Funktion der CH.. Wenn z. B. K~A - - CH. ist, so resultiert auch Ca, - - CHA, und der Indikator ist zur Halite in die alkalischo Form iibergegangen. Aus Gleichung (2) ist zu folgern, dab der Farbumschlag allmahlich stattfindet, sobald die CH ungefahr die GriiBenordnung der Disso- ziationskonstante des Indikators aufweist. Als U m s c h l a g s i n t e r v a l l ist so das Gebiet zwischen den beiden Grenzpunkten der Wahrnehmbarkeit des

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Fig. 1. Umschlagskurven der yon Pfe i f fer (169, S. 413) empfohlenen Indikatoren :

a) Tropaeolin 00, b) Methylorange, c) alizarinsulfonsaures Natrium, d) Methylrot, e) p-Nitrophenol, f) Rosols~ure, g) a-Naphtholphthalein,

h) Thymolsulfonphthaloin, i) a-Naphtholbenzein, k) Alizaringelb.

Farbumschlages, ausgedriickt in ph-Werten, definiert. Tr~gt man nach B j e r r u m (15) oder v. A l s t i n e (2) die Werte fiir ph auf der Abszisse, diejenigen fiir die Gehalte an der alkalischen Form auf der Ordinate ab, so resultieren bilogarithmische Kurven, die asymptotisch zur Abszisse verlaufen, indem bei jedem Aziditatsgrade eine gewisse Menge der sauren neben der alkalischen Form des Indikators und umgekehrt vorhanden ist [Fig. 1; vgl. auch die ganz ahnliche graphische Darstellung ffir die Anderung der

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Dissoziat ion ~ mi t verschiedenem p H bei C l a r k and L u b s (32, S. 110), ferner M c C l e n d o n (136), M i c h a e l i s (144, S. 83f.) u. a.!]l).

Durch AuflSsen nach CA, lafl t sich aus Gleichung (2) ab le i ten : K~A

CA, = CH~" C ~ . . . . . . . . . (3)

worin CA, den Gehal t an der gefiirbten, C~A den an der ungefi~rbten (bezw. sauren oder alkalischen) Fo rm des Ind ika tors darstel l t . Indem nun in

einer bes t immten LSsung be i kons tan te r CH. auch der Quotient KnA einen

kons tan ten W e r t annimmt~ ist zu schliei~en~ dai~ die Menge der gefi i rbten Fo rm CA, propor t iona l der Konzent ra t ion des undissoziier ten Ind ika tors CH.~ i s t [ P f e i f f e r (169, S. 404)], d. h. i n n e r h a l b d e r G r e n z e n d e r L S s l i c h - k e i t d e s I n d i k a t o r s (!) n i m m t d i e F a r b s t i ~ r k e b e i g l e i c h e r CH. m i t s t e i g e n d e r Cm~ zu, bis der Si~ttigungszustand der LSsung fiir den undisso- z i ier ten Farbs tof f erreieht is t :

KHA [CA,]m~ - - 0- CH ~ . . . . . . . . . (4)

Andererse i t s is t fiir die S iehtbarkei t sgrenze der gefi i rbten Fo rm eine be- s t immte minimale Konzen t ra t ion des undissozi ier ten Ind ika tors nStig. Doch kann diese Konzent ra t ion , auch wenn wir daftir die Gleichung (5):

KHA [CA* ]m in --" [CtIAJmin" CH . . . . . . . (5)

anfiihren, hier nieht genauer prtizisiert werden, is t sie doch unter anderem yon perstinlieher Beobachtungse ignung und yon der Schichtdieke 2) abh~ingig . - -

2: ~-T

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ofl~ ....... ," . . . . ; . . . . 4---- , ...... ; . . . . 4- . . . . ,~ .....

of- . . . . . " . . . . . -i . . . . , .... , . . . . . ~ . . . . . ~ . . . . ~ ......

Fig. 2. Dissoziationskurve und Werte der J~'arbnuance in Abh~ngigkeit yore pH

[naeh 3 l i e h a e l i s (144~ S. 82)].

1) Wie gut die theoretiseh berechnete D i s s o z i a t i o n s k u r v e mit einer solchen~ die naeh den aus tier F a r b n u a n e e be- urteilten pH-Werten resultiert, iiberein- stimmt~ liigt sich graphisch darlegen~ wenn man bei beliebigem Indikator die Werte fiir pH wieder auf der Abszisse~ die fiir die relative Farbtiefe T auf der Ordinate abtriigt. Das Beispiel fiir p-Nitrophenol (Fig. 2) nach M i c h a e l i s (144, S. 82) ergibt praktisch fast vollkommene Iden- titiit von Farbtiefe T und Dissoziations- grad a.

3) Vgl. die fiir die Kolorimetrie ilber- haupt wichtige Gleiehung des L a m b e r t - schen Gesetzes:

J = Jo" e -x~ . . . . . . . . . . . (6)

oder l n J o - - l n J ~ xd . . . . . . . . . . . (7) worin Jo und J Eintritts- und Austrittsintensit~t der Lichtstrahlen, d die Sehiehtdieke des Mediums, x eine Stoffkonstante desselben und e die Basis der natiirlichen Logarithmen bedeutet.

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Bei den zweifarbigen Indikatoren mit verschiedenfarbiger saurer und alkalischer Form sind diese Verhaltnisse noch etwas komplizierter [ P f e ] f f e r (169, S. 398)], so daft hier darauf verzichtet werden mag (s. aber auch Abschn. I~ 4!).

3. Fiir die B e u r t e i l u n g de r F a r b n u a n c e der indikatoren sind z we i v e r s c h i e d e n e W e g e ausgearbeitet. Entweder wird eine derartige LSsung(Puf fe r oder Modera to r1 ) ) ausprobiert, die dem Indikator die gleiehe Nuance erteilt ~vie der unbekannten L(isung [ S S r e n s e n (209, 210); s. fiber die gewShnliche Technik dieses Verfahrens: K o l t h o I f (104, 105, S. l13f., 125f.), M i c h a e l i s (lg4, S. 89f.), F o d o r (52, S. 443f.), A t k i n s (5a), L e g e n d r e (116, S. 66~.), C l a r k (30~ S. 89f.) u. a.], oder es wird die relative Indikatormenge gemessen, die einer LaugenlSsung und der unbekannten l~lfissigkeit den gleichen Farbgrad verleiht [G i l l e sp i e and H u r s t (59)~ M i c h a e l i s (142, 143, 145), zusammen mit G y e m a n t (146, S.186f.), G i l l e s p i e (57, S. 746~.), K o l t h o f f (105, S. 128f.), L e g e n d r e (116, S. 62f.), C l a r k (30, S. 127f.) e) u.a.]. Im Absehn. II wird gezeigt werden, wie die Methodik der physiologischen Gewebeazidimetrie durehgangig dem zweiten Verfahren ohne Moderatoren naehgebildet ist. Indem wir in der Substanz gewShnlich gut moderierende LSsungen vorfinden, sollte gestrebt werden~ die Methoden in solchem Sinne ein wenig zu modifizieren. Besonders das Gesetz der s p e z i e l l e n M o d e r a t i o n gegen den Zusatz geringer Mengen der Moderatorsaure selbst [Michae l i s (144, S. 93)] mtii~te beachtet werden. Sobald man die hauptsaeh- lich moderierend wirkenden Substanzen der ZeUen kennen wfirde, ware vielleicht damit zu beginnen, die sauren und alkalischen LSsungen tier betr. Indikatoren durch Heranziehung jener Stoffe herzustellen. Ohne besondere Absieht sind entspreehende Versuche aber sehon in ahnlicher Weise angestellt worden [ P f e i f f e r (169, S. 408), A t k i n s and P a n t i n (Sb) u. a.].

4. Aus Gleiehung (2) oder (1) kann durch AuflSsung nach C~. ge- wonnen werden: K~A

C ~ : CHA" CA, " . . . . . . . . (8)

Fiir einfarbige Indikatoren silt nunmehr, daft der Farbgrad T 3) allein durch die Anionen A' bestimmt wird. Setzen wir (Hinzufiigung einer bestimmten

2) ieh ziehe start der gebr~tuehlichen Bezeichnung ,,Puffer", die yon Huber t und Fernbaeh stammt, die deutlichere ,~Moderatoren ~' vor~ vgh vor allem M. Koppel und K. Spiro in Bioehem. Zeitschr. 1914, 65, 410.

~) Im Prinzip die gleiche Methode versuehte sehon Bjerrum (15) zur Bestimmung der Dissoziationskonstante der Indikatoren, spRter Kolthoff (102, S. 114) zur Be- stimmung des pH yon Trinkwasser mittels Neutralrot, P fe i f fe r (169) bei der Azidimetrie pflanzlicher Gewebesehnitte nach dem Vorgange yon Gillespie (57) und Atkins (3); s. auch Barnet t and Chapman (8)~ v. Alstine (2) und Hatf ie ld (76).

8) Wir h~tten aueh fiir den Farbgrad dieselhe Bezeichnung wie fiir den Disso- ziationsgrad (a) setzen kSnnen and hKtten damit die gebrRuehliche Sehreibweise erhalten.

440 Sammelreferat

Indika~ormenge) T :-: 1~ so ist auch H A - ( l - -T) bekannt Definieren wir ? als die Funktior/ des Farbgrades T~ so ist ferner

T - - log 1 - -T . . . . . . . . . . (9)

K ~ Wird sodann Gleiehung (8) logarithmiert und der Quotient ~ dureh den

Wert aus Gleiehung (9) eliminiert, so ergibt sieh:

T Pn - - Pl~s ~ log 1 - - T . . . . . . . . (10)

" ~f~,, ' ' ]~ ' ' " :; " '!,, ~ ( : 1 ~ , ___ _ . " " '

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T Fig. 3. In Kurve a Darstellung der Funktion ~ -~ log ~ ; in Kurve b die Ordinate

in 10-fach, in Kurve c in 100-fach vergriiSertem ~Ial~stabe eingetragen fiir Werte yon < 1 [nach ]Kichaelis ( 1 6 5 , S. 489)].

