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Ein integriertes Konzept für die katalytisch vollständige Hydrolyse
von Cellulose zu vergärbaren Zuckern
Antje C. Spiess
Fachtagung Nachhaltige Biokraftstoffe, 28. Okt. 2010
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
2
Biokraftstoffkreislauf im Exzellenzcluster
Biomasse
Kohlendioxid
in die Atmosphäre
Sonnenenergie
& Kohlendioxid
O OH
OH
OH
HO
OH
HO2C CO2H
Itaconic Acid
O
OOH
2-Hydroxymethylfurfural (HMF)
CO2H
O
Levulinic Acid
OO Oetc.
etc.
O
O OO O O
O
OHOH O
R
etc.
MTF
KatalytischeUmwandlung
Energie-umwandlungCO2-Neutrality
MaßgeschneiderteKraftstoffe
aus Biomasse
Verfahrens-technik
http://www.fuelcenter.rwth-aachen.de
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
3
(Ligno-)Cellulosen als Rohstoffe
Lignocellulose
� Reichhaltigstes Biopolymer der Erde
� Widerstandsfähigkeit ���� Vorbehandlung erforderlich
Cellulose
� Unlöslich in wässrigen Medien
α-Cellulose Avicel
http://genomics.doe.gov
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
4
Celluloseabbau durch T. reesei Cellulasen
Cellobiohydrolase
CBH II
ß-Glucosidase
Endo-glucanase
kristallin kristallinamorph
nicht-reduzierendesEnde
reduzierendesEnde
CBH I
Trichoderma
reesei
Celluclast®Novo, DK
5
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
� Cellulaseaktivität ist proportional zur adsorbierten Enzymmenge
Cellulaseaktivität und Adsorption
10 g/L α-Cellulose, 0,1 M Acetat-Puffer, pH 4,8, Celluclast® entsalzt, 30°C, 40 min, 1000 rpm
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
10
20
30
40
50
60
70
80
Ads
orbi
erte
Cel
lula
se
[mg
Cel
lula
se/g
Cel
lulo
se]
Freie Cellulasekonzentration [g/L]
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Rea
ktio
nsge
schw
indi
gkei
t [g
/L/h
]
adsorbierte Cellulase
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit
Helene Wulfhorst, Sachiko Wakimura
6
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
� Oberfläche erhöht Cellulaseaktivität bei hoher Konzentration� Kristallinität verringert Cellulaseaktivität bei geringer Konzentration
Cellulaseaktivität und Struktur der Cellulose
Sigmacell
0-15 g/L Cellulose, 0.25 g/l Celluclast, 0.1 M Acetatpuffer, pH 4.8, 200 µL, 37°C, 900 rpm, 3 mm, 96-MTP
Jäger G et al., Biotechnol. Biofuels 3:18 (2010)
Oberfläche
[m²/g]
0.05
0.09
0.25
α-Cellulose
Avicel
Kristallinität
[%]
82*
64*
0*
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
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Vorbehandlung durch ionische Flüssigkeit
(Ligno-)Cellulose
GlucoseEnzymatische Hydrolysein ionischer Flüssigkeit
SelektiveFällung
Enzy
mat
isch
e
Hyd
roly
se
Lösen
in io
nisch
er
Flü
ssigkeit
Quantitative Beschreibung der homo- und heterogenen
Depolymerisation
8
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Ionische Flüssigkeiten (IL)
� Bestehen meist aus organischen Ionen
� Schmelztemperatur unter 100 °C (gemäß Definition)
� Einstellbare Eigenschaften
� � Einige IL lösen Cellulose derivatisierungsfrei
Anionen
Chlorid (Cl)
Acetat (Ac)
Dimethylphosphat (DMP)
….
Kationen1-Butyl-3-methylimidazolium (BMIM)
1-Allyl-3-methylimidazolium (AMIM)
1-Ethyl-3-methylimidazolium (EMIM)
1,3-Dimethylimidazolium (MMIM) …
Cl-
Cl-
Seddon K. tce 730:33 (2002)
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
9
Einige ionische Flüssigkeiten lösen Holz
� Ionische Flüssigkeiten, die im Screening Cellulose lösen, lösen zumindest teilweise auch Holz
EMIM Ac,Buche,
1000 rpm,90 °C, 1 h
Zavrel M et al. Biores. Technol. 100:2580 (2009).
