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Ecologia MicrobianaDra. Ana Paula Ramos
•Informação genética
•Replicação do DNA e elementos envolvidos
•Técnicas moleculares mais usadasIsolamento de material genético٭Técnicas de amplificação de ácidos nucléicos٭
-PCR e variações, PCR em tempo real*Técnicas de amplificação do sinal
-HibridizaçõesFase sólida Blothings (Southern, Northern, Dot Blot)Fase líquida
*Técnicas para análise de seqüências-RFLP -RAPD
•Aplicações das técnicas
Objetivos da Aula:
DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Composição do DNA e do RNA
- DNA: carrega a informação genética
- RNA: molécula intermediária entre a informação e a expressão gênica
Ácidos Nucleicos são formados por “blocos de construção pareados”: purinas e pirimidinas (bases nitrogenadas)
fosfato e açúcar
Ligações químicas
DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Replicação do DNA: várias enzimas
• DNA Polimerase • SSB (Single Strand Binding Protein)• Primase• Helicases • DNA ligase
DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
– Adenina – Guanina– Citosina – Timina
– Adenina– Guanina– Citosina– Uracila
Purinas
Pirimidinas
DNA RNA
Açúcar
Desoxirribose Ribose
Fita dupla Fita simples
DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Transcrição e Tradução (expressão gênica): dogma central
• É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir
da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma
molécula de DNA de fita dupla
Por que métodos moleculares??
•Metodologia clássica x Métodos moleculares
-Dificuldade em recuperar as células de um sistema
•Microrganismos pouco concentrados em amostras ambientais (água...)
•Alto número de microrganismos viáveis, mas não cultiváveis (91 a 99%)
Estratégias gerais para estudar seqüências específicas de DNA
Pop
ula
ção a
ser
est
ud
ad
a
Amplificação específica
Detecção específica
Análise de seqüências
Amplificação in vitro
Hibridizações
RFLP, RAPD e sequenciamen
to
Isolamento e purificação do material genético
– Remover qualquer material ou componente celular que possa interferir nas técnicas moleculares
• Recuperação celular: por centrifugação• Lise celular: detergentes • Desproteinização: uso de enzimas• Extração de ácidos nucléicos• Purificação de ácidos nucléicos
Métodos diferentes para amostras diferentes
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
Desnaturação: 95°C
Anelamento: 55°C
Extensão: 72°C
Desnaturação: 95°C
Anelamento: 55°C
Extensão: 72°C
25 a 40
ciclos 25 a 40
ciclos
• Amplificação in vitro de ácidos nucléicos: aumento da possibilidade de visualizar estas moléculas
– DNA molde (alvo)– Iniciadores– Nucleotídeos (dNTP’s)– Íons Magnésio (necessários para ativar a enzima)– DNA polimerase– Tampão (manutenção do pH ótimo)
REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE -PCR
Seqüência alvo
Ciclo da PCR - etapa 1
Seqüência alvo
Seqüência alvo
DESNATURAÇÃO DO DNADESNATURAÇÃO DO DNA
Ciclo da PCR - etapa 2
Seqüência alvo
Seqüência alvo
Iniciador 1Iniciador 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVOHIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO
Ciclo da PCR - etapa 3
Seqüência alvo
Seqüência alvo
Iniciador 1
Iniciador 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNA
Polimerase
SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQTAQ DNA DNA POLIMERASE POLIMERASE
Final do primeiro ciclo da PCR
Seqüência alvo
Seqüência alvo
DUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVODUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVO
Ciclos da PCR
Desnaturação
Hibridação
ExtensãoFinal do ciclo
1 ciclo = 2 Amplicons
2 ciclos = 4 Amplicons
3 ciclos = 8 Amplicons
4 ciclos = 16 Amplicons
5 ciclos = 32 Amplicons
6 ciclos = 64 Amplicons
7 ciclos = 128 Amplicons
No. No. No. Amplicons No. Amplicons CiclosCiclos Copias do DNA alvoCopias do DNA alvo
11 2 2
22 4 4
33 8 8
44 16 16
5 5 32 32
66 64 64
2020 1.048.5761.048.576
3030 1.073.741.8241.073.741.824
Produtos de PCR
Visualização dos produtos de PCR por Eletroforese
• Separação de moléculas por peso molecular: ácidos nucléicos ou proteínas
• Diferença de potencial entre dois eletrodos (+ e -)
• Matriz polimerizada : agarose e poliacrilamida
• RT-PCR – Transcrição reversa• Nested-PCR – Iniciadores internos, dois “rounds” de
amplificação• PCR Multiplex – Vários iniciadores• ICC/PCR – PCR associada à cultura celular
Variações da PCR
RT- PCR
Não segue o dogma central da biologia molecular
Não segue o dogma central da biologia molecular
Trabalhar com DNA é mais estável !Trabalhar com DNA é mais estável !
• Utilizado em estudos de expressão gênica
• Utilizado para detecção viral (vírus de RNA)
RNA Transcrição Reversa
cDNA
Nested PCR
Multiplex PCR
ICC-PCR (Integrated Cell Culture - PCR)
Amostra processada
Cultura
Crescimento / efeito citopático
Lise celular e extração dos ác. nucléicos do lisado
RT-PCR / PCR
Eletroforese: produto específico
• Para os casos nos quais há necessidade de aumentar a concentração microbiana e há muitos inibidores: amostras ambientais
• Deixa-se um tempo padronizado onde não é necessário observar crescimento / ECP, mas já é possível a detecção por PCR
• Ajuda na remoção de inibidores o que aumenta a sensibilidade da PCR
• Volume de análise muito maior
PCR em tempo real - quantitativo
Diagrama de um “sinalizador” molecular. Este sinalizador tem 33 nucleotídeos com um corante fluorescente (R) ligado ao terminal 5´ e um bloqueador de sinais (Q) no terminal 3´. As 9 bases do terminal 5´pareiam com as 9 bases do terminal 3´ e faz com que o sinal fluorescente fique muito próximo ao bloqueador. Quando o fluorescente é excitado ele é bloqueado pelo bloqueador e nenhuma fluorescência é detectada. As bases em rosa representam sequências que pareiam especificamente com o produto de PCR.
