View
0
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
저 시-비 리- 경 지 2.0 한민
는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게
l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.
다 과 같 조건 라야 합니다:
l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 된 허락조건 명확하게 나타내어야 합니다.
l 저 터 허가를 면 러한 조건들 적 되지 않습니다.
저 에 른 리는 내 에 하여 향 지 않습니다.
것 허락규약(Legal Code) 해하 쉽게 약한 것 니다.
Disclaimer
저 시. 하는 원저 를 시하여야 합니다.
비 리. 하는 저 물 리 목적 할 수 없습니다.
경 지. 하는 저 물 개 , 형 또는 가공할 수 없습니다.
HMGB1 처리에 한
NLRP3 플라마
연 학 학원
과학과
수
HMGB1 처리에 한
NLRP3 플라마
지도 수 신 수
문 사학 문 함
2015 12 월
연 학 학원
과학과
수
감사
사 학 무사 마 수 도 아 없 도 주시고 원해주신
많 들께 마 감사 마 합니다.
실험실에 처 들어 업할 지 항상 변함없 격 움
주시고 상 아갈 수 도 도움 주신 신 수
수님께 진심 감사 말씀 합니다. 신 에 연 에
심 갖고 언해주신 수님, 수한 수님께 감사 드립니다.
그리고 항상 많 가 주신 미생물학 실 상래, 한, ,
, 재 , 상 , 신 재, 수님께 감사 드립니다.
슬픈 함께 공 하 억 물해 실험실 식 들께
감사 드립니다. 실험에 한 언 아 없 해 주시고 항상 뜻한
마 보듬어주시 과 같 곽만 사님, 폭 지식
많 것 가 쳐 주시 사님, 편안한 실험실 생 할 수
도 쾌한 만들어주시 규 사님, 2 동안 곁에
큰 어주고 실험에 한 언 아 지 않았 스승
아람 , 언 고 습 주변사람 게 하 라 ,
실험실에 묵묵 하 신 꿈 향해 아가 훈 ,
막내 가 어 많 웃 수, 그리고 업생
빈 숙 에게 감사 마 합니다.
마지막 지 지 항상 믿어주시고 원해주시 함 없
지원해주신 아 지 훈, 어 니 연 그리고 언 내 편 어
언니 수 경하고 사랑합니다.
수 씀
차
문 약··············································································· 1
Ⅰ. ················································································ 3
Ⅱ. 재료 ·································································7
1. 재료 ····································································7
2. 포 양 플라마 도 ···········································7
3. 마우스 BMDM 포 생 ···············································8
4. Western blot analysis·····················································9
5. Enzyme linked Immunsorbent assay (ELISA) ························9
6. Immunoprecipitation ··························································11
7. ROS ····························································11
8. 마우스 에 플라마 도 tolerance ··········12
9. siRNA transfection ···············································12
10. 통계 ····································································12
Ⅲ. 결과 ····································································13
1. HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과 ···············13
2. HMGB1 처리에 한 NLRP3 특 플라마 tolerance
과 ················································································15
3. HMGB1 처리에 한 플라마 ···········20
4. LTbR HMGB1 결합 ···········································24
5. LTbR HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance
과 ····································································26
6. TRIM30a에 한 ROS 과·········································29
7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance
과···································································31
Ⅳ. 고찰···············································································34
Ⅴ. 결 ···············································································40
참고문헌··············································································41
Abstract ···············································································48
그림차
그림 1. 마우스 식 포에 HMGB1 처리 후 LPS ATP
극에 한 IL-1β 비 ····················15
그림 2. 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 후 LPS
nigericin, alum, poly(dA:dT) 극에 한 IL-1β
비 ·········································17
그림 3. HMGB1 처리 후 플라마
····················································22
그림 4. LTbR HMGB1 결합 ························25
그림 5. LTbR 결 마우스 BMDM에 HMGB1 처리에
한 플라마 tolerance 과 ···············27
그림 6. TRIM30a에 한 ROS 과 ·············30
그림 7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라
마 tolerance 과 ··························32
그림 8. HMGB1 처리에 한 LTbR LPS
tolerance 과 ··············································33
약
AIM2 absent in melanoma 2
ASC apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy-
terminal CARD
ATP adenosine triphosphate
BMDM bone marrow derived macrophage
CARD caspase activation and recruitment domain
DAMP danger-associated molecular patterns
HMGB1 high mobility group box 1 protein
IL Interleukin
LPS lipopolysaccharide
LTa1b2 lymphotoxin a1b2
LTbR lymphotoxin b receptor
NLRP3 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3
LRR leucine-rich repeat
PAMPs pathogen-associated molecular patterns
PRR pattern-recognition receptor
Poly(dA:dT) poly(deoxyadenylic-deoxythymidylic)
Poly(I:C) polyriboinosinic:polyribocytidylic acid
PYD pyrin domain
RAGE receptor for advanced glycation end product
ROS reactive oxygen species
TLR toll-like receptor
TNF-α tumor necrosis factor-α
TRIM30α tripartite-motif protein 30
1
문 약
HMGB1 처리에 한
NLRP3 플라마
플라마 천 역 병원 물질 또 상
포 식하여 역 도하고 숙주 생
가시킨다. 하지만, 러한 역 지 않
가 역질 또 역질 수 문에
플라마 신 달 엄격하게 어야 한다. 그러
아직 지 플라마 에 해 많 진 가 없다.
HMGB1 핵 내에 재하 핵단 DNA 지
사 에 여한다. LPS 같 스트 스 또 endo-
toxemia sepsis 에 식 포 비
HMGB1 후 매개체 TLR9 ligand CpG‐ODN, TLR4
ligand LPS 복합체 하여 염 사 생
진시켜 염 악 시키 것 알 다. 그러 근
HMGB1 처리에 해 ischemia-reperfusion injury 감 시켜
LPS tolerance 킬 수 다 들 보고 었다. 하지만,
HMGB1 처리에 한 immune tolerance 과 TLR 에 한 NF-
κB 신 에만 한 어 inflammasome tolerance 에 해
연 가 많 진행 어 지 않다. 본 연 에 재 합 HMGB1
단 질 마우스 식 포에 처리 하 플라마
tolerance 가 도 것 찰하 다. 재 합 HMGB1
처리한 후 플라마 시켰 NLRP3 플라마
2
특 IL-1β IL-18 비가 감 하 HMGB1 처리 시
플라마 TRIM30α 가 는 것
하 다. TRIM30α 도하는 lymphotoxin β receptor (LTβR)
HMGB1 결합 역침강 과 ELISA 하 LTβR
agonistic antibody 처리 통해 플라마 tolerance 과가
하 다. 하고 LTβR 결 마우스
BMDM 포에 HMGB1 처리 시 플라마 tolerance 가
감 하여 HMGB1 처리에 한 플라마
tolerance 는 LTβR 하 다. 또한
HMGB1 처리 하 TRIM30α ROS level
감 함 하 마우스 에 도 HMGB1 처리에
한 플라마 tolerance 가 도 찰하 다.
본 연 통하여 처리 HMGB1 LTβR 결합하여
TRIM30α 도함 NLRP3 플라마
억 시킬 수 새 게 시하는 다.