Die durch van A l s t i n e (2) und P f e i f f e r ( 1 6 9 ) angegebenen Kurven nach Gleichung (10) gestatten ohne woitere Berechnung die Ablesung tier verschiedenen pH-Werte bestimmter LSsungen ; s. auch die Tabelle bei Mich ae l i s und G y e m a n t ( 1 4 6 , S. 204), ferner ( 1 4 5 , S. 490) und Fig. 3.

Wenngleich Gleichung (10) nach der Ableitung nur flit einfarbige In- dikatoren Geltung besitzt, ist sie yon G i l l e s p i e ( 5 7 ) und van A l s t i n e (2) ohne direkten Beweis in dieser oder der welter modifizierten Form:

P~ - - PEA "q- log [Tropfenverhiiltnis S~ure] . . . . (11) . J ~ a S e J

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auch auf zweifarbige Indikatoren tibertragen worden [s. auch P f e i f f e r (169, S. 406f.)]. Der yon K o l t h o f f (105, S. 132) gewUnschte experimentelle Beweis steht noch aus. Theoretisch ist leicht einzusehen, dai~ die Uber- tragung yon Gleichung (10) oder (11) auf doppelfarbige Indikatoren n u r b e r e c h t i g t se in k a n n , wenn die saure und die alkalische Form der Indi- katoren sowohl in der Farbintensit~it iibereinstimmen (sie also bei jeweils gleichen Konzentrationen neben der betreffenden anderen Form bemerkbar werden, d. h. die beiden Aste der Umsetzungskurve symmetrisch sind, s. Fig. 1), als auch die gleiche L~islichkeit besitzen 1). In ersterer Beziehung sind z. B. die sonst durch besonders schSne Farbengebung ausgezeichnetenSulfophtha- leine [Clark and L u b s (31, 32, 127), ferner L u b s (126)] weniger gut geeignet als die meisten der von P f e i f f e r (169, S. 406f.) empfohlenen Indi- katoren. Es sollte vielleicht versucht werden, Gleichung (10) bezw- (11) durch eine andere zu ersetzen, die in gleicher Weise abgeleitet werden mSge, wie T i z a r d and B o c r e e (222) bei tier graphischen Darstelhng der Neutrali- sationskurve zweier Siiuren die Beziehung zwischen der C~ und den beiden Dissoziationskonstanten im ersten Aquivalenzpunkte konstatieren konnten~ also etwa:

Ti T2 pH : pHA J - 1/2 log ~ J - log - ~ ] (12)

worin T 1 and T 2 bezfigtich die Farbgrade des Anions und Kations bedeuten mSgen.

Anm.: Um derartige and iihnliche Komplizierungen mSglichst wenig beachCen zu brauchen, stellen wir als Forderungen an die zu verwendenden Indikatoren hin: 1. Die beiden Formen des Farbstoffes miissen mSglichst gleiche Farbintensit~it haben [s. auch Reiss (182, S. 61f.)]; 2. sie sollten miiglichst iibereinstimmende (wiinschenswert: mSglichst hohe) L(islichkeit besitzen. Weitere Forderungen werden aus der Dis- kussion der miiglichen Fehlerquellen der kolorimetrischen Azidimetrie resultieren.

5. Als F e h l e r q u e l l e n de r k o l o r i m e t r i s c h e n C ~ - B e s t i m m u n g miissen kurz erw~hnt werden [s. auch: S m i t t (208, S. 105), E v e r s (49), hI i chae l i s (145, S. 492f.), Cu l l en and H a s t i n g s (43), K o l t h o f l (105, S. 141fi), L e g e n d r e (116, S. 83f.), C l a r k (30, S. 118f.), Re i s s (182, S. 61fi) u. a.]:

a) Unterschiede in der L S s l i c h k e i t der Indikatoren. - - Von Indi- katoren gleicher Dissoziationskonstanten haben die leichter 15slichen ein starker ausgebreitetes Umschlagsintervall. Denn aus Gleichung (3) und (4) ist zu ~olgern, dat~ der Anfang des Umschlagsintervalls bei einer berechen- baren Cn liegt: 0

C t I . - - [CA.jrain �9 KHA (13)

1) Erwiihnt sei auch die weitere Voraussetzung, dab beide Formen des Indikators sich gegeniiber den miiglichen Fehlerquellen (Abschn. I, 5) gleich verhalten.

44P~ Sammelreferat

Denken wir uns die LSslichkeit zweier Indikatoren derart, daft diese bei einem zehnmal so grofi ist wie beim andern, so wird die Konzentration der gef~rbten (sauren) Form CA. bei jene'm auch zehnmal so grofi sein wie der entsprechende Wert bei letzterem. Wenn man also eine ges~ttigte LSsung des Farbstoffes verwendet, so liegt der Anfang des Umschlagsintervalls des einen Indikators bei einer 1/1 o mal so groflen CH wie die, bei der der andere umsehl~gt, d.h. der pH-Wert ist um 0,1 kleiner.

Der Endpunkt des Umschlagsintervalls wird iibrigens praktisch bei dem leichter 15slichen Indikator nur wenig eher erreicht werden;

b) E i g e n f a r b e oder auftretende P i g m e n t e in der Zelle. - - Leider ]iegen fiber diese Itir biologische Verh~ltnisse sicher sehr bedeutsame Fehler- quelle m. W. noch keine exakten Versuche vor. Doch ist auch ohne nahere Prfifung einzusehen, dai~ es sieh um ~hnliche Beeinflussungen handeln muir, wie sie etwa die Eigenfarbe lebloser (verunreinigter) Untersuchungsflfissig- keiten aufweisen kSunen. Ffir die Methodik mSgen also event. ~hnliche Kunstgriffe brauchbar sein, wie sie unter den angegebenen Verh~ltnissen angewendet werden [T ing l e (221), F o d o r (52, S. 445), Michae l i s (145, S. 492f.), K o l t h o f f (105, S. 139f.), C la rk (30, S. 69f.); s. aueh W u l f f (248; 248a)!]. Durch Schaede (201, S. 220) ist zur Fortschaffung des gelbgrfin oder anders gef~rbten Sehimmers der Membran und des Plasmas, der vielleicht auf Lichtbrechungserscheinungen (Di f f rak t ion?- Ref.)_ira Mikroskop beruht und bei verschiedenen Linsensysteme~ konstatiert women ist, die Ver- wendung von ApochromatSlimmersionen und Kompensationsokularen yon Zeit~ empfohlen worden;

c) c h e m i s c h e B i n d u n g (oder Adsorption?) des Indikators an Struktur- partikeln [vgl. G r a y (64a)] . - Die verschiedenen Elemente in den Zellen in Gestalt yon PigmentkSrnchen, Mitochondrien, Lipoidbl~schen usw. besitzen ein untereinander sehr verschiedenes VermSgen zur Bindung der Farbstoffe [vgl. fiber die Lokalisierung der Farbstoffe z. B. Luck~ (129), S c o t t (205a), fiber die Seltenheit der Vitaltinktion des Plasmas Se h a e d e (200, S. 350) und Abschn. II, 3]. Die Aufnahme scheint hauptsachlich an nichtw~sserigem (vielleicht lipoidartigem) Substrat zu erfolgeu [ F a u r ~ - F r ~ m i e t (50)]; Ver- suche fiber eine derartige Komplexbildung mit den Indikatoren sind yon Re i s s (182, S. 63f.) angestellt worden (s. auch Abschn. I, 5, d!).

l~eben chemischen Bindungen und Adsorptionsvorgangen mSgen bisweilen sogar chemische Ver~nderungen tier Indikatoren in dem biologischen Milieu eintreten, doch liegen darfiber erst wenig Erfahrungen vor [Kritik bei R u h l a n d (192)]. Vgl. aueh W a l b u m (239) und die Literatur fiber das Oxydations-Reduktions-Potential bei N e e d h a m (156) u. a. !

Einer Nachprfifung scheint Ref. auch die Frage der LSslichkeit der Indikatoren in Lipoiden [ J a r i s ch (91), F a u r ~ - F r ~ m i e t (50)] und der damit vielleicht zusammenh~ngenden Anderung des Farbgrades zu bediirfen (s. auch Abschn. I, 5, a);

Sammelreferat 443

d) P r o t e i n f e h l e r . - - Dahin rechnen wir seit S S r e n s e n [209--210] die Abweichungen von den tatsachlichen pH-Werten, die sich infolge vor- handener Proteine und ihrer Abbausubstanzen durch deren Eigenart ergeben, dai~ sic sowohl saure, als auch basische Farbstoffe binden kSnnen [s. S. 442, ferner H o m e r (85), F o d o r (52, S. 447), M i c h a e l i s (145, S. 495), A t k i n s (Sa, S. 106f.), C l a r k (30, S. 118, 122f.) usw.]. Sehr viele Indikatoren miissen wegen dieser Fehlerquelle beanstandet werden, darunter auch die Phthaleine, sofern im Plasma ungespaltene Proteine zu vermu~en sind [ Z o l l e r (249)]. Am wertvollsten scheint p-Nitrophenol, brauchbar scheinen auch Methylviolett lind die damit verwandten Farbstoffe zu sein. Die Vermeidung des Protein- fehlers durch kolorimetrische Messung yon Ultrafiltraten nach B r i n k m a n n og Dam (22) ist ffir biologische Objekte wohl nur bei Benutzung yon Prei~- s~iften mSglich. Mit Re i s s (182, S. 66f.) kSnnen wir den Proteinfehler H berechnen [vgl. Gleichung (8)] nach der Formel:

