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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce (Asteraceae) e determinação de sua Atividade Biológica
Lúcia Roberta de Souza Filizola
Dissertação Mestrado do Departamento de Ciências
Farmacêuticas /UFPE
Orientador : Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier
Recife- PE 2003
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce (Asteraceae) e
determinação de sua Atividade Biológica
Lúcia Roberta de Souza Filizola
Dissertação de Mestrado, submetida ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Produtos Naturais
Orientador: Prof.Dr.. Haroudo Satiro Xavier
Recife – 2003
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Reitor
GERALDO JOSÉ MARQUES PEREIRA
Vice-reitor
YONY DE SÁ BARRETO
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
PAULO ROBERTO FREIRE CUNHA
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
GILSON EDMAR GONÇALVES E SILVA
Vice- Diretor do Centro de Ciências da Saúde
JOSÉ THADEU PINHEIRO
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
SILVANA CABRAL MAGGI
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
ANTÔNIO RODOLFO DE FARIA
Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
DAVI PEREIRA DE SANTANA
Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
DALCI JOSÉ BRONDANI
LÚCIA ROBERTA DE SOUZA FILIZOLA
Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce ( Asteraceae) e
determinação de sua Atividade Biológica
BANCA EXAMINADORA:
Membro Externo Titular
Prof. Dr. Nicácio Henrique da Silva
Departamento de Bioquímica da Universidade Federal de Pernambuco
Membros Internos Titulares
Profa. Dra. Eulália Camelo Pessoa de Azevedo Ximenes
Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco
Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier
Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco
Membro Externo Suplente
Profa. Dra. Rejane Magalhães de Mendonça Pimentel
Departamento de Botânica da Universidade Federal Rural de Pernambuco
Membro Interno Suplente
Profa. Dra. Maria Nelly Caetano Pisciottano
Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco
“ Sempre que duvidamos de nosso próprio caminho, ou perdemos a visão do
processo, temos de nos lembrar para onde estamos evoluindo, o que significa todo
o processo de viver. Alcançar o céu na Terra é a razão de estarmos aqui. E aqui
sabemos como se pode fazer isso...como será feito.”
(James Redfield)
AGRADECIMENTOS
À Deus, meus familiares e amigos, que me compreenderam nos momentos
de angústia e ausência, e me deram a certeza de que quando a perseverança é
nossa companheira diária, alcançar o nosso objetivo, torna-se inevitável.
Ao Prof. Haroudo Satiro Xavier, que me recebeu da melhor forma possível e
com quem tive o imenso prazer de compartilhar e aprender os ensinamentos de um
grande mestre e orientador.
Aos Amigos e Colegas do Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN),
Dra. Ana Lima, Dra. Nancy Veloso , Benigna Silva, Elina Albino, Lígia Barbosa,
Cristina Durão, Cristiane Lima, Soraia de Souza, Silvana Farias, Cátia Menezes,
Cristina Menezes, Sandoval Vieira, Ismênia França, Carlos Alberto Lima, Letícia
Carneiro, Verônica Pereira, Maria dos Anjos Rodrigues, Cristina Monteiro, Zênia
Maciel, Denise Rodrigues, Manoel Albino, Tiago Gomes, Ângela Figueirôa,
Josemayre Luna, enfim, todos que compartilham comigo as tarefas diárias
profissionais, e que de forma direta ou indireta, sem exceção, me apoiaram.
À uma grande e eterna amiga, que me incentivou e participou de cada
momento desse trabalho. Agradeço imensamente a Deus pela bela oportunidade
que me deu de poder vivenciar e aprender o valor de uma grande amizade, Lúcia de
Fátima Francelino da Silva.
Aos colegas do mestrado: Ana Amélia Lira, Eduardo Gonçalves, Francisco
Jaime Júnior, Roseane Maria Costa, Risonildo Cordeiro, Rosiel Santos, Sabrina
Torres, Simone Bezerra, Thiago Aquino, Tereza Raquel, Valderes Almeida, Márcia
Francisca Linhares, pela amizade conquistada durante todo o tempo que estivemos
juntos.
À Drª Ana Albertina de Araújo pela ajuda e participação nesse trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Farmacognosia, pela divertida e saudável
convivência, Diogo Florêncio, Lívia Barreto, Clébio Pereira, Karina Randau, Késia
Pontual, Frederico Duarte e Sarah Rodrigues.
À Dra. Evani Lemos, pela sua dedicação e amizade.
À Jovita Farias, pela amizade e dedicação.
Aos meus estimados amigos: Cristiano Soares da Rocha e Cristiane Rocha,
por toda nossa amizade, apoio e companheirismo na nossa jornada.
À Lindinalva Maria da Silva e minha avó, Maria José, por todo amor e carinho
dispensados.
À grande amiga e sogra, Sra. Lucíola Filizola, por todo apoio e incentivo.
Ao Prof. Francisco José de Abreu Matos, pela atenção e realização da
Espectrometria de Massas.
À Dra. Neide Shinohra, do Ins tituto de Nutrição da Universidade Federal de
Pernambuco, pela amizade e atenção.
À Dra. Mércia Caracciolo, do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, que
contribuiu para a realização dos testes farmacológicos.
À Dra. Eulália Ximenes, do Instituto de Antibióticos da Universidade Federal
de Pernambuco, pela sua amizade e cooperação técnica nos testes antimicrobianos.
À Dra. Ivone de Souza, pela amizade e auxílio na aquisição de animais para
os testes farmacológicos.
À Dra. Rejane Pimentel, Graça Chagas e Nilton, do Departamento de
Botânica da Universidade Federal Rural de Pernambuco, pela amizade,
profissionalismo e cooperação.
À Dra. Rita de Cássia Pereira, pela identificação do material botânico.
Ao Departamento de Química Fundamental (DQF) da Universidade Federal
de Pernambuco, pela realização dos ensaios espectrométricos.
Ao Prof. Dr. Parviz Afiatpour , Profª Maria do Carmo Fraga, Rejane Silva, Dr.
Almir Wanderley, Erick da Silva e Orion da Silva, do Departamento de Farmacologia
e Fisiologia da Universidade Federal de Pernambuco, pela amizade e realização dos
testes farmacológicos.
A todos os professores do Mestrado em Ciências Farmacêuticas, pelas
orientações e incentivo durante o curso.
À Secretária do Mestrado Iguacy Duque, por toda sua dedicação e amizade.
Ao Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPE, por disponibilizar as
instalações físicas para que fosse possível a realização deste trabalho.
Aos meus pais, Carlos e Maria José, meu avô, Luiz, que não se encontram
mais conosco, meu profundo agradecimento pela oportunidade que me deram de
poder conviver com pessoas e vivenciar momentos de grande sabedoria e
aprendizado, que jamais serão esquecidos.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS xii
LISTA DE TABELAS xiv
LISTA DE QUADROS xv
LISTA DE FIGURAS xvi
RESUMO xix
ABSTRACT xx
1. INTRODUÇÃO 21
2. OBJETIVOS
24
Capítulo I – Estudo Farmacognóstico
1. Farmacobotânica – Anatomia dos Órgãos Vegetativos
de Vernonia brasiliana (L.) Druce (Artigo aceito para
publicação na Revista Acta Farmacéutica Bonaerense)
25
Introdução 27
Materiais e Métodos 27
Resultados e Discussão 28
Referências Bibliográficas 31
2. Estudo Farmacoquímico
Introdução 35
2.1 Materiais e Métodos 38
2.1.2 Material Vegetal 38
2.1.3 Identificação do Material Botânico 38
2.2 Drogas e Reagentes 38
2.3 Equipamentos 40
2.4 Outros 40
2.5 Metodologia 41
2.5.1 Perfil Fitoquímico 41
2.5.2 Pesquisa de Polifenóis 43
2.5.3 Pesquisa de Saponinas
2.5.4 Pesquisa de Alcalóides
45
45
2.5.5 Pesquisa de Mono e Sesquiterpenos 45
2.5.6 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides 46
2.5.7 Pesquisa de Iridóides 46
2.5.8 Pesquisa de Açucares Reduto res 47
2.6 Resultados e Discussão 47
2.6.1 Análises Cromatográficas do “Screening”
Fitoquímico das Folhas de V. brasiliana
47
2.6.2 Pesquisa de Polifenóis 48
2.6.3 Pesquisa de Saponinas 51
2.6.4 Pesquisa de Alcalóides 51
2.6.5 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos 51
2.6.6 Pesquisa de Terpenóides e Esteróides 52
2.6.7 Pesquisa de Iridóides 53
2.6.8 Pesquisa de Açúcares Redutores 54
2.7 Isolamento do Acetato de β - amirina (Molécula B) 56
2.7.1 Isolamento de dois Flavonóides (Molécula C1 e E2) 57
2.7.2 Caracterização das Moléculas C1, E2 e B 58
Capítulo II – Atividade Biológica de Vernonia brasiliana
(L.) Druce
1. Atividade Antimicrobiana 80
1.1 Revisão da Literatura 80
1.2 Materiais e Métodos 81
1.2.1 Microrganismos 81
1.2.2 Solventes e Padrões Primários 82
1.2.3 Meios de Cultura 82
1.2.4 Extratos Vegetais 82
1.3 Metodologia 83
1.3.1 Preparação dos Extratos Brutos 83
1.3.2 Preparação dos Inóculos Microbianos 84
1.3.3 Semeio 84
1.3.4 Leitura 85
1.4 Resultados e Discussão 85
2. Atividade Farmacológica 91
2.1 Revisão da Literatura 91
2.2 Materiais e Métodos 93
2.2.1 Animais 93
2.2.2 Extratos Vegetais 93
2.2.3 Drogas e Reagentes 93
2.2.4 Equipamentos e Materiais 94
2.3 Metodologia 94
2.3.1 Experimentos in vivo 94
2.3.1.1Observações Gerais e Toxicidade Aguda 94
2.3.1.2 Atividade Antinflamatória 95
2.3.1.3 Atividade Antiálgica 95
2.4 Resultados e Discussão 96
3. Conclusão Geral 97
Referências Bibliográficas 99
Anexos 105
LISTA DE ABREVIATURAS
AcOEt – Acetato de etila
AcOH- Ácido acético
AlCl3 – Cloreto de Alumínio
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CDCl3 – Clorofórmio Deuterado
ºC – Graus Celsius
cf. – Conferir
C – Centro
D – Direita
DAUFPE – Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco
E – Esquerda
EBM – Extrato Bruto Metanólico
EM – Espectro de Massas
H 3 BO3 – Ácido Bórico
HCOOH –Ácido Fórmico
IC – Isolado clínico
IPA – Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária
IV – Infravermelho
J – Constante de Acoplamento
MeOH – Metanol
mg - miligrama
mL – Mililitro
mm – Milímetro
NaOAc – Acetato de Sódio
NaOMe- Metóxido de Sódio
nBuOH – Butanol Normal
NEU – Difenilborinatodeamino2etila
nm - Nanômetros
P1 – Padrão
P2 - Padrão
pH – Potencial hidrogeniônico
ppm – partes por milhâo
Rf – Relação de Frente
RNM 1 H – Ressonância Nuclear Magnética Protônica
Tab. – Tabela
TMS - Tetrametilsilano
UFC – Unidade Formadora de Colônia
UFPE – Universidade Federal de Pernambuco
UI – Unidade Internacional
U.V – Ultravioleta
λmáx – Lâmbida Máximo (máximo comprimento de onda)
β - Beta
α - Alfa
µg – Micrograma
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Vernonia
brasiliana.
86
Tabela 2 – Atividade Antimicrobiana dos Flavonóides C 1, E2 ,
Nistatina e Anfotericina B.
87
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Componentes químicos encontrados em diversas espécies
de Vernonia.
35
Quadro 1.1 – Estruturas de algumas substâncias descritas no gênero
Vernonia
37
Quadro 2– Fases móveis e reveladores utilizados para identificação de
metabólitos secundários em Vernonia brasiliana (L.) Druce
42
Quadro 3 – Metabólitos secundários encontrados no extrato bruto
metanólico das folhas de Vernonia brasiliana
47
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Vernonia brasiliana (L.) Druce - A. ramo vegetativo; B. ramo
florífero; C. inflorescência capítulo; D. estilopódio; E. brácteas involucrais
pilosas; F. receptáculo; G. cipsela.
33
Figura 2 – Vernonia brasiliana (L.) Druce - . A. pecíolo; B. raiz; C. caule;
D. nervura principal; E. epiderme adaxial com tricoma glandular capitado
(seta); F. epiderme abaxial com tricomas e estômatos anomocíticos; G.
mesofilo; H. margem foliar; I. tricoma não-glandular.