핵심 말: HMGB1, NLRP3, inflammasome, Tolerance, Lymphotoxin b
receptor, TRIM30a
3
HMGB1 처리에 한
NLRP3 플라마
<지도 수 신 수>
연 학 학원 과학과
수
Ⅰ.
역체계 병원체 숙주 보 하 역할 수행하 척
동물 경우 천 역과 역 갖 다.1 역 포 포 에
pathogen-associated molecular pattern (PAMP) 식하 pattern recognition
receptor (PRR) 갖고 미생물 갖 공통 핵산, 포
벽, 비물 등 식할 뿐만 아니라 상 가 포 비
uric acid, adenosine triphosphate (ATP), heat shock protein70 (HSP70)과 같
damage-associated molecular pattern (DAMP) 식하여 역 도한
다.2,3 천 역에 여하 PRR 에 라 크게 가지 다.
첫 째 Toll-like receptors (TLRs) 같 포막 (transmembrane) 또
4
endosome에 재하 PRR 에 하 , 째 RIG-I-like receptor
(RLR), AIM2-like receptor (ALR), nucleotide-binding domain and leucine-rich
repeat-containing (NLR) 단 질과 같 포질에 재하 수 체가 에
한다. 에 NLR과 ALR 플라마 (inflammasome) 복합체
하 별 어체계 갖 다.2-4 플라마 러스, 균감염,
포 상, 사 균 등과 같 건에 천 역에 여하
한 할 뿐만 아니라 역 에도 여한다.
플라마 식 수 체 apoptosis-associated speck-like protein containing a
carboxy-terminal CARD (ASC), caspase-1 함께 합체 루어 염
사 interleukin (IL)-1β, IL-18 시켜 포 비
하거 pyroptosis 도하여 포 사 에도 여한다.5,6 NLRP3 플라마
상 동하지 않 가 역질 , 2 당뇨, 동맥경
등 다양한 질병 하 문에 엄격 어야 한다.7
High mobility group box 1 (HMGB1) 포핵 내에 매우 하게 재하
는 단 질 포핵뿐만 아니라 포안과 에 다양한 생물학 에
여한다.8 HMGB1 215개 아미 산 루어 DNA
minor groove에 결합하는 티프 A box (aa 28-44) B box (aa 179-185)
가지 말단에는 루탐산과 아스 트산 acidic tail
루어 다.9-12 HMGB1 주 핵 내에 치하여 DNA 스 단
질에 결합하여 뉴클 안 시키고 DNA 사
5
한다.13 단핵 또는 식 포 핵 내에 치하는 HMGB1 균 감염,
포 상, lipopolysaccharide (LPS)에 해 아 틸 , 산 , 당 같
사 후 역과 거쳐 포질과 포 능동 동 거나
상 포에 수동 비 어 험신 염
에 여한다.14-18 포 비 HMGB1 DAMP 하여 단
독 천 역 시킬 뿐만 아니라 tumor necrosis factor-α (TNF-α)
같 염 사 카 또는 상 포 비 단 질과
복합체 루어 역 킨다.13 포 에 재하는 HMGB1
TLR2, TLR4, TLR9, receptor for advanced glycation endproducts (RAGE)
결합한다고 알 , DNA 결합 룬 HMGB1 경우 RAGE
결합하여 가포식 매개하여 포독 물질에 한 항 갖는
다.14,19-22 그러나 지 지 보고 HMGB1 염 능과는
HMGB1 처리 하 는 LPS에 한 ischemia-reperfusion injury 감
시켜 LPS tolerance 킬 수 다는 연 가 근에 보고 고 다.23-
26 하지만 재 지 HMGB1 처리에 해 나타나는 immune tolerance
과는 NF-κB 신 달 체계에만 한 어 그 과가 연 었 플라
마 과 계는 아직 지 보고 가 없다.
Tripartite-motif (TRIM) RING domain, B-box, coiled-coil (RBCC)
공통 갖 단 질 러한 다양한 생물 에 보 어
다.27 재 지 진 TRIM 단 질 포 열, ,
6
포사 , 양 , 항 러스 등 천 역에 매우
한 한다.27-29 TRIM family 하 TRIM30α 마우스에
재하 TLR 또 lymphotoxin β receptor (LTβR)에 해 도 어 NF-κB
신 에 여하 TAB2/3 해하여 억 할 뿐만 아니라
NLRP3 플라마 reactive oxygen species (ROS) 생 감 시켜
염 질 시킨다.28,30 그러 마우스 TRIM30α 가 가 운 상
동 계 갖 사람 TRIM5 천 역 시키 가지고
어 역할 수행한다.31,32
LTβR 림프 , NK 포, B 포 비 TNF subfamily
LTα1β2, LIGHT 리간드 식하여 , 상피 포, 질 포, 그
리고 골수 포 다.33,34 에 LTβR 2차 림프 달
과 지, 수지상 포 통한 역 항상 에 주 연 어
다.35-38 그러 근 보고에 TLR4 TLR9 극 후 LTβR
염 사 생 억 시키고, 마우스 에 dextran
sodium sulfate (DSS) 매개 한 염 생 시 TRIM30α 통해 염
할 수 것 라 가 시하 다.39,40
라 본 연 에 HMGB1 처리에 해 플라마 tolerance가
도 것 하고, HMGB1 처리에 해 도 플라마
tolerance에 TRIM30α가 미 향 하고 한다. 아가 플라
마 tolerance에 TRIM30α가 하 에 해 연 하고 하 다.
7
Ⅱ. 재료
1. 재료
재 합 사람 LTbR-Fc 단 질 mGM-CSF (R&D system, Mineapolis, MN),
poly(I:C), LPS (L5293), ATP, nigericin (Sigma Aldrich, St Louis, MO), Inject Alum
poly(dA:dT) (Inviviogen, San Diego, CA) 매하여 사 하 , 항체
anti-HMGB1 (ab18256), anti-TRIM30a (Abcam, Cambidge, UK), anti-A20
(Cell Signaling, Cambrodge, MA), anti-IL-1β (R&D system), anti-caspase-1
(Adipogen, San Diego, CA), anti-peroxiredoxin (Prx) I (Abfrontier, Seoul, Korea),
anti-LC3 (Novus, San Diego, CA) 사 하 다. 마우스 TNF-a ELISA
Ready-SET-Go (e-Bioscience, Sandiego, CA), 마우스 IL-1β ELISA (R&D
system), 마우스 IL-18 ELISA (e-Bioscience, Atlanta, GA) 사 하여 마우스
TNF-a, IL-1β, IL-18 양 하 다.
2. 포 양 플라마 도
마우스 식 포 J774 포주 마우스 골수 래 식 포(bone
marrow-derived macrophage, BMDM) 하 다. J774 포주 포 양액
2 mM L-glutamine과 10% 우태아 청 (fetal bovine serum, FBS)(Gibco,
Rockville, MD) 포함 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
하여 5% CO2, 37°C 건에 양하 다.
플라마 시키 해 마우스 BMDM 포 J774 포주에
8
HMGB1 20 μg/ml 처리하여 24시간 동안 5% CO2, 37°C 건에 양
후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 간 시켰다. 플라마
건에 라 각각 nigericin 10 μM 30 , alum 250 μg/ml 6시간 처리하고
poly(dA:dT) 1 μg/ml transfection 한 후 6시간 동안 양하 다.