/ CHA + Ce CHA

Cr H = KtIA.CA ' . . . . . . . . . (14)

wenn wir pHv fiir den scheinbaren, pHr fiir den wirklichen Aziditfitsgrad und Ce ftir die Konzentration der Proteine und ihrer Abbauprodukte setzen;

e) S a l z f e h l e r . - - Diese ebenfalls seit S ( i r en sen (209--210) be- kannte Fehlerquelle betrifft die Erscheinung, dab Neutralsalze die Farbnuance des sauren Indikators nach der alkalischen, die des alkalischen Farbstoffes nach der sauren Seite bin verschieben k~innen [ F o d o r (52, S. 446), Mich ae l i s (145, S. 494f.), K o l t h o f f (105, S. 143f.), N e e d h a m (155), Vl~s (230), Cla rk (30, S. l19f.) usw., aus der neueren Spezialliteratur ferner: H a r n e d (74), K o l t h o f f (100, 101, 103), G i l l e s p i e and W i s e (60)]. Eine einwandfreie theoretische Erkliirung ftir diese Erscheinung ist wohl noch nicht zu geben [ K o l t h o f f (105, S. 143), C l a rk (30, S. 122)]. Zuweilen wurde der Salz- fehler gerade bei sehr geringen Konzentrationen sehr groi~ gefunden [Phenol- sulfonphthalein nach K o l t h o f f (102, S. 114), Tetrabromphenolsulfophthalein nach K o l t h o f f (105, S. 145)]; meistens aber ist die Korrekturnotwendigkeit proportional der Abnahme der Salzkonzentration geringer [ B r i g h t m a n , M e a c h a m and A e ree (21)]. Manche Indikatoren scheiden wegen der Fehler- quelle ganz yon der Verwendung aus [Well s (243), K o l t h o f f (105, S. 146f.); s. im iibrigen M i c h a e l i s und @ y e m a n t (146) bezw. K r f i g e r (lg8)!]. Der Fehlerwert ~ 1/ii~t sich tibrigens analog von Re i s s ' Formel ftir den Protein- fehler gleichfalls berechnen:

(CHA + C~ C~A - - pH~ - - pHr - - K~A" \ -C~ CA, ]

C~ . . . . . . . . . (15) -- K]IA �9 CA"

wenn C= die Konzentration der wirksamen Salzquantit~t bedeutet (s. oben);

444 Sammelreferat

f) D i e l e k t r i z i t ~ t s k o n s t a n t e des P r o t o p l a s m a s . - - Auf den ersten Blick am schwerwiegendsten, abet fiir den zukiinftigen Ausbau der azidimetrischen NIethodik vielleicht kaum so hinderlich wirkt die yon LSsungen reinen Wassers abweichende Dielektrizitatskonstante des Protoplasmas [ G i c k l h o r n (55, S. 138)]. Sicher kann diese Fehlerquelle bedeutende Aus- marie annehmen (s. alich die yon G i c k l h o r n zitierten Sammelreferate yon O. Bli ih und E. A. H a f n e r . ) Sie fortan auszusehalten, d. h. die Dielektrizit~ts- konstante verschiedener Protoplasten kennen zu lernen, ist sicher eine dankens- werte, wenn aueh reeht schwierige Arbeit [ K e l l e r (98, S. 30)]; einen Anfang dazu hat bereits K e l l e r [97; s. aueh P 6 t e r f i und E t t i s c h (166)!] gemacht (iiber die bisherigen Bestimmungsmethoden s. die yon G i c k l h o r n zitierte Zusammenfassung E r r e r a s ! ) ;

g) w e n i g e r b e d e u t s a m e F e h l e r q u e l l e n bei biologisehen Azidit~tsmessungen. - - Hier kSnnte der Temperaturfehler erw~hnt werden, der sieh bei sehr starker Temperatursteigerung (Siedehitze) ~uriert [wegen p-Nitro- phenol s. M i c h a e l i s und G y e m a n t (146)], ferner der Alkoholfehler (Einfluri des Alkohols als LSsungsmittel auf den Umschlag der Indikatoren), dutch den saute Indikatoren empfindlicher, basische weniger empfindlich werden. Trotzdem neuere Untersuchungen [B i shop , K i C t r e d g e and H i l d e b r a n d (16), W e g s c h e i d e r (242)] vorliegen, scheint Ref. eine Naehpriifung wertvoll zu sein [Thie l (220, S. 28, 30)], wiewohl schon angenommen werden kann, dari bei biologischen Aziditatsmessungen unter vorschri~tsm~riiger Behandlung der Indikatoren keine Fehler dadurch entstehen werden. Indem es sich im biologisehen Milieu meistens um gut moderierende L~sungen handelt, kann auch der dann nachweisbar geringe Saurefehler [ M i e h a e l i s und K r i i g e r (148, S. 317), K o l t h o f f (105, S. 141f.), B r e s s l a u (20, S. 589)] gewShnlieh vernaehlassigt werden.

Anm.: Als weitere Fo rde rungen an die v e r w e n d e t e n I n d i k a t o r e n kSnnen aufgestellt werden: 3)mSglichst geringer Salz- und Protein~ehler. Ferner werden in Hinblick auf das Untersuchungsmaterial als V0raussetzungen erw~hnt: 4) Mangel einer Eigenfarbe des Protoplasten, 5) Abwesenheit yon Granulierungen und Strukturen, die die F~rbstoffe stark zu speichern verm0gen [Pfe i f fer (169, S. 400)]. Die Bemerkungen von Smi t t (208) ~iber den Standardwert der ~essungen yon Medal ia (137) sind wegen ungentigender Beachtung dieser Regel leider allzu berechtigt. Ahnlich steht es sicher um viele andere ,Resultate" der kolorimetrischen Untersuchung yon Protoplasten. Die Frage, wie weir die Befunde durch Anwendung yon Indikatoren au~ die Verhaltnisse der lebenden Zellen fibertragen werden k0nnen, soll im III. und IV. Abschnitt behande]t werden.

Sammelreferat 445

II. Der gegenw~rtige Stand der kolorimetrischen ~lethodik bei biologischen pH.Messungen

Trotz der Ungunst der biologischen Verh~ltnisse sind fiir eine An- wendung der kolorimetrischen Methodik auf sie schon manche, freilich verschieden brauchbare Verfahren erarbeitet, fiber die wohl zuerst P. Reiss (182~ S. 70f.) im Zusammenhang berichtet hat. Seiner Gliederung werden wir uns im wesentlichen anschliefen, und unsere Bemtihungen kSnnen sich also vor allem auf Ergi~nzungen beschr~tnken. Danach kSnnen wir, wenn wir die Untersuchung yon Prefs~tften hinzuftigen, aufer der Kombinierung verschiedener Verfahren ftinf Gruppen yon Methoden unterscheiden und naeh- einander betrachten [vgl. auch P a 1 i t z s e h (161a) !).

1. Bei der U n t e r s u c h u n g Yon P r e f s i ~ f t e n sind leider die Fragen nach der Reaktion des Zellsaftes und des Protoplasmas nicht getrennt zu beantworten. Auferdem ist damit zu reehnen, daf bei der ~TStung und Misehung der Zellbausteine chemische Umsetzungen yon nicht zu beurteilenden Ausmafen sich abwickeln ktinnen, die dadureh die aktuelle Reak~ion beein- flussen miissen [Atk ins (3), Schade , N e u k i r c h und H a l p e r t (198), Mevius (139, S. 657), P f e i f f e r (168, S. 79; 169, S. 397), K t i s t e r (112, S. 1) u. a.]. Es ist also verstiindlich, daf dieses Verfahren, das mit abgestorbenem Zell- material arbeite~ Is. aber Miehae l i s und K r a m s z t y k (147), H e m p e l (78), C l e v e n g e r (29), H a a s (71) R o n e a t i e Q u a g l i a r i e l l o (189) u. a.] gern ver- lassen wird zugunsten des andern, Indikatoren in den unzers~tirten lebenden Protoplasten einzufiihren (S. 446 sq.).

Bei Objekten, deren Zellen so voluminSs und gleichzeitig so gelegen sind, daft man daraus Zellsaft mit einer Glaskapillare en~nehmen kann [Mevius (140)], wird ein derartiger Fehler sicher sehr viel geringer oder versehwinde$ ganz [vgl. C roz i e r (40), B r o o k s (23)].

Im Prinzip den kolorimetrischen Methoden vergleiehbar, aber besonders wegen der Unabhiingigkeit yon der Fiirbung der zu untersuchenden Fliissig- keiten, sowie auch wegen der schnellen "Ausftihrbarkeit mit kleinsten Flfissigkeitsmengen beinahe iiberlegen sind die s t a l a g m o m e t r i s e h e und die v i s k o s t a l a g m o m e t r i s c h e Me th o d e fiir iiltere bezw. frische Ober- fl~chen, die yon T r a u b e und S o m o g y i (223; 224, S. 489] angegeben werden und ohne weiteres auf Prefis~fte zu tibertragen wiiren, sofern mSglichst schwaehe Siiuren und Basen, die gleiehzeitig mtiglichst kapillaraktiv und mSgliehst 18slich, dabei nicht fliiehtig sind, als Indikatoren verwendet werden. Die angegebenen Naehteile der Verwendung yon Prefis~ften werden freilich nicht vermiedenl).

x) Vgl. auch die Anm. S. 450 iiber die ,,Indicatorfolie" [Wulff (248, S. 733; 248a), Bermann (9a)]t

446 Sammelreferat

2. Na t f i r l i ch im Zel lk~irper a u f t r e t e n d e I n d i k a t o r e n sind oft zu azidimetrischen Anniiherungsmessungen herangezogen worden [s. die mono- graphische Darstellung von P e r k i n and E v e r e s t (165)], sowie Re i s s (182, S. 71f.)!]. Die Auswertung derartiger Beobachtungen zur Charakterisierung yon Sfiflwasser soll. nach S t e p h a n i d e s (213) und T r i l l a t (225) bis auf die RSmer zurfickgehen. W a t s o n (240) wies ant eine solche Verwendung des Saftes yon Vaccinium L., Wa lbum (238; 239) und ebenso M e C l e n d o n (135) auf die eines Auszuges von Brassica oleraeea L. var. capitata L. 3. rubra (,Rot- kohl") hin. Haas (69; 70). untersuehte die Pigmente yon Scilla, Hyacinthus, Pelargonium, Viola, Primula, ~rowallia, Cichorium usw., Smi th (207) die Korolle yon Ipomoea. Croz ie r (40) - - vgl. auch B r o o k s (23) - - extrahierte den pigmenthaltigen Salt der groi~en Zellen von Valonia, verwandte das blaue Pigment yon Chromodoris zebra (36; 37; 4 1 ) u n d prfifte hauptsachlich die natfirlichen Indikatoren tierischer Gewebe (38; 39). H a r v e y (75) verwandte bei Permeab~litiitsmessungen das Pigment Antedonin im Epithel der Viscera der ttolothurie Stichopus ananas als Mat~stab fiir den Siiuredurchgang. Wesent- lich herabgesetzt wird die Bedeutung des Veffahrens mit natfirlichen Indi- katoren dadurch, daft diese oft nicht in das Protoplasma eindringen, fiber dessen Aziditiit also nichts ausgesagt werden kann [Brenner (19), S. 283]. Vor allem sind aber fiber das Verhalten der natfirlichen Indikatoren gegen- fiber den Fehlerquellen noch Untersuchungen nStig.

