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Elementos de Microscopia e Microanálise
Docente: Profª Drª Maria Tercília V. A. Oliveira
Discente: Bruna Victorasso Jardim
CULTURA CELULAR
Definição Conjunto de técnicas que permitem
cultivar células fora do organismo dadas as condições apropriadas
Tecidos Humanos
Animais
Vegetais
IN VITRO X IN VIVO
Histórico
Wilhen Roux - 1885
Cultivou células de embrião de aves e, solução salina aquecida
Ross Harrison - 1907
Pioneiro no cultivo celular de animais
Hipótese Doutrina do neurônioOrigem do axônio - cada fibra nervosa é o produto de uma única célula nervosa e não da fusão de várias.
• fragmentos de tecido da medula espinhal de anfíbios
• linfas coaguladas como meio de cultura
• armazenadas em câmara úmida e morna
• microscópio – intervalos regulares de tempo
• células nervosas individuais com um axônio cada
Base para a cultura celular
1ª limitação
Burrows – 1910
Desenvolvimento de meios nutritivos
Plasma de aves nutrir explantes de tec. embrionário
Alexis Carrel
-Subculturas para prolongar a vida das células
- utilizando meio nutritivo
Plasma
Extratos de embrião
Rous e Jones - 1916
Tripsina para dissociar células embrionárias
2ª LimitaçãoContaminação
Alexis Carrel - 1913
Desenvolvimento de condições assépticas
- Cultivou células de embrião de aves por + de 30 anos
1940 -
1940 - Surgimento dos antibióticos
Avanços com alguns destaques
Células dividiam indefinidamente extrato de embrião de galinha
George Gey - 1952
1ª linha celular contínua
células HeLa
- Utilizou meios indefinidos e complexos
Plasma de aves
Extrato de embrião bovino
Cordão umbilical humano
Dificuldade para analisar a composição específica para cada tipo celular se desenvolver e funcionar normalmente
Células epiteliais humanas procedentes de carcinoma cervical
Stanley Cohen - 1954
Fator de crescimento nervoso estimula o crescimento dos axónios em cultura de tecidos
Harry Eagle – 1955
Investigou os requerimentos nutritivos das células em cultivo
Sais Glicose AminoácidosVitaminas
Soro de proteínas+
Células cultivadas em condições experimentais
definidas
Meio Basal de Eagle (BME) aa essencias
Meio Mínimo Essencial de Eagle (MEM) + aa
Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM) 4x + aa
Soro fetal bovino
Células morrem após um número finito de divisões em cultura
Leonard Hayflick e Paul Moorhead - 1961
Fibroblastos jovens
Fibroblastos velhos
quimicamente definido
Pequenas moléculas
Proteínas específicas
Sais
Glicose
Vitaminas
Aminoácidos
Sobreviver e proliferar
Transferrina Fatores de crescimento
Possibilitou o estudo de moléculas sinalizadoras extracelulares
Essenciais para sobrevivência, desenvolvimento e proliferação de
tipos de células específicos
Ham -1965 1º meio livre de soro capaz de manter algumas células de mamíferos em cultivo
Harris e Watkins - 1965
1º heterocário de células de mamíferos pela fusão
Humano Camundongo
Mitose crs. no mesmo núcleo células híbridas
Linhagens com composição cromossômica =
Localizar genes no genoma e banco de DNA de crs. específicos
+ =
Augusti- Tocco e Sato - 1969
1ª linhagem celular estável a partir de uma célula tumoral de nefroblastoma de camumdongo eletricamente excitáveis
19751ª linhagem celular produtora de anticorpos monoclonais hibridomas
Cesar Milstein
George Kohler
Linfócitos B do baço com antígeno do anticorpo desejado inoculado
+Células de mieloma que
se reproduzem em cultura indefinitamente
Células produzindo o anticorpo desejado
Hayashi e Sato – 1976
Trabalhos demonstrando: = linhagens celulares
Michael Wigler
Células crescerem em meios livres de soro
= misturas de hormônios e fatores de crescimento
1º introduzir genes de cópias únicas de mamíferos in vitro
Gene que codifica a enzima timidina quinase em células com esse gene deficiente
Richard Axel
1977
Avanço na cultura celular pela possibilidade de produzir proteínas
terapêuticas em grande escala
Martin Evans -1986
Isolaram e mantiveram vivas in vitro células embrionárias humanas
Isolou e cultivou células totipotentes de ratos
James Thomson e John Gearhart – 1998
Bactéria X Células de tecido
Cultivadas em suspensão
Cultivadas em superfície
sólida
Duplicação em 30 min.