3. 마우스 BMDM 포 생
C57BL/6 마우스 BMDM 포 하여 HMGB1 처리에 한
플라마 과 하 다. 마우스 다리 뼈 강 뼈
리한 후 골수 포 RPMI1640 지 한 26G 주사 하
다. 다 상 지 통과시킨 후 cell strainer 하여 단 포
리하 다. 해 액 ammonium-chloride-potassium
(Sigma Aldrich) 1 ml 상 에 5 간 시킨 후 FBS free RPMI 1640
3 척 하 다. 마우스 골수 래 식 포 10% FBS가 포
함 RPMI1640 지에 20 ng/ml mGM-CSF 첨가한 후 5% CO2, 37°C
건에 7~10 동안 시킨 하 다.
LTbR, TLR4, RAGE HMGB1에 한 수 체 한다. 라
HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance에 어 한 수 체가 여하
지 알아보 해 각각 LTbR, TLR4, RAGE 결 마우스 BMDM
얻어 시킨 후 실험에 하 다. LTbR, TLR4, RAGE 결 마우스
각각 학 강 식 수님, 연 학 신 재 수님, 연 학
9
하 수님 연 실 공 아 사 하 다.
4. Western blot analysis
HMGB1 처리에 한 플라마 과 단 질 수 에
하 다. J774 포주 마우스 BMDM 포에 insect 포 리
HMGB1 20 μg/ml 24시간 동안 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5
mM 30 처리하여 극한 후 상 액 얻고 다시 whole cell lysate (WCL)
리하여 SDS-PAGE 실시하 다. WCL 1% protease inhibitor가 첨가
RIPA buffer lysis하여 15,000xg 원심 리 한 후 상 액 BCA assay
량 후 하 고, 상 액 경우 원심 리하여 cell debris 거 후
methanol-chloroform 하여 하 다. 플라마 건에 HMGB1
처리에 한 과 하 해 nitrocellulose membrane
(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) 후 caspase-1, IL-1β 도
하 다.
HMGB1에 한 TRIM30α 수 찰하 해 마우스 BMDM
포 또 J774 포주에 재 합 HMGB1 20 μg/ml 단독 처리하여 cell
lysate SDS-PAGE 진행하 다. Nitrocellulose membrane 후
TRIM30α 항체 검 하 다.
5. Enzyme linked Immunsorbent assay (ELISA)
10
HMGB1 처리에 한 플라마 과 찰하고 염 사
IL-1β TNF-α 도 ELISA 통해 하 다. J774
포주 마우스 BMDM 포에 HMGB1 20 μg/ml 처리 후 LPS 500 ng/ml 4
시간, ATP 2.5 mM 30 처리하여 극한 후 상 액 리하여 하 다.
Anti-IL-1β capture antibody 60x PBS 1x가 도 한 후 새도
ELISA plate (Corning Costa, Tewksbury MA)에 immobilization 시키고 0.05%
Tween-20가 포함 PBST 척하 다. 1% BSA가 포함 PBS
고 1시간 시켜 blocking 하 다. 포 양한 상 액 1:10
도 1% BSA-PBS 하여 2시간 시켰다. 결합하지 않 단 질
0.05% PBST 차 척한 anti-IL-1β detection antibody 2시간
후 streptavidin-HRP 20 시켰다. 결합 루어지지 않 것
0.05% PBST 척하여 거한 후에 TMB 질 (KPL, Gaithersbury, MD)과
시켜 색 도 450 nm 에 spectrophotometer OD 값 통하
여 하 다.
TNF-α ELISA 경우 10% FBS가 포함 PBS (10% FBS-PBS) 1시간 동
안 blocking한 후 상 액 1:10 하여 2시간 시켰다. 결합하
지 않 단 질 0.05% PBST 차 척한 anti-TNF-α detection
antibody 1시간 후 streptavidin-HRP 40 시켰다. 결합
루어지지 않 것 0.05% PBST 척하여 거한 후에 TMB 액과
시켜 색 도 OD 값 통하여 하 다.
11
HMGB1과 LTβR 상 하 해 HMGB1 2 μg/ml
coating buffer에 하여 ELISA plate에 immobilization시켰다. 10% FBS-PBS
1시간 동안 blocking한 후 재 합 단 질 LTβR-Fc 5 μg/ml 도
serial dilution하여 2시간 시켰다. 0.05% PBST 차 척 한 3
μg/ml anti-human IgG HRP 시켰다. 결합 루어지지 않 것
0.05% PBST 척하여 거한 후에 TMB 액과 시켜 색 도
하 다.
6. Immunoprecipitation
Protein G beads(Invitrogen, Carlsbad, CA) LTβR-Fc 단 질 100 ng 고
37°C에 2시간 시켰다. Protein G beads-LTβR-Fc에 HMGB1 100 ng
고 4°C에 새도 시킨 후 결합한 단 질 하 해
anti-HMGB1 anti- LTβR 항체 사 하여 Western blot 통해 하 다.
7. ROS
J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5
mM 30 처리하여 극한 후 포 양액 거하고 PBS 3 척하
다. PBS에 ROS detection reagent H2DCFDA (Invitrogen, Waltham, MA)
10 μM 한 후 5% CO2, 37°C 건에 포 15 간 시켰다.
PBS 3 척 후 마지막에 200 μl PBS 어 flow cytometry (BD
12
FACSVerse) 하여 하 다.
8. 마우스 에 플라마 도 tolerance
7-8주 C57BL/6 마우스에 HMGB1 1 mg/kg 24시간 간격 복강내
1 또 2 주 하고 24시간 후에 LPS 10 mg/kg 주 하 다. 2시간 후
에 alum 25 mg/kg 복강 내 여하 다. Alum 여 4시간 후 마우스
액 채취하여 4°C에 2,000xg 10 간 원심 리 후 청 리하
다. cytokine ELISA 하여 하 고, 청 1:20
하여 사 하 다.
9. siRNA transfection
J774 포주 40-50% confluence가 도 6 well plate에 24시간 도
양하 다. TRIM30α siRNA duplex 50 nM 12μl INTERFERin
transfection reagent 400μl OPTI-MEM에 어 진탕하고 상 에
15 간 시킨 후 포에 48~72시간 동안 transfection하 다. 양액
새 운 10% FBS-RPMI1640 지 한 후 실험에 사 하 다.
10. 통계
실험 상 복 수행하 , 평균 값 그래프 하 다.
Error bar SD 하 다. P-value 값 one-way ANOVA 한 후
13
Bonferroni 보 하여 하 다.
