View
1
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Ministério da Saúde
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
Escola Nacional de Saúde pública Sérgio Arouca
ENSP
Centro de Estudo da Saúde dos Trabalhadores e Ecologia Humana - CESTEH
Mestrado em Saúde Pública
Subárea Saúde, Trabalho e Ambiente
Área Temática Toxicologia
Avaliação de genotoxicidade de trabalhadores expostos à sílica
Aluno: Francisco José Guimarães Joca
Orientadora: Profa. Dra. Rita Mattos
Julho - 2009
ii
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Estudo da Saúde dos Trabalhadores e Ecologia Humana - CESTEH
Mestrado em Saúde Pública
Subárea Saúde, Trabalho e Ambiente
Área Temática Toxicologia
Avaliação de genotoxicidade de trabalhadores expostos à sílica
Aluna: Francisco José Guimarães Joca
Banca Examinadora:
Titulares:
Profa. Dra. Rita Mattos (CESTEH-ENSP-FIOCRUZ) - Orientadora
Profa. Dra. Paula de Novaes Sarcinelli (CESTEH-ENSP-FIOCRUZ)
Prof. Dr. Jaime Silva de Lima (UNIRIO)
Suplentes:
Prof. Dr. Moacelio V. Silva Filho (EPSJV-FIOCRUZ)
Prof. Dr. Sérgio Rabello Alves (CESTEH-ENSP-FIOCRUZ)
Julho - 2009
iii
"O estudo em geral, a busca da verdade e da beleza são domínios em que nos é consentido ficar crianças toda a vida”.
Albert Einstein
iv
AGRADECIMENTOS
• Agradeço a Deus por sua infinita Misericórdia e Amor em todas as dimensões de
minha vida.
• Aos meus Pais por terem me gerado, formado e me aturado até hoje.
• A toda a minha família, em especial meus avós, por representarem minhas
referências, raízes e princípios.
• À Fernanda, minha futura esposa, que tem sido muito mais que minha
companheira de caminhada, por seu amor, ajuda, carinho e resistência. E por
sua família que já considero também minha.
• À minha orientadora, Drª Rita de Cássia Oliveira da Costa Mattos, por ter sido a
pessoa que primeiro me recebeu nesta Escola. E que posteriormente me abriu
as portas de seu laboratório, onde me acolheu como aluno e membro de sua
equipe. Por sua confiança, por me orientar e formar até hoje, e por seus muitos
ensinamentos toxicológicos e não toxicológicos.
• Ao Laboratório de agrotóxicos, onde iniciei a caminhada nesta Escola. Ao Dr
Jefferson Oliveira Silva, e a querida Drª Paula Sarcinelli que me acolheram e
me orientaram neste momento.
• A esta Escola que muito me provocou como profissional e pessoa, que com toda
certeza colaborou muito em minha formação, apresentando e reafirmando
muitos valores da minha vida profissional.
• À queridíssima Drª Carmem Marinho por sua amizade, exemplo, estímulo,
formação e ensinamentos que caminham com aqueles que possuem o privilégio
de serem seus alunos e/ou amigos.
• Às professoras Drª Ana Maria Braga e Drª Élida Hennington por suas aulas,
ensinamentos e suas críticas mais que construtivas. A todos os docentes que
contribuíram nesta etapa da minha formação.
• À minha Orientadora de graduação Drª Jussara Lagrotta Candido que contribui
até hoje em minha formação.
• Ao Dr Adriano Caldeira (UERJ), sua aluna Drª Michele e à Drª Helena Zamith
(INCQS) pela disponibilidade, contribuições e trocas sobre a metodologia do
teste do Ensaio Cometa.
• Ao Dr Moacelio Veranio Silva por suas provocações contributivas e ajuda
providente.
v
• Ao Dr Hermano pela disponibilidade, e por dispor de seu tempo para o próprio
atendimento clínico dos trabalhadores avaliados no presente trabalho e a
leitura de exames dos mesmos.
• À equipe do ambulatório que muito colaborou na recepção e na avaliação
ambulatorial dos trabalhadores, especialmente a enfermeira Cristiana e Marisa,
e a Drª Patrícia que, além disso, disponibilizaram os prontuários destes.
• À minha companheira de graduação Maíra, sua chefe Drª Regina Amendoeira e
toda a sua equipe que, com visão institucional, nos deixaram muito à vontade
na utilização do seu microscópio de fluorescência, possibilitando a realização
deste estudo.
• Um agradecimento especial aos companheiros e amigos do Setor de Indicadores
de efeito, por todo apoio, ajuda, trabalho em equipe e convivência produtiva
em nosso setor: Mário, Murata, Ana Luiza, Carlúcio, Helena, Leandro,
Vinício, Isabele, Natália, Marcinha, Ely, Daniel, Simone, Daniele, Lucas e
Valéria.
• Aos companheiros do Laboratório de Toxicologia do CESTEH, como Amanda,
Dr Moacelio, Sayonara, Yvone, Alan, Telma, Fábio e todos os outros pela
constante troca e convivência.
• A todos os voluntários deste estudo, principalmente os trabalhadores expostos à
sílica que propiciaram a realização deste estudo.
• Aos funcionários do CESTEH que diretamente ou indiretamente contribuíram
para a execução deste trabalho e para a minha formação. Assim como a equipe
de ar condicionado que muito trabalhou para tentar manter condições
laboratoriais adequadas.
• Aos meus companheiros de mestrado, por esta produtiva e intensa etapa
construída, e também contínua.
• E finalmente aos meus amigos, sejam os que me acompanham por muitos anos
ou aqueles que descobri há não tanto tempo. Enfim, aqueles que já, há certo
tempo, encontro disponíveis para partilhar as alegrias e dificuldades da vida.
Como João Paulo, Raphael, Afrânio (pai-amigo), Ana Maria, Pe Francisco,
Alex, Jorge, Marcelo.
vi
RESUMO
A exposição ocupacional a poeiras de sílica está associada a diversos
efeitos adversos sobre o sistema respiratório dentre os quais é possível destacar a
pneumoconiose clássica, também conhecida como silicose. Espécies reativas de
oxigênio (EROs) são geradas diretamente pelo depósito de poeiras fibrogênicas no
tecido pulmonar. A produção contínua de EROs, ou sua ineficaz remoção, pode
impactar o sistema antioxidante, induzir estresse oxidativo e provocar danos
celulares nos pulmões. Diferentes estudos em matrizes biológicas apontaram o
Ensaio Cometa como um indicador altamente sensível para a exposição a agentes
carcinógenos e extremamente sensível para uma variedade de classes de danos ao
DNA. É um teste de genotoxicidade simples, de baixo custo, versátil, rápido e
extremamente sensível para qualquer população de célula eucariótica. O objetivo
deste estudo foi avaliar danos genotóxicos e alterações em enzimas do estresse
oxidativo decorrentes da exposição à sílica em trabalhadores expostos e não
expostos atendidos no Ambulatório de Pneumatologia Ocupacional do Centro de
Estudo da Saúde do Trabalhador e Ecologia Humana (CESTEH) da Escola
Nacional de Saúde Pública (ENSP/FIOCRUZ). Ensaio Cometa demonstrou ser um
método sensível e confiável na detecção de danos ao DNA, causados pela
exposição à sílica. Variações na atividade da enzima GST podem ser usadas para
estudos de silicose como um indicador biológico de efeito, pois estas mudanças
podem estar presentes precocemente nesta doença. Neste estudo foi confirmado o
risco dos pacientes silicóticos desenvolverem tuberculose. Isto demonstra quanto a
fisiopatologia desta doença pode impactar o sistema imunológico. O hábito de
fumar mostrou uma associação com o desenvolvimento da silicose e da
tuberculose. Nos trabalhadores expostos à sílica, a exposição ocupacional parece
sobrepujar um possível efeito do tabaco nos níveis dos indicadores enquanto que
em uma população não exposta à sílica o tabagismo mostrou-se impactante.
vii
ABSTRACT
The occupational exposure to silica dusts is associated to several adverse
effects on the breathing system and is possible to highlight the classic
pneumoconiose, known also as silicose. Reactive oxygen species (ROS) are
directly created by the deposit of fibrinogenic dusts on the lung tissue. The
continuous production of ROS, or their ineffective removal, can eliminate the anti-
oxidant system, induce oxidative stress and induce cellular damage in the lung.
Different studies in biological matrix pointed the Comet Assay as a highly
sensitive indicator for carcinogenic agents and extremely sensitive to several
classes of DNA damages. This method can be defined as a simple genotoxicity
assay, with low cost, versatile, rapid and extremely sensitive to any eukaryotic
cell. The aim of this study was to evaluate genotoxic damages and changes in
enzymes that play a role in oxidative stress due to silica exposure in exposed and
unexposed workers seen at the ambulatory of Occupational Pneumatology, part of
Worker’s Health and Human Ecology Study Centre (CESTEH), situated on
National School of Public Health, Oswaldo Cruz Foundation (ENSP/FIOCRUZ).
Comet Assay demonstrated to be a sensitive and realible method for detection of
DNA damage due to silica exposure. Changes on the GST activity can be used for
silicosis studies as an effect biomarker, since these changes may be present early
in this disease. In this report was confirmed the risk of silicotic patients in
developing tuberculosis. This confirms how the physiopathology of silicosis can
impact the immunological system. The tobacco addiction showed a positive
association with silicosis and tuberculosis. Among the workers exposed to silica,
the occupational exposure seems surpass a possible tobacco effect on the
biomarker levels whereas for a silica unexposed population the tobacco addiction
exhibited a significant impact.