++0+EMIM Ac
0000MMIM DMP
0000BMIM Cl
0000EMIM Cl
++++AMIM Cl
KastanieBucheWeiß-tanne
Fichte
+ vollständiges Lösen, 0 teilweises Lösen
5 % w/w Holzpulver in IL, 1000 rpm, 90 °C
10
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
� Cellulosestruktur zerstört � vermutlich amorphes Material
� Vergrößerte Oberfläche
(Ligno-)Cellulose aus IL regeneriert
Mikroskopische Aufnahmen, Nikon Eclipse E600, 40X
Regenerierte Fraktion, getrocknert und zerkleinert
Ungelöster Rückstand, cellulosearme Fraktion
Fichte
50µm
Jörn Viell,AVT-PT
Avicel RegenerierteCellulose, suspendiert
Daniela Bross, Jörn Viell
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
11
Enzymatische Hydrolyse nach Vorbehandlung mit IL
(Ligno-)Cellulose
GlucoseEnzymatische Hydrolysein ionischer Flüssigkeit
SelektiveFällung
Enzy
mat
isch
e
Hyd
roly
se
Lösen
in io
nisch
er
Flü
ssigkeit
Quantitative Beschreibung der homo- und heterogenen
Depolymerisation
12
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Einfluss ionischer Flüssigkeiten auf Cellulaseaktivität
� Ionische Flüssigkeiten verringern Enzymaktivität stark� Kann Strukturveränderung den Aktivitätsverlust kompensieren?
10 g/L α-Cellulose, 10 % (v/v) IL in 50 mM NaAc, pH 4.5, 1.8 g/L Cellulase, 45 °C
NaA
c P
uff
er
[MM
IM]
[DM
P]
Merc
k
[MM
IM]
[DM
P]
IoL
iTec
[AM
IM]
[Cl]
Merc
k
[BM
IM]
[Cl]
Merc
k
[EM
IM]
[Ac]
BA
SF
[EM
IM]
[Ac]
IoL
iTec
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Rela
tive E
nzym
akti
vit
ät
(-)
Engel P et al. Green Chem. doi:10.1039/C0GC00135J.
13
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
� Anfängliche Aktivitätssteigerung (bis zu 20-fach),� Aber: Bei steigenden IL-Gehalten geringere Endoglucanaseaktivität
0 12 24 36 480
20
40
60
80
100
Um
satz
red
. Z
ucker
(%)
Zeit (h)
unbehandelte Cellulose reg. Cellulose; 0 % (v/v) IL reg. Cellulose; 10 % (v/v) IL reg. Cellulose; 20 % (v/v) IL reg. Cellulose; 30 % (v/v) IL
0 12 24 36 480
20
40
60
80
100
Um
satz
red
. Z
ucker
(%)
Zeit (h)
unbehandelte Cellulose reg. Cellulose; 0 % (v/v) IL reg. Cellulose; 10 % (v/v) IL reg. Cellulose; 20 % (v/v) IL reg. Cellulose; 30 % (v/v) IL
Hydrolyseverlauf mit regenerierter Cellulose
10 g/L Cellulose, MMIM DMP in 50 mM NaAc, pH 4.8, 1.8 mg/mL Cellulase, 45°C
Engel P et al. Green Chem. doi:10.1039/C0GC00135J.
14
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Hydrolyseverlauf von IL-vorbehandelter Fichte
Fichte vorbehandelt mit BMIM Cl, 10 g/L Substrat, 2.5 g/L Celluclast entsalzt, 900 rpm, 45°C
0 12 24 36 48 600
2
4
6
8
10
16 %
72 %
Red
uzie
rend
e Z
ucke
r [
g/L]
Zeit [h]
42 %
0
20
40
60
80
100
Mas
senv
erlu
st S
ubst
rat
[%]
ungelöster Rückstand
regenerierte Fraktion
Holz ohne Vorbehandlung
� Effektiver Abbau des Celluloseanteils in beiden Fraktionen
Helene Wulfhorst, Anita Ogolong
15
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Verständnis für Polymerabbau
(Ligno-)Cellulose
GlucoseEnzymatische Hydrolysein ionischer Flüssigkeit
SelektiveFällung
Enzy
mat
isch
e
Hyd
roly
se
Lösen
in io
nisch
er
Flü
ssigkeit
Quantitative Beschreibung der homo- und heterogenen
Depolymerisation
16
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
� Population:=• Chemisch identische
Spezies, die sich in einerEigenschaft unterscheidet
� (homogene) Elementarreaktionen
• � großes Differentialgleichungssystem
• Implementation in Predici® (CiT Wulkow, Rastede)
Populationbilanzmodell für polymeres Substrat
Kettenlänge s
Cellulose-konzentration C
Cs
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
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Cellulosepolymerisationsgrad in homogener Reaktion
3 mg/mL
Endo-glucanase
15 mg/mLExo-glucanase
3 mg/mL Endo-+ 15 mg/mL Exo-glucanase
Philip Engel, Patrick Schmidt
No
rmie
rte
Gew
ich
tsko
nze
ntr
ati
on
No
rmie
rte
Gew
ich
tsko
nze
ntr
ati
on
No
rmie
rte
Gew
ich
tsko
nze
ntr
ati
on
Kettenlänge (s) Kettenlänge (s)
Kettenlänge (s)
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
18
Homogene enzymatische Cellulosehydrolyse
(Ligno-)Cellulose
GlucoseEnzymatische Hydrolysein ionischer Flüssigkeit
SelektiveFällung
Enzy
mat
isch
e
Hyd
roly
se
Lösen
in io
nisch
er
Flü
ssigkeit
Quantitative Beschreibung der homo- und heterogenen
Depolymerisation
19
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Ionische Flüssigkeit: Cellulaseaktivität vs. Celluloselöslichkeit
� ���� Neue Enzyme finden, die bei hohem IL-Anteil aktiv sind!