14
Ⅲ. 결과
1. HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과
HMGB1 처리에 플라마 tolerance 과 찰하 해
해 J774 포주 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 한 후 LPS
ATP 처리함 비 IL-1β TNF-α 도 ELISA 하
여 하 다. J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 24시간 동안 처리한
후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 처리하 다. 후 포 양액
얻어 TNF-α IL-1β ELISA 하 다. 그 결과, J774 포주에
HMGB1 처리에 해 IL-1β TNF-α 비가 감 함 하 다 (그
림 1A). 플라마 tolerance 과가 마우스 BMDM 포에 도 동 하게
찰 지 하 해 HMGB1 처리하 시간과 도 다 게
한 후 LPS 4시간, ATP 30 처리하여 비 는 IL-1β 도 측 하
다. 그 결과 HMGB1 처리 시간과 도가 가할수 비 는 IL-1β
양 감 하는 것 찰하 다 (그림 1B).
15
그림 1. 마우스 식 포에 HMGB1 처리 후 LPS ATP 극에 한
IL-1β 비 . (A) J774 포주에 HMGB1 10 mg/ml 24시간 처리하고
LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 30 처리 한 후 포 양액 얻어 IL-1β,
TNF-a 생 양 ELISA 함 (B) 마우스 BMDM 포에
HMGB1 10 mg/ml 8, 16, 24시간 처리하거 , HMGB1 0.1, 1, 10, 20 mg/ml
24시간 처리하고 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 30 처리 한 후 포 양
액 얻어 IL-1β 생 양 ELISA 함 (*P<0.001, **P<0.0001).
16
2. HMGB1 처리에 한 NLRP3 특 플라마 tolerance 과
플라마 여러 가지 극 들에 해 다. LPS 에 한
TLR 하 신 달 후 ATP, nigericin, alum 처리하 NLRP3
플라마 고, poly(dA:dT) 처리하 AIM2 플라마
다. HMGB1 처리에 해 도 플라마 tolerance
과가 다양한 플라마 에 도 지 하 해 마우스
BMDM 포에 LPS 처리 후 각각 ATP, nigericin, alum, poly(dA:dT)
처리하여 하 다. 그 결과, NLRP3 플라마 특 tolerance
과가 ELISA Western blot 하 다. HMGB1 처리 후
LPS ATP, nigericin 또 alum 처리하여 NLRP3 플라마
시켰 IL-1β 비 도가 감 함 하 다 (그림 2A-C). 그러
LPS 처리 후 poly(dA:dT) transfection 한 AIM2 플라마 에
HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과가 없 찰하 다
(그림 2D). 또한 Western blot 통해 하 LPS ATP, nigericin,
alum 에 한 NLRP3 플라마 에 IL-1β 비가 감 어
찰하 다 (그림 2A-C). HMGB1 처리에 pro-IL-1β, pro-caspase-1,
NLRP3, ASC 량 변 Western blot 통해 한 결과 차 가
없 찰하 다(그림 2E). 라 , HMGB1 플라마
생 사 IL-1β 비량 감 시킴 tolerance
도하 것 하 다.
17
18
19
그림 2. 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 후 LPS nigericin,
alum, poly(dA:dT) 극에 한 IL-1β 비 . C57BL/6 마우스 BMDM
포에 HMGB1 20 mg/ml 24시간 처리 한 후, LPS 500 ng/ml 4시간,
(A) ATP 30 , (B) nigericin 30 (C) alum 6시간 (D) poly(dA:dT) transfection 6
시간 처리 후 포 양액 수합해 IL-1β, IL-18 생 양 ELISA 과
western blot 함. One-way ANOVA 한 후, Bonferroni 보 함
(*P<0.001, **P<0.0001). (E) 마우스 BMDM 포 수합해 해한 후 포
해물 Western blot 하여 pro-IL-1β, pro-caspase-1, NLRP3, ASC,
GAPDH 함.
20
3. HMGB1 처리에 한 플라마
플라마 경 여러가지 에 해
T RIM30, A20, nitric oxide, type I IFN, 가포식에 해
다.7,41-44 라 HMGB1 처리에 해 들
가하 지 Western blot 과 ELISA 통해 하 다. J774 포주
마우스 BMDM 포 하여 HMGB1 20 μg/ml 8 시간, 24 시간 처리
후 포 수합해 해한 후 포 해물 Western blot 하 다.
그 결과, 플라마 TRIM30α 8 시간,
24 시간에 도 하 A20, iNOS 도 지 않 것
찰 었다 (그림 3A). Prx I 과 Prx II Prx family 주 포질 내에
재하고 Prx III 과 Prx V 미 콘드리아에 재하여 각각 에
ROS 거하 갖 다. ROS 플라마 에 주
하 문에 본 실험에 HMGB1 처리에 해
플라마 tolerance 가 도 Prx 단 질 여하 지 하
해 마우스 BMDM 포 J774 포주에 HMGB1 처리한 후 포질
내에 재하 Prx I-III, V 량 하 다. 그 결과 HMGB1
처리 Prx I-III, V 량에 아무런 향 미 지 않 것
하 다 (그림 3B, C). 또 다 플라마 알
type I IFN 과 가포식 하 HMGB1 처리에 해
변 가 없 하 다 (그림 3D, E). 가포식 도 실험 시
21
starvation 주 해 Hank's balanced salt solution (HBSS) 처리하여 양
하 다.
22
23
그림 3. HMGB1 처리 후 플라마 . (A) 마우스
BMDM 포에 HMGB1과 LPS 500 ng/ml 각각 8, 24시간 처리 후 포
해하여 Western blot 통해 TRIM30α, A20, iNOS, GAPDH 측 함.
(B) 마우스 BMDM 포 (C) J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 8, 24시간
처리 후 포 해하여 Western blot 통해 PrxI-III, V, GAPDH
측 함. (D) 마우스 BMDM 포에 HMGB1과 poly(dA:dT) 1 μg/ml 처리
후 포 양액 수합하여 IFN-α ELISA 수행함. (E) J774 포에
HMGB1 20 μg/ml 8, 24시간 처리하거나 HBSS 1, 2시간 시행한 후 포
수합해 해한 후 Western blot 진행하여 LC3I/II, GAPDH 함.
24
4. LTbR HMGB1 결합
BMDM 포에 HMGB1에 해 TRIM30a 도 하
다. TRIM30a LTbR가 도 단 질 알 다.
HMGB1 처리에 해 TRIM30a가 도 LTbR가 여하 지 알아보
해 LTbR HMGB1 결합 immunoprecipitation과 ELISA
하여 하 다. 해 재 합 LTbR-Fc 단 질과 HMGB1 단 질
시킨 후 protein G bead 역 강하 다. 그 결과 HMGB1과
LTbR-Fc가 결합 함 찰할 수 었다 (그림 4A). 또한 HMGB1 단
질 2 μg/ml ELISA plate에 24시간 동안 상 에 고 시킨 후 재
합 LTbR-Fc 단 질 양 가 시켰 간 결합 도
가함 찰하 다(그림 4B). 실 LTbR가 플라마
tolerance에 여하 지 하 해 LTbR에 한 agonistic 항체 0.5
μg/ml 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 처리하
비 IL-1β, TNF-a 양 감 하여 플라마 tolerance 과가
도 찰하 다 (그림 4C). 라 , 처리 HMGB1 LTβR에 결합
하여 플라마 알 진 TRIM30α 하여
NLRP3 플라마 에 한 IL-1β 비 억 시키 것 찰 다.