viii
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 – Classificação das leituras de raios X em categorias de 0 a 3, conforme
as normas da OIT de 1980 (ILO,1980).........................................................24
Tabela 2 - Quantidade de reagentes para o branco e amostras (em microlitros)...29
Tabela 3 - Características sócio-demográficas do Grupo de Trabalhadores
estudado.....................................................................................................37
Tabela 4 - Níveis dos Indicadores Biológicos no grupo Exposto à sílica (grupo
sílica) e no grupo Laboratório (Grupo Laboratório).....................................42
Tabela 5 - Indicadores Biológicos avaliados dentro da população de trabalhadores
expostos à sílica.........................................................................................48
Tabela 6 - Indicadores Biológicos e o fator idade. ............................................. 49
Tabela 7 - Indicadores Biológicos e as diferentes categorias de Raio X..............51
Tabela 8 - Modelo de Regressão Linear com Variável Dependente: Log TNF .... 64
Tabela 9 - Tabela de Contingência com Trabalhadores Doentes e Não Doentes que
desenvolveram tuberculose.........................................................................65
Tabela 10 - Trabalhadores silicóticos e não silicóticos e o hábito tabagista........67
Tabela 11 - Quadro contendo os trabalhadores que já tiveram tuberculose, e que já
fumaram ou nunca fumaram........................................................................68
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema da resposta celular induzida pela sílica. ............................................ 11
Figura 2 – Danos Genotóxicos Primários e Secundários (adaptado de SCHINS, 2002). .. 17
Figura 3 – Danos Genotóxicos Primários e Secundários: causas e consequências. ........... 17
Figura 4 – Desenho esquemático da técnica de Ensaio Cometa. (Fonte:
http://www.inf.ufsc.br/~awangenh/temas.html) .......................................................... 19
Figura 5 – Imagem por microscopia de fluorescência da migração de DNA, no ensaio
Cometa. (MOTA et al., 2007)...................................................................................... 19
Figura 6 – Esquema das etapas iniciais do projeto durante o período de sua realização. .. 23
Figura 7 - Fotografia da classificação do ensaio Cometa. Classe 0, sem danos; B- classe
1;C- classe 2; D- classe 3; dano máximo. Fonte: Silva et al., 2000 ............................ 33
Figura 8 - Distribuição das categorias da doença (silicose) classificadas de acordo com o
Raio X por padrões técnicos da OIT (ILO, 1980) no grupo exposto à sílica. ............. 38
Figura 9 - Distribuição dos distúrbios respiratórios avaliados por espirometria no grupo
exposto à sílica ............................................................................................................ 39
Figura 10 - Distribuição dos Indicadores Biológicos Cometa UA, Cometa % e GST
(unidade) do Grupo Exposto à Sílica e do Grupo Laboratório......................43
Figura 11 - Distribuição dos valores do Cometa UA entre as categorias da doença
e no Grupo Laboratório..............................................................................52
Figura 12 - Distribuição dos valores da atividade de GST entre as categorias e o
Grupo Laboratório......................................................................................54
Figura 13 - Distribuição do Log de TNF nos Grupos de idade............................55
Figura 14 - Distribuição dos valores do Ensaio Cometa em relação ao hábito
tabagista no Grupo laboratório....................................................................58
Figura 15 – Correlação da atividade da GST e os níveis de TNF........................62
Figura 16 – Correlação do tempo de exposição à sílica e TNF............................63
x
ABREVIATURAS
AC – Aberrações cromossomiais
CAT - Catalase
CDC – Centro para Controle e Prevenção de Doenças
CDNB - 1 cloro 2-4 dinitro benzeno
CESTEH - Centro de Estudos da Saúde do Trabalhador e da Ecologia Humana
ENSP – Escola Nacional de Saúde Pública
ERN - Espécies Reativas de nitrogênio
ERO - Espécies Reativas de Oxigênio
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
GPx - Glutationa peroxidase
GSH - Glutationa
GST- Glutationa S-Transferase
IARC – Agência Internacional para pesquisa do Câncer
IFN - Interferon-gama
IL- Intreleucinas
MA – Macrófagos Alveolares
MMS - Metil-metanosulfonato
MN - Micronúcleo
MS – Ministério da Saúde
NIOSH – Instituto Nacional para Segurança Ocupacional e Saúde
NK- Células Natural Killer
OIT - Organização Internacional do Trabalho
OMS – Organização Mundial de Saúde
PT – Teste tuberculínico
xi
SCGE - Single-Cell Gel Eletrophoresis
SOD- Superóxido dismutase
SPC - Separação prematura centromérica
TNF-α- Fator de Necrose Tumoral alfa
UT – Unidade Tuberculínica
UA – Unidade arbitrária
xii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1
1.1 Sílica ........................................................................................................... 2
1.2 Exposição à sílica ......................................................................................... 2
1.2.1 Riscos de Exposição...................................................................................4
1.3 Silicose ........................................................................................................ 5
1.3.1 Caracterização da Silicose..........................................................................6
1.4 Mecanismos celulares e moleculares na silicose e exposição à sílica ............. 7
1.4.1 Resposta do Sistema Imunológico à presença de poeira de sílica.................8
1.5 Silicose e o Estresse Oxidativo ..................................................................... 9
1.6 Genotoxicidade da exposição à sílica .......................................................... 14
1.6.1 Indicadores Biológicos de Genotoxicidade................................................18
1.7 Ensaio Cometa ........................................................................................... 18
2 OBJETIVO ............................................................................................... 21
2.1 Objetivo geral ............................................................................................ 21
2.2 Objetivos específicos .................................................................................. 21
3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 22
3.1 População estudada .................................................................................... 22
3.2 Procedimentos de avaliação física e clínica ................................................. 23
3.2.1 Exame Físico e Entrevista........................................................................23
3.2.2 Exames Radiográficos do tórax................................................................24
3.2.3 Teste tuberculínico cutâneo......................................................................24
3.2.4 Teste espirométrico..................................................................................25
3.3 Coleta das amostras de sangue .................................................................... 25
3.4 Determinações dos parâmetros do estresse oxidativo ................................... 25
3.4.1 Catalase (CAT)........................................................................................25
3.4.2 Glutationa S-transferase (GST).................................................................27
3.5 Metodologia do Ensaio Cometa .................................................................. 29
3.6 Análise dos resultados ................................................................................ 33
3.7 Fator-alfa de Necrose Tumoral (TNF - α) .................................................... 33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 35
4.1 Caracterização da População de trabalhadores expostos à Sílica .................. 35
4.1.1 Clínica dos trabalhadores expostos à sílica...............................................37
xiii
4.2 Caracterização da população não-exposta (Grupo Laboratório) ................... 39
4.3 Avaliação da Exposição .............................................................................. 40
4.3.1 Expostos não-silicóticos x Expostos silicóticos.........................................46
4.3.2 Idade.......................................................................................................48
4.3.3 Estaleiro..................................................................................................49
4.4 Raio-X e categorias da doença .................................................................... 50
4.4.1 Ensaio Cometa.........................................................................................51
4.4.2 Catalase...................................................................................................52
4.4.3 GST.........................................................................................................53
4.4.4 TNF.........................................................................................................54
4.5 Hábito de fumar ......................................................................................... 56
4.5.1 Na População exposta à sílica...................................................................56
4.5.2 No Grupo Laboratório..............................................................................58
4.6 Correlações ................................................................................................ 59
4.6.1 Log TNF x Anos de Exposição à sílica.....................................................59
4.6.2 Idade x Anos de Exposição à sílica...........................................................59
4.6.3 GST x TNF normalizado por logaritimização (Log TNF)..........................60
4.7 Análises de Regressão Linear ..................................................................... 61
4.7.1 Modelo 1.................................................................................................62
4.7.2 Modelo 2.................................................................................................64
4.8 Tuberculose / Doença..................................................................................64
4.9 Tabagismo / Doença ................................................................................... 66
4.10 Tabagismo / Tuberculose...........................................................................67
4.11 Sensibilidade e Especificidade do Ensaio Cometa .................................... 68
5 CONCLUSÕES ......................................................................................... 70
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 71
Guimarães Joca, FJ 1
1 INTRODUÇÃO
Existem diferentes formas de particulados dispersos no ar, tais como
poeiras, névoas, fumos e neblinas. Todos eles, quando gerados nos ambientes de
trabalho, podem estar relacionados com doenças ocupacionais.
A sílica possui uma ocorrência natural extensiva e um amplo uso, sendo
atribuído a este particulado um papel de destaque na exposição ocupacional de
trabalhadores de diversas ocupações e em inúmeros setores produtivos. O termo
sílica refere-se aos compostos de dióxido de silício (SiO2) nas suas formas
cristalina, vítrea e amorfa. O dióxido de silício é o composto binário de oxigênio e
silício mais abundante da Terra 1.
Poeira é toda partícula sólida capaz de ficar em suspensão no ar, formada
por trituração ou outro tipo de ruptura mecânica de um material original sólido e
possuem diferentes naturezas, origens e tamanhos, geralmente são irregulares e
maiores que 0,5 micrometros 2.
As poeiras são consideradas importantes contaminantes do ambiente de
trabalho por estarem associadas a diversos tipos de doenças do sistema
respiratório. Podem causar diferentes efeitos à saúde humana, sendo absorvidas ou
reagindo com diferentes tecidos. Estes efeitos podem ser pequenas complicações,
maiores agravos ou até mesmo uma doença progressiva e letal, como algumas
pneumoconioses. A intensidade destes danos é relacionada com tamanho, forma,
propriedades químicas, densidade e concentração das partículas no ar, além de
fatores como o tempo de exposição 3.
Quando inaladas e, por conseguinte, em contato com os tecidos biológicos,
estas poeiras induzem uma reação celular que é dependente de sua composição. A
composição do particulado tem uma importante relação com os possíveis efeitos
tóxicos nos trabalhadores expostos. Entretanto, os mecanismos das respostas
biológicas desencadeadas pela exposição são variados e complexos 4.
Guimarães Joca, FJ 2
1.1 Sílica
Sílica é o nome de um grupo de minerais contendo silício e oxigênio,
representado por meio da fórmula geral SiO2. A sílica é uma substância
quimicamente inerte e pode ser de origem mineral, biogênica ou sintética.
Apresenta-se em forma livre, combinada com óxidos metálicos (formando-se
assim os silicatos) e em rochas.
A forma livre (SiO4) pode ser classificada como cristalina que é
quimicamente idêntica, apresentando diferenças apenas em sua estrutura.
Exemplos de formas cristalizadas são o quartzo, a cristobalita e a tridimita que
são as três formas mais importantes sob o ponto de vista da saúde ocupacional. O
α-quartzo é a forma cristalina de sílica mais estável termodinamicamente em
condições ambientais e também a mais abundante. A variedade de arranjos
estruturais que o quartzo pode apresentar resulta nas diferenças em suas
propriedades como solubilidade, características de clivagem, morfologia e
propriedades de superfície e podem ser um fator determinante na resposta
biológica 5.
A sílica cristalina é considerada carcinogênica, na forma de quartzo e de
cristobalita, em especial quando provenientes de fontes com exposições
ocupacionais. Quando sua superfície está recém-fraturada, a sílica cristalina torna-
se mais tóxica para as células do pulmão. As formas não cristalinas de sílica
(sílica amorfa) são consideradas de menor potencial fibrogênico, mas podem ter
suas estruturas transformadas em forma cristalina quando aquecidas a altas
temperaturas 6.
1.2 Exposição à sílica
Pneumoconiose é uma palavra de origem grega (conion = poeira) usada para
expressar pneumopatias relacionadas à inalação de poeiras em ambiente de
trabalho. As pneumoconioses são alterações patológicas pulmonares que impactam
o parênquima pulmonar e são mediadas por processos de hipersensibilidade, como
Guimarães Joca, FJ 3
alguns tipos de alveolites alérgicas, induzidas pela exposição às poeiras orgânicas 7.
As doenças respiratórias associadas à exposição ocupacional a sílica
cristalina foram descritas ao longo da história. Hipócrates, Ramazzini e Lohneiss
já haviam observado e descrito efeitos à saúde dos trabalhadores relacionados à
exposição à sílica. Hipócrates descreveu uma condição de "dificuldade
respiratória" em trabalhadores de minas e, em 1690, Lohneiss observou que,
quando "poeira e pedras alcançam os pulmões, os homens desenvolvem doença
pulmonar e respiram com dificuldade”. Segundo Greenberg 8, encontraram poeira
de sílica nos pulmões de mineiros e dez anos depois, Visconti utilizou o termo
"silicose" para descrever as doenças causadas pela exposição inalatória à sílica.
Tais agravos relacionados à exposição à poeira foram confundidos durante muito
tempo com outros termos, incluindo os termos tuberculose, doença de pedreiros,
asma, entre outros. Esta doença é considerada uma das mais freqüentes doenças
ocupacionais, seguida pela exposição ao tabaco presente no ambiente e à radiação
UV 9.
Segundo Steenland 10, cerca de 8000 pessoas morrem por ano de silicose em
todo o mundo. Ribeiro 11 destaca que o Brasil apresenta a maior prevalência de
trabalhadores expostos à sílica do que a encontrada em países europeus.
Entre os principais riscos encontrados nos ambientes de trabalho está a
exposição a poeiras, favorecendo o aumento de doenças do sistema respiratório. A
Organização Mundial de Saúde (OMS) afirma que o diâmetro aerodinâmico das
partículas está fortemente associado à habilidade que as partículas possuem para
penetrar e se depositar em diferentes locais do trato respiratório 12.