3. Die Vi ta l f~ i rbung, die auch zur Efforschung des Meehanismus der Stoffaufnahme und zu anderen Zwecken versucht worden ist, kann zur (an- n~hernden) Sch~tzung der CH dienen, sobald die Tinktion mit den ent- spreehenden Indikatoren erfolgt. Als S c h w i e r i g k e i t e n diesesVerfahrens sind jedoch zu erw~hnen: die komplizierte chemische Natur der Farbstoffe und das aus dem hohen Molekulargewieht herrtihrende kolloidale Verhalten, durch das die Diffusibilitiit, die Fiillbarkeit durch Elektrolyte, die Adsorbierbarkeit u. dgl. modifiziert wird; die Beeinflussung der Fiirbung durch anwesende Eiweii~k0rper [Entfiirbung; s. W a l b u m (239), R u h l a n d (193; S. 198), ferner Abschn. I, 5, d] oder Salze (S. 443); die giftige Wirkung der Indikatoren [HCiber (82, S. 581, 597), R u h l a n d (193, S. 187)], vielleicht zum groi~en Tell beruhend auf beigemengten Verunreinigungen yon Salzen, auch solcher mit mehrwertigem Kation, einwirkend auf die Permegbilit~t und andere Lebenserscheinungen der Zellen; schliei~lich der Umstand, daft durch Zusatz mehrwertiger Ionen die Anfiirbbarkeit gewisser Strukturen dureh elektrisehe Adsorption aktiviert wird [ H a m b u r g e r (72), P. Maye r (134)]. Die M e t h o d e besteht bei Zellen, die im wiisserigen Milieu leben, sowie vielfach auch bei Gewebeschnitten, in einfacher Uberfiihrung in die Indikatorli~sungen [Bethe (10 usw.) u. a., B a r n e t t and C h a p m a n (8), A t k i n s (3, S.417), B~ l i n t (6), G i c k l h o r n und K e l l e r (55a), P f e i f f e r (168, S. 81f.; 169, S. 400); - - s . auch H u r w i t z , Meyer and O s t e n b e r g (86)], event, unter vorheriger Umstimmung

Sammelreferat 447

der intrazellularen Azidit~it nach Bethe(10; 14) und R o h d e (187; 188); vgl. auch: L e w i s and F e l t o n (120)! Bei Pflanzen kann nach dem Vorgange yon Kfister, die saugende Wirkung der Transpiration verwendet werden. Vor kurzem be- richtete dieser Autor (112, S. 3f., 6f.) ernent fiber Versuche mit Tetrabrom- phenolsulfophthalein, Phen01sulfonphthalein i) u. a. nach dieser und der osmoti- schen Methode (Zellsaftf~rbungen). Die Verwendung moderierender LSsungen nach H e m p e l (78) braucht bei azidimetrischen Vitalf~trbungen nicht aus- geschlossen zu werden. Bei der Untersuchung hSherer Tiere erfolgt eine entsprechende Injektion [Schl~pfer (202), Rous (190; 191), Reiss (178; 180), C a r n o t et G r u z e w s k a (25), beide nebst G l d n a r d (26), P e t o w , W i t t k o w e r und P i e t r k o w s k i (167)]. Eine Veffeinerung der alten Methoden mit Lakmus- seide [Emich (48); Ab~inderung dutch Verwendung yon ,,Neutralrotseide" s. P f e i f f e r (168, S. 83)] und Jodeosin [Hof (84); P fe i f f e r , a. a. O. 84] stellt wohl das yon Haas (71) dargestellte Verfahren der Benutzung von Indikator- papieren 2) (ausgepreflter ZeUsaft) dar. Doch dfirften solche wegen gewisser Kapillarerscheinungen gewShnlich nur geringe Brauchbarkeit aufweisen [Gi l lesp ie and H u r s t (59), and Wise (60), K o l t h o f f (105, S. 183f.)].

Durch die relative Einfachheit der meisten Vitalf/irbungsverfahren m~igen teilweise die Nachteile der Unsicherheit der Resultate ein wenig ausgeglichen werden; doch bedarf es stets sorgfi~Itiger Prtifung des Versuehsmaterials, bevor ,,vorliiufige Ergebnisse" konstatiert werden. Die V i t a l s p e i c h e r u n g der Indikatoren geschieht meistens in den Vakuo len und in diffuser Art [Kiis ter (111; 112), l~ous (191)], bei basischen (selten sauren?) Indikatoren bisweilen auch in Form amorpher Flocken oder KSrnchen usw. im farblosen Zel]saft [Ruhland (193, S. 197), Rumj a n t z e w und K e d r o w s k y (194, S. 196)], sehr selten im Protoplasma selbst (Ruh land , a. a. O. S. 207: Methylviolett)3). Die Literaturangaben bis in die neuere Zeit pr~zisieren nicht immer aus- reichend, welche Bestandteile der Zelle verf/irbt werden4). Wfinschenswert w~re der Besitz einer allgemein oder miiglichst weitgehend brauchbaren Methode zur Fixierung der vital gef/irbten Objekte. S k r a u p (206) empfiehlt bei Verwendung yon Neutralrot die Fixierung mit w/isseriger SublimatlSsung.

Die D e u t u n g der Vitalf/trbungsresultate ist vermutlich durch An- wendung elektrodynamischer Prinzipien zu versuchen, wie es wohl zuerst yon H~iber und Nas t (83) angeregt worden ist, ohne vim Beachtung zu

1) .tiber (lessen Verwendung s. Massink (133)! ~) S. Anm. S. 450. a) Vgl. hierzu (lie Einteilung in granul~ire (Farbstoffwirkung in interptasmatischen

R~iumen), diffuse, metachromatisehe (beruhen(l auf J, nderung des Dispersit~tsgrades) un(l In(likatorenfiirbung (aktuelle Reaktion des L tisungsmittels) usw. bei G icklhorn un(l Keller (55a)!

~) Eine weitere Voraussetzung fiir die Verwertbarkeit der Befun(le besteht in (ler Beobachtung nur lebenden, m~gliehst unbesehiidigten Versuehsmaterials.

448 Sammelreferat

finden. Auch K e l l e r (98, S. 51) h~lt es fiir viel wahrscheinlicher, daft die ~Bindung dutch elektrostatische Adsorption kleiner Indikatorteilchen als dureh chemische Affiniti~t bewirkt wird. Wenngleich die elektrische Ladung der Teilchen durch H'- und OH'-Ionen - - und damit auch die Verteilung der Farbstoffe - - veriindert werden kann, so ist beides allerdings iihnlich durch andere Ionengruppen zu erreichen [ K a j i k a w a (92), W e r t h e i m e r (244), T a n i (218)]; nach W e r t h e i m e r (245) sollen bei der polaren Adsorption~ als welche die Anfi~rbbarkeit eines Gewebes gedeutet wird, die H" wie hoch- wertige Kationen, die OH' wie entsprechende Anionen wirken [vgl. auch P i s c h i n g e r (171)]. Sicherlich ermutigen die bisherigen Beobachtungen, die mSgliche Bedeutung des Ladungssinnes fiir die Permeierfiihigkeit der Elek- trolyte und speziell der Indikatoren endlich genauer zu eruieren [G i r a rd ~61; 62), C o l l a n d e r (35, S. 404)]. Dadurch mSchten dann auch die Vital- fiirbungsversuche in systematische Bahuen gedriingt werden und bequemer und liickenloser zu Resultaten fiihren [vgl. auch G i c k l h o r n und K e l l e r (55a)!).

4. E i n f i i h r u n g des I n d i k a t o r s n ach m e c h a n i s c h e r Z e r s t ~ i r u n g d e r Me mbran . - - Sofern die Permeabflitiit der Zellen fiir die Indikator- ilSsungen unzureichend ist oder fehlt, kann eine kolorimetrische Messung der �9 naeh Art der Vitalfiirbungsverfahren durch verschieden ausfiihrbare Ver- letzungen tier Zellmembran bewerkstelligt werden. Re i s s (182, S. 72fi) erw~hnt die folgenden MSglichkeiten: a) nach Vl~s (229) - - s. auch u et C o u l o n (232) - - gelingt die Einfiihrung yon Indikatorsubstanz nach Ze r - . q u e t s c h e n der Zellen (Eier yon Tartigraden). Reis s (183) wandte die Me- rhode bei Messungen an Ovocyten yon J~chinoeardium und Eiern von Para- ~centrotus lividus an; - - b) die Einfiihrung des Indikators kann aueh durch die m i k r u r g i s c h e Methode mittels Mikromanipulator 1) erfolgen. C h a m b e r s t27) injiziert mittels Mikropipe~te eine IndikatorlSsung in alas Innere des Protoplasmaleibes. S c h m i d t m a n n (203; 204), der den Mikromanipulator yon P 4 t e r f i verwendet, gentigt der so erzielte Farbgrad nicht zu einwand-

-freier Messung; er empfiehlt, eine mikroskopisch kleine Substanz des trockenen :Indikators mittels Gelatinel~isung in der Spitze einer sehr feinen Operations- nadel zu befestigen und die Nadel dann von unten in die Zelle einzufiihren 1 die sich wie iiblich im hiingenden Tropfen in der Mikro-Feuchtkammer ~befindet.

Dem Vortefl des sch~rferen Farbtones in dem Verfahren nach S c h m i d t - m ann gegeniiber dem yon C h a m b e r s steht allerdings der Naehteil entgegen, <lafi mehr noch als bei letzterer Methode der Einflufi der Indikatoren-

1) Vgl. zur Mikrurgie etwa: R. Chambers in Biol. Bull. 19181 S.121; in Science -1921. N.S. 541 S. 411~ in Anat. Ree. 1922. 24, S. 1; - - T. P~terfi in Naturwiss. 1923. 111 S. 81~ in Abderhalden, Handb. d. biolog. Arbeitsmethoden, Abt. V, Tell 2, "S. 2471 (1924); - - H. Pfe i f fer in Mikrokosmos 19241 17, S. 106! S. ferner Fig. 3--4 ~in Protoplasma 1, S. 274--275 und Fig. 1, S. 347.