Konzentration der ionischen Flüssigkeit
0 % 50 % 100 %
Ce
llu
lase
akti
vit
ät
Ce
llu
los
elö
slic
hk
eit
Betriebs-fenster
21
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Viskositätsmessung für Cellulose
� Viskositätsmessung ist sensitiv auf Veränderungen (langer) Polymerketten
10 mg/mL α-Cellulose, 90 %(v/v) EMIM Ac, 80°C, Scherrate 100 1/s
Philip Engel, Xin Lin
23
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Integrierter chemo-enzymatischer Prozess
(Ligno-)Cellulose
GlucoseEnzymatische Hydrolysein ionischer Flüssigkeit
SelektiveFällung
Enzy
mat
isch
e
Hyd
roly
se
Lösen
in io
nisch
er
Flü
ssigkeit
Chemische
+ Geschwindigkeit- Abbauprodukte
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
24
Hydrolyse von Cello-Oligomeren und Cellulose
10 g/L Substrat, 0.5 % (v/v) Celluclast ®, Acetatpuffer pH 4.5, 45 °C
Unbehandelte CelluloseDPW ~ 3200
Aus IL regenerierteCelluloseDPW ~ 1600
Cellulose nachchemischer VorhydrolyseDPW ~ 700
Rinaldi R et al., ChemSusChem, 3: 1151-1153 (2010).
25
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
t [min] 0 2 5 7 10 12 15 30 45 60 90 120
Vergleich mit konventioneller Cellulosehydrolyse
4.5 h
50 h Konventionelle enzymatische Cellulosehydrolyse
Chemo-enzymatische Cellulosehydrolyse
Rinaldi R et al., ChemSusChem, 3: 1151-1153 (2010).
� Bisher schnellster Prozess für die selektive Umsetzung von Cellulose zu löslichen Zuckern!
26
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
� Lösen und Fällen aus ionischen Flüssigkeiten ist eine Vorbehandlung für enzymatischen Celluloseabbau
� Verständnis der (Ligno-)Cellulosehydrolyse• Chemo-physikalische Wirkung ionischer Flüssigkeiten
• Beitrag von Endo- und Exoglucanasendurch mathematische Modellierung
� Erstmaliger Nachweis von Cellulaseaktivitätin ionischen Flüssigkeiten
� Effektiver chemo-enzymatischer Prozess für Cellulosehydrolyse
Zusammenfassung
27
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.10.2010
Ausblick
� Verständnis für Celluloseabbau durch iteratives Wechselspiel von Modell und Experiment verbessern
� Übertragung auf verschiedene Lignocellulosen und Vorbehandlungsverfahren
� � Maßgeschneiderte Enzympräparationen für homogenen und heterogenen Abbau von Lignocellulose-haltiger Biomasse
A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010
28
Vielen Dank…
� …an alle Mitwirkenden• Benjamin Bonhage (Dipl)• Daniela Bross (BSc)• Jochen Büchs (Prof)• Efthimia Ellinidou (BSc)• Philip Engel (PhD)• Kerstin Garschhammer (BSc)• Gernot Jäger (PhD)• Martin Kunze (PhD)• Xin Lin (MSc)• Radoslav Mladenov (BSc)• Anita Ogolong (Res)• Martin Pöhnlein (BSc, Res)• Patrick Schmidt (Dipl)• Bianca Seiferheld (BSc, Res)• Sachiko Wakimura (Res)• Helene Wulfhorst (PhD)
• Michael Zavrel (PhD)• Erik Zeithammel (Res)
� … an die Kooperationspartner• Roberto Rinaldi, MPI
• Ferdi Schüth, MPI• Michele Girfoglio, IMB• Ulli Commandeur, IMB• Raffaele Cannio, CNR Napoli• Jörn Viell, AVT.PT
� … für finanzielle Unterstützung• Deutsche Forschungs-
gemeinschaftExC 236 „Tailor-madefuels from biomass“
• GK 1166 „Biocatalysis usingnon-conventional media“
• NRW Forschungsschule „BreNaRo“
� … für Ihre Aufmerksamkeit
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