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Cinética Enzimática
DRA. VALESKA ORMAZABAL V.
DEPTO. CIENCIAS BÁSICAS
FACULTAD DE MEDICINA
CURSO MEDICINA MED.207
2012
COOPERATIVIDAD
P PP PPL
L L
L
LL
L
L
LL
LK1 K2 K3 K4
K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva
K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa
K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad
Una proteína une más de una molécula de un mismo ligando
La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una
molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así
hasta ocuparse toda la molécula
s s s ss s
s
s
s s
+ + +
1 2 3
En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3
Por lo que cooperatividad negativa, es cuando la fijación de
una molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.
El comportamiento cooperativo implica:
1. Que hay más de un sitio de fijación de substrato
por molécula de enzima (estr.cuaternaria)
2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación
Tratamiento de Hill
Snh
Y = -------------
Snh0,5 + Snh
Aplicada a las enzimas con cinética sigmoidal
v
Y = ------------
Vmax
Saturación de la
enzima [Po2]nh
Y = ---------------
K` + [Po2]nh
S0,5 Concentración substrato la saturación
es igual ½ Vmax
nh igual a 1 es una saturación hiperbólica michaeliana
S0,5 = Km
S
Y = ----------- =
S0,5 + S
v
------------
Vmax
S
= -----------
Km + S
nh>1 Cooperatividad positiva
nh<1 Cooperatividad negativa
2.2.1-Linearización de la ecuación de Hill
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
loglogmax
log
max1
loglog1
log
11
SnhSnhvoV
vo
voV
vo
Y
Y
SnhSnhY
Y
S
S
SS
S
SS
S
Y
Ynh
nh
nhnh
nh
nhnh
nh
maxV
vY
Reacción enzimática la
fracción de saturación
Representando la ecuación lineal
log [S]
0
Log[S0,5]
pendiente = nHill
La ecuación de una recta pendiente es el índice de Hill
S0,5 Concentración substrato para la cual la saturación es igual a ½ de la velocidad
máxima
voV
vo
maxlog
Obtención valor experimental del índice de Hill nos
permite deducir la existencia de cooperatividad.
nH indica cuántas de las zonas de unión de sustrato
de una enzima afectan a la afinidad de la unión del
sustrato en el resto de las zonas de unión.
Significado Biológico de la
Cooperatividad
Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la concentración de
sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de una saturación del 10% al
90%.
Enzimas con cinética hiperbólica, índice de Hill 1 se necesita aumentar 81
veces la concentración de sustrato para alcanzar el 90% de saturación
Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase de una
saturación del 10% al 90% se necesita aumentar 6561 veces la
concentración de sustrato.
Regulación Alostérica de la función enzimática
•La velocidad de una reacción enzimática depende de la
formación del complejo [ES].
¿ Es posible regular la actividad enzimática,
modificando la interacción enzima-sustrato?
Enzimas Alostéricas
•Evidencia Experimental:
Threonine
dehydratase
L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile-
- Sólo la primera enzima de la vía, la “treonina-dehidratasa”, muestra este tipo de
inhibición.
- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
a) El ligando implicado en la regulación de la actividad enzimática (molécula reguladora oefector), generalmente, es estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la reacciónque cataliza la enzima retroinhibida.
b) La mayor parte de las enzimas
cuya actividad se controla/regula
por este tipo de regulación, no
muestran cinéticas hiperbólicas
clásicas cuando se representa v
[S], sino que muestran una
cinética de tipo sigmoidal.
c) Es relativamente fácil distinguir entre la unión del efector a la enzima y la unión del sustrato.
Varios tratamientos químicos y físicos nos permiten “desensibizar” la enzima, es decir, hacerle
perder su respuesta ante las moléculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida
de la actividad catalítica. Así en el caso de la ACTasa un tratamiento térmico, suave, da lugar a una
enzima activa no inhibible por CTP. La enzima “desensibizada” muestra una cinética hiperbólica
semejante a la que presentan las enzimas michaelianas.
d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo son “oligómeros”, es decir,
proteínas formadas por varias subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas débiles.
* La unión de la molécula reguladora al “sitio de regulación” induce un cambio conformacional
reversible en la enzima que causa una alteración de la estructura del centro activo y los consiguientes
cambios en sus propiedades cinéticas.
- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
1. la molécula reguladora o efector se une a un sitio de la enzima
diferente del centro activo, de manera que la interacción entre la
molécula reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o
“alostérica”, (del griego otra estructura).
Inhibidores y activadoresalostéricos
s
0 2 4 6 8 10 12
Y
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
(+ Inhibidor)
(+ Activador)
(sin efectores)
V+
V0
V-
Los efectores alostéricos operan sobre el grado de
cooperatividad del sistema:
- Los inhibidores alostéricos aumentan el grado de
cooperatividad
- Los activadores alostéricos disminuyen el grado de
cooperatividad; a concentraciones elevadas de activador,
la cinética pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.
Modelos que permiten explicar el fenómeno de Cooperatibidad
•Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux
•Modelo Secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer
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