34
Figura 3 – Hábito Geral de Vernonia brasiliana (L.) Druce . 22
Figura 3.1 - Inflorescência de Vernonia brasiliana (L.) Druce 23
Figura 3.2 -Galha com presença de cecidias Vernonia brasiliana (L.)
Druce
23
Figura 4 - Cromatograma mostrando polifenóis encontrados em V.
brasiliana, no detalhe a molécula característica de derivado cinâmico
48
Figura 5 - Cromatograma no ultravioleta, mostrando os flavonóides
encontrados em V.brasiliana
49
Figura 5.1 - Cromatograma no visível, mostrando os flavonóides
encontrados em V.brasiliana
49
Figura 6 - Cromatograma no ultravioleta de agliconas de flavonóides
encontradas nas folhas de V. brasiliana.
50
Figura 7- Cromatograma de Mono e Sesquiterpenos encontrados em V.
brasiliana
52
Figura 8- Cromatograma de Terpenóides, padrão de β - amirina e
padrão de β - sitosterol
53
Figura 9 – Cromatograma de Iridóides encontrados nas folhas de V.
brasiliana.
54
Figura 10 – Cromatograma de Açúcares (visível) e padrão glicose 55
Figura 11 - Flavonóide – origem das absorções no ultravioleta 58
Figura 12 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
C1 em MeOH
61
Figura 13 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
C1 em MeOH/NaOMe.
61
Figura14 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
C1 em MeOH/ AlCl3
62
Figura 15 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
C1 em MeOH /NaOAc
62
Figura 16 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
C1 em MeOH/ AlCl3 + HCl
63
Figura17 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
C1 em MeOH/ NaOAc + H 3 BO3
63
Figura 18 - Espectro de H RMN, CDCl3, TMS, 300MHz da Molécula C1 64
Figura 19 - 5-hidroxi –7,4’ - dimetiléter flavona (Molécula C1) 65
Figura 20 – Espectro de Absorção na região do Ultraviole da Molécula E2
em MeOH.
68
Figura 21 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
E2 em MeOH / NaOMe
68
Figura 22 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
E2 em MeOH /NaOAc
69
Figura 23 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
E2 em MeOH /AlCl3
69
Figura 24 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
E2 em MeOH /AlCl3 + HCl
70
Figura 25- Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula
E2 em MeOH/NaOAc + H 3 BO3
70
Figura 26 - Espectro de H RMN ,CDCl3 , TMS, 300MHz da Molécula E2 . 71
Figura 27 – Espectro Ampliado de H RMN ,CDCl3 , TMS, 300MHz da
Molécula E2 .
72
Figura 28 – 5,8,4’-trihidroxi-3,6,7-trimetiléter flavonol (Molécula E2) 73
Figura 29 – Espectrometria de Massas da Molécula B 75
Figura 30 - Principais fragmentos no Espectro de Massas da Molécula B
76
Figura 31 - Espectro de Absorção na região do Infravermelho da
Molécula B
77
Figura 32 - Espectro de HRMN, CDCl3 ,TMS, 300 MHz da Molécula B 78
Figura 33 – Estrutura do Acetato de β - Amirina. 79
Figura 34 - Atividade Antifúngica das Frações Flavanoídicas sobre
Candida albicans (DAUFPE 1007 e IC) e Candida krusei (A, B, C e D)
89
Figura 34.1 - Atividade Antifúngica das Frações Flavanoídicas sobre
Candida albicans (DAUFPE e IC) e Candida krusei ( E, F, G, H, I )
90
RESUMO
Vernonia brasiliana (L.) Druce – Asteraceae, é um arbusto comumente
encontrado em áreas ruderais do grande Recife e restos da Mata Atlântica do estado
de Pernambuco, sendo vulgarmente conhecida como “Tramanhem”, guardando
parentesco com inúmeros “Assa-Peixes” do gênero Vernonia. De longa data suas
folhas são empregadas na medicina popular, para inibir o reumatismo inflamatório,
cólicas hepáticas e em casos de hemorragia. O presente trabalho esboça um estudo
farmacognóstico com as folhas do vegetal, onde os aspectos Farmacobotânicos e
Farmacoquímicos são aprofundados, fornecendo subsídios à caracterização da
matéria prima e correlação com atividade antimicrobiana encontrada frente às
bactérias Gram positivas, Micrococcus flavus e Staphylococcus aureus, e leveduras,
Candida albicans e Candida krusei, frente às duas moléculas polifenólicas isoladas
(metoxiflavonas) e caracterizadas por análise espectroscópica (UV, RMN 1 H e EM).
Estas moléculas apresentaram atividade antifúngica, inibindo até 23 mm.
Igualmente, foi isolado e caracterizado o Acetato de β-amirina, triterpeno sem
correlação com as indicações etnofarmacológicas. Ensaios de toxicidade, antiedema
e analgesia também foram efetuados, sem apresentarem um significado maior. Um
“screening” cromatográfico com extrato foliar metanólico mostrou a presença de
polifenóis (glicosídeos de flavonóides, derivados cinâmicos e agliconas), terpenóides
(triterpenos, sesquiterpenos, monoterpenos, incluindo dois iridóides) e açúcares
redutores, ausência de cumarinas, fenilpropanoglicosídeos, taninos
(proantocianidinas condensadas e gálicos), saponósidos e alcalóides.
ABSTRACT
Vernonia brasiliana (L.) Druce – Asteraceae, is a shrub , scattered in the
Atlantic forests of the State of Pernambuco and around the city of Recife. It is known
locally as Tramanhem. Its leaves are utilized in folk medicine for the treatment of
rheumatoid arthritis, inflammation, hepatic colic and in the case of bleeding.The main
interest of present work out lined on pharmacognostic study, where the emphysize
was placed on pharmacobotany and pharmacochemistry aspect of its leaves. On
antibacterial study , its inhibitory properties on gram positive strain and yeasts were
observed. Two polyphenol molecules were isolated (methoxyflavonoids), and
characterized by spectroscopy ( UV, NMR, Mass ). These molecules revealed
antifungus activity. Also from the leaves were isolated and characterized ß-amirine
acetate, an triterpene without obvious correlation with popular use. The metanolic
extract of leaves of Vernonia brasiliana did not reveal any toxic effect up to 2 g/kg of
body weight, nor display analgesic or antinfammatory properties in rats.
Chromatography screening of metanolic extract of leaves, demonstrate the presence
of polyphenols (glycosides, flavonoids and aglicons), terpenoids (triterpenes,
sesquiterpenes, monoterpenes, including two iridoids) and sugar reducers, but
absence of cumarins, phenylpropanoglycosides, tannins (proantocianidins, galics),
saponins and alkaloids.
1 − I N T R O D U Ç Ã O
Em nosso país perde-se no tempo a contribuição de inúmeras espécies de
Vernonia ao receituário popular das plantas medicinais, reconhecidas,
genericamente, por seus ramos tênues e longos, como “assa-peixe,” o que traduziu
em algum momento, a aplicação mais generalizada desse vegetal (cf. FIGURAS 3,
3.1 e 3.2 ).
No Nordeste, cerca de 60 espécies foram descritas, medrando nas diversas
zonas do semi-árido, muito mais acentuadamente em clareiras e formações
secundárias da zona da mata (MATOS,1997). Particularmente no Recife e região
Metropolitana, destacando-se as espécies V. brasiliana (L.) Druce, V. condensata
Baker (exótica, nativa da Africa), V. cinerea Less e V. scorpioides Pers.
O enfoque de nosso trabalho recaiu sobre o primeiro taxon citado, por
algumas razões maiores: sua primeira citação botânica na região, remonta à época
dos primeiros naturalistas do Brasil, Guilherme Piso e Jorge Marcgrave, aportando
ao Recife nos últimos meses de 1637 e início de 1638 (PICKEL, 1949). O vegetal
(notadamente suas folhas) sempre foi tido pelas pessoas simples interioranas, como
excelente remédio contra cólicas hepáticas, hemorragias, corizas fortes, hematomas,
e ainda na cura de belides e outras moléstias da visão (CÉSAR, 1956). Reforçou,
ainda, nossa escolha, os estudos preliminares com esse vegetal, no Instituto de
Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, demonstrando a ocorrência
em suas folhas de um princípio antimicrobiano ativo contra Staphylococcus aureus
Rosenbach, em provas de disco de papel de filtro, estável mesmo quando aquecido
a 100 ºC, durante 30 minutos em pH ácido (D´ALBUQUERQUE et al.,1961).
Adicione-se a esses aspectos a ocorrência abundante da espécie em locais
próximos do Campus, traduzindo-se numa maior facilidade de obtenção de material
vegetal em perfeitas condições para estudo fitoquímico e de bioatividade, eixos
ainda escassamente estudados, o que nos pareceu compor um motivo singular e
relevante execução desse trabalho.
FIGURA 3 -Hábito Geral de Vernonia brasiliana (L.) Druce .
FIGURA 3.1 - Inflorescência de Vernonia brasiliana (L.) Druce
FIGURA 3.2 -Galha com presença de cecidias de Vernonia brasiliana (L.) Druce
2 − O B J E T I V O S
GERAL
Validação e caracterização botânica, e determinação de sua atividade
biológica (microbiológica e farmacológica) de metabólitos secundários de interesse
farmacológico presentes nas folhas de Vernonia brasiliana .
ESPECÍFICOS
Ø Caracterização Botânica;
Ø Perfil Cromatográfico da espécie Vernonia brasiliana (L.) Druce;
Ø Extração , isolamento e purificação de metabólitos secundários; e
Ø Determinação das atividades biológicas (microbiológicas e farmacológicas)
dos extratos brutos e substâncias isoladas.
C a p í t u l o I : E s t u d o F a r m a c o g n ó s t i c o 1 . F a r m a c o b o t â n i c a Artigo enviado e aceito para publicação – Revista Acta Farmacéutica
Bonaerense (cf. ANEXO A)
ANATOMIA DOS ÓRGÃOS VEGETATIVOS DE VERNONIA BRASILIANA (L.) DRUCE1
ANATOMY OF THE VEGETATIVE ORGANS OF VERNONIA BRASILIANA (L.) DRUCE1
LÚCIA ROBERTA DE SOUZA FILIZOLA (*)2, REJANE PIMENTEL3, KARINA
PERRELLI RANDAU2, HAROUDO SATIRO XAVIER.2
2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Laboratório de Farmacognosia, Universidade
Federal de Pernambuco, Av. Arthur de Sá, S/N, 50740-521- Recife - PE-Brasil. E-mail:
lufilizola@hotmail.com
3Departamento de Biologia, Laboratório de Fitomorfologia de Fanerógamas, Universidade
Federal Rural de Pernambuco, Av. Manoel de Medeiros, S/N- 52171-900, Dois Irmãos,
Recife-PE-Brasil. E-mail: pimentel@ufrpe.br
Resumo
Descrições anatômicas de raiz, caule e folha de Vernonia brasiliana (L.) Druce mostraram
tricomas não-glandulares em forma da letra T encontrados em toda a planta, principalmente
na epiderme inferior das folhas. Alguns tricomas capitados foram observados na epiderme
inferior foliar. Na raiz, os feixes vasculares foram do tipo colateral circundados por uma faixa
descontínua de fibras agrupadas. A região medular apresentou células com dois tamanhos,
com as menores na posição central.
Palavras chaves: Vernonia brasiliana, Asteraceae, folha, caule, raiz.
Summary
Anatomical descriptions of root, stem and leaf of Vernonia brasiliana (L.) Druce (Asteraceae)
were made. Transversal and paradermal free-hand sections of fresh material were stained with
safranin and astra blue. All the analysis was done in digital images under a precalibrated light
microscope. Non-glandular two-arms T-shaped trichomes were found in the whole plant,
mainly in the lower epidermis of the leaves. Some capitate trichomes in the lower epidermis
of the leaves were observed. In root, the vascular bundles were collateral with a discontinuous
band of clustered fiber cells. The pith region showed two sizes of parenchyma cells with the
smaller cells in the central position.
Key Words: Vernonia brasiliana , Asteraceae, leaf, stem, root.