25
그림 4. LTbR HMGB1 결합 . (A) Protein G bead LTbR-Fc 단 질
37°C에 2시간 시키고 후 HMGB1 4°C에 24시간 시킨
후 시켜 HMGB1 항체 결합 함. 단 질 사람 Ig
함. (B) ELISA plate에 HMGB1 2 mg/ml 도 착시킨 후 LTbR 10
mg/ml 고 도 , 2 수 하여 시키고 결합 ELISA .
(C) 마우스 BMDM 포에 LTbR agonistic 항체 0.5 μg/ml 처리 후
LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 극해 포 양액 IL-1β,
TNF-a 생 양 ELISA 함 (*P<0.001, *P<0.0001).
26
5. LTbR HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과
HMGB1 처리에 해 도 플라마 tolerance 과가 LTbR
지 하 해 LTbR 결 마우스 BMDM 하 다. 또한
HMGB1 수 체 알 RAGE 결 마우스 BMDM과 TLR4 결
마우스 BMDM 함께 함 플라마 tolerance 도 시 다
수 체 여 여 하 다. 야생 , LTbR, TLR4, RAGE 결
C57BL/6 마우스 골수 포 BMDM 포 하여 얻 후
HMGB1 20 μg/ml 24시간 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30
처리하 다. TLR4 결 BMDM 경우 TLR3 리간드 poly(I:C) 1 μg/ml
4시간, ATP 30 처리하여 포 양액과 포 수합해 Western blot
IL-1β, caspase-1, GAPDH 찰하 다. 야생 BMDM 포에 도
플라마 tolerance가 LTbR 결 BMDM과 RAGE 결 BMDM 포에
찰 지 않았다 (그림 5 A). RAGE 경우 HMGB1과 DNA 함께
처리하 AIM2 플라마 억 시킬 수 다 연 결과가
어 RAGE 플라마 과 연 시 었 NLRP3 플
라마 과 계 아직 진 가 없다.19 TLR4가 결 BMDM 포
에 야생 과 마찬가지 플라마 tolerance가 도 었다 (그림 5B).
라 본 실험 결과 합하 HMGB1 처리에 해 도 플라
마 tolerance 과 LTbR RAGE가 여한다 것 하 다.
27
28
그림 5. LTβR 결 마우스 BMDM에 HMGB1 처리에 한 플라마
tolerance 과 . (A) C57BL/6 wt, LTβR 결 마우스, RAGE 결 마
우스 BMDM 포 리해 mGM-CSF 사 20 ng/ml 처
리해 시킨 후 HMGB1 20 μg/ml 24시간동안 처리 후 LPS 500 ng/ml
4시간, ATP 2.5 mM 30 처리하고 포 수합해 해 시킨 후 포
해물 Western blot 하여 IL-1β, caspase-1, GAPDH 함,
(B) 야생 , TLR4 결 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 후 poly(I:C)
1 μg/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 처리 후 Western blot 하여 함.
29
6. TRIM30a 에 한 ROS 과
ROS 는 플라마 매개하는 주 극 하
TRIM30α 에 해 다.44 라 HMGB1 처리 후 변 하는 ROS
생 도 하여 플라마 tolerance 도에 여하는지
찰하 다. ROS scavenger N-acetyl-L-cysteine (NAC) 양
함께 하 다. J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 24 시간, 또는
NAC 1 mM 1 시간 처리한 후 LPS 500 ng/ml 4 시간, ATP 2.5 mM 3
처리하 다. 그 결과 HMGB1 처리 하 ROS 생 감 하
찰하 다. 양 NAC 처리한 포에 도 ROS 생 도가
감 함 하 다(그림 6A). 그러나 TRIM30α 가 knock down
포에 HMGB1 처리에 한 ROS 생 억 과가 감 함
찰하 다 (그림 6B). 라 HMGB1 처리에 한 ROS 과에
TRIM30α 가 여함 하 다.
30
그림 6. TRIM30a 에 한 ROS 과 . (A) J774 포주에 HMGB1
20 μg/ml 24시간, 또는 NAC 1 mM 1시간 처리한 후 LPS 500 ng/ml 4시간,
ATP 2.5 mM 30 처리하 . DCF-DA 10 μM 15 동안 처리한 후 포
수합하여 FACS 통해 하 . (B) J774 포주에 TRIM30α siRNA
transfection 72시간 후 실험에 하 . TRIM30α knock down Western
blot 하 .
31
7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과
마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과가
타 지 하고 7-8 주 C57BL/6 야생 마우스에 HMGB1 1
mg/kg 24 시간 마다 복강주사 1 또 2 주 후 LPS 10
mg/kg 여하고 2 시간 후에 다시 alum 25 mg/kg 여하 다. 후
4 시간 후에 청 얻어 IL-1β 양 ELISA 통해 량하 다.
C57BL/6 야생 마우스에 PBS 만 복강 주사한 마우스 경우 76.24 ±
56.22 었고, LPS+alum 처리 시 IL-1β 양 624.24 ± 242.28 pg/ml
가하 다. 마우스에 HMGB1 1 처리 한 후 LPS+alum 처리 시
543.02 ± 24.57 플라마 감 과가 도 지 않았지만 HMGB1
2 복주사 하 는 236.11 ± 267.64 pg/ml 감 어 플라마
tolerance 가 도 었다 (그림 7A).
32
그림 7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance
과 . C57BL/6 야생 마우스에 HMGB1 1 또 2 복강주사 후
LPS alum 복강주사하여 마우스 청 얻 . ELISA 하여
청 내 재하 IL-1β 양 량하 . One-way ANOVA 후
Bonferroni 보 함 (*P<0.0001).
33
그림 8. HMGB1 처리에 한 LTβR LPS tolerance 과.
플라마 1 차 TLR signaling 통해 NLRP3, pro-IL-1β 가
도 고, 2 차 ATP, nigericin, alum, ROS 극 가
어 . 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리하 LTβR 결합
루어 상 하여 TRIM30α 단 질 . TRIM30α 는 ROS
생 억 시키고 플라마 감 시켜 결과 IL-1β IL-
18 비가 감 하여 플라마 tolerance 도함.
34
Ⅳ. 고찰
플라마 병원 물질 또 상 포 비 물질
식하여 결과 사 비하거 포사 도한다.5,6,45-
47 플라마 해 TLR signaling 1차 극과 ATP,
nigericin, alum, poly(dA:dT) 같 것들에 해 2차 극 루어 야
루어진다. 플라마 천 역과 역 매개하
여 역 도하고 숙주 생 가시킨다.48-50 하지만, 러한
역 지 않 가 역질 또 역질
문에 플라마 신 달 엄격하게 어야 한다.5 라
근에 플라마 할 수 가 무엇 지에
한 연 가 진행 에 다.51 핵단 질 HMGB1 DAMP
한다고 알 근에 LPS에 한 TLR매개 염 하
여 NK-κB 신 비 TNF-α 양 감 시킬 뿐만 아니라
ischemia/reperfusion에 한 포 상 시킨다 연 가 보고 어
역 tolerance 도할 수 다 새 운 가 시 었다.24-26,52
본 실험에 HMGB1 처리에 해 도 플라마 tolerance
과 에 여하 하 다. 그 결과 HMGB1 처리
시간과 도에 라 IL-1β TNF-α 비가 감 하 것 J774 포주
마우스 BMDM 포에 찰하 다. 플라마 NLR family
35
AIM2가 재하 각각 특 들에 해 다. LPS에 한
TLR 하 신 달 후 ATP, nigericin, alum 처리하 NLRP3 플라마
고, poly(dA:dT) 처리하 AIM2 플라마
다.5 HMGB1 처리에 한 플라마 과가 NLRP3 AIM2
플라마 에 동 하게 하 지 찰한 결과 미 게도 HMGB1
처리 하 AIM2 플라마 에 tolerance 도하지 않았지만
NLRP3 플라마 에 특 tolerance가 도 하 다. 그
러 러한 플라마 에 특 차 에 해
보고 가 없다. 라 한 에 해 가 실험
필 하다.