A exposição ocupacional a poeiras de sílica está associada a uma série de
efeitos adversos sobre o aparelho respiratório, dentre os quais se destacam a
bronquite crônica, certas desordens de tecido conjuntivo, autoimunidades, câncer
pulmonar e a pneumoconiose clássica, conhecida como silicose 13.
Esta doença exerce um papel de destaque em diversos programas de órgãos
internacionais relacionados à saúde e trabalho, pois acomete e mata inúmeros
trabalhadores. Um destes exemplos é o Programa de Eliminação Mundial da
Silicose, lançado em 1995 pela Organização Internacional do Trabalho (OIT) e a
Guimarães Joca, FJ 4
OMS, e visa diminuir drasticamente a prevalência desta doença em todo o mundo.
Através da adoção de diversas ações no campo da saúde coletiva, este programa
tem como objetivo principal a erradicação total desta doença até 2030 6.
Alguns fatores da exposição ocupacional á sílica devem ser considerados
tais como: composição da fração respirável, concentração de partículas em
suspensão, teor de sílica e tamanho destas partículas, presença de outros minerais
presentes em fração respirável e tempo de exposição à sílica. Além destes fatores,
a condição de saúde dos indivíduos expostos, como a integridade e efetividade das
respostas imunológica e a presença de outras patologias respiratórias, são bastante
importantes 3.
A poeira de quartzo quando inalada induz um processo inflamatório celular.
Em diferentes modelos de experimentação animal de “curta duração”, a exposição
à sílica por instilação traqueal induziu a formação de discretos nódulos silicóticos.
Esta exposição impede o clearance promovido pelos macrófagos alveolares
ocasionando lesões consecutivas e progressivas. Segundo a OMS, não existem
dados científicos da cinética do clearance de partículas de quartzo quando inaladas
e depositadas no pulmão de humanos. Um conjunto de fenômenos biológicos
ocorre após a instilação da sílica, sendo o estresse oxidativo o que está
relacionado com a capacidade das partículas de sílica de induzir citotoxicidade e
atividade fibrogênica. Estes mecanismos são os responsáveis pelos agravos
desencadeados pela exposição à sílica e estão envolvidos nos danos celulares
causados pelas partículas de sílica, são complexos e ainda não são completamente
conhecidos 3.
1.2.1 Riscos de Exposição
O risco da exposição à sílica é reconhecido desde a antiguidade, em
atividades como construção, mineração e produção de artesanatos e artigos
decorativos. Com o processo de crescimento industrial, o emprego da sílica e seu
consequente risco de exposição também aumentaram. O risco de exposição
ocupacional à sílica é encontrado em diversos ramos de atividade econômica e
diferentes processos de trabalho. Os principais exemplos são: operação de
Guimarães Joca, FJ 5
jateamento de areia; retífica; polimento e reparo de peças metálicas e minerais
com abrasivos contendo sílica; extração e beneficiamento de rochas; mineração de
metais e pedras preciosas; perfuração de poços; indústrias de cerâmica e de
materiais de construção; construção civil; fundições; fabricação de vidro, borracha
e fertilizantes; limpeza e manutenção de moinhos, fornos e filtros; confecção de
próteses dentárias.
A exposição ocupacional à sílica é grande tanto nos países em
desenvolvimento, como nos desenvolvidos embora nos países desenvolvidos exista
uma tendência a diminuir 14. No Estado do Rio de Janeiro, os trabalhadores
expostos são provenientes, em sua maioria, da área do jateamento da indústria
naval. Em menor número, temos trabalhadores autônomos, artesãos, vidraceiros,
metalúrgicos e indivíduos que exercem diversas funções em pedreiras.
1.3 Silicose
A silicose foi reconhecida como uma doença ocupacional já no início da
história da medicina ocupacional. É considerada como a pneumoconiose mais
prevalente no Brasil e no resto do mundo, principalmente nos países em
desenvolvimento 15.
A silicose é uma doença pulmonar incurável causada pela inalação, retenção
e reação pulmonar às partículas contendo sílica cristalina respirável. É
caracterizada pela fibrose do tecido pulmonar. Uma vez iniciada, a doença é
irreversível e geralmente progressiva. As partículas causam fibrose no tecido
pulmonar que reduz a capacidade do pulmão de captar oxigênio do ar 16.
Segundo, Fujimura 17, a susceptibilidade dos indivíduos expostos é um fator
que influencia no desenvolvimento da silicose, especialmente por causa dos
complexos mecanismos celulares e moleculares desta fisiopatologia que são
diferenciadas em especial pelas diversas expressões gênicas destes indivíduos.
Guimarães Joca, FJ 6
1.3.1 Caracterização da Silicose
Entre as pneumoconioses, a silicose se destaca por sua relevância e sua
maior freqüência. Esta complexa fisiopatologia pode ser classificada em três
formas clínicas com diferentes alterações histológicas e radiológicas. A silicose
pode ser abordada como aguda, subaguda e crônica 18.
A silicose crônica é considerada como a forma clássica da doença e pode se
desenvolver após 10-20 anos do início da exposição mesmo com uma exposição a
menores níveis de partículas. A silicose crônica é descrita de três formas: 1-
silicose simples: possui nódulos fibróticos difusos menores que 1 centímetro de
diâmetro e localizam-se nas partes altas do pulmão; 2- conglomerado de silicose
onde os nódulos tornam-se confluentes e substitui eventualmente o parênquima
pulmonar; 3- silicose massiva progressiva, uma lesão pouco comum composta de
nódulos silicóticos confluentes 19.
As partículas de sílica induzem uma reação intersticial reticuloendotelial
que começa pela ação dos macrófagos alveolares que as fagocitam, e as retém na
forma fagossômica. Como já citado, a mecanística de clearence dos macrófagos é
limitada diante das partículas de sílica. A exposição de macrófagos em cultura à
sílica acarreta a morte celular, porém os mecanismos da interação da sílica com a
célula, o destino do particulado e as causas da morte da célula ainda precisam ser
melhores elucidados 20.
A liberação das enzimas fagossômicas no citoplasma dá início a um
processo de morte celular que propicia a liberação das enzimas ativas e lipídeos
dos macrófagos, e os cristais de sílica que foram fagocitados. Estes lipídeos e
enzimas alcançam o sistema linfático na junção dos dutos alveolares, promovendo
a proliferação de células reticulares, promovendo a taxia de mais macrófagos e
fibroblastos para o local. Estas reações perpetuam-se juntamente com a exposição
contínua o que resulta na proliferação de fibras de colágeno, de reticulina e um
infiltrado inflamatório mononuclear que se dispõe em forma concêntrica,
caracterizando assim o nódulo silicótico. Dependendo da penetração dos cristais
de sílica pode ser induzida a formação de nódulos subpleurais, que podem atingir
a pleura visceral através principalmente dos vasos linfáticos.
Guimarães Joca, FJ 7
A histopatologia observada na silicose se compõe por nódulos silicóticos
peribronquiolares e perivasculares, com arquitetura birrefrigentes à luz polarizada.
Na progressão da doença crônica, os nódulos silicóticos tendem a se aglutinar
evoluindo para conglomerados de lesões maiores e posteriormente para sítios de
grande opacidade, podendo ter a deposição de fibrose como uma cicatriz na área
de parênquima pulmonar destruída 13.
A silicose possui um lento desenvolvimento e pode progredir
independentemente da exposição continuada. Assim, boa parte dos casos só será
diagnosticada após alguns anos após a exposição mesmo que o indivíduo já esteja
afastado da mesma. A forma subaguda da doença é caracterizada por apresentar
precocemente alterações radiológicas após cinco anos de exposição à sílica. Além
disso, os sintomas respiratórios costumam ser do tipo limitante e precoce. A
presença de nódulos com infiltrados inflamatórios intersticiais intensos e
descamação celular nos alvéolos caracteriza a histopatlogia desta forma da doença 21.
Existem algumas patologias associadas à exposição à sílica, sendo a silico-
tuberculose a que mais se destaca, ocorrendo tanto em países em desenvolvimento
quanto nos desenvolvidos. Em alguns países em desenvolvimento, como a África
do Sul, a exposição à sílica é responsável por epidemias de tuberculose. A
associação da tuberculose com a silicose é estudada desde o início do século XX.
Este particulado causa um impacto no sistema imune reduzindo a efetividade da
imunidade celular que pode ser refletida na diminuição do número de linfócitos T,
nos efeitos deletérios no metabolismo e nas funções dos macrófagos pulmonares.
Em virtude da silicose e tuberculose, os indivíduos doentes podem apresentar
maior deterioração da função pulmonar 14,22,23.
1.4 Mecanismos celulares e moleculares na silicose e exposição à sílica
Os indicadores biológicos são ferramentas úteis para avaliar a exposição a
substâncias químicas, identificar precocemente as alterações ou efeitos desta
exposição, identificar o início de patologias e predizer suscetibilidades individuais
Guimarães Joca, FJ 8
para o desenvolvimento de determinada doença bem como contribuem para
avaliação dos riscos no ambiente de trabalho.
1.4.1 Resposta do sistema imunológico à presença de poeira de sílica
Diversas citocinas participam do processo inflamatório da silicose. Estas
citocinas são pequenos polipeptídeos mediadores da inflamação e, podem
desenvolver diversos fenômenos biológicos, como inflamação, diferenciação e
crescimento celular, fibrogênese e homeostase, de acordo com o seu local de ação 24.
Muitos mediadores inflamatórios são reconhecidos como cruciais na
indução desta fisipatologia induzida pela exposição à sílica. Entre estes se
destacam citocinas como a Interleucina 1 (IL-1), 6 (IL-6), 10 (IL-10) e o Fator de
necrose tumoral α (TNF-α). O TNF-α, uma citocina tipicamente pleiotrópica se
destacando como um importante mediador da resposta inflamatória e do processo
fibriogênico após a exposição a diferentes agentes tóxicos ao pulmão. As lesões
silicóticas se desenvolvem através da secreção crônica de mediadores
inflamatórios e fibróticos. Modelos experimentais utilizando animais e estudos
clínicos indicam que o TNF-α e o IL-1 são importantes mediadores que regulam a
silicose e são derivados primariamente de macrófagos alveolares e células
epiteliais tipo II nos pulmões 25,26.
Em mineiros expostos a carvão e com pneumoconiose, o TNF-α é liberado
de monócitos de sangue periférico e em mineradores com fibrose progressiva
maciça e com pneumoconiose simples os mediadores TNF-α e IL-1 têm contínua
liberação dos macrófagos alveolares. O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória
que desempenha uma série de fenômenos biológicos tanto fisiológicos quanto
patológicos. A superprodução desta citocina provoca danos no organismo e sua
síntese é controlada de forma específica pelas células, através de uma forte
regulação da expressão do gene regulador 27.
A associação pleiotrópica das citocinas com a resposta tecidual frente a
processos de agressão e lesão é conhecida em diferentes tecidos. As citocinas são
moléculas mediadoras que não ficam restritas a respostas efetoras e regulatórias
Guimarães Joca, FJ 9
frente a processos infecciosos. Elas disparam e controlam fenômenos direta e
indiretamente relacionados com a “reação” tecidual, implicando em remodelagens
teciduais que podem ser de reparo funcional ou cicatrizante como a própria
fibrose. Desta forma, a inflamação e seus mediadores, se apresentam como
fenômenos cruciais no desenvolvimento e desfecho de doenças inflamatórias a
serem melhores compreendidas.