Introdução
A família Asteraceae é encontrada na América do Sul, principalmente no Brasil,
Bolívia e Venezuela (Gleason, 1923a,b; Pruski, 1997), apresentando cerca de 1535 gêneros e
aproximadamente 23000 espécies (Bremer, 1994, 1996). Para o Brasil são referenciados cerca
de 180 gêneros (Barroso et al., 1991) e, aproximadamente, 900 espécies de Vernonia
(Cronquist, 1981), amplamente distribuídos em toda a região norte e nordeste. Seus
representantes ocorrem como ervas, arbustos e rastejantes (Leitão Filho, 1972).
Vernonia brasiliana (L.) Druce é vulgarmente conhecida como assa-peixe, assa- peixe
preto, assa-peixe roxo, pau de múquem, pau de muqueca e manjericão de cavalo (Barros,
2002). Esta espécie se destaca por sua ação antioxidante (Sims,1972) , tendo sido
extensivamente estudada, principalmente devido à presença de alguns flavonóides capazes de
exterminar o Trypanosoma cruzi (Carvalho, 1991).
Esta espécie é encontrada erroneamente identificada como V. scabra Pers em
diferentes herbários, provavelmente como conseqüência da identificação feita por Baker
(1873, citado por Barros, 2002). Uma vez que esta espécie é amplamente usada na medicina
popular por pessoas mais carentes, uma acurada identificação é de vital importância para que
a mesma não seja confundida com uma outra planta que, além de não solucionar um
determinado problema, ainda provoque o aparecimento de outros. O objetivo deste estudo foi
investigar a estrutura anatômica dos órgãos vegetativos de Vernonia brasiliana (L.) Druce,
visando resolver prováveis problemas na sua identificação taxonômica.
Material e Métodos
O material tipo foi depositado no Herbário IPA (Empresa Pernambucana de Pesquisa
Agropecuária), sob o número IPA 59515, identificado pela Dra. Rita de Cássia Araújo
Pereira. Indivíduos de V. brasiliana (L.) Druce foram coletados num fragmento de Floresta
Atlântica, localizado no município do Curado, Recife, estado de Pernambuco, Brasil.
Material fresco de raízes, caule e folhas, incluindo o pecíolo, foram fixados em FAA,
por 48 horas (Johansen, 1940; Sass, 1951) e corados com safranina e azul de astra (Krauter,
1985). As características anatômicas foram analisadas em cortes transversais, à mão livre.
Epidermes de ambas as superfícies foliares foram clarificadas com hipoclorito de sódio 30%,
neutralizados em água acética 1%, coradas com safranina e azul de astra, montadas em
glicerina 50% (Johansen, 1940; Sass, 1951; Krauter, 1985) e analisadas sob microscópio
precalibrado (Olympus B071). Todas as análises foram feitas em imagens digitais, usando o
programa de análise de imagens Image Tool 3.0 (UTSCHSA, 2002). Os tipos estomáticos
foram identificados segundo Van Cotthem (1970).
A descrição morfoanatômica apresentada baseou-se nos critérios e parâmetros
utilizados por Oliveira, Akisue & Akisue (1998).
Resultados e Discussão
Vernonia brasiliana (L.) Druce (Fig. 1) é um arbusto perene variando entre 0,5 e 2,5
m de altura. Caule muito ramificado com ramos cilíndricos, verdes a amarronzados e tricomas
abundantes. Folhas alternas, simples e pecioladas com estípulas persistentes. Pecíolo
achatado, inserção marginal, biconvexo e base arredondada. Lâmina lanceolada,
membranácea, delgada, margem lisa e nervação peninérvea. O limbo é de consistência
membranácea com algumas espécies apresentando ápice agudo, geralmente truncado, base
arredondada, bordo liso com 15 – 40 mm de comprimento e 10 – 20 mm de largura. Flores
reunidas em inflorescências do tipo capítulo, racemiformes e congestas. Coloração
violácea-pálida.
De modo geral, os caracteres morfológicos encontrados nesta espécie correspondem
àqueles apresentados para o gênero por Althof (1998) e Nunes (1982).
As raízes, em vista transversal, mostraram contorno perfeitamente circular (Fig. 2B)
revestidas por epiderme simples seguida por parênquima cortical e uma faixa descontínua de
fibras agrupadas. O sistema vascular é composto por quatro feixes colaterais e parênquima
medular.
O caule apresentou contorno sinuoso, em vista transversal (Fig. 2C), com revestimento
de epiderme simples contendo tricomas não glandulares. Os tricomas são do tipo
não-glandular, consistidos de um pedúnculo 7-seriado, encimado por uma única célula que,
em posição transversal, assemelha-se a dois braços, já descritos para Vernonia por Solereder
(1908, citado por Metcalfe & Chalk, 1989). O cilindro central apresentou feixes vasculares
maiores nas margens mais sinuosas e de 3 a 7 feixes vasculares menores entre eles. A medula
está constituída por dois tamanhos de células parênquimáticas com as menores na posição
central.
A vista transversal do pecíolo (Fig. 2 A) mostrou contorno côncavo-convexo com
feixes vasculares colaterais, 3 a 5 maiores e 3 a 4 menores. As células epidérmicas, em vista
frontal, mostraram paredes anticlinais levemente sinuosas, em ambas as superfícies foliares
(Fig. 2E,F). A epiderme foliar é simples, uniestratificada e revestida por uma cutícula
delgada, em ambas as superfícies (Fig. 2G). Foram identificados estômatos anomocíticos (Fig.
2F) na face inferior, situados ao mesmo nível das demais células epidérmicas. Pêlos
glandulares e não-glandulares estão presentes em ambas as superfícies foliares, apresentando
uma maior densidade na face inferior (Fig. 2H). Os pêlos não-glandulares (Fig. 2I)
consistiram de um pedúnculo 7-seriado, encimado por uma única célula que, em posição
transversal, apresenta a forma da letra T. Os pêlos glandulares capitados (Fig. 2E, seta)
apresentaram um pedúnculo unicelular encimado por uma célula globular.
A nervura principal (Fig. 2D), na porção mediana da lâmina foliar, apresentou três
feixes vasculares colaterais de tamanhos similares. O mesofilo dorsiventral (Fig. 2G) está
constituído de uma camada de parênquima paliçádico sob a epiderme superior e 4-5 camadas
de parênquima lacunoso.
Em geral, os representantes da família Asteraceae apresentam uma ampla variação na
estrutura anatômica em resposta às condições ambientais (Metcalfe & Chalk, 1989). Estes
autores afirmaram que a despeito desta ampla variação, os tricomas identificados nas
Asteraceae poderiam ser utilizados como caractere diagnóstico (Carlquist, 1958/1961 citado
por Metcalfe & Chalk, 1989).
Os tricomas observados em V. brasiliana apresentaram dois braços, com braços
desiguais em forma de T (Fig. 2I), foram similares aos tricomas encontrados em V.
senegalensis Less. (Metcalfe & Chalk, 1989). Trabalhos anteriores destes autores
apresentaram características semelhantes de diferentes gêneros de Asteraceae, contudo essa
informação foi restrita a poucas espécies nesta família sem qualquer referência à V. brasiliana
(L.) Druce.
A literatura disponível é abundante acerca da existência de tricomas glandulares em
indivíduos pertencentes ao gênero Vernonia. A ocorrência de pêlos glandulares capitados no
caule e folhas nesta espécie não foi registrada. O potencial sistemático desta característica
anatômica parece óbvio, mas a eficiência na sua aplicação necessitará de observações
comparativas entre as diferentes espécies do gênero Vernonia.
Provavelmente, as mais importantes características anatômicas que devem ser
consideradas bons descritores e atributos diagnóstico em V. brasiliana (L.) Druce são: 1) dois
tipos de tricomas; não-glandular, com dois braços com pedúnculo em forma de T e glandular,
com 1-pedúnculo e 1-cabeça, abundantes na epiderme foliar inferior, 2) faixa descontínua de
fibras agrupadas no cilindro vascular das raízes, 3) células com dois tamanhos no parênquima
medular do caule e, 4) contorno fortemente sinuoso no caule com grandes feixes vasculares
nas áreas mais sinuosas.
A grande quantidade de tricomas nas epidermes de V. brasiliana está, provavelmente,
associada com sua atividade medicinal, uma vez que estas estruturas são o maior reservatório
de substâncias produzidas pelas plantas. Estudos em plantas medicinais indicam a relevância
considerável da presença de pêlos como células de armazenamento. Alguns deles podem
armazenar terpenóides (Fahn, 1988), derivados de floroglucinol (Hurre et al., 1979 citados por
Fahn, 1988) além de outros altamente importantes no uso medicinal.
Nas células do parênquima radicular e caulinar não foi observado armazenamento de
amido ou outro tipo de material de reserva, provavelmente porque esta planta está bem
estabelecida e bem adaptada às condições ambientais onde ela foi coletada.
Vernonia é um gênero que contém muitas espécies e oferece muitas oportunidades
para estudos anatômicos comparativos além da pesquisa original de Metcalfe & Chalk (1989).
Em conseqüência de seu uso extensivo pela população e pela indústria como medicamento, é
necessário examinar estágios sucessivos do desenvolvimento dos órgãos vegetativos,
principalmente as folhas, em qua lquer estudo comparativo de V. brasiliana (L.) Druce.
Referências bibliográficas (1) Gleason, H. A. (1923) a. American Journal of Botany. 10:297-309.
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de cerrado do Estado do Piauí, Brasil.” Tese de Doutorado em Botânica. Ed. Universidade
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Texas.
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(19) Nunes, J. M. S. (1982) Arquivos do Jardim Botânico do Rio de Janeiro 5:95-171.
(20) Metcalfe, C.R. & L. Chalk. (1989) “Anatomy of the dicotyledons” Vol. II. Ed. Clarendon
Press, Oxford, págs. 64-98.
(21) Fahn, A. (1988) Phyton 28:13-26.
Figura 1. Vernonia brasiliana (L.) Druce. A. ramo vegetativo; B. ramo florífero;
C.inflorescência capítulo; D. estilopódio; E. brácteas involucrais pilosas;
F.receptáculo; G. cipsela.
Figura 2. Vernonia brasiliana (L) Druce. A. pecíolo; B. raiz; C. caule; D. nervura principal;
E. epiderme adaxial com tricoma glandular capitado (seta); F. epiderme abaxial com tricomas
e estômatos anomocíticos; G. mesofilo; H. margem foliar; I. tricoma não-glandular.
2 Estudo Farmacoquímico
Introdução
O gênero Vernonia, aportando um grande número de espécies, certamente
abriga um vasto perfil fitoquímico com praticamente representantes de todos os
grupos de metabólitos secundários conhecidos, predominando os triterpenos,
esteróides, sesquiterpenos e flavonóides. Essas duas últimas classes de compostos
têm sido inclusive utilizadas como marcadores taxonômicos (CARVALHO,1999). Os
QUADROS 1 e 1.1 incluem e resumem alguns exemplos de moléculas e estruturas
químicas, respectivamente, já isoladas e caracterizadas nesse gênero (Base de
Dados NAPRALERT, 2003).
Quadro 1 - Componentes químicos encontrados em diversas espécies de Vernonia.
Espécie Compostos Químicos Partes da
Planta
Referência
V. acuminata acetato de Lupeol
(triterpeno)
PI Nestor, P.S./1984
V. altissima apigenina-7-metoxi
(flavona)
PA Wollenwerber, E.
et al./1989
V. angusticepis geandolide-3-oxo
(lactona sesquiterpênica)
acetato de lupeol
(triterpeno)
PA
PI
Budesinsky, M.et al
1994.
V. alvinii lupeol
(triterpeno)
R Bohlmann, F. et al.
1981
V. arkansana acetato de lupeol
(triterpeno)
β - sitosterol
(esteróide)
PA
R
Bohlmann, F. et al.
1991
V. arborea Zaluzanin D
(lactona sesquiterpênica)
R Bohlmann, F. et al.
1981
V. amygdalina quercetina
(flavonol)
FL Rwangabo, P.C.
et al /1986
V. brasiliana β-amirina ,germanicol e
lupeol (triterpenos)
F Almeida,T., M. et al.
1997
V. cinerea Acetato de α -amirina
(triterpeno)
β - sitosterol (esterol)
R Misra,T.N.et al.
1984
V. condensata lupeol (triterpeno) PA Bohlmann, F. et al.
1981
V. elaeagnifolia quempferol
(flavonol)
I Subramanian, N.S;
Nagarjan,S.,1981.