HMGB1에 해 플라마 과가 어 것 지
해 보고 여러 가지 플라마 해 보았다.
재 지 보고 NLRP3 플라마 가포식, Type I IFN,
A20, iNOS, TRIM30α 다.7,41-44 HMGB1 처리에 들
량 변 한 결과 HMGB1 처리하고 24시간 후 TRIM30α
가함 하 다. 그러 가포식, Type I IFN, A20, iNOS에
변 가 없었다. 처리한 HMGB1 플라마 tolerance
하 TRIM30α 가시킬 수 상 했 것
상 다.
ROS 균 감염, 포 상 시 가하 특 미 콘드리아 래
36
ROS 가 NLRP3 플라마 시키 주 한
다.53 라 본 연 에 플라마 뿐만 아니라 포질
과 미 콘드리아 ROS 감 시키 항산 단 질 Prx도 함께 찰하
다. Prx 6가지 동 단 질 그 Prx I과 Prx II가 포질
에 하게 재하여 포질 내 ROS 감 시키고 Prx III Prx V 미
콘드리에 하여 미 콘드리아 래 ROS 거에 여한다.54 HMGB1
처리 후 Prx I-III, V 찰한 결과, 아무런 변 가 없 하
다. 라 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과 NLRP3
플라마 특 TRIM30α가 여하여 도 것
생각 다.
TRIM30α 단 질 항 러스에 여하여 역 도하
러스 감염 시 가하 단 질 알 다.55 근 보고에
TRIM30α 단 질 TAB2/3 해 통해 TLR 매개 도 NK-κB 신
하 , ROS 생 함 NLRP3 플라마
억 시킨다 연 가 었다.28,44,56 TRIM30α 단 질 LTβR
도 다.39 LTβR TLR4 TLR9 2차 극 시 비 염
시 과 염 매개 단 질 량 감 시키 TRIM30α
단 질또한 NK-κB에 한 량 가한다.57 본 실험
에 HMGB1과 LTβR 결합 하여 처리 HMGB1 LTβR
결합하여 TRIM30α 도하 것 하 다. LTβR가 플라마
37
tolerance에 여하 지 하 해 LTβR에 한 agonistic 항체
하여 HMGB1과 동 한 건 처리 한 후 플라마 시켰
tolerance가 도 것 찰하 다. 러한 상 처리
HMGB1 LTβR과 결합하고 TRIM30α 하여 NLRP3 플라
마 에 한 IL-1β 비 억 시키 것 생각 다.
TLR4 RAGE HMGB1과 결합 루 수 체들 다.20 처리
HMGB1 도 플라마 tolerance에 LTbR 어
상 지 알아보 해 각각 LTbR, RAGE, TLR4 결 마우스 BMDM
하여 플라마 tolerance 과 해 보았다. 재 보고
에 RAGE HMGB1과 DNA 함께 처리하 AIM2 플라
마 에 한 tolerance 도할 수 다 연 결과가 어 RAGE
플라마 과 연 시 었 NLRP3 플라마 과
계 아직 진 가 없다.19 야생 과 TLR4가 결 BMDM 포에
HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance가 도 LTbR,
RAGE 결 BMDM 포 경우 플라마 tolerance가 찰 지 않았다.
앞에 언 하 듯 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 도에
LTbR가 여함 할 수 었다. RAGE 또한 NLRP3 플라마
tolerance 도에 여함 찰할 수 었지만 어 한 신 달 체계
갖고 tolerance 도하 지에 해 심도 연 가 필 할 것
보 다.
38
ROS 는 NLRP3 플라마 시키는 도물질 하나
하 주 미 콘드리아 포질 비 다. 미 콘드리아는
포 스트 스에 매우 민감하게 하는 포 극 게
ROS 뿐만 아니라 미 콘드리아 DNA 하여 NLRP3
플라마 시킬 수 다. TRIM30α 는 포질 내 ROS
감 시킴 NLRP3 플라마 억 할 수 다고 알
다.44,53 라 본 연 에 는 HMGB1 에 해 도 TRIM30α
ROS 가 는지 찰하 다. HMGB1 처리 한 포에 ROS
생 감 하 나 TRIM30α 가 knock down 포에 LPS+ATP
처리에 한 ROS 생 과는 NAC 에 하여 억 는 , HMGB1
처리에 ROS 과는 상실 는 것 찰하 다. 라 HMGB1 에
한 ROS 과는 TRIM30α 도 하 다. 그러나
TRIM30α 에 한 ROS 아직 지 진 가 없
가 실험 다.
HMGB1 처리에 한 플라마 억 과는 마우스 실험에 도
동 하게 도 하 다. C57BL/6 마우스 에 HMGB1 1
처리 하 는 플라마 tolerance 과가 도 지 않았 나 2
처리 하 플라마 tolerance 과가 도 하 다. 청
내 재하는 HMGB1 단 질 가수 해 에 해 쉽게 해 어
진다고 보고 어 다.58 아마도 1 주 HMGB1 가수 해 에
39
해 해 어 플라마 tolerance 과가 감 것 사료 다.
라 HMGB1 2 주 하 HMGB1 처리에 한 과가
지 어 플라마 tolerance 가 도 것 생각 다. 처리
HMGB1 LTβR 결합하여 플라마 TRIM30α
시켜 결과 마우스 에 도 플라마 억 할 수
보여 다.
본 연 에 는 HMGB1 처리에 해 TRIM30α 가 도 고
결과 NLRP3 플라마 tolerance 가 도 는 것 하 다.
라 HMGB1 처리에 한 TRIM30a 도 통하여 NLRP3
플라마 매개 IL-1b 생 역할 수행할 수
새 게 시하는 다.
40
Ⅴ. 결
플라마 병원 물질 식하여 천 역과 역
매개하 한 단 질 복합체 IL-1β, IL-18 비 포 사 에
여한다. 그러 아직 지 플라마 에 해 많
진 가 없다. 근 연 에 HMGB1 처리에 해 LPS
tolerance 도하고 ischemia/reperfusion 에 한 포 상
감 시킨다 보고가 다. 본 연 에 HMGB1 처리에 해
플라마 tolerance 가 도 것 찰하 러한 tolerance
과에 ROS 생 도가 감 하 것 하 다. 러한 상
에 처리 HMGB1 LTβR 결합 루어 TRIM30α 단 질
도함 ROS 루어 질 것 생각 다. 본 연 통해
HMGB1 처리가 NLRP3 플라마 에 한 할 수
새 게 시한다.