1.5 Silicose e o Estresse Oxidativo
A exposição a partículas de sílica provoca uma inflamação persistente
sustentada pela liberação de oxidantes nos alvéolos pulmonares. As espécies
reativas de oxigênio (EROs) incluem radicais hidroxilas, superóxido, peróxido de
hidrogênio e singleto de oxigênio, que são gerados tanto nas superfícies das
partículas de sílica, mas também pelas células fagocíticas na tentativa de digerir as
mesmas partículas. Dois tipos diferentes de radicais de sílica quando ligados
fracamente a íons de ferro geram por diferentes mecanismos os radicais HO• e
O2•- em solução aquosa. A sílica cristalina é um forte estimulador do “burst”
respiratório nas células fagocitárias, tanto como nos macrófagos, aumentando o
consumo de oxigênio e a produção de O•, H2O2 e NO levando há uma intensa
inflamação e a geração de HO• nos pulmões. É através da geração de oxidantes
tanto pelas partículas de sílica cristalina como pelas células ativadas pela mesma
que se propicia lesões pulmonares e disparam os mecanismos e sinalizações
celulares que levam aos impactos genotóxicos secundários da exposição à sílica.
Além disto, o dano oxidativo ao DNA é considerado um importante fator no
processo de carcinogênese 28,29.
As espécies de oxigênio reativas são geradas diretamente pelo depósito de
poeiras fibrogênicas no tecido pulmonar e, indiretamente, pelos macrófagos
alveolares e leucócitos polimorfonucleares, que são liberadas durante a fagocitose
das partículas de poeira. A produção elevada e contínua de EROs ou sua
inadequada remoção pode suprimir o sistema de defesa antioxidante e resultar no
estresse oxidativo, devido a um desequilíbrio entre os antioxidantes e oxidantes,
em favor dos oxidantes, conduzindo a danos celulares no pulmão 30,31,32.
Guimarães Joca, FJ 10
A Figura 1 ilustra a resposta celular à exposição à sílica no tecido
pulmonar. Uma vez a poeira de sílica dentro do espaço alveolar, a partícula pode
reagir com a matriz extracelular (etapa 1) e ser fagocitada pelos macrófagos
alveolares (AMs), que destrói as partículas presentes no pulmão (etapa 2).
Dependendo da característica superficial das partículas, este processo de limpeza
pode se repetir (etapa 3) ou provocar a ativação de macrófagos e/ou levar a morte
celular (etapa 4). Em último caso, os macrófagos serão ativados, a nível celular e
molecular, provocando a ativação dos fatores de transcrição e a liberação de EROs
e espécies reativas de nitrogênio (ERN), fatores quimiotáticos, enzimas líticas,
citocinas, fatores de crescimento, podendo levar a uma eventual morte celular
(necrose/apoptose) e liberação de partículas. Subseqüentes ciclos de ingestão-
reingestão acompanhados por um contínuo recrutamento de AM, neutrófilos
(PMN) e linfócitos são a causa do processo inflamatório crônico pela sílica.
Portanto, as células-alvos, células do epitélio bronquiolar e alveolar, serão então
afetadas por produtos dos macrófagos (etapa 5) e pela própria partícula (de sílica)
extracelular (etapa 6), outra vez resultando na ativação e/ou morte celular 29.
As espécies oxigênio reativas e as citocinas pró-inflamatórias específicas
(TNF-α) ativam fatores transcricionais incluindo o fator-kB (NF-kB), via
específica de sinalização intracelular. A translocação dos fatores de transcrição
para o núcleo do citoplasma inicia subsequentemente a transcrição de genes com
múltiplas funções inflamatórias, incluindo citocinas (TNF, IL-4, IL10) e enzimas
antioxidantes, tais como glutationa peroxidase, superoxido dismutase e catalase 29,31.
Guimarães Joca, FJ 11
Figura 1 - Esquema da resposta celular induzida pela sílica.
(1) interação com a matéria extracelular; (2) fagocitose pelos macrófagos alveolares (AM); (3) Limpeza; (4) ativação dos macrófagos e/ou morte; (5) resposta das células alvos pelos produtos dos macrófagos; (6) ação direta das partículas nas células alvos; (7) geração excessiva de ERO e ERN (adaptado de FUBINI & HUBBARD, 2003)29.
Dentre os antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos podemos citar, a
superóxido dismutase (SOD), a glutationa peroxidase (GPx), a Glutationa S-
Transferase (GST), a catalase (CAT) e a glutationa (GSH) 32,33,34. Estes sistemas estão
localizados em três compartimentos: o tecido pulmonar, fluido intersticial e os
eritrócitos circulantes 35. O eritrócito contém uma grande quantidade de enzimas
antioxidantes e a determinação das atividades dessas enzimas eritrocitárias pode ser
realizada por métodos simples, específicos e não invasivos, utilizando um
equipamento do tipo fotométrico, para a investigação da função do estresse oxidativo
em trabalhadores expostos ocupacionalmente a partículas de poeira em atividades
consideradas de risco para a silicose 33.
A SOD catalisa a destruição do radical ânion superóxido (O2-), convertendo-o
em oxigênio e peróxido de hidrogênio. A ação desta enzima permite a eliminação do
O2- mesmo em baixas concentrações. Existem duas formas de SOD no organismo, a
primeira contém Cu2+ e Zn2+ como centros redox, presente no citosol, e a segunda
contém Mn2+ como centro redox e está presente na mitocôndria.
Guimarães Joca, FJ 12
A enzima catalase atua na dismutação do peróxido de hidrogênio (H2O2) em
oxigênio e água 30,32,34. A molécula de H2O2 isoladamente é praticamente inócua,
porém pode se difundir facilmente através das membranas celulares (membrana do
núcleo e mitocondrial). Devido ao fato da célula possuir metais de transição,
ocorre geração do radical hidroxila (HO•) em seu interior. O radical HO• causa
danos ao DNA, RNA, às proteínas, lipídios e membranas celulares 36,37.
A GSH e as GPx fazem parte de um grupo de enzimas que possuem selênio
(selenocisteína) em sua estrutura, que atuam catalisando a dismutação do peróxido
de hidrogênio em água e oxigênio, sendo que a glutationa opera em ciclos entre
sua forma oxidada e sua forma reduzida na presença de GPx 38.
As GST são um exemplo de enzimas metabólicas, cujos polimorfismos vêm
sendo associados à maior sensibilidade a compostos químicos, representando uma
superfamília de enzimas que atuam nas reações metabólicas de fase II (reações de
conjugação), preparando compostos químicos para serem eliminados do
organismo. A GST também faz parte do sistema de defesa antioxidante do
organismo, auxiliando na resposta ao estresse oxidativo 39. De maneira geral, as
GST catalisam a conjugação do grupamento glutation (GSH) com substratos
eletrofílicos. Estes substratos podem ser endógenos ou metabólitos de
xenobióticos provenientes da primeira etapa (reações de fase I) do processo de
metabolização de substâncias químicas realizado pelo organismo 40,41.
Muitos argumentos suportam a hipótese de que os marcadores da resposta
ao estresse oxidativo sejam um intermediário fenotípico para a pneumoconiose. A
pneumoconiose está relacionada com o aumento quantitativo de peróxido de
hidrogênio e, as enzimas catalase, glutationa peroxidase e a superoxido dismutase
atuam na degradação desta molécula 31.
Recentemente estudos têm mostrado que parâmetros antioxidantes em
eritrócitos apresentaram uma associação negativa de acordo com a severidade das
pneumoconioses, como por exemplo, a enzima SOD, enquanto outras enzimas
apresentam associações positivas, tais como CAT e GPx 30.
Altin e colaboradores 42 realizaram um estudo populacional com 89
trabalhadores, em que objetivou entender melhor a relação entre a exposição
ocupacional à poeira de carvoarias e as atividades das enzimas antioxidantes (SOD
Guimarães Joca, FJ 13
e GPx) e a concentração de malondialdeído (MDA, peroxidação lipídica) em
sangue. O diagnóstico de pneumoconiose, em estágio precoce e em baixo grau, foi
realizado através da tomografia computadorizada. Diferenças estatísticas (p<0,05)
foram encontradas entre os grupos controle (n= 46) e o grupo com pneumoconiose
(n=43, profusões0/1 a 2/2) em relação à MDA, SOD e GPx (r=0,508; r=-0,487 e
r=-0,592, respectivamente). Em paralelo com as profusões das pneumoconioses, os
níveis de MDA foram mais altos, enquanto que as atividades de SOD e GPx
diminuíram com o aumento das profusões.
Já o estudo realizado por Nadif e colaboradores 30 em 240 trabalhadores de
carvoarias na França, separados em grupos com concentrações baixa e alta de
poeira, encontrou correlações positivas e significativas entre a catalase e
glutationa peroxidase de acordo com a exposição à poeira (r=0,350, p=0,006;
r=0,380, p=0,003), enquanto que em relação à superoxido dismutase encontrou
uma correlação negativa (r=-0,380, p=0,003). Comparando-se as enzimas
antioxidantes e os cinco subgrupos de grau de profusão, de acordo com a
classificação da OIT de 1980 43, a atividade da catalase mostrou uma associação
positiva. Já a atividade da SOD apresentou uma associação negativa com relação à
severidade da pneumoconiose. Foi também observada uma relação entre a
atividade da catalase e a pneumoconiose em que foi maior em mineradores com a
contagem de micronódulo.
Em um estudo realizado por Evelo e colaboradores 44 foi observada uma
diminuição da atividade da GST em trabalhadores de carvoarias com um estágio
inicial de pneumoconiose, assim como uma diminuição da atividade da GPx e da
concentração de GSH, podendo estas variações terem sido originadas de danos
causados por EROs.
O tecido epitelial das vias aéreas é um alvo para espécies reativa de
oxigênio (ROS), seja através da inalação dos mesmos do ambiente, oriundos ou
inalados a partir do ambiente exterior ou liberados de leucócitos recrutados e
acumulados durante a inflamação pulmonar. As células epiteliais dos alvéolos e o
fluído do revestimento alveolar possuem a proteção de enzimas e moléculas
antioxidantes 45. Uma dessas moléculas é a glutationa (GSH), um tripeptídeo (γ-L-
glutamil-L-cisteinilglicina) que é o mais abundante, é um onipresente tiol não
proteico encontrada em células no seu estado reduzido. A GSH é um importante
Guimarães Joca, FJ 14
antioxidante protetor frente a radicais livres, compostos eletrofílicos, xenobióticas
e outros oxidantes. A GSH tem participação em diversos eventos celulares como a
resposta inflamatória, a remodelação de matriz extracelular e até mesmo a
regulação de proliferação celular 46.
A enzima GST é uma das principais vias de detoxificação através da
conjugação do xenobiótico com a GSH que é vital antioxidante presente tanto no
interior como no meio extracelular com papel protetor frente a estresses oxidativos
e que desempenha um papel crucial no controle de processos pró-inflamatórios
que acometem os pulmões. Ou seja, a atividade desta enzima pode refletir
alterações no metabolismo da GSH que indicam e implicam em um desequilíbrio
oxidante/antioxidante e por sua vez indicam e implicam em um processo
inflamatório e lesivo nos pulmões. Pode assim também sinalizar e ajudar a
elucidar também os impactos genotóxicos de origem secundária no microambiente
pulmonar. Desta forma, pode fornecer informações que se somem às informações
fornecidas pelos ensaios de genotoxicidade como o Ensaio Cometa 47,48.
Os danos oxidativos ao DNA são considerados como marcadores do próprio
estresse oxidativo e portanto, pode ser também um marcador preditivo de doenças
relacionadas ao estresse oxidativo 49.