V. erdvendbergii lupeol (triterpeno)
acetato de lupeol
( triterpeno)
PA
Dominguez, X.A. et al
1986
V. fasciculata genkwanina (flavona) F Narain, N.K./1997
V.flexuosa apigenina e astragalina
(flavonol)
F King,B.L.; Jones,S.B. /
1982
V. galamensis
ssp.
galamensis
quercitrina, quercetina
(flavonol)
PI Awaad,A.S.,Grace,
M.H,
2001
V. jalcana genkwaniana
(flavona)
PA Jakupovic,J. et al
1986
V. simplex apigenina-8-c-glicosídeo,
luteolina (flavona)
quercitrina (glicosídeo de
flavonol)
F King,B.L., Jones,S.B.
1982
Legenda : R = raiz, C= caule, F= folhas, PA = partes aéreas, PI = planta inteira , FL= flor , I = inflorescência
QUADRO 1.1 – Estruturas de algumas substâncias descritas no gênero Vernonia.
O
OOH
OH
OH
OH
CH2
CH3
CH3CH3
CH3 CH3
OH
CH3
CH3
H
H
H
O
O
O
O
OHOH
OH
OH
OH
CH3
OH
OH
Luteolina Lupeol Quercitrina
O
OOH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
OOH
O
OH
CH3
Apigenina Quercetina Genkwanina
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OOH
OH
OHO
OH
HO OH
OH
CH3
CH3CH3
CH3CH3
OH
CH3
CH3CH3
Quempferol Vitexina Germanicol
2.1 Materiais e Métodos
2.1.2 Material Vegetal
O material vegetal utilizado para o estudo fitoquímico, foi obtido de indivíduos
adultos, constituídos de folhas, raiz e flor. Coletado no período compreendido entre
Dezembro de 2001 a Fevereiro de 2003, nos arredores da floresta atlântica,
localizada no Bairro do Curado, Recife.
Após a coleta, o material foi acondicionado em sacos plástico e conduzido ao
laboratório de Farmacognosia do Departamento de Farmácia. A secagem e
conservação foram realizadas à temperatura ambiente (30°C), em dependência
arejada, durante 5 dias, sendo então acondicionado em recipientes plásticos
apropriados e assim mantidos, enquanto não utilizado.
2.1.3 Identificação do Material Botânico
A identificação botânica do material vegetal foi efetuada na Empresa
Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA, em cujo herbário ficou depositada
exsicata sob o número 59515, a cargo da Dra. Rita de Cássia Araújo Pereira.
2.2 Drogas e Reagentes
Ø Acetato de Etila P.A (Merck);
Ø Acetona P.A (Merck);
Ø Ácido Clorídrico P.A (Merck);
Ø Ácido Fórmico P.A (Merck);
Ø Ácido Sulfúrico P.A (Merck);
Ø Água Destilada;
Ø Anidrido Acético P.A (Merck);
Ø Benzeno P.A (Merck);
Ø Carvão Ativado P.A (Merck);
Ø Cloreto de 2,3,5 – trifeniltetrazolio P.A (Merck);
Ø Clorofórmio P.A (Merck, Reagen);
Ø Difenil Boriloxietilamina P.A (Fluka);
Ø Etanol P.A (Merck);
Ø Hidróxido de Amônio P.A (Merck);
Ø Hidróxido de Sódio P.A (Merck);
Ø N-Hexano P.A (Reagen);
Ø Metanol P.A (Merck,Vetec e Reatif)
Ø Polietileno Glicol 400 P.A (Merck);
Ø Subnitrato de Bismuto (Merck);
Ø Vanilina P.A (Carlo Erba);
Ø ß- Sitosterol (Extrasynthese);
Ø ß- Amirina (Extrasynthese) e;
Ø Quercetina (Merck).
2.3 Equipamentos
Ø Balança Analítica;
Ø Balança semi-analítica;
Ø Câmara Ultra-Violeta (250-365 nm);
Ø Destilador;
Ø Estufa;
Ø Multiprocessador;
Ø Placa aquecedora;
Ø Câmara Fotográfica Digital;
Ø Bomba de vácuo;
Ø Aparelho de Soxhlet;
Ø Rotaevaporador Buchi Instruments;
Ø Espectrofotômetro de Ultravioleta, Perkin Elmer, Lambda 6;
Ø Espectrofotômetro de HRMN, Varian, modelo Unity Plus, 300MHz; e
Ø Espectrofotômetro de Massas R1010C, Delsi-Nermag.
2.4 Outros
Ø Borrifadores para Revelação em Cromatografia em Camada Delgada (CCD);
Ø Colunas Cromatográficas;
Ø Placas Cromatográficas (Merck);
Ø Cubas para CCD;
Ø Duolite S-861;
Ø Sephadex LH-20;
Ø Gel de Sílica 60 Merck;
Ø Celulose Machery - Nagel;
Ø Poliamida Polyclar AT – Serva; e
Ø Filmes Fotográficos -Kodak.
2.5 Metodologia
2.5.1 Perfil Fitoquímico
Obedecendo aos procedimentos do Laboratório de Farmacognosia, baseados
nos estudos de HARBORNE (1998), WAGNER (1996) , MARKHAM (1982) e
XAVIER (2001), alíquotas de 15 µL de uma infusão metanólica das folhas do vegetal
(10% p/v) foram submetidas à análise cromatográfica, usando-se placas prontas de
gel de sílica 60 Merck, art.105553, diversos sistemas de desenvolvimento e
reveladores adequados.
Dessa forma foram obtidos os cromatogramas pertinentes aos diversos
grupos de moléculas majoritárias, possivelmente presentes, tais como: polifenóis
(cumarinas, flavonóides, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, esteróides,
proantocianidinas condensadas, leucoantocianidinas, ácido gálico e taninos
hidrolisáveis), terpenos (monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, iridóides e
saponinas), alcalóides e açucares redutores, como descrito no QUADRO 2.
QUADRO 2 – Fases móveis e reveladores utilizados para identificação de
metabólitos secundários em Vernonia brasiliana (L.) Druce.
Metabólitos Sistema de Eluição Revelador Referência
Alcalóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:11:11:27v/v)
Dragendorff Wagner,1984
Monoterpenóides,
Sesquiterpenóides e
Diterpenóides
Benzeno-AcOEt (97: 3v/v) Vanilina
Sulfúrica
Wagner,1996
Triterpenóides e
Esteróides
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:0,5:0,5:0,5 v/v)
Liebermann/
Burchard
Harborne,1998
Iridóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:11:11:27 v/v) Vanilina
Sulfúrica Wagner,1984
Saponinas AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:11:11:27 v/v) Vanilina
Sulfúrica Wagner,1996
Açucares n-BuOH-Me2CO-Tampão
fosfato pH= 5,0(40:50:10
v/v)
Trifeniltetrazólio Metz,1961
Cumarinas Éter-Tolueno-AcOH 10%
(50:50:50 v/v)
U.V Wagner,1996
Derivados Cinâmicos AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:11:11:27 v/v)
NEU Wagner,1996
Flavonóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:11:11:27 v/v)
NEU Wagner,1984;
Markham,1982.
Fenilpropanoglicosídeos AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:11:11:27 v/v)
NEU Wagner,1996
Proantocianidinas
Condensadas e
Leucoantocianidinas
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100:11:11:27 v/v)
Vanilina
Clorídrica
Robertson,1956
Taninos Hidrolisáveis
(ácido gálico)
AcOEt-tolueno-HCOOH
(10:3:1 v/v)
Alumen de
Ferro 1%
NEU
Stiasny,1912.;
Xavier, 2001
2.5.2 Pesquisa de Polifenóis
Incluem três grupos de moléculas, em função do procedimento:
I) Cumarinas, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos e
Flavonóides
II) Proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas
III) Taninos gálicos.
A pesquisa do grupo I é realizada obtendo-se dois cromatogramas, em um
deles emprega-se a fase móvel polar, acetato de etila - ácido fórmico - ácido acético
- água (100:11:11:27 v/v), destinado a moléculas polares (glicosídeos), o outro com
a mesma fase móvel em proporções menores, tornado o sistema menos polar
(100:1:1:1 v/v), destinado a moléculas livres (agliconas).
De acordo com esta metodologia a presença de cumarinas se caracteriza no
cromatograma por mancha com intensa fluorescência azul, quando observado sob
lâmpada ultravioleta (UV-365 nm). Após revelação com o reagente de NEU
(difenilborinatodeamino2etila), torna-se praticamente inalterada aquela coloração à
luz ultravioleta, os derivados cinâmicos e fenilpropanoglicosideos, apresentam
fluorescência azul-claro antes da revelação com o reagente de NEU, após a sua
aplicação e observação do cromatograma à 365nm, os derivados cinâmicos
adquirem forte fluorescência azul e os fenilpropanoglicosídeos fluorescência verde-
amarelada. Os flavonóides, por sua vez, em sua grande maioria, antes da revelação
com o reagente de NEU, mostram fluorescência à luz ultravioleta cor marrom escuro,
após a revelação adquire fluorescência que varia do laranja até o verde musgo,
conforme os substituintes no esqueleto molecular (BRASSEUR & ANGENOT,1986).
A pesquisa do grupo II efetua-se pela observação dos cromatogramas, com a
fase móvel mais polar e utilizando o revelador vanilina clorídrica a 1%, as manchas
das proantocianidinas condensadas (taninos catéquicos) apresentam-se em
vermelho vivo e com valores de Rf muito baixos, aquelas das leucoantocianidinas
coram-se igualmente em vermelho intenso, porém com Rf superior a 0,5 (dímeros)
ou entre 0,8 a 0,9 (monômeros).
A pesquisa do grupo III os taninos gálicos foram investigados obedecendo
uma modificação do protocolo proposto por Stiasny (1912), desenvolvida no
Laboratório de Farmacognosia (XAVIER, 2001). Inicialmente investiga-se por
cromatografia em camada delgada (CCD) a existência de ácido gálico. Para tanto,
uma alíquota do extrato bruto é co-cromatografado com padrão daquela molécula
empregando-se o sistema AcOET-Tolueno-Ácido Fórmico (10:3:1 v/v) e efetuando-
se a revelação com Alúmen de Ferro a 1%, o ácido gálico produz mancha de
coloração azul quase preto, apresentando aproximadamente um Rf em 0,60,
cromatograma idêntico é efetuado revelando-se com o reagente de NEU e
posteriormente observado à luz ultravioleta. O ácido gálico produz mancha com
fluorescência azul.
Para investigação de taninos gálicos, uma alíquota do extrato bruto em água
destilada (5 mL de solução a 10%) é submetida a tratamento hidrolítico com 15 mL
de formol e 5 mL de ácido clorídrico concentrado, refluxando-se sob agitação
durante 30 minutos. Quando frio, o hidrolisado é submetido à filtração simples em
papel, e o filtrado torna-se desprovido de formol e ácido por passagem em coluna
cromatográfica de Duolite S-861, lavando-se com água até obtenção de frações
isentas de aldeído e acidez. Os fenóis retidos na resina são finalmente
desadsorvidos com acetona e a fração acetônica submetida a CCD, como já descrito
para o ácido gálico. A existência de ácido gálico oriundo de taninos, apresenta-se no
cromatograma de forma quantitativa, e superior ao demonstrado pelo ácido gálico
presente em forma livre, quando essas duas moléculas coexistem no mesmo
material vegetal.
2.5.3 Pesquisa de Saponinas
Esta pesquisa é realizada pela observação das características afrogênicas de
uma solução do extrato bruto em água, sendo a mesma submetida a violenta
agitação manual. A produção de espuma abundante e persistente, durante pelo
menos 1 hora, indica a presença de saponósidos. A confirmação pode ser efetuada
por CCD, empregando-se uma fase móvel polar e o revelador a vanilina sulfúrica ou
anisaldeído.
2.5.4 Pesquisa de Alcalóides
Para confirmação dessas moléculas, o cromatograma foi submetido à fase
móvel polar, acetato de etila: ácido fórmico : ácido acético : água (100:11:11:27 v/v)
e revelado com o reagente de Dragendorff. A presença de alcalóides caracteriza-se
pelo surgimento de manchas com coloração laranja forte.
2.5.5 Pesquisa de Mono e Sesquiterpenos
Moléculas terpênicas com baixo peso molecular, em geral, são de pouca
polaridade e reagem fortemente com vanilina sulfúrica, apresentando manchas com
coloração predominantemente entre o azul e o violeta. A alíquota foi
cromatografada usando-se como fase móvel tolueno:acetato de etila (97:3 v/v) e
revelada com os reagentes: solução etanólica de ácido sulfúrico a 5% e solução
etanólica de vanilina a 2%, aquecimento em estufa a 100°C, durante 3 minutos.