Sammelreferat 449

konzentration zu wenig beriicksichtigt erscheint [S. 438; ferner Pf e i f f e r (169~ S. 412)]. Ref. scheinen also beide Verfahren noch weiterer Erprobung und kiinftiger Verfeinerung bediirftig (s. auch R a p k i n e et W u r m s e r (176)!]. Vor den verschiedenen Vitalf~rbungsmethoden s. str. haben beide den groi~en Vorteil der Unabh~ngigkeit yon der oft quantitativ so geringen Permeabilit~t der Protoplasten voraus, ohne daft hier die Fehlerquellen der kolorimetrischen Azidimetrie (S. 441f.) gegeniiber den einfacher auszufiihrenden Vitaltinktionen verringert w~irden. Soweit es sich um die Gewinnung von Annaherungswerten handelt~ sind die mikrurgischen Vital- f~rbungsmethoden auch in der jetzigen Gestalt schon sehr bedeutungsvoll.

5. A n f a n g e e x a k t q u a n t i t a - t i v e r M e s s u n g e n der CH. - - Sowohl die alten VitalfRrbungsverfahren, als auch die mikrurgische Anwendung der Indikatoren haben aber aui~er dem Bestreben, die Fehlerquellen tunlichst auszuschalten oder zu verkleinern (event. sie quantitativ zu bestimmen)~ in Zukunft das Ziel zu verfolgen sich immer mehr zu einer exakt quantitativen Arbeitsweise zu entwickeln. In dieser Hinsicht besitzen wir zwar erst geringe Ans~tze, die aber um so wertvoller und beachtenswerter erscheinen. Der- artige quantitativ schon ziemlich exakt ausgeffihrte Messungen der CH erfolgen mit Kol.orimetern, wie sie vielfach konstruiert worden sind [Hurwi tz~ Meyer and O s t e n b e r g (86), B a r t e l l (9), D u g g a r and D o d g e (46), G i l l e s p i e (58), B a r n e t t and Bar -

Fig 4. Anwendung des Bjerrumkeiles vor dem Mikroskopspiegel

Is. Reiss (182, S. 81)].

Fig. 5. Mikrokolorimetrische Einrichtung nach Vl~s (231).

s Halbprismen~ r Beleuchtungsspiegel~ f Schr~gfl~iche.

n e t t (7), Myers (152), B r e s s l a u (20), C l a r k (30, S. 53) u.a.]. Dabei arbeiteten W a g n e r (236; 237) und Guil - l a u m i n (65; 66). noch makroskopisch mit gewonnenen Pret~saften; P a n t i n (162) verwandte in ~hnlicher Weise wie bei andern Kolorimetern mikro- skopisehe Kammern; N e e d h a m (153--155; 157) brachten den Indikator in KapfllarrShrchen. Einen besonderen Kunstgriff erdachte Vl~s (229). In der

Protoplasma. I 99

450 Sammelreferat

Anwendung yon R e i s s (182, S. 81) besteht seine Einrichtung in der Gegen- fiberstellung eines B j e r r u m s e h e n Keiles [ B j e r r u m (15), G i l l e s p i e (57)] derart vor dem gewShnlichen 1VIikroskop, daft der Keil durch eine Schraube vor dem Spiegel des Instruments und den Fenstern eines entsprechenden Geh~uses auf- und abw~rts bewegt werden kann [Fig. 4; vgl. auch P a n t i n (162)!]. Eine weitere Vervollkommnung stellt das nach Angaben yon Vl~s (231) soeben durch N a c h e t konstruierte Mikrokolorimefer dar, das an dem Okular angebracht wird [Fig. 5; s. R e i s s (182, S. 82)!]; Bau und Handhabung sind vom Autor beschrieben, dem Ref. leider aus eigener Ansehauung noch nicht bekannt.

Anm.: Mit dem von P. W u l f f (2~8; 248a) soeben konstruierten Hilfsmittel der , Ind ica to r fo l i e " , d. i. einer Einriehtung, bei der einer dnrchsichtigen~ quellbaren Membran die Indikatorsubstanz einverleibt wurde, sind wohl Messungen der intrazella- laren Azidit~it noch nicht vorgenommen worden. Doch besitzt dieses Yerfahren vor der Anwendung yon Indikatorpapieren manche Vorteile (z. B. Fortfall des Hineindiffundierens der die Eigenfarbe der LSsung bedingenden Bestandteile), die unter der u dal~ durch Pipetten (oder event, naeh Auspressen) gewounene Zells~fte zur Untersuehung gelangen sollen, einen Yersueh mit dem yon der Fa. F. und M. Lautenschl~ger- Miinehen zu beziehenden Material wiinschenswert erscheinen lassen. Indem nach Mit- teilung des Erfinders auch Kolloide aus der L~sung uicht h ine indi f fundieren" sollen, wiirde der Eiweil]- uncl wahrscheinlieh auch der Salzfehler dutch Verwendung yon Indieatorfolie eliminiert werden k~nnen. Da der Bezug des Materials aber erst von Ende 0ktober an erfo]gen konnte, waren Versuche, die ein sieheres Urteil erlaubt h~tten, nieht mehr vor Absehlul~ des Manuskriptes auszufiihren [vgl. aueh Ber- mann (9a)i].

III . Uberblick bisheriger Resultate der kolorimetrischen und Yitalf~rbnngs- versuche

1. Gegen die M S g l i c h k e i t e i n e r ~ ) b e r t r a g u n g der Befunde der Azidit~tsmessungen auf biologische Verh~ltnisse sprechen nicht wenige hlo- mente, so daft die Vitalazidimetrie der Zellen und Gewebe eine recht scharfe Kritik erfahren hat [Ke l l e r (98~ S. 26~.), M e n d (150), s. auch G i c k l h o r n (55, S. 131) u. v.a.] . Aueh gegen die bevorzugte Stellung der H'-Ionen richten sich die NIeinungen [ F o d o r (53)]1). Wenn wit nun bier gewisse Ph~nomene im Leben der Gewebeelemente auf den Orenzfall zuriiekfiihren, daft vor allem (ob zuweflen auch allein?) die H' und OH * am physiologischen Geschehen beteiligt sind, so liegt darin natih-lich eine W i l l k i i r l i c h k e i t ~ indem theoretisch aueh yon jeweils andern Ionenpaaren ausgegangen werden kSnnte. Dieses Vorgehen entsehuldigt aber sowohl tier Umstand, daft es eine mindestens ebenso grofle Willkiirlichkeit ist, wenn man unter den Elektro-

1) Uber den gro~en Einflu~ z. B. der Br'- und I'-Ionen gleieh dem freier H' bei Koagulationen s. QKrtner (54a, S. 170)!

Sammelreferat 451

lyten die Sauren und Basen si~mtlichen Salzen gegentiber als etwas Besonderes hinstellt, als auch die recht vorteilhafte Tatsache, daft jener ideale Grenzfall der Abwesenheit anderer Arten aktivierter Ionen praktiseh oft gut realisierbar ist. I_ndem sich nun die Berticksichtigung der azidimetrischen Beziehungen bei den physiologischen Ionengleichgewichten im polyphasisehen System der Protoplasten und ihrer Komplexe als ein lure so dringlicher zu beachtendes Postulat erweist, je feiner die physiko-chemische Analyse durchgeftihrt wird, ist es sieher nicht iiberfliissig, die Bedeutung der CH fiir physiko-chemische Ver~nderungen am lebenden (und toten) Kolloidsubstrat nach dam derzeitigen Stande unseres Wissens kritisch abzuw~gen, wenngleich die methodisehen Schwierigkeiten bei tier Eliminierung der Fehlerquellen gerade fiir die biologischen Verhaltnisse noch bei weitem nicht tiberwunden sind.

Dabei werden wir uns zwar in erster Linie an Ergebnisse halten mfissen, die allein oder neben anderen Verfahren auf kolorimetrischer pH- Messung beruhen, ohne daft wir indessen solche Resultate durch Anwendung anderer Forschungsmethoden (S. 434, 459), die eineVerkniipfung oder wesentliche Vertiefung der Ansichten gew~ihrleisten, vtillig ausschliei~en m6chten. Wegen der vielen mSgliehen Fehlerquellen ktinnen allerdings aus dam Verhalten der nattirliehen und der kiinstlich eingefiihrten Indikatoren nur mit gewisser Vorsicht, event, sogar kritischer Zurfickhaltung, Riicksehlfisse auf den Azi- ditiitsgrad gezogen werden. Doch fi~llt schon eine Zusammenstellung von Befunden, die durch Anwendung anderer azidimetrischer Verfahren nicht widerlegt sind, recht reichhaltig aus.

2. Fragen wir nach der Ursache , du rch we lche die a k t u e l l e Z e l l a z i d i t i i t m a n c h e r l e i p h y s i o l o g i s c h e E r s c h e i n u n g e n b e e i n f l u f l t , so mtissen wit vor allem die Wirkung ffeier H'-Ionen auf die Zelleiweifie hervorheben. Es erfolgt eine Verschiebung des i s o e l e k t r i s c h e n P u n k t e s , in dem ,,die Summe der Anionen und der Kationen des Ampholyten zusammen- genommen bei gegebener Gesamtmenge des Ampholyten ein Minimum" und in dem ,,die Konzentration der Anionen des Ampholyten gleich der der Kationen desselben" ist [Miehae l i s (14~, S. 57); s. auch L o e b - E w e y k (124, S. 41f.)]1). Indem nun die kolloidalen Eigenschaften der Organeiweii~e im isoelektrischen Punk te meistens ihi~ Minimum haben (nach L o e b - E w e y k a. a. O. 44f. vielfach auch die tibrigen Charaktere), wird die Bedeutung der aktuellen Azidit~t theoretisch verstandlich. Eine Reihe physikochemischer Zustands-

1) Dabei wird der isoelektrische Punk~ vielleicht als eine gewisse Reaktionsbreite aufzufassen sein [Naylor (152a, b)], was vermutlich mit dam gleichzeitigen Vorkommen mehrerer Proteine im Plasma zu erkRtren ist. -- S. aber auch Kruy t and Tendeloo (110a, S. 1310), nach denen die pbysikalischen Eigenschaften nicht einfach yon der C H bedingt warden, der isoelektrische Punkt geradezu bei verschiedenen pH-Werten erreichbar sein so l l . - Vgl. sehlieglich Pauli (162a, S. 187f.), )Iond (1507 S. 233)!