1.6 Genotoxicidade da exposição à sílica
O termo genotoxicidade foi utilizado pela primeira vez há três décadas para
descrever componentes da interação química com material genético. O termo
genotóxico é uma expressão geral proposta para expressar efeitos tóxicos, letais e
hereditários no material genético nuclear e externo ao núcleo celular, tanto em
células somáticas como em células germinativas 50.
Substâncias genotóxicas são aquelas que possuem uma capacidade biológica
direta, ou secundária, através de seus metabólitos de alterar a codificação do
DNA. Um agente tóxico é dito genotóxico quando ocasiona alterações na estrutura
ou no conteúdo dos cromossomos (clastogenicidade) ou da sequência de pares de
bases do DNA. Estes efeitos podem ocorrer mesmo em exposições à baixas
concentrações e, deste modo, podem acarretar problemas reprodutivos, alteração
Guimarães Joca, FJ 15
do desenvolvimento embrionário e alterar o desenvolvimento do organismo adulto,
incluindo processos carcinogênicos 51,52,53.
Nas últimas décadas, diversos testes de genotoxicidade foram
desenvolvidos e vêm sendo utilizados para avaliar o potencial genotóxico das
substâncias químicas. Estudos demonstraram alterações citogenéticas associadas à
exposição à sílica, como o aumento da incidência de aberrações cromossomiais e
troca de cromátides irmãs. A sílica cristalina é considerada um carcinógeno
pulmonar sendo classificado pela IARC no grupo de Carcinógenos humanos,
Grupo I 54. Várias propriedades químicas intrínsecas a particulados como a sílica
têm sido propostas para explicar os danos genotóxicos primários e secundários
oriundos da exposição 55.
Os testes de genotoxicidade constituem uma importante etapa de pesquisa
do câncer e na avaliação de risco de potenciais carcinogênicos. A carcinogenese
caracteriza-se como uma sequência de eventos que incluem a ocorrência de
alterações genéticas relacionadas à ativação de oncogenes, a inativação de genes
supressores tumorais, e que podem até culminar na ativação de genes do ciclo
celular. Desta forma, estas alterações implicam em proliferações descontroladas e
até mesmo em indiferenciações celulares. O fenômeno da carcinogênese é dividido
em dois fenômenos: iniciação e a promoção. É justamente na fase de iniciação que
se considera os eventos genotóxicos sendo importantes como regentes da mesma.
Para uma avaliação de risco é necessário tanto avaliar e identificar a
carcinogenicidade de exposições químicas, mas também averiguar se a mesma é
ou não genotóxica 53,55.
Os testes de genotoxicidade são diversos, porém complementares na
avaliação da situação de genotoxicidade, de modo a se encontrar tanto testes
altamente sensíveis como também testes não tão sensíveis, porém mais
específicos. Segundo Møller 56, o teste do Ensaio Cometa é um ensaio adequado e
deve ser incluído no monitoramento de populações em exposição ocupacional.
Além disso, diferentes estudos em matrizes biológicas apontam o Ensaio Cometa
como um indicador altamente sensível para exposição a agentes reconhecidos
como carcinógenos, e extremamente sensível para uma variedade de classes de
danos ao DNA 57,58.
Guimarães Joca, FJ 16
Knaapen 59 encontrou danos ao DNA através do Ensaio Cometa em células
epiteliais de pulmão de ratos expostos por instilação a um padrão de quartzo. Este
autor cita neste estudo alguns trabalhos anteriores que já demonstravam in vivo o
potencial genotóxico da sílica. Dentre eles, Yamano e colaboradores 60 detectaram
este potencial através da quantificação de 8-hidroxido-2’-deoxiguanosina, uma
modificação do DNA caracteristicamente produzida por EROs e que está
relacionada a possíveis pontos de mutação de bases nitrogenadas.
O comportamento físico-químico de particulados é na maioria das vezes
bem diferente dos carcinogênicos químicos não-particulados. Acredita-se que
espécies reativas de oxigênio (EROs) exercem um papel fundamental na
genotoxicidade primária de particulados, que pode derivar de suas propriedades de
superfície e do contato direto com estas, da presença de metais de transição nos
mesmos, da mobilização de ferro intracelular, e da peroxidação de lipídeos.
Outros aspectos relevantes para a genotoxicidade primária são: tamanho de
partículas, sua forma, sua cristalinidade e a sua solubilidade, e pode também
incluir a captação da partícula, a interação com a maquinaria de divisão celular e a
presença de mutagênicos carreados com a partícula 61.
As figuras 2 e 3 ilustram como funcionam os fenômenos relacionados aos
mecanismos que ocasionam tanto os danos genotóxicos primários como os
secundários, ressaltando a utilização de testes de genotoxicidade e de testes de
marcadores de dano oxidativo ao DNA para a detecção destes danos. Os estudos in
vitro contribuem para entender e identificar propriedades genotóxicas primárias
como, por exemplo, no caso da sílica, a geração de oxidantes a partir do quartzo.
Ao passo que estudos in vivo contribuem para o entendimento de como a
inflamação pulmonar induzida por particulados e o estresse oxidativo associado
ocasionam o dano genotóxico secundário. Além disso, este tipo de estudo pode
fornecer informações a respeito de possíveis relações dose-efeito tanto para a
inflamação como para os efeitos genotóxicos 37.
Guimarães Joca, FJ 17
Figura 2 - Danos Genotóxicos Primários e Secundários (adaptado de SCHINS, 2002)37
Figura 3 - Danos Genotóxicos primários e secundários suas causas e conseqüências (adaptado de SCHINS, 2002)37
A matriz biológica comumente usada nos testes de genotoxicidade são as
células sanguíneas onde se encontra a população celular linfocitária que, por
transpassar diversos compartimentos do organismo humano, pode refletir
eficazmente efeitos gerados no organismo exposto, mesmo não sendo células alvos
do agente genotóxico. Além disso, pela sua fácil obtenção, esta matriz colabora
para que a metodologia seja pouco invasiva e mais rápida. Os leucócitos são
classicamente utilizados em testes cromossomiais, e mais recentemente em testes
que detectam quebras no DNA e a formação de adutos como a 8-OHdG, um
marcador de dano oxidativo do DNA 62,63.
Guimarães Joca, FJ 18
1.6.1 Indicadores Biológicos de Genotoxicidade
Os métodos genotóxicos mais comumente utilizados na avaliação de
substâncias químicas são as quebras de fita do DNA, as alterações nas bases
nitrogenadas, a formação de adutos; as Aberrações Cromossomiais (AC), os
micronúcleos (MN), e a troca de cromátides irmãs (SCE). Nos últimos anos, o
Ensaio Cometa em condições alcalina tornou-se uma relevante ferramenta no
contexto do monitoramento biológico humano e estudos de avaliação de danos
genéticos em populações expostas a agentes genotóxicos 64,65.
1.7 Ensaio Cometa
O Ensaio Cometa é um teste de genotoxicidade simples, de baixo custo,
versátil, rápido e extremamente sensível para qualquer população de célula
eucariótica. Também é empregado para investigar os efeitos de antioxidantes e do
estresse oxidativo, além de possuir aplicações em diferentes áreas tais como,
genotoxicidade, monitoramento biológico humano e epidemiologia molecular e até
mesmo a ecotoxicologia 56,58,66,67.
Conceitos da técnica como tratamento alcalino para se obter a detecção da
quebras em fita simples, a necessidade de calibração dos Cometas, a importância
da profundidade do tampão de corrida e as diferentes formas de leitura do Ensaio
estão em ampla discussão e dirigem a melhora e o desenvolvimento da técnica.
Outra discussão que se destaca, é a utilização de padrões internos como o uso de
controles positivos de danos ao DNA, como por exemplo, a exposição de amostras
ao mutagênico MMS, para se obter tais controles 68,69,70.
O ensaio Cometa utiliza células individualizadas em gel de agarose, sobre
lâminas de microscopia filmadas em agarose, que são lisadas e depois submetidas
a um processo de eletroforese (Figura 4). Este processo faz com que a corrente
elétrica desloque o DNA para fora do núcleóide. Esta migração se configura em
um arrasto em forma de cauda, remetendo a imagem de um Cometa que pode ser
visto na figura 5. Por tudo isso, essa técnica foi chamada de ensaio Cometa ou
também de eletroforese em gel de célula única 71.
Guimarães Joca, FJ 19
Figura 4 - Desenho esquemático da técnica de Ensaio Cometa. (Fonte: http://www.inf.ufsc.br/~awangenh/temas.html)
Figura 5 - Imagem por microscopia de fluorescência da migração de DNA, no ensaio Cometa. (MOTA et al., 2007)72
Quanto mais fragmentado estiver o DNA, mais rapidamente o mesmo
migrará na eletroforese. Pode-se visualizar esta migração ao corarmos as Lâminas
com um corante que se ligue a DNA, como o intercalante brometo de etídio, e
submetê-las posteriormente a visualização em microscopia Ótica de Fluorescência.
Quanto maior o arrasto (a cauda formada do Cometa), maior será o dano estimado
ao DNA causado pelo agente genotóxico 52,64,71.
O Ensaio Cometa em condições alcalinas é o mais utilizado atualmente. A
condição alcalina não necessariamente aumenta a sensibilidade da técnica (danos
mínimos poderiam ainda ser detectados sem ele), porém o pH alcalino é
responsável pela formação de uma cauda mais pronunciada e também por uma
melhor resolução do ensaio 73.
Existem diversas e sofisticadas formas para se realizar a leitura das lâminas
do Ensaio Cometa. Os sistemas que se utilizam de softwares são modos menos
trabalhosos, porém demandam aquisições de custo elevado. É possível, contudo,
manter o baixo custo da técnica e a qualidade da leitura quando esta é feita através
Guimarães Joca, FJ 20
da contagem e descriminação dos danos por um operador treinado, expressando,
assim, o resultado da leitura em unidades arbritárias. Alguns estudos mostram que
não há diferença significativa no resultado final do método com operador e com o
que utiliza Softwares específicos 69.
Mediante os fatores individuais que podem influenciar os resultados do
Ensaio Cometa, esta técnica configura uma ferramenta que, apesar de muito útil
para estudos populacionais humanos, ainda não pode ser aplicada à avaliação de
risco individual de doenças como o câncer. É uma ferramenta que no momento só
deve ser aplicada aos indivíduos quando situados em um contexto populacional 73.
Guimarães Joca, FJ 21
2 OBJETIVO
2.1 Objetivo geral
O objetivo deste estudo é avaliar danos genotóxicos e alterações em
parâmetros enzimáticos do estresse oxidativo decorrentes de exposição à sílica, em
trabalhadores expostos e não expostos, atendidos no Ambulatório de
Pneumatologia Ocupacional do Centro de Estudo da Saúde do Trabalhador e
Ecologia Humana (CESTEH) da Escola Nacional de Saúde Pública
(ENSP/FIOCRUZ).
2.2 Objetivos específicos
• Implementação da metodologia de genotoxicidade de Ensaio Cometa no
Laboratório de Toxicologia do CESTEH;
• Aplicação do teste de Ensaio Cometa no universo amostral;
• Determinação das atividades das enzimas do estresse oxidativo Catalase
(CAT) e Glutationa S-Transferase (GST) no universo amostral;
• Determinação dos níveis da Citocina TNF no universo amostral;
• Associação dos sinais clínicos da doença silicose com os parâmetros da
resposta ao estímulo oxidativo e com os resultados da avaliação genotóxica
por ensaio Cometa;
• Associação das variáveis: hábito de fumar, idade e tempo de exposição,
obtidas através de questionário, com os resultados do ensaio Cometa,
parâmetros do estresse oxidativo, níveis de TNF e da avaliação clínica.