2.5.6 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides
Estas moléculas em solução clorofórmica, na presença de anidrido acético e
ácido sulfúrico concentrado (reagente de Liebermann-Burchard), produzem
colorações que variam do azul esverdeado (esteróides) ao castanho avermelhado
(triterpenos) (HASHIMOTO, 1970). Uma adaptação do método à CCD, permite aferir
a presença dessas moléculas (HARBORNE,1998; SHARMA,1991). Placas
cromatográficas foram submetidas a fase móvel tolueno-acetato de etila (90:12),
reveladas com o reagente de Liebermann-Burchard, seguido de aquecimento a
100°C e estufa, durante 5 minutos, com observação no visível e luz ultravioleta (365
nm).
2.5.7 Pesquisa de Iridóides
Alguns iridóides (glicosídeos de monoterpenos modificados, do tipo
asperulina, aucubina e monotropeína) reagem com vanilina sulfúrica, produzindo
uma coloração violácea (HARBORNE,1998). Placas cromatográficas contendo o
extrato metanólico foram submetidas à fase móvel polar acetato de etila: ácido
fórmico : ácido acético : água (100:11:11:27 v/v) e revelados com vanilina sulfúrica,
seguida de aquecimento a 100°C, durante 5 minutos.
2.5.8 Pesquisa de Açúcares Redutores
Cromatogramas com o extrato metanólico foram submetidos a fase móvel
butanol-tampão fosfato, pH = 5,0 - acetona (4:1:5 v/v) e revelados com solução
metanólica a 4% de cloreto de trifeniltetrazólio, seguida de aquecimento a 100°C,
durante 5 minutos (RUSSEL,1983). Desenvolvimento de manchas com coloração
vermelho-sangue confirmam a existência de açucares redutores.
2.6 Resultados e Discussão
2.6.1 Análises Cromatográficas do “Screening” Fitoquímico das Folhas de
V. brasiliana.
O QUADRO 3 expressa os resultados obtidos após ensaios preliminares
efetuados no extrato bruto metanólico das folhas.
QUADRO 3 – Metabólitos secundários encontrados no extrato bruto metanólico das folhas de Vernonia brasiliana.
MOLÉCULAS RESULTADOS
Cumarinas Negativo
Proantocianidinas condensadas e
Leucoantocianidinas
Negativo
Derivados Cinâmicos Positivo
Fenilpropanoglicosídeos Negativo
Flavonóides Positivo
Taninos Hidrolisáveis Negativo
Alcalóides Negativo
Iridóides Positivo
Saponinas Negativo
Triterpenóides e Esteróides Positivo
Monoterpenóides e Sesquiterpenóides Positivo
Açucares Positivo
2.6.2 Pesquisa de Polifenóis
A ausência de cumarinas foi constatada pela inexistência, no cromatograma,
de moléculas com forte fluorescência à luz ultravioleta (365 nm). Nessas condições,
uma molécula com valor de Rf elevado em fase móvel polar, com tênue
fluorescência azul claro, exacerbada após reação com o reagente de NEU foi
evidenciada, indicando um derivado cinâmico. As moléculas do tipo
fenilpropanoglicosídeos, de fluorescência verde amarelada foram excluídas neste
tipo de ensaio.
Essa molécula encontra-se sobreposta a uma outra de fluorescência laranja,
um flavonóide (cf. FIGURA 4).
FIGURA 4 - Cromatograma mostrando polifenóis encontrados em V. brasiliana, no detalhe a molécula característica de derivado cinâmico.
Cinco manchas com Rf decrescentes (0,80 - 0,50), pertencentes a flavonóides
foram observadas. Aquelas com Rf próximo a 0,50 são de glicosídeos de
flavonóides, dentre estas, percebe-se duas manchas com Rf 0,60 e 0,62 de
fluorescência vermelha, devido a glicosídeos de Eriodictiol (flavanona). Estas
mesmas moléculas forneceram um cromatograma no visível, onde após reagirem
com o reagente de NEU por um período de 2 horas, mostram coloração vermelha
intensa. Observa-se ainda nestas condições uma mancha com RF 0,70 e de
coloração vermelha, também pertencente a esse tipo de moléculas (cf. FIGURAS 5
e 5.1).
FIGURA 5.1 Cromatograma no visível, mostrando os flavonóides
encontrados em V.brasiliana
FIGURA 5 Cromatograma no ultravioleta,
mostrando os flavonóides encontrados em V.brasiliana
Com uma fase móvel de polaridade mediana, pôde-se avaliar as agliconas de
flavonóides que se localizaram no “front” do cromatograma anterior. Nestas
condições observamos a existência de pelo menos seis dessas moléculas (cf.
FIGURA 6).
FIGURA 6 - Cromatograma no ultravioleta de agliconas de flavonóides encontradas
nas folhas de V. brasiliana.
As moléculas com Rf maiores, em torno de 0,50 e 0,60 , são do tipo
Apigenina ou Quempferol (fluorescência esverdeada). A molécula com Rf 0,30 e
0,10, de fluorescência laranja , são Quercetínicas ou Luteolínicas. Uma molécula com
Rf aproximado de 0,20, um derivado de Eriodictiol (fluorescência vermelha), foi
evidenciado, bem como uma com Rf 0,30, sobreposta, de fluorescência esverdeada
(Apigenínica ou Quempferólica) (BRASSEUR & ANGENOT,1986). Não foi
constatados a existência de proantocianidinas, taninos gálicos, nem ácido gálico.
2.6.3 Pesquisa de Saponinas
Ensaio por via úmida (afrogenicidade), revelou a inexistência dessas
moléculas. Ausência de espuma persistente e abundante, dispensando-se o
emprego de cromatografia.
2.6.4 Pesquisa de Alcalóides
Os ensaios realizados , por CCD (reagente de Dragendorff) ou por via úmida
(reação com reagentes de precipitação de alcalóides), em vidro de relógio e revelada
com reagentes de Dragendorff, Mayer, Bertrand e Bouchardat, indicaram a
inexistência destas moléculas.
2.6.5 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos
A existência de terpenóides de baixo peso molecular, mono e sesquiterpenos
foram evidenciadas no cromatograma obtido após desenvolvimento com fase móvel
de baixa polaridade , tolueno : acetato de etila (97:3 v/v) e revelada com vanilina
sulfúrica, seguida de aquecimento em estufa a 100°C, durante 5 minutos. Quando
pelo menos seis moléculas foram observadas, aquelas em número de três de Rf
superior (Rf entre 0,70-0,90), devido a monoterpenos e, as outras três de Rf 0,20,
0,25 e 0,35, devido provavelmente a sesquiterpenos, cf. FIGURA 7.
FIGURA 7- Cromatograma de Mono e Sesquiterpenos encontrados em V. brasiliana
2.6.6 Pesquisa de Terpenóides e Esteróides
Um cromatograma desenvolvido com fase móvel de baixa polaridade, tolueno
: acetato de etila (90:12 v/v) foi revelado com o reagente de Liebermann-Burchard,
após prévio aquecimento em estufa a 100°C, durante 5 minutos, seguido de
exposição à luz ultravioleta, apresentou 04 manchas, duas com Rf elevado (Rf 0,70
e 0,80) e duas com Rf em torno de 0,40 e 0,50. Destas , uma correspondendo ao β-
sitosterol e a outra ao Acetato de β - amirina , com Rf ligeiramente superior ao da β -
amirina (cf. co-cromatografia com este padrão) (cf. FIGURA 8).
FIGURA 8- Cromatograma de Terpenóides (A) –EBM; (P1) -padrão de β - amirina; (P2) - padrão β - sitosterol
2.6.7 Pesquisa de Iridóides
A presença dessas duas moléculas foi constatada no cromatograma quando
revelado com vanilina sulfúrica e posterior aquecimento em estufa a 85°C, durante 5
minutos, observando-se o desenvolvimento de duas manchas com coloração
marrom e marrom-violácea, de Rf 0,60 e 0,65, respectivamente (cf. FIGURA 9).
FIGURA 9 – Cromatograma de Iridóides encontrados nas folhas de V. brasiliana.
2.6.8 Pesquisa de Açúcares Redutores
A existência de açucares redutores, glicose e provavelmente dois
dissacarídeos,
foi observada no cromatograma revelado com Cloreto de Trifeniltetrazólio, seguido
de aquecimento em estufa a 85°C, durante 5 minutos. Observando-se manchas de
coloração vermelha com Rf de 0,30 - 0,40 e 0,50, esta última correspondendo a
glicose (cf. co-cromatografia com este padrão na FIGURA 10).
FIGURA 10 – Cromatograma de Açucares (visível) : (E) – EBM; (D) -.padrão glicose
O perfil fitoquímico obtido a partir do extrato bruto das folhas, confirmou a
predominância de compostos polifenólicos e terpenóides. Dentre os polifenóis, foi
constatado a presença de derivado cinâmico, e um número majoritário de
flavonóides, reforçando o descrito na literatura (Base de dados do NAPRALERT,
2003), como a presença de glicosídeos do eriodictiol e agliconas de outros
flavonóides. Moléculas fenólicas, tais como: cumarinas, fenilpropanoglicosídeos
proantocianidinas, taninos gálicos e ácido gálico, não foram constatadas nos ensaios
realizados.
Quanto aos terpenóides, foram encontrados aqueles de baixa polaridade,
mono e sesquiterpenos, como também as moléculas de alto peso molecular,
triterpenos e esteróides, em concordância com a co-cromatografia apresentada na
FIGURA 8 (padrões de β - amirina e β- sitosterol).
A presença de alguns iridóides, foi constatada no cromatograma com o
aparecimento de duas manchas características. A inexistência de saponinas foi pré-
determinada pela ausência de espumas, através do ensaio preliminar de
afrogenicidade. Os alcalóides não estavam presentes nas folhas da planta em
estudo.
Açúcares redutores, glicose e provavelmente dois dissacarídeos, foram
identificados em cromatograma, correspondendo a co-cromatografia do padrão de
glicose utilizado (cf. FIGURA 10).
2.7 Isolamento do Acetato de β - Amirina (Molécula B)
Cerca de 15 g do extrato bruto metanólico foi tratado com n-hexano (50 mL,
três vezes), adicionados de carvão ativado (3g) e colocados em repouso por 15
minutos. A solução hexânica foi submetida à filtração simples em papel e o líquido
resultante concentrado a 1/10 do volume inicial. Em seguida foi realizada uma
cromatografia em coluna de gel de sílica - 60 (70-230 mesh), 30x5 cm, empacotada
com n-hexano, seguindo-se um gradiente de polaridade crescente (Benzeno e
AcOEt), obtendo-se 70 frações de 15 mL cada. As frações eluídas (47-53), com
Benzeno : AcOEt (17:3 v/v), mostraram, quando analisadas por CCD, sistema
Tolueno : AcOEt (90:15 v/v) e, reveladas com o reagente de Liebermann – Burchard,
uma única substância de Rf 0,50, reunidas e submetidas a evaporador rotatório para
eliminação do solvente, forneceram 340 mg de sólido esbranquiçado. As demais
frações continham outras moléculas.
2.7.1 Isolamento de dois Flavonóides (Moléculas C1 e E2)
Para a obtenção dessas moléculas, foi realizada uma pré–purificação do
extrato bruto metanólico (6g), empregando-se coluna cromatográfica de Sephadex
LH–20, 70x8 cm, empacotada e eluída com Metanol, da qual foram obtidas 16
frações de 300 mL cada. As frações 8-11, quando analisadas por CCD, mostraram
conter a maioria dos flavonóides. Estas foram reunidas e forneceram após
eliminação do solvente à vácuo (30°C), cerca de 2,5g de material ligeiramente
amarelado. Para o isolamento dos flavonóides, após vários ensaios cromatográficos,
optou-se por cromatografar o material em coluna cromatográfica de Poliamida
Polyclar AT-Serva, art.33162, empacotada e eluída em Benzeno, assim foram
obtidas 83 frações de 15 mL cada uma.
As frações 7-13 (C1) e 59-79 (E2), mostraram em CCD, tratar-se de
flavonóides e estavam praticamente puras. Uma re-cromatografia foi realizada com
cada um desses grupos de frações em nova coluna de Poliamida, usando-se para
C1, como eluente n-hexano: clorofórmio (13:7 v/v) e para a cromatografia de E2
clorofórmio: AcOEt (17:3 v/v). Dessa forma duas moléculas puras, C1 (140 mg) e E2
(120 mg), foram isoladas.
