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DESARROLLO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ACÉTICAS
José M. GuillamónDepartamento de Bioquimica i BiotecnologiaFacultat d’Enologia de TarragonaUniversitat Rovira i Virgili
Josemanuel.guillamon@urv.net Rovira i Virgili University
BACTERIA ACÉTICAS. PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS
• Bacilos Gram negativos moviles
• Catalasa Positivos
• Metabolismo estrictamente aeróbio
• Capacidad para crecer en medio ácido
• Capacidad para oxidar una gran cantidad de sustratos
• Aplicaciones industriales: vinagre, Ácido glucónico,
sorbosa, celulosa, etc.
2
Taxonomía de las bacterias acéticas
Taxonomía de las bacterias acéticas
• Persoon (1822)
Mycoderma
• Pasteur (1868)
Mycoderma aceti
• Beijerinck (1900)
Acetobacter
3
Taxonomía de las bacterias acéticas
• Gluconobacter
G. oxydans
• Acetobacter:
A. aceti
A. pasteurianus
A. hansenii
A. liquefaciens
Taxonomía de las bacterias acéticasReordenación por pruebas moleculares (año 2003)
6 Géneros y 34 especies:
• Acetobacter (14 especies)
• Gluconobacter (3 especies)
• Gluconoacetobacter (11 especies)
• Acidomonas (1 especie)
• Asaia (4 especies)
• Kozakia (1 especie)
4
Taxonomía de las bacterias acéticas
Acetobacter
A. aceti
A. pasteurianus
Especies aisladas en vinagres
Gluconoacetobacter
Ga. hansenii
Ga. europaeus
Ga. xylinus
Ga. oboediens
Ga. intermedius
Ga. entanii
Aislamiento y Recuento
5
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE ACÉTICAS
Toma de muestra Uva, vino o vinagre
Recuento en placa Dilución decimal o Centrifugación (10.000 rpm/10 min)
Medio de cultivo GYC• Glucosa 5%
• Extracto de levadura 1%• Pimaricina (100mg/l) • Penicilina (3U/ml)
• Carbonato Cálcico (0.5%)
Incubar 48 horas/ 28ºC
Disolución del CaCO3
Tinción Gram y prueba de la catalasa
Otros medios de aislamiento
Medio RAE (Sokollek et al., 1998)
Glucosa 40 g
Extracto levadura 10 g
Peptona 10 g
Fosfato sódico 3,38 g
Ácido cítrico 1,5 g
Etanol 20 ml
Ácido acético 10 ml
Agar 10 g
Agua 1 Litro
Medio Manitol
D-Manitol 25 g
Extracto levadura 5 g
Peptona 3 g
Agar 15 g
Agua 1 Litro
6
Técnicas de identificacióny recuento independientes
del cultivo
Identificación de especies de bacterias acéticas medianteanálisis de restricción del gen ribosomal 16S
16S 23S 5SITS ITS
1) Amplificación mediante PCR del gen ribosomal 16S
2) Digestión del fragmento amplificado con diferentes enzimas de
restricción
3) Separación de los fragmentos en base a su tamaño en un gel de
agarosa
7
Técnicas moleculares de identificación
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)Permite amplificar una región del genoma bacteriano
millones de veces
Reacción de PCR:• DNA molde• Oligonucleótidos (20-24 nt) complementarios
a los extremos del fragmento a amplificar
• Nucleótidos• Polimerasa
8
Técnicas moleculares de identificaciónLa Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Técnicas moleculares de identificaciónEl análisis de restricción o RFLPs
Enzimas de restricción
EcoRI
9
Análisis de restricción del rDNA 16S
1. Amplificación del rDNA 16S mediante la PCR
Se obtuvieron amplificados de todas las cepas de referenciade un tamaño aproximado de 1450 pb
Productos de PCR∼∼∼∼ 1450 bp
Productos de PCR ∼∼∼∼ 1450 bp
Análisis de restricción del rDNA 16S
2. Digestión del fragmento amplificado mediante diferentes enzimas de restricción (hasta 8 enzimas)
Patrones de restricción obtenidos con TaqI
Ga. hansenii A. acetiG.oxydans Ga.liquefaciensGa. XylinusGa. europaeus
A. pasteurianus
10
Cepa Enzima de restricción TaqI Enzima de restricción RsaI
G. oxydans 1408 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90
G. oxydans 360 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90
G. oxydans 1484 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90
G. oxydans 1414 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90
A. aceti 1261 850+350+210 500+400+300+150+125
A. aceti 298 850+350+210 500+400+300+150+125
A. aceti 1505 850+350+210 500+400+300+150+125
A. aceti 1372 850+350+210 500+400+300+150+125
A. pasteurianus 1262 500+350+330+210 500+400+300+150+125
A. pasteurianus 1553 500+350+330+210 500+400+300+150+125
Ga. hansenii 1527 650+350+210+175 500+400+400+150
Ga. liquefaciens 1381 500+350+210+175+160 500+400+400+150
Ga. liquefaciens 1347 500+350+210+175+160 500+400+400+150
Ga. xylinus 1515 500+350+210+175+160 500+400+400+150
Ga. xylinus 1518 500+350+210+175+160 500+400+400+150
Ga. europaeus 6160 500+350+210+175+160 500+400+400+150
Tamaños de los fragmentos de restricción
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Mo
sto
M.F
. In
oc-
M.F
. Esp
on
t.
F.F
. In
oc.
F.F
. Esp
on
t.
Ga. liquefaciens
Ga. hansenii
A. pasteurianus
A. aceti
G. oxydans
Diversidad de especies de bacterias acéticas
ESTUDIO ECOLÓGICO DE UNA FERMENTACIÓN VÍNICA
11
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 12 17
Ga. liquefaciens
Ga. hansenii
G. oxydans
A. aceti
% e
spec
ies
de
acét
icas
Diversidad de especies de acéticas durante la FML
Día de Fermentación Malolactica
ESTUDIO ECOLÓGICO DE UNA FERMENTACIÓNMALOLÁCTICA
Tipificación de cepas de bacterias acéticas mediante la técnica ERIC-PCR
⊇⊇⊇⊇ En bacterias se han descrito secuencias repetitivas en el genoma:• Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)
⊇⊇⊇⊇ Ya existen oligonucleotidos diseñados para la amplificación por PCR de las secuencias comprendidas entre estos elementos repetitivos
ERICs
LMG 1390LMG 1484LMG1282LMG 1408
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Recuento de poblaciones de bacterias acéticas
mediante la PCR cuantitativa
• No es necesario el cultivo previo
• Cuantifica poblaciones de bacterias mediante
cuantificación del ADN bacteriano de la muestra
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Recuento de poblaciones de bacterias acéticas
mediante la PCR cuantitativa
Recuento de poblaciones de bacterias acéticas
mediante la PCR cuantitativa
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