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erseheinungen des Protoplasten miissen also einer bestimmten C~ zugeordnet sein~ mSge es sich nun um intraprotoplasmatische Synthesen oder Abbau- prozesse, um eine ver~nderte Reaktionsgeschwindigkeit, um Ver~nderung aussehliefilich chemischer Affinit~ten, um Abweichungen in den physikalischen Erseheinungsformen des Protoplasmas [Viskositat, Oberflaehenspannung~ Quellung usw., s. z. B. K u w a d a and S a k a m u r a (113, S. 253)]~ um den Ablauf yon Fermentreaktionen [Literatur bei C l a rk (30, S. 332--334); gegen die aussehliei~liche Wirksamkeit der C~ und fiir die Mitwirkung der Tr~ger- substanz trat jiingst wieder F o d o r (53) ein] oder um das soeben yon N e e d h a m (156) [s. auch K e l l e r (95, 97, 98)~ K o e h l e r and R e i t z e l (99)] er- 5rterte Potential yon Oxydations- und Reduktionsorten handeln [vgl. auch R o b b i n s (184), and S c o t t (185), Vl~s (230)~ Mond (150) und die Literatur bei C l a r k (30, S. 338)!).

3. In Kfirze sei fiber einige l~ ISg l i chke i t en der W i r k s a m k e i t b e s t i m m t e r C~ hier referiert. So sind z. B. auch die Erscheinungen bei der Z e l l t e i l un g auf Ver~nderung im Azidit~itszustande zurfiekgefiihrt worden. Die Theorie yon P e a r s a l l and P r i e s t l e y (16g), yon P f e i f f e r (170, S. 79f.) als Fastigialtheorie b ezeichnet [s. dazu auch We be r (241), 1VI a c D o u g a l ~132)!], fordert das Vorhandensein eines Gef~lles der CH mit dem isoelektrischen Punkte der Zellproteine (als Resultante im energetischen Sinne) an den Stellen einer Zellmeristematisierung (Embryonalisierung). Die Bedeutung einer bestimmten Azidit~t wurde auch fiir die Eireifung [ F a u r ~ - F r ~ m i e t (50)], die Befruch- tung [Reiss (179)], fiberhaupt jegliche Teilungst~tigkeit yon Zellmaterial [ P e a r s a l l and E w i n g (163), N e e d h a m (155), Reis s (182, S. l l l f . ) ] wahrscheinlieh gemacht. Vielleicht ist auch die yon H u x l e y (87) und zusammen mit M u r r a y (88) verfochtene ,Chemodifferenzierung" teilweise mit Azidit~its- phanomenen verbunden. Der Eintritt kolloidchemischer Zustands~nderungen des Protoplasmas bei der Zellteilung ist jedenfalls sichergestellt~ mindestens fiir viskosimetrisch zu fassende Variationen, die bei Richtigkeit der P e a r s al 1 schen Hypothese der Proteinbeeinflussung dutch die CH auftreten miissen, naeh den Befunden yon L l o y d (121), J a c o b s (90), G i e r s b e r g (56) und A d d o m s (1) wenigstens dutch ver~nderte CH resultieren kSnnen . Weitere physikalische Konstanten gilt es allerdings noch in vivo der messentlen Bestimmung zu- g~ngig zu maehen. Die Versuche, ohne so zeitraubende Voruntersuchungen durch kolorimetrische Azidit~tsbestimmung die CH direkt zu messen [ P f e i f f e r (170)], kSnnen noch nicht als gelungen bezeiehnet ~erden. Wenn man die aufschlui~reichen Untersuchungen von S p e k (212) fiber die kolloidehemischen Erscheinungen bei der Zellteilung beachtet, mut~ man fibrigens vor einer Ubersch~tzung des Einflusses verschiedener C~ warnen [vgl. auch P r ~ t (173b)!].

Nach den bisherigen Feststellungen stehen abet manche andere G ewe b e- l e i s t u n g e n sicher in enger Beziehung zum Aziditatsgrade [Reiss (182~ S. 101f.)], Mond (150), P r ~ t (173a) u. a.], so z. B. die Lebenstatigkeit fiber-

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haupt [Go toh (63)], die Sekretion yon Nektar bei Vieia Faba [Me C l e n d o n (135): Farbweehsel des Anthocyans], amoeboide [ P a n t i n (162), s. dagegen N e e d h a m (153, 154), sowie R e i s s a. a. O. S. 110] und andere Bewegung [ Q u a g l i a r i e l l o (175), G r a e f f (64), Vl~s et C o u l o n (232), Reis s a. a. O. S. 111], die Nierentiitigkeit [ S t i e g l i t z (215); Urinabscheidung nach Mond (150) von den Anionen abh~ngig; s. die Literatur zur klinischen I-Iarnprtifung bei C l a r k (30, S. 344)!] usw. Den sehr empfehlenswerten Weg der Be- trachtung einer Einzelerscheinung unter dem Wechsel der C~ beschreibt P r ~ t (173a) yon der Plasmolyse. Sobald derartig erst eng zu umreiflende Teilerscheinungen unter Ausschaltung resp. Verminderung der Fehlerquellen auf die Beeinflussung durch den Aziditiitsgrad untersucht worden sind, kann die pH-Forschung hoffentlieh sehr viel Achtang diesem Faktor im physiologischen Gewebegeschehen zurtickerobern, die ihm dureh zu schnelles, daher mit Irrttimern behaftetes Arbeiten, durch vorzeitiges Generalisieren und ein- seitige t)bersch~tzung verloren gegangen ist. Einen wertvollen Anfang stellt hier die - - verschiedene azidimetrische Methoden anwendende - - Unter- suchungsreihe von Vl~s and seinen Mitarbeitern (235) tiber die Einwirkung tier CR auf das RotationsvermSgen der Polarisationsebene und auf die Ultra- violettadsorption an einigen Kolloidmodellen dar, die fiir die Bioazidimetrie sicher von Bedeutung ist. So fortgeschritten in der ganzen Versuchstechnik sind aber welter zu erw~thnende Arbeiten leider nicht. S m i t h (207) konstatiert eine Ver~nderung der C~ wiihrend des Aufbliihens yon Ipomoea, G u s t a f s o n (68) eine so]che im Laufe des Tages; auch unterscheiden sich verschieden alte Zellen in dieser Beziehung [S ide r i s (205a, b), Rei s s (182, S. 107)]. Eine Ab~inderung des Aziditiitsgrades tri t t ferner unter pathologischen Verh~tltnissen [Grae f f (64), D a m b o v i c e a n u et R a p k i n e (44), S c h a d e (197), Reiss a. a. O. S. 108f.; s. auch die elektrometrisch an Tumorengewebe gewonnenen Resultate yon H a r v e y (75a) und W o g l o m (247b)!] oder beim Absterben der Zellen ein [ R e b e l l o (177); verminderte pH-Werte ftir be- seh~digte oder absterbende Zellen sind oft .in der Literatur konstatiert]. Aueh W a g n e r (237) machte den Befund, daft nach Injektion mit Mikroben ein Sinken, nach (~berstehen der Infektion die Wiedererlangung des normalen pH-Wer~es eintritt. Einer Nachpriifung scheint Ref. die Beobachtung yon pH-Veranderungen an der Hautoberfliiche nach RSntgenbestrahlung [M e m m e s- h e i m e r (138); s. die Besprechung bei Re i s s (182, S. 45)!] zu bedtirfen. Noch nicht endgiiltig zu entscheiden ist auch die Frage der Beeinflussung des intrazellularen pIt-Wertes durch die vorschiedene Reaktion der Aufienmedien. W~hrend nach Vl~s et Nou~l (233), L a p i c q u e (114, 115) H o a g l a n d and Dav i s (81), P a n t i n (162), R u m j a n t z e w und K e d r o w s k y (194) und vielen anderen Autoren eine solche zu zeigen ist, fand B ~ l i n t (6) trotz stark abweichender Aufienreaktion fast vollkommene Konstanz der pH-Werte [s. auch Mev ius (140)!]. Es ist unsicher, ob Fehlerquellen in dem einen oder anderen Falle das Resultat verdunkelt haben, z. B. etwa bei der

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Respiration der Zellen auftretende CO2, die sicher eine Erniedrigung des pH- Wertes erzielen kSnnte [Sehade , N e u k i r c h und H a l p e r t (198), Vl~s, Re i s s et V e l l i n g e r (234)]. Dabei ist die Beantwortung der Frage yon prinzipieller Bedeutung, beruh~ doch darauf der Einflufl der N~hrlSsung auf die ersten Wachstumsstadien [ H i x o n (80), S t o k l a s a (216, 217); viele Literaturangaben fiber das hier anschliet3ende Gebiet der Bodenazidit~t bei C l a r k (30) u. a.].