2.7.2 Caracterização das Moléculas C1, E2 e B
2.7.2.1 Caracterização da Molécula C1
Normalmente as absorções de flavonóides no ultravioleta são importantes
ferramentas para sua caracterização molecular. Estas absorções, para efeito de
estudos espectroscópicos, estão definidas como produzidas por cromóforos do
primeiro anel A (Banda II, 240-285 nm) e dos anéis C e B (Banda I, 300-550 nm) (cf.
FIGURA 11).
O
O FIGURA 11 - Flavonóide – origem das absorções no ultravioleta
A molécula codificada como C1, apresentou λmáx. (MeOH) no ultravioleta :
250 nm (ombro), 270 nm (Banda II) e 350 nm (Banda I) (cf. FIGURA 12). Estas
absorções estão coincidentes com aquelas esperadas para uma flavona, 250-280
nm (Banda II) e 300-350 nm (Banda I) (MARKHAM,1982).
A coloração da fluorescência desta substância (verde musgo), quando um seu
cromatograma é revelado com o reagente de NEU e exposto à luz ultravioleta (365
nm), indica um flavonóide com um substituinte em 4’, portanto um esqueleto do tipo
A
B
Banda II
Banda I C
apigenínico (BRASSEUR & ANGENOT, 1986), reforçando os dados do ultravioleta.
Isto fica definido pela presença, no espectro de ressonância magnética nuclear
protônica, de um singlete com um único próton a 6,58 ppm e característico de
flavonas (MABRY,1970). Outras absorções no ultravioleta após o emprego de
reagentes de deslocamento, permitiram importantes definições:
a) Tratamento com NaOMe, determinou um efeito batocrômico na Banda I de 55 nm
(350 - - 405 nm) com diminuição da intensidade, indicando que a molécula não
contém uma hidroxila livre em 4’, desde que se trata de uma flavona. A inexistência
de decomposição com o tempo (contínua diminuição da intensidade), sugere a
inexistência de 3,4’ – OH, grupos o-dihidroxi no anel A ou 3 hidroxilas adjacentes no
anel B(cf. FIGURA 13) (MARKHAM,1982).
b) O tratamento com AlCl3, produziu um efeito batocrômico na Banda I, com relação
ao espectro em metanol de 45 nm, indicando a existência de hidroxila em C-5. Uma
oxigenação em C-6 não é possível, nem tão pouco uma prenilação nesse átomo
com hidroxila em C–5, porque não acarretaria deslocamento ou ocorreria um
deslocamento muito menor (17-20 nm). Da mesma forma, a existência de um OH em
C-3 fica afastada, pois o efeito batocrômico seria superior a 50 nm (50-60 nm) (cf.
FIGURA 14). A adição de ácido clorídrico ao AlCl3 não provocou alteração no
espectro, cf. FIGURA 16 , indicando a inexistência de formação do complexo (o-
dihidroxi) com o alumínio, que seria posteriormente desfeito pelo ácido, confirmando
portanto, uma hidroxila em C- 5 (MARKHAM,1982).
c) Usando-se NaOAc como agente de deslocamento, não foi observado efeito
batocrômico da Banda II, indicando a ausência de OH livre em C- 7 (cf. FIGURA 15)
(MARKHAM,1982).
d) A combinação dos reagentes NaOAc e H3BO3, não produziu nenhum efeito
batocrômico da Banda I, o que era esperado se existissem grupos orto dihidroxi no
anel B, cf. FIGURA 17 .
Os dados espectroscópicos obtidos a partir do Espectro de Ressonância
Magnética Nuclear Protônica (HRMN, CDCl3 , TMS, 300MHz, ppm) foram definitivos
à elucidação estrutural de C1. O espectro apresenta absorções apenas em um
campo magnético baixo, a partir de 3,00 ppm. Em 3,88 ppm e 4,00 ppm foram
observados 2 singletes com 3 prótons cada, característicos de metoxila, um par de
dubletes com J de 3 Hz são característicos de prótons em C-6 (6,37 ppm) e C-8
(6,49 ppm) (MABRY,1970). Um singlete centrado a 6,58 pm, referido anteriormente,
e típico de próton em C-3, portanto de flavonas. Finalmente um par de dubletes com
J de 8 Hz (sistema AA’BB’), caracteriza a substituição no anel B, e se devem aos
prótons em 3’, 5’ (7,00 ppm) e 2’ ,6’ (7,50 ppm) (cf. FIGURA 18). Todos esses dados
estão plenamente de acordo com as estrutura 5-hidroxi-7,4’-dimetoxiflavona (cf.
FIGURA 19), esta substância não tão difundida, ocorre em Baccharis rhomboidalis
Remy, uma Asteraceae (SILVA,1971).
FIGURA 19 - 5-hidroxi –7,4’ - dimetiléter flavona (Molécula C1)
2.7.2.2 Caracterização da Molécula E2
A molécula codificada como E2 apresentou um espectro de absorção na
região do ultravioleta com λmáx.(MeOH) nm : 270, 282 e 344, cf. FIGURA 20. Estas
absorções estão na faixa esperada para flavonas (250-280 nm, Banda II) e (310-350
nm, BandaI). A coloração verde musgo da fluorescência desta molécula à luz
ultravioleta (365 nm), quando um seu cromatograma é revelado com
Difenilborinatodiamino2etila (NEU), mostra que se trata de flavona ou flavonol com
um único substituinte em C-4’ (BRASSEUR & ANGENOT,1986), seria portanto um
esqueleto do tipo apigenínico (flavona) ou quempferólico (flavonol). Após adição de
reagentes de deslocamento, outras absorções no ultravioleta foram obtidas:
a) O tratamento com NaOMe determinou um efeito batocrômico de 60 nm na banda I
(344 - - 404)(cf. FIGURA 21), indicando uma hidroxila em C-4’ livre, pois não houve
diminuição da intensidade ou redução contínua da intensidade (decomposição),
afastando a possibilidade de existência de 3,4’ OH, grupos o-dihidroxi no anel A ou 3
hidroxilas adjacentes no anel B (tipo Miricetina). Afastando-se também a
possibilidade de uma hidroxila em C-3 com hidroxila substituída em C-4’
(MABRY,1970).
b) O tratamento com reagente NaOAc provocou um leve efeito batocrômico (270 --
273) de apenas 3 nm (cf. FIGURA 22). Isto indica a inexistência de uma hidroxila
livre em C-7, ao mesmo tempo em que aponta para a existência de substituintes
oxigenados em C-6 ou C-8. A combinação dos reagentes Acetato de Sódio e Ácido
Bórico, não produziu nenhum efeito batocrômico (cf. FIGURA 25), indicando a
inexistência de grupos de o-dihidroxi no anel B (MABRY,1970).
c) O tratamento com AlCl3 determinou um efeito batocrômico de 42nm (344 - - 386)
(cf. FIGURA 23), mostrando e reforçando a existência de uma hidroxila em C-5. Um
efeito ainda maior seria esperado se houvesse a possibilidade de se ter uma
hidroxila em C-3, com ou sem 5-OH. A adição do àcido clorídrico ao AlCl3 não
provocou alterações no espectro,o que era esperado se existissem hidroxilas
vizinhas no anel B (cf. FIGURA 24).
O Espectro de Ressonância magnética Nuclear Protônica (HRMN, CDCl3,
TMS, 300MHz, ppm) foi elucidativo (cf. FIGURAS 26 e 26.1):
a) O espectro não mostrou absorções abaixo de 3,00 ppm, há um grupo de
singletes a 4,37ppm, cuja integração indica tratar-se de três metoxilas. A inexistência
de um singlete correspondendo a 1 próton entre 6,5 ppm e 6,8 ppm, elimina a
possibilidade de ser uma flavona (MABRY,1970).
b) A inexistência de absorções entre 6,00 ppm e 7,00 ppm, exclui a presença de
prótons no anel A. O padrão de substituição no anel B deve permitir uma franca
interação entre seus prótons para manter a simetria dos mesmos, portanto do tipo
AA’ e BB’, com uma hidroxila em C-4’, levando a dois dubletes centrados em 7,51
ppm (H-5’), 7,53 ppm (H-3’), 7,70 ppm (H-6’) e 7,72 ppm (H-2’) (MABRY,1970;
HARBORNE,1975).
A estrutura dessa molécula, considerando os dados do ultravioleta, é
consistente com o flavonol 5,8,4’ – trihidroxi- 3,6,7 trimetiléter (cf. FIGURA 27), esta
molécula, ainda não foi referenciada na família Asteraceae, .segundo nossa busca
em literatura pertinente.
FIGURA 27 – 5,8,4’-trihidroxi-3,6,7-trimetiléter flavonol (Molécula E2)
2.7.2.3 Caracterização da Molécula B
O Espectrômetro de Massas (EM) desse composto (cf. FIGURA 29),
apresenta um íon molecular (M+) a 468 m/z, com um pico base a 218 m/z. Este
último fragmento é diagnóstico, pois resulta de uma reação Diels-Alder inversa, a
partir do pico pai, como descrito na literatura (DJERASSI et al,1962; BUDZIKIEWICZ
et al,1963). Os outros fragmentos mais importantes e que reforçam a estrutura da
molécula são aqueles m/z 203 e 189 m/z (cf. FIGURA 30), todos em consonância
para o esperado de um composto triterpênico da série do oleanano, como descrito
pelos autores citados.
O Espectro de Infravermelho da Molécula B, caracteriza-se pela presença de
absorções entre 2853 e 2923 cm-1. correspondendo a estiramento simétrico e
assimétrico dos grupos CH, CH2 e CH3. Absorção a 1733 cm –1, corresponde a
absorção da carbonila de um éster (cf. FIGURA 31). A absorção em 1459 cm-1 é
uma deformação angular simétrica no plano de CH2. Absorção a 1376cm-1, se deve
a vibrações de deformação angular fora do plano, simétrica e assimétrica, do
metileno.
A confirmação final pode ser feita com base no Espectro de Ressonância
Magnética (HRMN, CDCl3, 300MHz, ppm). Este se enquadra perfeitamente no
esperado para moléculas triterpênicas. A região entre 0,70 ppm e 2,00 ppm contém
invariavelmente sinais intensos produzidos pelos grupos metilenos e metila.
Observam-se singletes correpondentes a metilas em 0,78 ppm; 0,80 ppm; 0,83 ppm;
0,85 ppm; 0,87ppm; 1,25 ppm; 1;58 ppm; 1,68 ppm e 2,04 ppm. Em 4,49 pm é um
multiplete, o próton do C-3. Em 5,15 ppm, há um dublete correspondendo aos
prótons de dupla ligação. O espectro HRMN da molécula B é apresentado na
FIGURA 32. A possível estrutura, considerando os dados acima relatados é, para o
Acetato de β - Amirina (cf. FIGURA 33). Essa substância, embora comum nos
vegetais superiores, não tinha sido ainda referenciada em V. brasiliana.
OCH3
O
OCH3
O
H
H
m/z 468
m/z 189 m/z 218m/z 203
+ -CH3 (C - CH3 + 2H)
-
+.
+
. +
0
250 u.m.a
FIGURA 30 - Principais fragmentos no Espectro da Molécula B
100 % 44 % 62 %
FIGURA 31 - Espectro de Absorção na região do Infravermelho da Molécula B
FIGURA 32 - Espectro de HRMN, CDCl3 , TMS, 300 MHz da Molécula B
FIGURA 33 – Estrutura do Acetato de β - Amirina.
Capítulo II : Atividade Biológica de Vernonia brasiliana (L.) Druce
1. Atividade Antimicrobiana
1.1 Revisão da Literatura
Membros da família Asteraceae, notadamente do gênero Vernonia, Eremanthus
e Eupatorium, devido a sua rica composição em lactonas sesquiterpênicas,
triterpenos e flavonóides, são importantes fontes bioativas contra fungos e bactérias.
Registros não tão recentes deram conta de que folhas de Vernonia brasiliana,
centro de nossos estudos, continha uma molécula ativa contra Staphylococcus
aureus, e igualmente contra bacilos Gram positivos, Gram negativos e leveduras de
interesse médico (D`ALBUQUERQUE et al, 1961).
No livro “Plantas do Nordeste, Especialmente do Ceará”, consta que o
cozimento das folhas, banhos ou loções, é recomendado para o reumatismo
inflamatório (BRAGA,1976).
Testemunho com outras espécies de Vernonia, relata a atividade inibitória contra
Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, e fraca atividade frente o
Aspergillus flavus (CHEN et al,1987).