41
IV. 참고문헌
1. Boehm T, Iwanami N, Hess I. Evolution of the immune system in the
lower vertebrates. Annu Rev Genomics Hum Genet 2012;13:127-49.
2. Lamkanfi M, Dixit VM. Mechanisms and functions of
inflammasomes. Cell 2014;157:1013-22.
3. Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation.
Cell 2010;140:805-20.
4. Kayagaki N, Warming S, Lamkanfi M, Vande Walle L, Louie S, Dong
J, et al. Non-canonical inflammasome activation targets caspase-11.
Nature 2011;479:117-21.
5. Latz E, Xiao TS, Stutz A. Activation and regulation of the
inflammasomes. Nat Rev Immunol 2013;13:397-411.
6. Miao EA, Rajan JV, Aderem A. Caspase-1-induced pyroptotic cell
death. Immunol Rev 2011;243:206-14.
7. Mao K, Chen S, Chen M, Ma Y, Wang Y, Huang B, et al. Nitric oxide
suppresses NLRP3 inflammasome activation and protects against
LPS-induced septic shock. Cell Res 2013;23:201-12.
8. Magna M, Pisetsky DS. The role of HMGB1 in the pathogenesis of
inflammatory and autoimmune diseases. Mol Med 2014;20:138-46.
9. Read CM, Cary PD, Crane-Robinson C, Driscoll PC, Norman DG.
Solution structure of a DNA-binding domain from HMG1. Nucleic
Acids Res 1993;21:3427-36.
10. Yang H, Antoine DJ, Andersson U, Tracey KJ. The many faces of
HMGB1: molecular structure-functional activity in inflammation,
apoptosis, and chemotaxis. J Leukoc Biol 2013;93:865-73.
42
11. Lotze MT, Tracey KJ. High-mobility group box 1 protein (HMGB1):
nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immunol
2005;5:331-42.
12. Ulloa L, Batliwalla FM, Andersson U, Gregersen PK, Tracey KJ.
High mobility group box chromosomal protein 1 as a nuclear protein,
cytokine, and potential therapeutic target in arthritis. Arthritis Rheum
2003;48:876-81.
13. Andersson U, Tracey KJ. HMGB1 is a therapeutic target for sterile
inflammation and infection. Annu Rev Immunol 2011;29:139-62.
14. Wang H, Bloom O, Zhang M, Vishnubhakat JM, Ombrellino M, Che J,
et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice.
Science 1999;285:248-51.
15. Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein
HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature
2002;418:191-5.
16. Kim YH, Kwak MS, Park JB, Lee SA, Choi JE, Cho HS, et al. N-
linked glycosylation plays a critical role for the secretion of HMGB1.
J Cell Sci 2015.
17. Bonaldi T, Talamo F, Scaffidi P, Ferrera D, Porto A, Bachi A, et al.
Monocytic cells hyperacetylate chromatin protein HMGB1 to redirect
it towards secretion. EMBO J 2003;22:5551-60.
18. Youn JH, Shin JS. Nucleocytoplasmic shuttling of HMGB1 is
regulated by phosphorylation that redirects it toward secretion. J
Immunol 2006;177:7889-97.
19. Liu L, Yang M, Kang R, Dai Y, Yu Y, Gao F, et al. HMGB1-DNA
complex-induced autophagy limits AIM2 inflammasome activation
through RAGE. Biochem Biophys Res Commun 2014;450:851-6.
43
20. Tian J, Avalos AM, Mao SY, Chen B, Senthil K, Wu H, et al. Toll-like
receptor 9-dependent activation by DNA-containing immune
complexes is mediated by HMGB1 and RAGE. Nat Immunol
2007;8:487-96.
21. Park JS, Svetkauskaite D, He Q, Kim JY, Strassheim D, Ishizaka A, et
al. Involvement of toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by
high mobility group box 1 protein. J Biol Chem 2004;279:7370-7.
22. Li J, Wang H, Mason JM, Levine J, Yu M, Ulloa L, et al.
Recombinant HMGB1 with cytokine-stimulating activity. J Immunol
Methods 2004;289:211-23.
23. Wu H, Steenstra R, de Boer EC, Zhao CY, Ma J, van der Stelt JM, et
al. Preconditioning with recombinant high-mobility group box 1
protein protects the kidney against ischemia-reperfusion injury in
mice. Kidney Int 2014;85:824-32.
24. Hu X, Xu C, Zhou X, Cui B, Lu Z, Jiang H. PI3K/Akt signaling
pathway involved in cardioprotection of preconditioning with high
mobility group box 1 protein during myocardial ischemia and
reperfusion. Int J Cardiol 2011;150:222-3.
25. Aneja RK, Tsung A, Sjodin H, Gefter JV, Delude RL, Billiar TR, et al.
Preconditioning with high mobility group box 1 (HMGB1) induces
lipopolysaccharide (LPS) tolerance. J Leukoc Biol 2008;84:1326-34.
26. Izuishi K, Tsung A, Jeyabalan G, Critchlow ND, Li J, Tracey KJ, et al.
Cutting edge: high-mobility group box 1 preconditioning protects
against liver ischemia-reperfusion injury. J Immunol 2006;176:7154-8.
27. Nisole S, Stoye JP, Saib A. TRIM family proteins: retroviral
restriction and antiviral defence. Nat Rev Microbiol 2005;3:799-808.
44
28. Shi M, Deng W, Bi E, Mao K, Ji Y, Lin G, et al. TRIM30α negatively
regulates TLR-mediated NF-κB activation by targeting TAB2 and
TAB3 for degradation. Nat Immunol 2008;9:369-77.
29. Bowie AG. TRIM-ing down Tolls. Nat Immunol 2008;9:348-50.
30. Rathinam VA, Vanaja SK, Waggoner L, Sokolovska A, Becker C,
Stuart LM, et al. TRIF licenses caspase-11-dependent NLRP3
inflammasome activation by gram-negative bacteria. Cell
2012;150:606-19.
31. Pertel T, Hausmann S, Morger D, Zuger S, Guerra J, Lascano J, et al.
TRIM5 is an innate immune sensor for the retrovirus capsid lattice.
Nature 2011;472:361-5.
32. Versteeg GA, Benke S, Garcia-Sastre A, Rajsbaum R. InTRIMsic
immunity: Positive and negative regulation of immune signaling by
tripartite motif proteins. Cytokine Growth Factor Rev 2014;25:563-76.
33. Hehlgans T, Pfeffer K. The intriguing biology of the tumour necrosis
factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and
the games. Immunol 2005;115:1-20.
34. Stopfer P, Mannel DN, Hehlgans T. Lymphotoxin-β Receptor
Activation by Activated T Cells Induces Cytokine Release from
Mouse Bone Marrow-Derived Mast Cells. J Immunol 2004;172:7459-
65.
35. Fütterer A, Mink K, Luz A, Kosco-Vilbois MH, Pfeffer K. The
Lymphotoxin β Receptor Controls Organogenesis and Affinity
Maturation in Peripheral Lymphoid Tissues. Immunity 1998;9:59-70.