4. Die zahlreich vorgenommenen Azidit~tsmessungen des Plasmas und des Zellsaftes haben gleichzeitig eine wfinschenswerte Kl~rung fiber die R e a k t i o n b e i d e r ira R u h e z u s t a n d e gebracht. Danach seheint das Plasma bald alkalisch, bald neutral zu reagieren [s. unter anderem: H aas (69), L e w i s (118), zusammen mit F e l t o n (119, 120), L e p e s c h k i n (117, S. 180)~ S e h a e d e (199, 201), D e l o r e (45), C a r n o t mit verschiedenen Mitarbeitern (25, 26); zahlreiche NIessungsresultate bei R e i s s (182) wiederholt: Prfifung durch Lakmuspapier, verschiedene Anilinfarben und Indikatorenfarbstoffe oder teilweise elektrometrisch], zuweilen jedoch auch wenig oder mehr sauer [Markgewebe yon Carnegica: N I a c D o u g a l (132a)], wie es schon aus der Ausscheidung neutraler oder saurer LSsungen aus Zellen (wasser- ausscheidende Trichome der Pflanzen, Drfisen der Tiere) gefolgert werden kSnnte [Haas (69), R o h d e (187), A t k i n s (3--5), Vl~s (229), Rei s s (178--181)]. Die Vakuolen fQhren mehr, selten weniger sauren Salt [ P o l i c a r d (173): pH ~--- 6,5]. Wegen des Azidit~tsgrades verschiedener Zell- kOrper kann auf C r o z i er (36--41) verwiesen werden. Die Absterbe- erscheinungen und nekrotischen Ver~nderungen an den Zellen sind nach iiber- einstimmenden Befundeu mit einem Absinken des pH-Wertes verbunden [s. bes. R e b e l l o (177)!]1). Iqicht nur verschiedene Objekte [ W a g n e r (236) S t o k l a s a (217), N~mee (159), R u m j a n t z e w und K e d r o w s k y (194, S. 199)], sondern auch mehrere Schichten und Gewebelagen pflanzlicher und tierischer Organismen sind durch einen ganz charakteristischen pH-Wert der Ruhelage charakterisiert [Croz i e r (37, 38), A t k i n s (5), P e a r s a l l and P r i e s t l e y (164), R e i s s (178, 179), Rous (190, 191), S c h m i d t m a n n (203, 204), D u r a l und Mitarbeiter (47), K e l l e r (98), P f e i f f e r (170)u. a.], basiert doch die ,,Fastigial- theorie" P e a r s a l l s (S. 452) nieht zum wenigsten auf dieser Tatsache. Ffir einen gewissen Dif~erenzierungsgrad mag also eine bestimmte aktuelle Azidit~t

1) Durch Koltzoff (108) ist gezeigt worden, wie die Phagozytose yon Carehesiura dureh ihre Bedingtheit yon der CH geradezu eine brauehbare ]Rethode fiir die Bestimmung der pH-Werte ergeben kann. Vermutlich wird bei einer gewissen CH die Kul~ere Plasma- schicht auf Cilien und im Sehlundrohr reversibel ver~indert. Dadureh werden die Ciliea klebrig, ohne die regul~re Funktion einzubiiBen. Der plasmatische Sehlundboden wird allmKhlieh z~her und widersteht stKrker der Vakuolenbildung. Die Wand der sich bil- denden Vakuolen wird weniger dehnbar, ihr Lumen bei steigender C~ immer kleiner . . . . In der Grenzschicht sol] dutch die erhShte AziditKt gin festes kolloides Gelskelett gefKllt werden [s. aueh Pr~t (173a]).

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angenommen werden kSnnen [Literatur bei C l a r k (30, S. 317f., 336)]. Die Erscheinung wird allerdings dadurch kompliziert, dafi in bestimmten Zellen der Aziditatsgrad einigermat3en konstant gehalten wird, wie das ftir die Blut- bestandteile [vgl. M e n d (150), ferner die Beispiele bei R e i s s (182~ S. 93f.)] und fiir die Zellen niederer Pflanzen [aus neuerer Zeit: S a k a m u r a (195), l ) l e h l a (226, 227), B o d e (17)] am besten bekannt geworden ist [s. auch M a c D o u g a l (132a)!]. Soweit die Regulation der intrazellularen pH-Werte nicht dutch die Konstanz des Mediums oder durch die Impermeabilit~t der Zellmembran gew~hrleistet werden kann, diirften entsprechende Exkretions- t~tigkeit, vor allem aber die Anwesenheit und Wirksamkeit yon Moderatoren das Ziel ziemlicher Konstanz der Aziditat trotz funktioneller und patho- logischer Variationen desselben (S. 453) erreichen [vgl. vor allem: R e i s s (182, S. 97f.)].

5. Es ist zu beachten, wie aul3er der Moderation der biologischen Flfissigkeiten auch die P e r m e a b i l i t i i t de r P r o t o p l a s t e n v o n den h e r r s c h e n d e n p H - W e r t e n b e e i n f l u i ~ wird [ C o ] l a n d e r (34; 35), M e v i u s (140), S i d e r i s (205a, b) u. a., vgl. ferner die Modellversuche yon G ~ r t n e r (54a~ S. 169) fiber Dispersitatsveranderungen!]. Doch ist nich~ nur die CH eine Funktion der Permeabilit~t, sondern auch die Konzentration der Hydroxylionen Cog, [ J a c o b i (89); s. auch H a y n e s (77)!]. In beiden Beziehungen ist vor aUem an die Beobachtungen yon B e t h e (10~-13) und seiner Schiller [bes. B e t h e und T o r o p o f f (14), R o h d e (187; 188)] zu erinnern. Die von ihnen vertretene R e a k t i o n s t h e o r i e de r Z e l l p e r m e a b i l i t a t hat die kolorimetrische Vitalazidimetrie (S. 446f.) wesentlich zu fSrdern versucht. Nach dieser Anschauung wird die Anf~rb- barkei t mit basischen und sauren Indikatoren, sofern deren TeilchengrSfle nicht einen gewissen Wer t tibersteigt, ausschlief~lich durch die Innenreaktion tier Zellen beherrscht. Aufler Modellversuchen (Farbstoffadsorption an Kolloiden bei verschiedener CH) wurden yon ihnen Experimente an Zellen angestellt~ die a priori eine verschiedene Innenreaktion aufwiesen [ B e t h e (10) an Blut- kSrperchen yon Ascidien; R o h d e (187, S. 432) an Pflanzenzellen, (188) an l~ana-Arten; P ohl e (172) an Cauls familiaris] oder solche durch eine ver~nderte Aufienreaktion bekamen 1) [Befunde yon R o h d e (187) an Asparagus, Daueus,

1) Die Voraussetzung dafiir, dab die iutrazellulare Reaktion zum Teil durch die- jenige au~erhalb der Zetlen bestimmt wird, ist zum mindesteu nieht unberechtigt [H(i ber (82, S. 531)], wenn aueh naeh Her tz (79) eine Umstimmung bei Opalinen erst nach ein- getretener Schiidigung erfolgte [S. 453; s. auch B~lint (6), Scot t (205a), Rum- jantzew und Kedrowsky (194), sowie die Modellversuche yon Bethe (13)!]. Ferner ist auf die Ergebnisse von Hopkins (85a) zu verweisen, uach dem sieh bei Amoeba die Bewegungsgesehwindigke~ yon Tieren aus sauren Kultureu yon pH ~ 6,0 an steigert his zum Maximum bei pH = 6,6 and dann sehnell abnimmt (Minimum bei pH ~ 7,1

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Vicia, Spirogyra usw.]. P i s c h i n g e r (171~ S. 174f., 183f.) konnte ferner zeigen, daft sowohl in Adsorptions-, als auch in F~rbeversuchen Eiweifikolloide und - - freilich fixierte - - animalische Gewebe bei einer charakteristischen CH der FarblSsung einen raschen Verlust des FarbbindungsvermSgens erfahren~ und ~ zwar stimmt der Reaktionsbereich der Tinktionsabnahme mit dem Umschlags- intervall in der kataphoretischen Wanderungsrichtung der Farbstoffe iiberein und ist mit soleher Feinheit zu bestimmen, dab die Festlegung der isoelek- t r ischen Punkte der Gewebe mit ziemlicher Genauigkeit m~glich wird. [Vgl. auch G r a y (64a)~ R o b b i n s (184, 184a)~ W i n s l o w and S h a u g n e s s y (247a), N a y l o r (152a~ b) usw.] Wenn v. M S l l e n d o r f (149) noch die Strukturdichtigkeit fiir bedeutsamer als die elektrische Ladung der Ge- webestrukturen und somit wichtiger als ihre Aziditat halt, so diirfen wit das mit P i s e h i n g e r (171~ S. 193) so erkl~ren, daft er eine andere Fixierung anwandte und mit Farbl~sungen stark wechselnder Dispersitat experimentierte. ~_hnliche Gedankenverbindungen sind auch fiir die Ar- beiten yon K e l l e r (93 usw.; 98~ S. 72fi) leitend~ wenngleich er - - nach P i s c h i n g e r (a. a.O.S.170) ohne geniigenden Grund-- lebende Gewebebestand- tefle als elektrisch negativ geladen betracbtet, denen die bisherige Literatur oft eine positive Ladung zuschreibt. Gestiitzt wird freilich diese wohl noch nicht zu entscheidende Ansicht K e l l e r s durch elektive Farbungen yon Giek l - h o r n an Daphnien und Cyclops [Ke l l e r (98~ S. 239f.)]. lVIit tier veranderten Auffassung harmoniert die Angabe K e l l e r s (a. a. O. S. 32), daft nach der ge- laufigen Annahme die grofien Werte der CH ,an den S~ure- start an den Basenpolen angegeben" wiirden. Bei aller Anerkennung der Bedeutung tier Ladungsverh~ltnisse (und der Azidit~t) miissen wir freflich K e l l e r (a. a. O. S. 57) zustimmen~ daft Oberfl~chenspannung~ Kapillarkr~fte~ Enzymeffekte und andere derartige physikochemische Faktoren das Resultat ebenfalls weitgehend diver- gieren kSnnen. Gegen die alleinige Wirksamkeit des kolloidchemischen Speicherungsprinzips B e t h e s sprechen auch die Versuehe yon W i e c h m a n n (246; 247), nach denen nicht bei neutraler Reaktion, ja nicht einmal bei st~trkerer Ans~uerung ein Eindringen yon Farbstoff stattfand, ebenso die Experimente yon S c h u l t e n (205) an Rana-Arten Is. aueh H e r t z (79), H S b e r (82, S. 529), R u m j a n t z e w und K e d r o w s k y (194)]. Auch C o l l a n d e r (35, S. 398) erhebt Einwande, namlich daft die Strukturverh~ltnisse besonders pflanzlicher Zellen unzureiehend beachtet werden, insofern der Gehalt des Zellsaftes an kolloiden Adsorbentien nicht bekannt ist [Meyer (141, S. 390f.),

bis 7,6), wKhrend die gleiche Erscheinung fiir Individuen alkalischer Kulturen yon pH ~ 8,0 an bei einem Werte yon ungefKhr 7~6 ihr Maximum hat, um bei weiterer AnsKuerung his pH = 7,1--6,6 ein Minimum aufzuweisen. Endlich sind bier die Unter- suchungen yon S~rugger (217a) fiber den Einflu$ der H'-lonen auf das Protoplasma der Wurzelhaare yon Hordeum vulgare zu beaehten.