Dezenove espécies dos gêneros incluindo Vernonia, Eremanthus e Eupatorum
foram testadas contra Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, e seis espécies foram ativas contra os fungos: Candida albicans,
Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Cladosporium sphaerospermum.
Dentre as espécies avaliadas, aquelas dos gêneros Vernonia e Eremanthus
mostraram as melhores atividades (DAVINO et al,1989).
Atividades antifúngicas foram também notadas quando extratos de folhas e
caules de espécies de Vernonia eram testadas contra Aspergillus flavius, A.
parasiticus, A . ochracus, A. fumigatus, Penicillium citrinum e Fusarium sp,
produtores de micotoxinas (FREIRE,1995).
Diante desses relatos, ensaios com extratos e diversas partes de V. brasiliana
foram testados frente a microrganismos Gram positivos, Gram negativos e
leveduras. Alguns destes microrganismos estão depositados na Coleção de Culturas
Microbianas do Departamento de Antibióticos e outros foram isolados da clínica
médica.
1.2 Materiais e Métodos
1.2.1 Microrganismos
Para a determinação da atividade antimicrobiana foram utilizados
microrganismos Gram positivos, Gram negativos, Bacilo Gram negativos e leveduras
pertencentes ao gênero Candida..
Cocos Gram positivos: Micrococcus flavus –DAUFPE (323);
Staphylococcus aureus - IC (133 e 138);
Bacilo Gram negativo: Proteus mirabilis - IC (03) .
Fungos Leveduriformes: Candida albicans -DAUFPE (1007);
Candida krusei -DAUFPE (1002);
Candida albicans IC (01 a 09).
1.2.2 Solventes e Padrões Primários
Ø Metanol , Clorofórmio, Acetato de Etila, Benzeno e Hexano
Ø Padrões de Antibióticos Fúngicos testados: Nistatina (Potência 4800 UI/mg) e
Anfotericina B (Potência 850 µg).
1.2.3 Meios de Cultura
Ø Ágar Mueller Hinton (Oxoid);
Ø Caldo Mueller Hinton (Oxoid);
Ø Ágar Saboraud (Oxoid) e;
Ø Caldo Saboraud (Oxoid).
1.2.4 Extratos Vegetais
Ø Extrato bruto metanólico das sépalas -EMS (5% p/v);
Ø Extrato bruto metanólico do caule - EMB (5% p/v);
Ø Extrato bruto metanólico da raiz – EMR (5% p/v);
Ø Extrato bruto com acetato de etila da flor seca – EATF (5% p/v);
Ø Extrato bruto metanólico das folhas – EMF (5% p/v);
Ø Extrato bruto benzênico das folhas – EBF (5% p/v);
Ø Fração terpênica (FT) das folhas : molécula B (18mg/mL) em
benzeno:acetato de etila (1: 1v/v) e;
Ø Frações flavonóidicas (FF) das folhas: Molécula C1 (15mg/mL) e Molécula E2
(11mg/mL) em hexano : clorofórmio (13:7v/v) e clorofórmio : acetato de etila
(17:3 v/v), respectivamente.
1.3 Metodologia
A atividade Antimicrobiana das moléculas foi avaliada pelo Método de Difusão
em Meio Sólido (Bauer & Kirby ,1966), calcado na inibição do crescimento de um
microrganismo semeado na superfície do meio de cultura em torno de um disco de
papel de filtro impregnado com a droga. O método indica se o microrganismo tem
alguma sensibilidade ou é resistente a uma determinada substância numa
concentração conhecida (MOURA et al., 1992).
Na padronização dos inóculos microbianos, bem como para a manutenção e
avaliação das atividades, foram empregados os meios líquidos e sólidos de Müller-
Hinton e Saboraund, para bactérias e leveduras, respectivamente.
1.3.1 Preparação dos Extratos Brutos
As partes do vegetal (caule, sépalas, raiz, flor seca e folhas), foram
submetidas a infusão com metanol, acetato de etila e benzeno, sob agitação durante
30 minutos. As alíquotas foram reservadas para os testes (c.f item 1.2.4). A molécula
terpênica B e flavonoídicas (C1 e E2), foram obtidas por meio de ensaios
cromatográficos (itens 2.7 e 2.8). Para verificar a ação dos solventes sobre os
microrganismos, foram realizados controles (brancos) com Metanol, Benzeno e
Acetato de Etila.
Os padrões antibióticos utilizados, Nistatina e Anfotericina B, foram
solubilizados segundo literatura pertinente (FARM. BRÁS. IV), as concentrações
finais corresponderam a 1mg/mL.
1.3.2 Preparação dos Inóculos Microbianos
As culturas foram inoculadas em Caldo Müeller-Hinton e Sabouraund,
incubadas a 37ºC por 24 horas. Os inóculos foram padronizados com água
esterilizada, cuja turbidez correspondeu ao tubo 0,5 da escala de MacFarland, o que
equivale a 108 unidades formadoras de colônias (UFC/mL).
1.3.3 Semeio
Suspensões padronizadas dos microrganismos foram semeadas por
esgotamento em placas de Müeller-Hinton e Sabouraund com swabs estéreis. Sobre
os discos de papel, de 6 mm de diâmetro e peso de 30 mg ± 4 cm2 , foram pipetados
20 µL dos extratos ou das soluções de B, C1 e E2. Os discos foram secos, para
total eliminação dos solventes e depositados sobre os meios previamente
semeados, em seguida foram incubadas a 37ºC/24 horas (ACAR et al., 1996;
COURVALIN et al.,1985).
1.3.4 Leitura
Após incubação durante 24 horas, as leituras dos diâmetros dos halos de
inibição em torno dos discos contendo as amostras foram efetuadas com o auxílio de
régua milimetrada. Sendo considerado como padrão de sensibilidade os halos de
inibição iguais ou superiores a 10 mm.
1.4 Resultados e Discussão
Os extratos brutos de algumas partes do vegetal, foram selecionados para uma
avaliação da atividade antimicrobiana frente a bactérias Gram positivas, Gram
negativas e fungos leveduriformes, os resultados obtidos são apresentados na Tab.
1.
As moléculas flavonoídicas, obtidas das folhas, e os padrões antifúngicos de
referência, foram submetidos a ensaios de atividade antimicrobiana. Inicialmente
houve uma avaliação do perfil de inibição das moléculas, a partir dos resultados
obtidos, os padrões referenciados foram submetidos ao mesmo modelo de ensaio, a
fim de compararmos os resultados. Os resultados obtidos são apresentados na Tab.
2 e ilustrados nas FIGURAS 34 e 34.1 .
TABELA 1 – Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Vernonia brasiliana
Halos de Inibição (mm) Cepas EMS 5% EMC 5% EMR 5% EMF 5% EBF 5% EATF 5%
Staphylococcus
aureus 133
08 08 (-) 10 08 08
Staphylococcus
aureus 138
10 10 (-) 12 08 08
Micrococcus
flavus 323
20 13 10 18 10 (-)
Proteus mirabilis
03
(-) (-) (-) 09 08 07
Candida albicans
1007
08 (-) (-) (-) (-) (-)
Técnica de Difusão em Agar (-) = ausência de inibição; EMS (extrato bruto metanólico das sépalas); EMC (extrato bruto metanólico do caiule); EMR (extrato bruto metanólico da raiz); EMF (extrato bruto metanólico das folhas); EBF (extrato bruto benzênico das folhas) e EATF (extrato bruto com acetato de etila da flor seca). Observação : solventes utilizados não apresentaram inibição.
Analisando a Tab. 1 observa-se que em relação a atividade antimicrobiana
dos extratos brutos de folhas, raízes, sépalas e flores sobre as cepas testadas, o
extrato bruto metanólico das folhas apresenta melhor atividade inibitória.
TABELA 2 – Atividade Antimicrobiana dos Flavonóides C1, E2 , Nistatina e
Anfotericina
Halos de Inibição (mm) Cepas FF C1
(30 µg/ mL)
FF E2
(22 µg/ mL)
Nistatina
(25 µg/ mL)
Anfotericina B
(17 µg/ mL)
Staphylococcus
aureus 133
09 (-) NT NT
Staphylococcus
aureus 138
(-) 09 NT NT
Micrococcus
flavus 323
(-) 10 NT NT
Proteus
mirabilis 03
(-) (-) NT NT
Candida krusei
1002
18 22 NT NT
Candida
albicans 1007
17 23 21 16
Candida
albicans -IC 01
08 10 17 16
Candida
albicans -IC 02
10 12 20 15
Candida
albicans –IC 03
08 13 20 17
Candida
albicans -IC 04
09 14 20 16
Candida
albicans IC 05
09 18 35 35
Candida
albicans -IC 06
09 10 21 16
Candida
albicans -IC 07
09 11 17 17
Candida
albicans -IC 08
09 13 22 16
Candida
albicans -IC 09
11 13 21 17
Técnica de Difusão em Agar (-) = ausência de inibição FF = fração flavonoídica; IC = isolado clínico; NT = Não testado
A tabela 2 mostra que as moléculas dos flavonóides apresentaram para
alguns microrganismos atividades relevantes, notadamente aquelas desenvolvidas
por E2. A referida molécula apresentou um halo de inibição de 23mm sobre a
Candida albicans (DAUFPE 1007) superior aos padrões antifúngicos testados. A
molécula terpênica não foi referida por não apresentar em análise anterior atividade
antimicrobiana e antifúngica diante das cepas testadas.
FIGURA 34 - Atividade antifúngica das frações flavonoídicas sobre Candida albicans (DAUFPE 1007 e IC) e Candida krusei Legendas : A = CA – IC 02; B = CA- IC 04; C = CA –IC 03; D = CA – IC 07;
FIGURA 34.1 - Atividade antifúngica das frações flavanoídicas sobre Candida albicans (DAUFPE e IC) e Candida krusei (DAUFPE) Legendas : E = CA-IC 05; F = CK 1002; G = CA 1007; H = CA-IC 09; I = CA-IC 08.
2. Atividade Farmacológica
2.1 Revisão da Literatura
A farmacoetnologia de espécies de Vernonia, está associada em muitos países,
sobretudo, a problemas gastrointestinais, estomacais, cicatrizantes,
antiinflamatórios, antipiréticos, dentre outros (Base de Dados NAPRALERT, 2003).
Nesse domínio, poucos relatos estão dirigidos a V. brasiliana. De fato, as
informações mais detalhadas de seu emprego na medicina popular, estão
registradas no livro do professor Getúlio César, da Universidade Federal Rural de
Pernambuco, escrito há mais de cinco décadas e do qual transcrevemos, ipsis
litteris, o que nos pareceu mais relevante: “o suco das suas folhas bem pisadas,
coado, é um esplêndido remédio para cólicas hepáticas. O doente que dessa
medicação se utiliza sente a dor, depois de alguns minutos, ir fugindo e desaparecer
por encanto, deixando a pessoa livre, por muitos meses, de tão dolorosa angústia.”
“As raízes e folhas cozidas ou em chás tem, no interior, grande aplicação
em casos de hemorragia. Daí o seu batismo., por caboclos agradecidos, de
Tramanhem. Para defluxos e corizas fortes, as flores e folhas, em chá, opera
milagre, até para derrame pulmonar”.
“Pessoas que se machucam e ficam cheias de dores encontram, no sumo do
Tramanhem, bebido, e no cozimento de' suas folhas e ramos, alívio certo quando
banha com essa tisana a parte molestada ”.
“As folhas novas, as das sumidades do vegetal, são aproveitadas pelos nossos
matutos para curar belides e outras moléstias da vista. Operam da seguinte maneira:
as folhas novas colhidas, depois de bem lavadas, para as livrar da poeira, em água
bem limpa, são amarradas pelos pecíolos para formar um pequeno molho; em um
frasco de boca larga e um tanto espaçoso se dependura, pela rolha, o molhinho das
folhas de modo que não toque no vidro. Isso feito, se expõe o frasco sob os raios
diretos do sol para destilar, como dizem. Com o calor e a irradiação solar opera-se,
nas folhas ainda vivas, a transpiração e a clorovaporização, sendo a água nelas
contidas expulsa dos tecidos para se depositar no fundo do frasco. Depois as
folhinhas murchas são retiradas e a água que delas saiu guardada para servir de
colírio “.