Duplicação em 18 - 24
hrs
Células
Componentes específicos da Matriz Extracelular
Colágeno Laminina
Tipos de cultura celular
Cultura primária – preparada diretamente do tecido de um organismo, com ou sem fracionamento inicial das células
Cultura secundária – a partir de células retiradas da placa de cultura primária Subcultivos
Promove nova fonte de nutrientes e espaço para o crescimento contínuo de linhagens celulares
Linhagem de células
Células morrem após um nº finito de divisões em cultura
Mutação Células imortais – proliferam indefinidamente
linhagem de células
Podem ser armazenadas em N líquido e continuarem viáveis
Linhagem de células podem ser preparadas a partir de células de câncer
Proliferam-se em altas densidades
Crescem sem se fixarem a uma superfície
• Linhagem de células normais transformadas
Vírus indutor Substâncias químicas
Linhagens celulares são importantes na pesquisa celular alta quantidade de células de um determinado tipo
Não são idênticas
Clonagem celular
• Uma célula isolada origina a cultura
• Células geneticamente idênticas
Importância = linhagens de células mutantes com defeito em um gene específico
Função da proteína em células normais
Aplicações
Reproduzir fenômenos que ocorrem in vivo mas que são inacessíveis
Estudo da fisiologia e metabolismo de células específicas Estudar interações entre vários tipos de células – culturas mistas Estudo de neoplasias Testar drogas ou compostos químicos Possibilidade de gerar tecidos artificiais Produção de proteínas terapêuticas
adicionar ou remover moléculas específicas
Vantagens Reprodutibilidade dos resultados
-Linhagem de células clonais
-Controle das condições ambientais
Possibilidade de selecionar uma população de células específicas
Conhecimento do comportamento e função das células selecionadas
Desvantagens Perda das características – cultivo longo Necessidade de marcadores Confiabilidade dos resultados in vivo – ex: drogas Contaminação
Cuidados
Biossegurança Sala separada especial Esterilizar todos os materiais e equipamentos com álcool 70 Luz UV Usar: luvas estéreis, máscara... Não reutilizar materiais Material biológico lixo separado
Protocolo para cultivo celular
Cultivo de celulas de câncer de mama
• Biopsia do tecido
• meio de congelamento meio de cultura + DMSO + antibiótico
• 2 horas em geladeira
• 30 min a 5 cm do N liquido (p congelar aos poucos)
• armazenar em N Liquido
Protocolo para cultivo celular
Cultivo de células de câncer de mama
Biópsia do tecido Coletada e armazenada em meio de transporte
Preparação inicial limpeza com álcool e UV 20 min Meio de cultura, PBS, tripsina – banho maria a 37ºC
- 100 ml meio RPMI - 1 ml de antibiótico
3 ml -Tubo falcon
Preparo do meio de cultura
20 ml soro fetal bovino 1 ml antibiótico/antimicótico 1 ml L-glutamina 100 ml de meio de cultura RPMI 1640
Processamento do fragmento tumoral Lavar o tumor com PBS (4x – 2 min) Tesoura ou bisturi 1 ml de meio RPMI 1640 no frasco T-25 Estufa 37ºC – 5% CO2
1 ou 2 dias depois adicionar 1ml de meio lentamente para não soltar as células
Trocar o meio de cultura a cada 2 dias Retirar o meio com a pipeta 4ml de meio – frasco T-25 8 ml de meio – frasco T-75 O meio deve ser descartado com hipoclororito
Subculturas Retirar o meio de cultura Lavar com PBS 1X Retirar o PBS Adicionar 2 ml de tripsina Aguardar 4 –10 min o desprendimento das células Passar todo conteúdo do frasco para outro frasco Adicionar 2 ml de meio de cultura Colocar na estufa 37ºC – 5% CO2
Placa six-wells
Capela de fluxo para cultura celular
Congelamento de células
Tripsinizar Colocar em tubo falcon Centrifugar a 1600 rpm – 5 min Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 900 ul
de meio e 100 ul de DMSO Passar para criotubo Geladeira por 30 min Frezeer – 80ºC – 24 hrs Nitrogênio líquido
Descongelamento das células
Retirar o criotubo do N líquido Banho maria a 37ºC – 90 seg. Transferir para tubo falcon 15ml contendo: 10 ml de meio Centrifugar – 5min Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em
meio de cultura Transferir para frasco T-25 Estufa
Invertoscópio
4x
10x
10
40x
4x e 10xFungo
Obrigada
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