Guimarães Joca, FJ 22
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 População estudada
A população deste estudo foi composta de trabalhadores advindos do
Ambulatório de Pneumopatia Ocupacional do Centro de Saúde do Trabalhador e
Ecologia Humana (CESTEH) da Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca
(ENSP) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), localizado em Manguinhos, na
cidade do Rio de janeiro. Os trabalhadores foram selecionados aleatoriamente no
banco de dados do Ambulatório de Pneumopatias Ocupacionais tendo estes idades
superiores a 18 anos.
Para a realização desta dissertação, os trabalhadores foram divididos em
dois grupos: não exposto e exposto ocupacionalmente a sílica. O grupo não
exposto foi constituído de técnicos laboratoriais do CESTEH, selecionados
aleatoriamente (Grupo Laboratório).
O grupo exposto à sílica foi subdividido em dois subgrupos: exposto
doente, ou seja, os que apresentavam silicose, e exposto não doente, que não
apresentavam a doença. Para tanto, foi considerado trabalhador exposto doente,
aquele com RX de tórax ≥ 1/0, e exposto não doente, com RX de tórax =0/0, de
acordo com as normas da OIT 43.
Os critérios de inclusão adotados foram: idade superior a 18 anos, atendidos
no Ambulatório de Pneumopatias Ocupacionais, através de livre demanda, com
exposição ocupacional à sílica ou não (grupo Laboratório) e participação
voluntária do estudo através da assinatura do termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE). Como critério de exclusão foi adotado o teste tuberculínico
(PPD de Mantoux) positivo para os voluntários. As análises laboratoriais foram
realizadas no Setor de Indicadores Biológicos do Laboratório de Toxicologia do
CESTEH.
Após o consentimento em participar do estudo, todos os voluntários
seguiram as seguintes etapas (Figura 6): 1- Responder a um questionário de sinais
e sintomas pulmonares e características de suas atividades profissionais e de
exposição a substâncias químicas no ambiente de trabalho; 2- exame clínico; 3-
Guimarães Joca, FJ 23
realização de PPD; 4- espirometria; 4- radiografia e, por fim, 5- coleta das
amostras de sangue para as análises de Ensaio Cometa, de resposta ao estresse
oxidativo, e dosagem de TNF.
Figura 6 - Esquema das etapas iniciais do projeto durante o período de sua realização.
3.2 Procedimentos de avaliação física e clínica
3.2.1 Exame físico e entrevista
Os exames físicos e a entrevista consistiram de análise de dados clínico e
sócio-demográficos, com a finalidade de avaliar o grau de acometimento dos
indivíduos e a evolução clínica dos sintomas, além de identificar outras co-
morbidades, como alcoolismo, tabagismo, diabete mellitus, hepatite, doenças auto-
imunes, insuficiência renal, entre outras.
Guimarães Joca, FJ 24
3.2.2 Exames radiográficos do tórax
A técnica radiológica utilizada encontrava-se dentro dos padrões da
Organização Internacional do Trabalho (OIT) de 1980 43. Foram consideradas
alteradas as radiografias em que a média da leitura era maior que 1/0. As
radiografias foram classificadas quanto à profusão de lesões, e o tipo de lesão no
parênquima pulmonar, e foram divididas em categorias de 0 a 3 (Figura 9),
conforme a gravidade da doença.
Tabela 1 - Classificação das leituras de raios-x em categorias de 0 a 3, conforme as normas da OIT de 1980 43.
3.2.3 Teste tuberculínico cutâneo
O teste tuberculínico (PT) foi feito com 5 UT de PPD-S pela técnica de
Mantoux, de acordo com o Centers for Disease Control 74, com leitura entre 48 e
72 horas. Os resultados da leitura foram registrados, segundo os critérios dos
“CDC” e Ministério da Saúde 7 em: teste tuberculínico positivo e PT negativo. O
teste tuberculínico positivo foi considerado aquele com enduração ≥10mm (forte
reator), enquanto o PT negativo foi considerado aquele com enduração <10mm
(fraco reator ou não reator) 74. O método utilizado para a leitura foi o palpatório e,
no momento da leitura, os indivíduos com PT positivo foram indagados quanto à
presença de sintomas respiratórios prolongados e febre, e encaminhados para
tratamento adequado. Os indivíduos com PT negativo realizaram, após uma
semana, um segundo PT.
Categoria 0 raios-x com leitura 0/-, 0/0 e 0/1
Categoria 1 raios-x com leitura 1/0, 1/1 e 1/2
Categoria 2 raios-x com leitura 2/1, 2/2 e 2/3
Categoria 3 raios-x com leitura 3/2, 3/3 e 3/+
Guimarães Joca, FJ 25
3.2.4 Teste espirométrico
O teste espirométrico foi realizado de acordo com a técnica orientada pela
American Thoracic Society 75 que consiste numa expiração forçada até o limite do
volume de reserva expiratória, após inspiração máxima. A espirometria avalia a
função ventilatória, refletindo dados sobre distensibilidade ou resistência elástica
do aparelho respiratório e sobre a resistência ao fluxo aéreo. É um teste que
auxilia na prevenção e permite o diagnóstico e a quantificação dos distúrbios
ventilatórios, tendo um importante papel na pneumologia ocupacional.
Os indivíduos do grupo Laboratório não passaram pelos procedimentos dos
exames físico, radiográfico do tórax, teste tuberculínico cutâneo e espirométrico.
3.3 Coleta das amostras de sangue
Amostras sanguíneas, com aproximadamente 10 mL, foram coletadas por
profissional habilitado em tubos a vácuo, contendo anticoagulante, e
acondicionadas sob refrigeração até o momento das análises de hemograma
completo, de Ensaio Cometa, das enzimas CAT e GST e da Citocina TNF.
As análises de hemograma completo foram realizadas no Centro de Saúde
da ENSP e a parte experimental do trabalho foi realizada no Laboratório de
Toxicologia do CESTEH/FIOCRUZ. As metodologias executadas foram
padronizadas, de acordo com critérios e testes de acuidade e precisão analíticas.
3.4 Determinações dos parâmetros do estresse oxidativo
3.4.1 Catalase (CAT)
A determinação da atividade da enzima Catalase (CAT) em eritrócitos
humanos foi realizada baseada no método de Aebi 76 que tem por finalidade
quantificar a atividade da enzima CAT através da decomposição de H2O2 a uma
D.O de 230nm.
Guimarães Joca, FJ 26
Soluções utilizadas
• Solução de tampão fosfato [fosfato de potássio monobásico 50mM; fosfato de
sódio dibásico 50mM, pH 7,0];
• Solução de peróxido de hidrogênio [30% de H2O2 em solução de tampão fosfato
(50mM, pH 7,0)];
• Solução de cloreto de sódio isotônico [0,9% NaCl em água destilada].
Procedimento
Nota: As amostras de sangue (coletadas em tubos heparinizados) devem ser
mantidas a 0°C (banho de gelo) durante toda a elaboração das análises, a serem
realizadas no mesmo dia de coleta das amostras para o não comprometimento da
atividade enzimática.
Para cada amostra, separa-se uma alíquota de 2mL em tubos e centrifuga-se
as amostras por 10 minutos a 3500 rpm a 4°C. Posteriormente, despreza-se o
plasma (sobrenadante). Uma alíquota de 500µL de sedimento de eritrócitos de
cada amostra é transferida para outro tubo de centrífuga refrigerada, onde se
acrescenta 5mL de cloreto de sódio (solução salina) para a lavagem dos
eritrócitos. Homogeneízam-se os tubos por 15 segundos e, em seguida, centrifuga-
se as amostras por 10 minutos a 3500 rpm a 4°C. Esse processo de lavagem é
repetido por mais duas vezes. Após as 3 lavagens, transfere-se 50µL do sedimento
de eritrócitos para um tubo de vidro e adiciona-se 200µL de água deionizada, para
a hemólise dos eritrócitos, formando assim o hemolisado concentrado. Este
procedimento é realizado em triplicata. Posteriormente, homogeneízam-se os tubos
por 20 segundo, sendo os mesmos mantidos em banho de gelo até o momento da
leitura no espectrofotômetro.
Momentos antes da análise espectrofotométrica, deve ser preparada a
solução de peróxido de hidrogênio e o hemolisado diluído, através da adição de
5µL do hemolisado concentrado e 2,5mL de tampão fosfato. A leitura das
amostras transcorre no modo cinético por 15 segundos a um comprimento de onda
de 230nm. Para a leitura do branco, adiciona-se na cubeta, 2 mL do hemolisado
Guimarães Joca, FJ 27
diluído e 1 mL de tampão fosfato e para a leitura das amostras, adicionar na
cubeta, 2 mL do hemolisado diluído e 1 mL de peróxido de hidrogênio.
Cálculos
Não é possível definir uma unidade internacional para a catalase, portanto
recomenda-se o uso de uma constante de reação de 1ª ordem (k). Esta constante
pode ser relacionada com o teor de hemoglobina presente na amostra (k/g Hb), que
serve como uma medida da atividade específica da catalase em eritrócitos. Os
cálculos de CAT são baseados nas seguintes fórmulas:
k = (2,3/15) (log A1/A2);
k = 0,153 (log A1/A2) (segundos-1);
k/mL = ka;
k/g Hb = k/mL (1000/b) = 0,153 (a/b)(log A1/A2).
Onde,
A1 = absorvância no t=0;
A2 = absorvância no t=15 segundo;
a = Fator de diluição;
b = teor de hemoglobina (Hb) em grama/litro (g/L)
Nota: Para o cálculo da atividade da enzima catalase há a necessidade do
valor do teor de hemoglobina nos eritrócitos. Portanto, utilizou-se exame de
hemograma completo recente (até 3 meses) ou solicitou-se o pedido do exame
através do laboratório.
3.4.2 Glutationa S-tranferase
A determinação da atividade enzimática da GST foi realizado por
espectrofotometria UV-Visível, utilizando comprimento de onda de 340nm e 1-
Guimarães Joca, FJ 28
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) como substrato universal, de acordo com o
método descrito por Habig et al 77.
Reagentes
• Solução de cloreto de sódio isotônico [0,9% NaCl em água destilada];
• Tampão Fosfato 0,1M [KH2PO4 0,1M; K2HPO4 0,1M; pH=6,5];
• Solução de Etanol (EtOH) 95% (v/v);
• Solução de CDNB 0,3M, preparada em solução de EtOH 95%;
• Solução de GSH 0,3M, preparada em Tampão Fosfato 0,1 M.
Procedimentos
Lavagem de Eritrócitos
Logo após a coleta de sangue, transfere-se, para um novo tubo de ensaio,
uma alíquota de 2 mL de sangue total e centrifuga-se a amostra a 3000 rpm por 30
minutos. Em seguida, retira-se uma alíquota de 500µL de eritrócitos (sedimento),
sendo transferida para um novo tubo de ensaio, onde se adiciona 5 mL de NaCl 0,9
%, para a lavagem dos eritrócitos.
Homogeneíza-se cada tubo por 15 segundos, e posteriormente, centrifugam-se
os mesmos a 3000 rpm por 10 minutos. Ao término da centrifugação, retira-se a parte
sobrenadante, com o auxílio de uma pipeta, tomando cuidado para não aspirar
eritrócitos precipitados. Os procedimentos de lavagem de eritrócito são realizados 3
vezes. Após a terceira lavagem, transferem-se duas alíquotas de 50 µL de eritrócitos
de cada amostra para dois novos tubos, onde se adiciona 1450µL de Água Tipo I e,
em seguida, homogeneíza-se por 30 segundos, ocorrendo a hemólise.