“Em caso de Pterígio, que é o espessamento da conjuntiva em forma triangular,
cujo vértice procura cobrir a córnea, uma gota do suco das folhas depois de bem
coado em pano bem fino, pingado em cada olho é o remédio pelos roceiros
procurados com resultados surpreendentes. Afirmam eles que a membrana que
tenta cobrir o globo ocular, com essa intervenção, será destruída, desaparecendo
totalmente em poucos dias se o doente insistir em usá-lo metodicamente”. E
arremata, aquele autor, finalizando: “No domínio da veterinária o Tramanhem tem
entrada: as folhas bem machucadas em um pouco de água, depois de coada, a
golda é aplicada em forma de clister nos casos de cólicas e câmara de sangue dos
eqüinos com resultado positivo e imediato” (CESAR, 1956).
No que se refere à toxicidade do gênero, há registro de umas poucas espécies
que contêm um glicosídeo cardiotônico, sendo abortiva em caso de um uso
prolongado das mesmas (MARTINS,2000)
2.2 Materiais e Métodos
2.2.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus var. albinus , de ambos os
sexos, com aproximadamente 2 meses (200 – 300g) e, camundongos Mus
musculus, ambos os sexos, com aproximadamente 2 meses (20 – 30g), todos
oriundos dos biotérios do Instituto de Antibióticos, Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da UFPE e Centro de Pesquisa Ageu Magalhães –UFPE. Os animais
receberam água e dieta ad libitum e foram mantidos em condições controladas de
iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e temperatura 25 ± 2ºC.
2.2.2 Extratos Vegetais
Foram utilizados resíduos de extratos brutos metanólicos das folhas de
Vernonia brasiliana (20%), suspensos em água.
2.2.3. Drogas e Reagentes
Ø Cloreto de Sódio a 0,9% (salina);
Ø Carragenina;
Ø Indometacina;
Ø Tween 80 e;
Ø Mepiridina.
2.2.4 Equipamentos e Materiais
Ø Plestimômetro;
Ø Banho – Maria;
Ø Cronômetro;
Ø Becker;
Ø Balança semi-analítica;
Ø Balança Analítica;
Ø Bastão de Vidro e;
Ø Seringas Descartáveis.
2.3 Metodologia
2.3.1 Experimentos in vivo
2.3.1.1 Observações Gerais e Toxicidade Aguda
As observações dos efeitos gerais do extrato do vegetal nas doses de 0,25 a
2,0g/kg por via intraperitoneal foram realizadas em camundongos de ambos os
sexos. Os animais foram distribuídos em grupos de 6, onde um dos grupos recebeu
salina 0,9% (controle).
Após a administração das amostras, os animais confinados e dispostos em
uma superfície plana, foram observados durante 240 minutos. Posteriormente foram
realizadas observações a intervalos regulares, durante 7 dias. Os efeitos de
alterações na postura, motilidade, depressão, frequência respiratória, sedação, entre
outros, foram anotados segundo os critérios propostos por MALONE (Malone,1977).
2.3.1.2 Atividade antiinflamatória
Inflamação aguda induzida por carragenina : Foi utilizado o teste de edema da
pata de ratos, induzido por carragenina (Winter,1962). O efeito antiinflamatório foi
comparado com o da Indometacina (10mg/ kg) e aquele do extrato vegetal nas
doses de 500 mg e 1000mg/ kg de peso por via oral.
2.3.1.3 Atividade Antiálgica
A ação analgésica do resíduo do extrato metanólico, dissolvido em água, foi
determinado pelo método da Placa Quente (Eddy e Leimbach,1953). Este consiste
em colocar o animal sobre uma placa de alumínio aquecida em banho-maria à
temperatura constante de 55ºC. A resposta ao estímulo térmico, medida em
segundos, corresponde ao lamber das patas ou andar em círculos. A reatividade dos
camundongos medida aos 20 minutos e imediatamente antes da administração das
drogas serve como controle. Após injeção intraperitoneal da amostra nas doses de
500mg e 1000mg/ kg, a reação ao calor foi novamente medida por 01 hora, 02 horas
e 03 horas. Miperidina (30mg/ kg) e salina a 0,9% foram utilizadas como droga
referência e controle, respectivamente.
2.4 Resultados e Discussão
2.4.1 Observações Gerais e Toxicidade Aguda .
Os testes de atividade geral em camundongos tratados com extrato de V.
brasiliana (0,25 /kg a 2,0g /kg) não revelaram qualquer alteração que os
diferenciassem dos animais controle durante os 07 dias de observação, sugerindo,
ausência de toxicidade aguda nas doses empregadas.
2.4.2 Atividade Antinflamatória
O extrato do vegetal não mostrou atividade antiinflamatória quando
administrado por via oral nas doses de 500mg /kg e 1000mg /kg.
2.4.3 Atividade Antiálgica
Quando administrado por via intraperitoneal nas doses de 500mg/kg e
1000mg/kg, o extrato do vegetal não apresentou atividade antiálgica.
3 Conclusão Geral
Os estudos realizados com a espécie Vernonia brasiliana propiciou o
conhecimento de aspectos farmacobotânicos, farmacoquímicos e relacionaram as
atividades biológicas (antimicrobiana e farmacológica), ainda pouco abordadas.
O estudo farmacobotânico forneceu importantes atributos diagnósticos para a
espécie em tela, ressaltando-se: a) dois tipos de tricomas, um não glandular com 2
braços ornados de pendúnculo em forma de T e outro, glandular, 1-pendúnculo, 1-
cabeça, ambos abundantes na epiderme foliar inferior; b) existência de faixa
descontínua de fibras agrupadas no cilindro vascular das raízes; c) parênquima
medular do caule com células de dois tamanhos.
Na análise farmacoquímica das folhas, predominaram a existência de
metabólitos terpênicos e polifenólicos (flavonóides), salientando a identificação de
três moléculas, um triterpeno, um flavonol e uma flavona. A primeira molécula bem
difundida nos vegetais superiores trata-se de um triterpeno do grupo oleanano. A
flavona de distribuição bem mais restrita, anteriormente constatada em outro táxon
de Asteraceae e um flavonol, para o qual esta parece ser a primeira descrição nessa
família.
O estudo da atividade biológica mostrou que o extrato bruto metanólico das
folhas é desprovido de toxicidade aguda, da mesma forma que não foram
evidenciadas propriedades antinflamatória e antiálgica nas doses analisadas. Em
relação à atividade antimicrobiana, tanto o extrato referido como as frações
flavonoídicas, apresentaram resultados relevantes com halos de inibição entre 18 e
23 mm de diâmetro, frente às cepas de Candida albicans (DAUFPE e Isolados
Clínicos) e Candida krusei, leveduras responsáveis por diversas infecções
sistêmicas em pacientes graves e ou imunodeprimidos; ressaltando que a molécula
E2 (flavonol) apresentou um halo de inibição de 23 mm sobre a Candida albicans,
superior ao padrão do antibiótico testado, Anfotericina B, considerado como uma das
melhores drogas antifúngicas.
R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S
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XAVIER, H. S., Comunicação Pessoal, Recife, 2001.
ANEXOS
ANEXO A – CARTA DO DR. NESTOR O . CAFFINI RELATIVA A ACEITAÇÃO E PUBLICAÇÃO DO ARTIGO NA REVISTA ACTA FARMACÊUTICA BONAERENSE.
A Scientific Journal of the College of Pharmacists of the Province of Buenos Aires, Argentina
Publicación científica del Colegio de Farmacéuticos de la Provincia de Buenos Aires, Argentina Calle 5 Nª 966, La Plata 1900, Argentina. Tel. (54 221) 429 0900
http://www.colfarma.com.ar/afb/index.html
La Plata, 13 de junio de 2003 Lúcia Roberta de Souza Filizola Departamento de Ciências Farmacêuticas, Laboratório de Farmacognosia, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Arthur de Sá, S/N, 50740-521- Recife - PE- Brasil
E-mail: lufilizola@hotmail.com Ref.: AFB 71503
Estimada Dra. Filizola:
Tengo el agrado de dirigirme a usted con el objeto de poner en su conocimiento que la nueva versión de su trabajo “Anatomia dos Órgãos Vegetativos de Vernonia brasiliana (L.) Druce”, de Lúcia R. de S. FILIZOLA, Rejane PIMENTEL, Karina P. RANDAU & Haroudo S. XAVIER, es aceptable para ser publicado en Acta Farm. Bonaerense. Oportunamente le remitiremos por correo electrónico un archivo PDF con la prueba de imprenta para que proceda a su revisión.
Quedo a la espera de la nueva versión del manuscrito, de acuerdo a las
sugerencias del árbitro. Al tiempo de agradecer su colaboración, hago propicia la oportunidad para saludarla con las expresiones de mi mayor consideración.
Dr. Néstor O. Caffini, Editor E-mail: caffini@biol.unlp.edu.ar
Anexo B - Normas da Revista Acta Farmacêutica Bonaerense
Disponível em < http:// www.colfarma.org.ar/afb> Acesso em : 30/08/2003.
Acta Farmacéutica Bonaerense considerará a publicação de contribuições vinculadas direta ou indiretamente às Ciências Farmacêuticas, na forma de trabalhos originais, comunicações curtas, atualizações, revisões, notas ao Editor, etc. Os trabalhos deverão ser enviados ao Editor, Acta Farmacéutica Bonaerense, Calle 5 Nº 966, 1900 La Plata, Argentina, em duas vias e escritos em espaço duplo. Juntamente com as duas cópias do manuscrito, os autores deverão enviar uma versão em disquete de 3 ½ " contendo os arquivos correspondentes em Word ou Word Perfect for Windows. Serão aceitos manuscritos em espanhol, português e inglês.
A apresentação deverá seguir as seguintes regras gerais:
a) Na margem superior direita deverá constar a numeração da página e o nome do autor a quem a correspondência deverá ser enviada.
b) O Título deverá fornecer, da forma a mais concisa possível, informações claras sobre conteúdo do trabalho. Se o trabalho estiver escrito em espanhol ou português, deverá incluir uma tradução do título em inglês. Se o trabalho estiver escrito em inglês, o título deverá ser acompanhado de uma tradução em espanhol.
c) Abaixo do título deverá constar o primeiro nome completo e sobrenome de cada um dos autores, com identificação (*) do autor para o qual a correspondência deverá ser enviada. Nas próximas linhas serão declarados os endereços postais dos autores.
d) A seguir será incluido um Resumo de aproximadamente 100 palavras. Se os trabalhos estiverem escritos em espanhol ou portugues, deverá ser incluido uma tradução do resumo em inglês (Summary). Se o trabalho está escrito em inglês o Summary deverá ser acompanhado de um resumo em espanhol.
e) Após o resumo deverão ser listadas ao menos três Palavras chaves em ordem alfabética, em espanhol ou português e em inglês (Key Words).
f) Na medida do possível, o trabalho deverá ser dividido em capítulos, sugerindo-se os seguintes títulos: Introdução, Material e Métodos, Resultados, Discussão e/ou Conclusões. Em continuação poderão ser incluídos os Agradecimentos.
g) As referências bibliográficas serão numeradas conforme a ordem em que são citadas no texto. A bibliografia deverá ser listada ao final do trabalho e ordenada numericamente abaixo do título Referências bibliográficas. As citação de periódicos1, monografias2, e livros3 deverão seguir exatamente os seguintes exemplos:
(1) Pazos, A., K.H. Wiederhold & J.M. Palacios (1986) Eur. J. Pharmacol. 125: 123-9
(2) Boelcke, O. (1992) "Plantas vasculares de la Argentina, nativas y exóticas", Ed. Hemisferio Sur, Buenos Aires, págs. 209-10
(3) Askhenazi, A. & G.E. Peralta (1994) "Muscarinic acetylcholine receptors", en "Hanbdbook of receptors and channels" (S.J. Peroutka, ed.), CRC Press, Boca Raton, Fda., Vol. 1, págs. 1-27
h) As tabelas e figuras serão numeradas, utilizando números árabicos, na ordem em que aparecem citadas no texto. O tamanho das letras e símbolos incluidos nas figuras devem ser estabelecidos em dimensão adequada, considerando que esses são habitualmente reduzidos ao tamanho de meia coluna (6.5 cm). Os títulos e texto de figuras e tabelas devem ser incluidos após as referências bibliográficas.
Os trabalhos recebidos serão remetidos aos consultores corespondentes, que avaliarão criticamente os manuscritos, cuja opinião será comunicada imediatamente ao autores. Se os consultores sugerirem correções, os autores deverão enviar a nova versão em duplicata, acompanhada de outro disquete contendo os arquivos correspondentes. Os trabalhos serão corrigidos em caso de conter erros sintáticos ou ortográficos. Acta Farmacéutica Bonaerense enviará, sem encargo aos autores, cinqüenta separatas de cada trabalho publicado.
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