Detecção do produto do PCR pelo “sinalizador molecular”. Quando o sinalizador liga-se ao produto de PCR (T°C de 5 a 10°C mais elevada que a T°C de anelamento dos primers), ele vai fluorescer quando excitado no comprimento de onda adequado. A quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR amplificada.
MÉTODO TAQMAN
•Sonda TaqMan® complementar a uma região interna do produto de PCR e ligada a um composto fluorescente.
•Quando a amplificação começa, a DNA polimerase corta a sonda, e a fluorescência é liberada.
•A fluorescência é liberada a cada ciclo, gerando um sinal fluorescente específico da seqüência.
• Moléculas individuais de ácidos nucléicos (fita simples) apresentam a capacidade de formar moléculas de fita dupla (hibridização) necessidade de alta complementaridade entre as bases para que isso aconteça;
• Sensibilidade menor que os métodos de amplificação gênica
Hibridização
Utilizada para confirmação
Hibridização
• Sondas são marcadas direta ou indiretamente com enzimas, radioisótopos ou substratos quimioluminescentes / antigênicos, possibilitando a hibridização e detecção
– Fase líquida: captura híbrida
– Fase sólida: Southern e Northern blot, Dot Blot e Colony Blot
Hibridização
Fase Líquida: captura híbrida
• Enzimas de Restrição: enzimas isoladas de procariotos que reconhecem seqüências específicas no DNA dupla fita.
Fase sólida: Ácidos nucléicos digeridos com enzimas de restrição e imobilizados em um suporte sólido
Fase sólida: Ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido
Sou
thern
e N
ort
hern
B
lot
Dot Blot : ácido nucléico diretamente imobilizado em membranas, vácuo
• RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição) – Tipagem
• exemplo: variações dentro do gene rRNA, que é conservado
– Comparação entre o número e o tamanho dos fragmentos;
– Variações no tamanho dos fragmentos gerados por distintas amostras de DNA após clivagem enzimas de restrição;
– Padrões de bandas diferenciados indicam organismos distintos geneticamente (mesma espécie ou não);
Análise de seqüências
• RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico randomicamente amplificado)- DNA fingerprinting
– PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa estringência (especificidade no produto de DNA a ser amplificado)
– Não é necessário um conhecimento prévio do genoma– Uniformidade no padrão de bandas para espécies
relacionadas
Análise de seqüências
DNA
Desnaturação a 95oCDesnaturação a 95oC
DNA
Extensão a 72ºCExtensão a 72ºC
400bp400bp
310bp310bp
260bp260bp
75bp75bp
Fragmentos de RAPD
Visualização de Fragmentos de RAPD
• Diferentes técnicas : quando se conhece ou não o genoma do organismo estudado
• Processamento das amostras é de extrema importância
ácidos nucléicos de boa qualidade, pureza e, principalmente, com mínimo de inibidores
Utilização de técnicas moleculares na avaliação e detecção da diversidade microbiana
Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos
Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos:
• O LVA vem trabalhando na avaliação da contaminação em moluscos desde aproximadamente 10 anos;
• Importância devido o grande destaque de Florianópolis e região na Maricultura
• Moluscos: animais filtradores concentram patógenos
Salmonella spp.
Vírus: RNA Hepatite A, Rotavírus, Norovírus, Poliovirus DNA Adenovírus, Poliomavírus,
Necessidade de diminuição de
inibidores presentes na carne
de ostras e enriquecimento da amostra em meio
de cultivo (viabilidade e aumento do
número de células)
Análise de contaminação viral em amostras de águas:
Método de filtração e concentração(Katayama et al., 2002)
Centriprep - Millipore
• Alto custo da infra-estrutura do laboratório e reagentes;
• Diferenciação entre células viáveis e não viáveis; depende da técnica e do organismo a ser estudado
• Dificuldade em pesquisar quando o genoma do microrganismo não é conhecido.
Problemas...
2008-2011: MAPA L-2/CNPq: IMPLEMENTAÇÃO DE TÉCNICAS DE DEPURAÇÃO DE OSTRAS DE CULTIVO QUE VISEM GARANTIR A QUALIDADE E INOCUIDADE DO PRODUTO.
2007-2009: Ed. Universal/CNPq 2007 : VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS HUMANOS DE INTERESSE EM SAÚDE PÚBLICA E MEIO AMBIENTE: Rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite A como modelos de contaminação de águas ambientais
2007-2009: Ed. FINEP/SEBRAE: Produção de ostras triplóides da espécie Crassostrea gigas..
30/11/2008 a 30/10/2009 FAPESC: Produção de sementes de ostras triplóides (3n) para a maricultura catarinense.
2009-2010: AECID: “Agencia Espanola de Cooperación Internacional para el Desarollo” (INTERNATIONAL COLABORATION BETWEEN UFSC AND BARCELONA UNIVERSITY FOR HUMAN EXCHANGE) : Desenvolvimento de métodos para a detecção e quantificação de vírus em moluscos.
PROJETOS EM ANDAMENTO
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