36. Rennert PD, James D, Mackay F, Browning JL, Hochman PS. Lymph
Node Genesis Is Induced by Signaling through the Lymphotoxin β
Receptor. Immunity 1998;9:71-9.
45
37. Kabashima K, Banks TA, Ansel KM, Lu TT, Ware CF, Cyster JG.
Intrinsic lymphotoxin-β receptor requirement for homeostasis of
lymphoid tissue dendritic cells. Immunity 2005;22:439-50.
38. Wang YG, Kim KD, Wang J, Yu P, Fu YX. Stimulating Lymphotoxin
Receptor on the Dendritic Cells Is Critical for Their Homeostasis and
Expansion. J Immunol 2005;175:6997-7002.
39. Wimmer N, Huber B, Barabas N, Rohrl J, Pfeffer K, Hehlgans T.
Lymphotoxin-β receptor activation on macrophages induces cross-
tolerance to TLR4 and TLR9 ligands. J Immunol 2012;188:3426-33.
40. Wimmer N, Huber B, Wege AK, Barabas N, Rohrl J, Pfeffer K, et al.
Lymphotoxin-β receptor activation on macrophages ameliorates acute
DSS-induced intestinal inflammation in a TRIM30α-dependent
manner. Mol Immunol 2012;51:128-35.
41. Shi CS, Shenderov K, Huang NN, Kabat J, Abu-Asab M, Fitzgerald
KA, et al. Activation of autophagy by inflammatory signals limits IL-
1β production by targeting ubiquitinated inflammasomes for
destruction. Nat Immunol 2012;13:255-63.
42. Guarda G, Braun M, Staehli F, Tardivel A, Mattmann C, Forster I, et
al. Type I interferon inhibits interleukin-1 production and
inflammasome activation. Immunity 2011;34:213-23.
43. Vande Walle L, Van Opdenbosch N, Jacques P, Fossoul A, Verheugen
E, Vogel P, et al. Negative regulation of the NLRP3 inflammasome by
A20 protects against arthritis. Nature 2014;512:69-73.
44. Hu Y, Mao K, Zeng Y, Chen S, Tao Z, Yang C, et al. Tripartite-motif
protein 30 negatively regulates NLRP3 inflammasome activation by
modulating reactive oxygen species production. J Immunol
2010;185:7699-705.
46
45. Schroder K, Tschopp J. The inflammasomes. Cell 2010;140:821-32.
46. Rathinam VA, Vanaja SK, Fitzgerald KA. Regulation of
inflammasome signaling. Nat Immunol 2012;13:333-42.
47. Davis BK, Wen H, Ting JP. The inflammasome NLRs in immunity,
inflammation, and associated diseases. Annu Rev Immunol
2011;29:707-35.
48. Sander LE, Davis MJ, Boekschoten MV, Amsen D, Dascher CC,
Ryffel B, et al. Detection of prokaryotic mRNA signifies microbial
viability and promotes immunity. Nature 2011;474:385-9.
49. Bauernfeind FG, Horvath G, Stutz A, Alnemri ES, MacDonald K,
Speert D, et al. Cutting edge: NF-κB activating pattern recognition
and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by
regulating NLRP3 expression. J Immunol 2009;183:787-91.
50. Franchi L, Eigenbrod T, Nunez G. Cutting edge: TNF-α mediates
sensitization to ATP and silica via the NLRP3 inflammasome in the
absence of microbial stimulation. J Immunol 2009;183:792-6.
51. Man SM, Kanneganti TD. Regulation of inflammasome activation.
Immunol Rev 2015;265:6-21.
52. Robert SM, Sjodin H, Fink MP, Aneja RK. Preconditioning with high
mobility group box 1 (HMGB1) induces lipoteichoic acid (LTA)
tolerance. J Immunother 2010;33:663-71.
53. Heid ME, Keyel PA, Kamga C, Shiva S, Watkins SC, Salter RD.
Mitochondrial reactive oxygen species induces NLRP3-dependent
lysosomal damage and inflammasome activation. J Immunol
2013;191:5230-8.
54. Hofmann B, Hecht HJ, Flohe L. Peroxiredoxins. Biol Chem
2002;383:347-64.
47
55. Wang Y, Lian Q, Yang B, Yan S, Zhou H, He L, et al. TRIM30α Is a
Negative-Feedback Regulator of the Intracellular DNA and DNA
Virus-Triggered Response by Targeting STING. PLoS Pathog
2015;11:e1005012.
56. Choi UY, Choi WY, Hur JY, Kim YJ. Polyubiquitin chain-dependent
protein degradation in TRIM30 cytoplasmic bodies. Exp Mol Med
2015;47:e159.
57. Wimmer N, Heigl U, Klingseisen L, Schneider-Brachert W, Hehlgans
T. Lymphotoxin-beta receptor signalling regulates cytokine
expression via TRIM30α in a TRAF3-dependent manner. Mol
Immunol 2013;54:40-7.
58. Ito T, Kawahara K, Okamoto K, Yamada S, Yasuda M, Imaizumi H, et
al. Proteolytic cleavage of high mobility group box 1 protein by
thrombin-thrombomodulin complexes. Arterioscler Thromb Vasc Biol
2008;28:1825-30.
48
Abstract
The Pre-conditioning of High Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1)
Negatively Regulates Inflammasome Activation
Su Jung Park
Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University
(Directed by Professor Jeon-Soo Shin)
Inflammasomes are central signaling proteins and cytosolic surveillance
complexes that recognize bacterial infection and metabolic dysregulation.
Inflammasome activation results in interleukin (IL)-1β, IL-18 secretion, and
pyroptosis, yet the regulation mechanisms remain poorly defined. High
mobility group box1 (HMGB1) protein is not only nuclear protein that binds
and stabilizes DNA structure, but also it is a damage-associated molecular
pattern molecules (DAMPs). Although the pro-inflammatory functions of
HMGB1 was revealed first, recent studies have shown that HMGB1 pre-
conditioning protects cell injury triggered by ischemia/reperfusion, and
induces immune tolerance. Here, we demonstrated that the pre-conditioning
49
of recombinant HMGB1 negatively regulates NLRP3 inflammasome
activation. Our data indicates that the pre-conditioning of HMGB1 decreases
IL-1β and IL-18 levels in mouse macrophage cell line J774 and mouse bone
marrow-drived macrophages (BMDM) compared to non-pre-conditioned
cells. Furthermore, pre-conditioning of HMGB1 diminishes production of
reactive oxygen species (ROS) level. HMGB1 also induces tripartite-motif
protein 30α (TRIM30α), a regulator of NK-κB signaling and NLRP3
inflammasome, but not inducible nitric oxide synthase (iNOS), A20, or
interferon-α (IFN-α), which are known for inflammasome negative regulators.
In addition, this inflammasome attenuation effect by HMGB1 pre-
conditioning was mostly restored in lymphotoxin β receptor (LTβR)-deficient
cells, which have diminished TRIM30α expression. Taken together, our
results revealed novel role of HMGB1 pre-conditioning as a negative
regulator of NLRP3 inflammasome.
Key Words: HMGB1, NLRP3, inflammasome, tolerance, lymphotoxin breceptor, TRIM30a
Recommended