No momento da leitura, prepara-se a mistura de PBS + GSH + CDNB em
um tubo, conforme Tabela 2, homogeneíza-se a mistura, sendo transferida, em
seguida, para a cubeta. Para o branco, adicionar 100µL de PBS no lugar do
hemolisado e para a amostra, adicionar o hemolisado diretamente na cubeta,
fazendo 5 ciclos de aspiração com a pipeta, para homogeneizar. A leitura das
amostras foi realizada em modo cinético, a 340 nm, durante 1 minuto.
Guimarães Joca, FJ 29
Tabela 2 - Quantidade de reagentes para o branco e amostras (em microlitros):
Reagentes Branco Amostra
PBS 2800 2700
GSH 100 100
CDNB 100 100
Hemolisado - 100
Cálculo
Unidade/mL = [∆Abs/min Amostra - ∆Abs/min Branco x (3,0)(FD)]/[(9,6)x(0,1)]
Onde:
Fator de extinção molar = 9,6
Volume do hemolizado utilizado = 0,1 mL
Volume final na cubeta = 3,0 mL
FD = fator de diluição
3.5 Metodologia do Ensaio Cometa
Soluções Utilizadas
• Solução de Lise celular [NCl 2,5 M; Tris-HCl 10 mM; EDTA 100mM; Lauril
Sulfato de sódio 1%; pH 10];
• Tampão de Eletroforese [300mM / 1mM EDTA];
• Tampão de Neutralização [Tris 0,4 M];
• Solução de Brometo de etídeo [40ug/mL];
• Agarose [1,5%];
• Agarose Low Melting Point (LMP) [0,5%];
Guimarães Joca, FJ 30
• Solução A [MMS 80mM];
• Solução B [MMS 0,8mM]; Soluções Controle Positivo
• Solução C [MMS 0,4mM];
Procedimentos
Preparo das lâminas
Inicialmente, as lâminas foram lavadas com etanol absoluto e, em seguida,
mergulhadas em agarose 1,5% a 60°C. Posteriormente, se limpa a parte inferior
das lâminas e deixa-se a agarose gelificar na parte superior, horizontalmente.
Preparo das amostras controle
a) Controle celular – adiciona-se 250uL de sangue total em tubo Eppendorf;
b) Controle solvente – adiciona-se 50uL de tampão PBS a 200uL de sangue total
em Eppendorf;
c) Controle positivo MMS 1 – adiciona-se 50uL de solução B a 200uL de sangue
total em tubo Eppendorf, obtendo-se concentração final de MMS = 16x 10-5 M
(0,16mM);
d) Controle positivo MMS 2 – adiciona-se 50uL de solução C a 200uL de sangue
total em tubo Eppendorf, obtendo-se concentração final de MMS = 8x 10-5 M
(0,08mM);
e) Incuba-se todas as amostras controle junto com as amostras-teste por 2 horas a
37+/-1°C;
Preparo das células
Cada lâmina foi marcada com o código de identificação do indivíduo e/ou
das soluções controle. Em seguida, se homogeneiza o sangue invertendo o tubo
vacutainer algumas vezes. Transfere-se, com o auxílio de um pipetador
automático, uma alíquota de 10uL de sangue total ou de solução controle para tubo
Eppendorf e adiciona-se, lentamente, 120uL de agarose LMP, previamente
Guimarães Joca, FJ 31
aquecida e mantida à 37°C, homogeneizando suavemente à suspensão de células.
Posteriormente, espalha-se a suspensão em uma lâmina contendo um filme de
agarose à 1,5%, que foi preparada na etapa anterior, e coloca-se sobre ela uma
lamínula de 24 x 60mm, antes que a suspensão de células na agarose gelifique.
Prepara-se 5 lâminas por amostra.
Em seguida, as lâminas são colocadas em uma bandeja e deixadas na
geladeira por 5 minutos. Após o tempo determinado, retira-se, cuidadosamente, de
cada lâmina as suas lamínulas e, subseqüentemente, acondiciona-se às lâminas, em
130mL de solução de lise, num recipiente tipo Coplin, revestido externamente com
papel laminado. A partir desta etapa, evita-se a incidência de luz direta, para
prevenir lesões adicionais ao DNA.
As lâminas são guardadas em geladeira por, no mínimo, 1 hora e, no
máximo, 24 horas e, após este período, são arrumadas em fileiras ao lado do anodo
(+) da cuba de eletroforese. Adiciona-se, cuidadosamente, a solução de
eletroforese à 4°C, pelas laterais da cuba, o suficiente para cobrir as lâminas,
deixando-as em contato com o tampão de corrida, por 25 minutos, para possibilitar
o desenovelamento do DNA e assim poder expressar as diferentes classes de
lesões álcali-lábeis.
Ajusta-se o volume da solução e a fonte de eletroforese nas condições de
operação (25v/300A) e procede-se a corrida de eletroforese, por 25 minutos. Ao
término da corrida, retira-se, cuidadosamente, as lâminas da cuba, lavando-as com
tampão de neutralização, 3 vezes com intervalos de 5 minutos, para cada lavagem,
por final as lâminas são fixadas em Etanol por imersão durante 10 minutos.
Deixam-se as lâminas secarem em contato com o ar, à temperatura
ambiente, por 24 horas ou mais, caso haja necessidade. As lâminas secas são
guardadas na sua embalagem original e deixadas à temperatura ambiente.
Os controles das condições ambientais mostraram-se importantes para
garantir o desempenho e os resultados do teste do Ensaio Cometa. A falta do
controle da temperatura e da umidade relativa do ar pode comprometer etapas
cruciais da técnica 58,73,78. Devido a problemas com o sistema de ar condicionado
do Laboratório de Toxicologia do CESTEH, local de realização dos experimentos
e onde foram armazenadas as lâminas para leitura, ocorreu por determinado tempo
Guimarães Joca, FJ 32
a perda de controle destas variáveis, com destaque para umidade. Esta situação
contribuiu para a perda de amostras e o impedimento temporário da realização do
Ensaio.
Coloração das lâminas
Com o auxílio de uma pipeta automática, distribui-se 40uL de solução
corante de brometo de etídeo (40 µg/mL) em cada lâmina, cobrindo-as,
posteriormente, com as lamínulas. Imediatamente após, observa-se ao microscópio
de fluorescência.
Análise dos Cometas ao microscópio
As lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência, equipado
com lentes oculares e lentes objetivas planocromáticas de 10X e 40X e com filtro
de excitação de 560nm (faixa verde) e um filtro de barreira de 590nm. Os Cometas
foram localizados com a objetiva de 20 x e após a sua visualização, as células
examinadas, com a objetiva de 40 x. Cada Cometa foi analisado e sua morfologia
observada, de modo que a lâmina foi lida (escaneada) da esquerda para a direita e
de cima para baixo, na sua porção mais central, de modo a evitar-se à recontagem.
Cada Cometa foi classificado visualmente, de acordo com a intensidade da cauda,
como mostra a figura 7 e, ao final das análises, faz-se o somatório das
classificações dos Cometas encontrados. Foram contados aleatoriamente cinquenta
“células” por lâmina, sendo lidas duas lâminas por indivíduo avaliado.
Guimarães Joca, FJ 33
A B
C D
Figura 7 - Fotografia da classificação do ensaio Cometa.Classe 0, sem danos; B- classe 1;C- classe 2; D- classe 3; dano máximo. Fonte: Silva et al., 200079
3.6 Análise dos resultados
As análises laboratoriais foram realizadas às cegas. Os técnicos
laboratoriais não tiveram acesso aos códigos de identificação das amostras
clínicas. A análise estatística realizada nas comparações entre dois grupos foi o
teste do T-student. A análise multivariada (ANOVA) seguida do teste de
Bonferroni foi utilizada para comparar médias de variáveis contínuas com
distribuição normal ou com N significativo. A medida do grau de relação linear,
entre bivariáveis quantitativas, foi realizada através da análise de coeficiente de
correlação de Pearson. A análise da sensibilidade e da especificidade dos
indicadores biológicos foi avaliada através de curva ROC (receiver operating
characteristic). Em todos os testes, o nível de significância adotado foi o de 5%.
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 13.0.
3.7 Fator-alfa de Necrose Tumoral (TNF - α)
A dosagem foi realizada por KIT comercial para a dosagem de TNF-α
humana da Invitrogen Corporation, CA, USA.
O método para determinação na TNF-α humana é baseado em um kit de
ELISA (Enzyme Lynked-Immuno-Sorbent Assay), onde um anticorpo monoclonal
específico para TNF-α humana é adsorvido dentro de cada poço de uma
Guimarães Joca, FJ 34
microplaca de leitura. Amostras, incluindo padrões de TNF e controles, e amostras
desconhecidas, são adicionadas dentro de cada poço.
Durante a primeira incubação (2 horas), o antígeno da TNF se liga ao
anticorpo (captura) adsorvido na parede do poço. Depois da 1ª lavagem, um
anticorpo de sinalização específico para TNF, é adicionado. Já na segunda
incubação (1 hora) o anticorpo de sinalização se liga a TNF adsorvida durante a 1ª
incubação. Após a remoção do excesso do segundo anticorpo (sinalização), a
enzima streptavidina-peroxidase é adicionada no poço. Esta se liga ao anticorpo de
sinalização para formar o chamado “sanduíche de 4 membros”. Após a terceira
incubação (30 min) e lavagem para remover toda a enzima não ligada, um
substrato colorido é adicionado, atuando sobre a ligação da enzima com anticorpo
de sinalização, para produzir cor. A intensidade desta coloração produzida é
diretamente proporcional à concentração de TNF humana presente na amostra
inicial.
Guimarães Joca, FJ 35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização da População de trabalhadores expostos à Sílica
A população estudada compreende 84 indivíduos com exposição
ocupacional à sílica em diversos processos de trabalho, sendo que 70,24% destes
trabalham ou trabalharam na indústria naval, em diversos setores, mas com
predomínio do setor de pintura naval. O tempo máximo e mínino de exposição
nesta população foram respectivamente de 10 meses e 44 anos. A Tabela 1
apresenta as características sócio-demográficas destes trabalhadores sendo que
somente 60 trabalhadores responderam ao questionário. Algumas informações
sobre tempo de exposição, hábito de fumar e beber foram obtidas dos prontuários
no Ambulatório de Pneumologia do CESTEH.
A escolaridade informada predominante foi a do ensino fundamental
incompleto apresentando uma freqüência de 29,8%. Além disso, 2,4% possuem
analfabetismo funcional.
Segundo Lima e colaboradores 80, a renda familiar e a escolaridade foram as
mais importantes variáveis preditoras dos acidentes de trabalho. Segundo estes
autores, existem controvérsias sobre esta questão, pois em países desenvolvidos
este fato não é levantado como um importante fator, especialmente quando se trata
de percepção do risco. Zwerling e colaboradores 81 atribuíram a baixa escolaridade
(inferior a quatro anos) que expunha os trabalhadores a um risco cinco vezes
maior do que a alta escolaridade (mais de 11 anos) na comparação com controles
de trabalho. Este risco relativo duplicava quando o autor ajustava em relação aos
vizinhos e quadruplicava em relação ao grupo populacional. Contudo, trata-se de
um fator também pouco estudado em especial quando se relaciona trabalho aos
seus riscos. Estes autores defendem que o uso de “controles de trabalho”
subestima o efeito da escolaridade.