Sammelreferat 457

L u n d e g ~ r d h (130, S. 320)]1); daff die Versuchsteehnik Miingel aufweist, indem teils giftige Azetatgemische, feils nur unter besonderen Verhiiltnissen [ C o l l a n d e r (35~ S. 392)] eindringende Phosphatgemische verwendet werden [s. aueh B r e n n e r (18)!]; schliefilich daft reichlichere Aufnahme von S~ure- farbstoffen in nicht besonders saure Zellen erfolgt (C o 11 a n d e r a; a. 0. S. 361 f.).

6. Bei aller Anerkennung der heifien Bemtihungen, allein auf kolori- metrisehem Wege eindeutige und sichere Resultate der pH-Messung und der Wirksamkeit tier C~ auf verschiedene Zellgeschehen zu bekommen, mtissen wir also mit Sicherheit damit rechnen, dai] e ine R e v i s i o n m a n c h e r h e u t e v i e l l e i c h t g e s i c h e r t s c h e i n e n d e r B e f u n d e v o r z u n e h m e n ist. Dieses allerdings bedauerliehe Ergebnis haben wir damit zu erklRren, daft die Methodik trotz aller erfreuliehen Ansatze noch nicht genfigend ausgearbeitet ist, um die - - yon uns angefiihrten (S. 441f.) - - FehlerqueUen ausschalten oder wenigstens exakt berticksichtigen zu kSnnen. Das biologische Milieu, auf dessert Analyse unsere Experimente sich richteten, ist eben so mannigfaltig yon den Verhi~ltnissen in nicht organischen LSsungen verschieden, daff vor- l~ufig bei einfacher Ubertragung tier Ergebnisse der Azidimetrie gewisse Inkorrektheiten nicht zn vermeiden sind.

IV. Ziele und Aussichten der kolorimetrischen Intrazellularazidimetrie

Wenn wir zusammenfassend den kritischen Wert der kolorimetrischen Azidit~tsmethodik an lebenden Zellen behandeln, so haben wir zuerst F o r d e r u n g e n ftir z u k f i n f t i g e U n t e r s u c h u n g e n zu stellen, die auf diesem Gebiete manchmM durch die yon Kritik allzu unbeschwert vorw~rts eilende Forschung iibersehen wurden. Wohl reihen sich in den letzten Jahren in methodischer Hinsicht und nach der Summe der Beobachtungen viele gls Befunde aneinander, so "daft man tiber den dadurch aufgerichteten Bau all- gemeine Befriedigung voraussetzen sollte. Jedoch trifft das nur in beschriinktem Mai]e zu, indem bei nicht wenigen Vertretern der exakten physikalischen Chemie die Klage fiber zu oberflaehliches Arbeiten und tiber unberechtigte oder vorschnelle @eneralisierung der nur in wi~sserigen LSsungen gtiltigen Befunde nicht verstnmmen will. Bei der gewaltigen Komplizierung, die das physiologische Zell- und Gewebegeschehen der Organismen beherrscht und weit- gehende Abweichungen yon den exakten Untersuchungen an unorganisierten Modellsubstanzen bedingen muff, ist es nicht zu verwundern, daff viele anfangs gut basiert ersehienenen Beobachtungen unter Beachtung der erst allmi~hlich bekannt gewordenen Fehlerquellen einer gewissen Revision bedtirfen~ so daft

a) Denn die Anfiirbung des Zellsaftes kann nur dann gemii$ Bethes Prinzip ein ]~al~ fiir die Intensit~it der sauren Reaktion sein, wenn im Zellsaft kolloide Ampholyte vorhanden sin(l, an denen die Adsorption des Indikators erfolgt.

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dadurch das Gebiet der kolorimetrischen Azidit~ttsmessungen und der Vital- f~rbungsforschung einem Umbaugel~inde gleicht, auf dem kaum schon hSher gefiihrte Mauern eine entfernte Vorstellung yon dem beabsichtigten stolzen Baue ahnen lassen. Nun gilt es~ die einzelnen Bausteine yon fehlerhaften Teilen zu befreien~ also die Kenntnis der Fehlerquellen quantitativ zu erfassen. Neben dem Bestreben nach Ausschaltung~ Reduktion und quantitativer Bestimmung der inkorrekten Abweichungen wird sich aber auch das Bemiihen nach quantitativer Effassung aller WertgrSi~en und nach direkter oder unter gewissen Voraussetzungen mSglicher Vergleichbarkeit der Resultate betiitigen miissen. Bevor wir jedoch dahin kommen kSnnen~ sind weiterhin - - in ihren Ausmal]en gewaltige - - Vorarbeiten zu leisten, um durch mehr qualitative~ abschatzende und variierende Experimente tiber auffiillige Einfltisse tier CH, Begrenzung der Aziditiitswirkung, sowie geeignete ,Modelle" Aufschlui~ zu gewinnen. Wie fiir fast a]le elektroanalytischen Untersuchungsverfahren [Kelle',r (98~ S. 72f.)] ist diese Vorarbeit auch ftir die Messung der intrazellularen pH-Werte zumeist erst noch zu leisten. Vielleicht kann sie auch nur zum Schaden einer spi~teren exakten Wiirdigung dieses Faktors schon jetzt in Hast erledigt werden. Die vorliegenden Bemerkungen mui~ten darlegen, wie selbst die methodischen Schwierigkeiten durchaus noch nicht'fiberwunden sind.

Wenn so die angefiihrten U n t e r s u c h u n g e n in e r s t e r L i n i e nur nac'h i h r e r v o r b e r e i t e n d e n B e d e u t u n g g e w i i r d i g t worden sind~ so braucht das natiirlich keine Herabsetzung ihres Wertes einzuschliei~en. Vielmehr diirfte eine solche Stelhngnahme geeignet sein, manche der inhaltlich zuweilen abgelehnten Arbeiten als fiir die Folge sieher nicht unwichtig einzu- schiitzen. Doch soll so eine Unterstiitzung der einseitigen Auffassung ver- mieden werden~ als ob die verschiedene aktuelle Aziditiit, ausgedrtickt durch die CH oder die entsprechenden pH-Werte~ bereits das Wesen der physiologischen Gewebe- und Zellgesehehen ersehSpfen kSnnte, als ob nicbt aufier der Azidit~t und der elektrischen Ladung der Teilche~ sowohl die iibrigen Ionen des Molektils, als auch diverse andere energetische Effekte die cytologischen Ph~nomene bedingen. Nach des Ref. Vermutung ist sogar nicht einmal - - vor Beweis des Gegenteils - - a priori auszuschliei~en~ dat~ alle diese Fak- toren u n t e r e i nem g e w i s s e n , k r i t i s c h e n " 1VIilieu e i n e n b e s t i m m t e n o p t i m a l e n o der m a x i m a l e n W i r k u n g s g r a d besitzen, um dafiirunter andern ~iui~eren Bedingungen gegeniiber dem energetischen Einflut~ anderer Faktoren an Wert zurtickzutreten. So w~re im lebenden Organismus vielleicht mit einer Variabilitiit der Zustiinde yon Kolloiden und ihren LSsungen zu rechnen, wortiber heute kaum schon etwas abzuschiitzen ist. Datum nun aber jeden Versuch~ Wirkungsweise und Wirkungsgrad tier CH im lebenden Organismus zu ergrtinden, wegen der verschiedenen Wertigkeit der meisten bisherigen Anstitze aufzugeben, also ausgeftihrte Vitalfiirbungsversuche mit Indikatoren nicht mehr azidimetrisch ausdeuten zu wollen, hiet~e ein Fortschreiten der Forschung auf einem Gebiete heute nur erst unvollkommen zu umgrenzender

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Bedeutung ausschlleflen. ,Modern" in dem fiblen Sinne der Schlagwort- Deutungen soll und braucht das kolorimetr ische Met3verfahren darum noch nicht zu werden [vgl. G i c k l h o r n (55, S. 141)!]. Glticklicherweise stehen tier Zell- und Gewebeazidimetr ie noeh andere, allerdings ungleich schwierigere Methoden zur Verftigung, deren Fehlerquellen b ei en t s p r e cher t d em A u s b au vielleieht weniger wei t t ragend sind. Sie dureh Verfeinerung und VervoU- kommnung immer besser den biologischen Verh~ltnissen anzupassen und sodann recht hi~ufig und vielseitig zur KonC~olle ffir die einfacher aus- zuffihrenden kolorimetr ischen Untersuchungen heranzuziehen, wird unser ferneres Bes t reben bilden. Ffirs erste dfiffte es angezeigt sein, in d i e s e r Z e i t s c h r i f ~ a u c h f i b e r d e n S t a n d d e r p o t e n t i o m e t r i s c h e n u n d k a t a l y t i s c h e n V e r f a h r e n in i i h n l i c h e r W e i s e zu b e r i c h t e n . Dor t wird dann auch zu zeigen sei~, wie - - en tgegen mancheu fibelmeinenden Angaben der Li te ra tur - - fiir die Methodik der Messung der aktuellen Aziditat bereits der geforderte ,fixe, scharf definierte, oft - - in Zukunft vielleicht fiberall ~ reproduzierbare Vergleichspunkt" geschaffen worden ist, n~mlich in der H'-Elektrode. Durch For tse tzung der Bemfihungen sind sicher noch mehr Berf ihrungspunkte als bisher zu der yon K e l l e r (98, S. 230) ver- t re tenen Elektrophysiologie zu finden, und unter den yon ibm zusammen- gestel l ten elektro-analytischen Untersuchungsmethoden der Cytologie diirften diejenigen zur CE-Messung und damit auch die k o l o r i m e t r i s c h e n V e t f a h r e n b e d e u t u n g s v o l l u n d t r o t z n o c h v o r h a n d e n e r F e h l e r q u e l l e n b r a u c h b a r sein.

B r e m e n , 29. Oktober 1926.

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Protoplasma. I 30

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