A média da idade dos trabalhadores estudados foi de 50,33 anos (DP =
8,32), sendo o valor mínimo de 26 anos e o valor máximo de 72 anos. O gênero
predominante foi o masculino com 98,81%. Esta população apresentou um tempo
Guimarães Joca, FJ 36
médio de exposição de 19 anos, sendo o menor tempo de 10 meses e o maior de 44
anos. Destes, 32,1 % declaram-se ativos e 66,7 % inativos.
Quanto aos hábitos de vida destes trabalhadores, verificou-se que 35,7%
consomem bebidas alcoólicas e 34,5% declararam não ingerir bebidas alcoólicas.
Em relação ao tabagismo 15,5% declararam-se fumantes, 42,9% dos
trabalhadores declararam-se ex-fumantes e 35,7% não-fumantes. Cinco
trabalhadores (6%) não informaram o seu perfil tabagista. Configurando assim 49
indivíduos já expostos ao tabagismo e 30 indivíduos nunca expostos ao mesmo.
O fato do processo de trabalho em estaleiros predominar nesta população, a
caracteriza como uma população exposta a sílica e à misturas de substâncias
químicas, ou seja enquadrando-se em uma possível situação genotóxica. O
primeiro estudo 82 que demonstrou o aumento de danos ao DNA por ensaio
Cometa em uma população exposta à sílica também possuía o caráter da
multiexposição química devido ao fato de que a população avaliada ser composta
por trabalhadores de fundição e olaria com cargos e atividades diversas. Na
construção de navios e plataformas, os trabalhadores ficam muitas vezes
confinados em áreas sem ventilação, em uma atmosfera pobre em oxigênio e rica
em agentes tóxicos, como fumaças tóxicas de maçaricos e outros tipos de soldas.
Nestes ambientes de trabalhos confinados encontramos altas concentrações de
gases como, dióxido de carbono, monóxido de carbono, metano, sulfeto de
hidrogênio e vapores de hidrocarbonetos, e solventes.
Guimarães Joca, FJ 37
Tabela 3 - Características sócio-demográficas do Grupo de Trabalhadores estudado.
Indústria Naval Já trabalhou 59
Nunca trabalhou 25
Alfabetismo Sabe ler e escrever 58
Não sabe ler e escrever 2
Escolaridade
Ensino Fundamental incompleto 25
Ensino Fundamental completo 13
Ensino Médio incompleto 11
Ensino Médio Completo 8
Mais que o Ensino Médio 1
Sexo Masculino 84
Feminino 1
Ativo / Inativo Ativo 27
Inativo 56
Uso de Bebida Álcoólica Faz uso 30
Não faz uso 29
Tabagismo
Fumante 13
Ex-fumante 36
Não fumante 30
Tabagismo Já fumou 49
Nunca fumou 30
Idade Grupo1- 26 a 50,3 anos 43
Grupo2- 50,4 a 72 anos 41
Tempo de exposição Grupo 1 – até 23 anos 21
Grupo 3 – de 24 até 44 anos 58
4.1.1 Clínica dos trabalhadores expostos à sílica
Observou-se uma frequência de 47 trabalhadores diagnosticados como não-
silicóticos, e 35 trabalhadores com silicose diagnosticada. Entretanto, dois
trabalhadores não obtiveram diagnóstico fechado em relação à silicose.
Nas categorias da silicose diagnosticadas pelo exame de Raios-X ocorreu
uma freqüência que corresponde a 12 indivíduos na categoria 1; 13 indivíduos na
categoria 2; 6 indivíduos na categoria 3 e 50 indivíduos na categoria 0, “normal”.
Três indivíduos não tiveram suas categorias classificadas (Figura 8).
Guimarães Joca, FJ 38
Figura 8 - Distribuição das categorias da doença (silicose) classificadas de acordo com o Raio X por padrões técnicos da OIT (ILO, 1980)43 no grupo exposto á sílica.
O exame de prova respiratória apontou 19 trabalhadores com resultado
“normal”, 12 com distúrbios muito leves, 31 com distúrbios leves, 10 com
distúrbios moderados e somente 7 com distúrbios acentuados, sendo que 5
trabalhadores não realizaram o exame da prova respiratória (Figura 9). Os testes
de função pulmonar podem apresentar resultados importantes, sendo estes
complementares para o diagnóstico da doença ocupacional respiratória. Eles
podem auxiliar desde na avaliação de indivíduos com sintomas respiratórios de
uma forma geral como também na identificação de pacientes com a patologia na
forma subclínica ou em fase inicial. Além disso, permitem a especificação e
quantificação da incapacidade respiratória 13.
As provas de função pulmonar são indispensáveis na investigação das
doenças ocupacionais respiratórias que afetam vias aéreas, assim como no
estabelecimento de incapacidade em pacientes com pneumoconiose. A
espirometria é a forma de avaliação funcional mais corriqueira, rápido, de fácil
execução e baixo custo. Em geral, trabalhadores com função pulmonar alterada ou
com queixas respiratórias, tendem a não permanecer em funções de alta demanda
Guimarães Joca, FJ 39
física. Portanto, é comum o encontro de espirometrias normais em grupos expostos
a riscos respiratórios e, mesmo, em portadores de pneumoconioses 6.
Pilger e colaboradores 83 relacionaram e analisaram parâmetros de
indicadores genotóxicos em uma população de trabalhadores expostos à sílica
cristalina (quartzo) com informações provenientes de exames de provas
respiratórias. Mas, para isto, seriam necessários maiores conhecimentos em
pneumologia e uma satisfatória distribuição estatística para os dados fornecidos
pela prova respiratória. Porém, o presente trabalho compreende relatar os
resultados destes testes (Figura 9). Nesta população de trabalhadores expostos a
sílica, 16 indivíduos (19%) já desenvolveram tuberculose.
Figura 9 - Distribuição dos distúrbios respiratórios avaliados por espirometria no grupo exposto à sílica
4.2 Caracterização da população não-exposta (Grupo Laboratório)
A população do Grupo Laboratório é composta por 26 indivíduos que
possuem atividades laborais no Laboratório de Toxicologia do
CESTEH/ENSP/FIOCRUZ, e que não são ocupacionalmente expostos a sílica.
Todos os indivíduos sabem ler e escrever e 25 (96,15 %) possuem mais que o
ensino médio. A média das idades deste grupo foi de 28,6 anos (DP = 6,62), sendo
18 do sexo feminino e 8 do sexo masculino. Todos os 26 indivíduos são
Guimarães Joca, FJ 40
ocupacionalmente ativos no laboratório. O tempo médio de trabalho em
laboratório é de 7,1 anos (DP = 3,5), sendo o menor tempo de um ano e meio e o
maior de 13 anos.
Sobre os hábitos de vida dos indivíduos deste grupo, em relação ao
consumo alcoólico (fazer ou não fazer uso do álcool) foi encontrado uma
frequência de 65,4% (n = 17) de indivíduos que se autodeclararam usuários de
álcool e 26,9% (n = 7) de indivíduos que declararam não ingerir bebidas
alcoólicas. Apenas dois indivíduos (7,7%) não forneceram informação sobre este
hábito.
No que diz respeito ao tabagismo neste grupo, declararam-se como
fumantes 11,5% (n = 3) dos indivíduos, 7,7% (n = 2) como ex-fumantes e 73,1%
(n = 19) como não fumantes. Dois indivíduos não forneceram informações sobre
tabagismo. Este grupo não passou por avaliações clínicas ambulatoriais.
4.3 Avaliação da Exposição
Alguns estudos que avaliam o impacto genotóxico de exposições químicas
em populações se utilizam de grupos não expostos às mesmas substâncias
químicas, para fins comparativos, mesmo em populações que possuam diferenças
em padrões como idade, tempo de exposição e hábitos de vida, bem como
diferenças no número de indivíduos de ambos os grupos e freqüência de gêneros.
Dušinka e colaboradores 84 estudaram os efeitos genotóxicos do asbesto em
humanos, utilizando uma população exposta de 61 indivíduos e 21 não expostos.
Existiam diferenças significativas entre os grupos nas variáveis: sexo, tempo de
exposição e hábito de fumar. O estudo avaliou o impacto genotóxico através dos
testes do ensaio Cometa, micronúcleos, aberrações cromossomiais. Os resultados
demonstraram uma clara associação entre exposição asbestos e os biomarcadores
utilizados, não sendo encontrada esta associação no grupo não exposto à fibra.
Outro estudo avaliou a associação de polimorfismos e danos
cromossomiais, através de freqüências de MN e AC em trabalhadores exposto em
uma refinaria de petróleo na Coréia. O grupo exposto era composto de 108
trabalhadores diretamente expostos ao benzeno e 33 trabalhadores de escritório da
Guimarães Joca, FJ 41
mesma refinaria. Existiam diferenças significativas entre idade, tempo na
atividade, número de cigarros consumidos por ano (grupo exposto fumava
praticamente três vezes mais que o controle) e hábito de beber. Os resultados
demonstraram diferenças altamente significativas entra a freqüência de AC e MN
entre grupo exposto e controle indicando fortemente que a exposição crônica ao
benzeno ocasiona um relevante impacto genotóxico na população
ocupacionalmente exposta ao mesmo. Outros trabalhos que avaliavam o potencial
genotóxico em diversas exposições demonstram também diferenças entre variáveis
populacionais 85,86,87.
Estes aspectos comprovam que a exposição às substâncias químicas tem
uma relevância importante nos efeitos genotóxicos, de tal forma que algumas
variáveis com potencial de confundimento ficam suprimidas frente à intensidade
do efeito gerado pela exposição.
Os indicadores biológicos, Cometa UA, Cometa em %, atividade da GST e
da Catalase, avaliados nos dois grupos tiveram distribuição normal, com exceção
dos resultados do TNF que foram normalizados através da logaritmização.
Portanto, o log TNF foi utilizado para os cálculos. A Tabela 4 apresenta os
resultados dos indicadores biológicos no grupo expostos à sílica e no Grupo
Laboratório. A Figura 10 apresenta a distribuição dos indicadores nas amostras
populacionais estudadas. Foram encontradas diferenças significativas entre os
grupos populacionais para o ensaio Cometa e a atividade da enzima GST. Para o
Ensaio Cometa obteve-se um p = 0,000 de modo que a média da população
exposta a sílica foi significativamente maior que a média do grupo do laboratório,
e em relação à atividade da enzima GST obteve-se um p = 0,010 de maneira que a
média da população exposta a sílica foi menor que a média do grupo do
laboratório.
O resultado do Ensaio Cometa sinaliza o possível risco genético que se
encontram os trabalhadores desta população exposta à sílica e aponta a
necessidade de se melhor avaliar a mesma população quanto à situação genotóxica
que se encontram e o risco de desenvolverem câncer. Mostra também por medidas
de precaução o quanto é importante acompanhar clinicamente estes pacientes e
como seria importante eliminar a sílica cristalina e outros riscos químicos do
processo de trabalho dos mesmos. Além disso, estes resultados associados a outros
Guimarães Joca, FJ 42
estudos como Başaran e colaboradores 82 apontam o Teste do Ensaio Cometa como
um confiável e sensível método para a detecção de danos no DNA de células
individualmente mas como também sugerem este teste como um indicador
biológico de exposição a sílica.
Tabela 4 - Níveis dos Indicadores Biológicos no grupo Exposto à Sílica (Grupo
Sílica) e no grupo Laboratório (Grupo Laboratório)
p
Min Min
Max Max
8 5
99 21
8 5
72 21
14,91 19
59,45 41
0,41 1,5
3,32 4,1
2,8 -
283,4 -
0,45 -
2,45 -
Média SD
Grupo Sílica Grupo Lab
5,2
5,1
7,04
0,71
-
-0,52
12,17
12,08
30,87
2,35
-
-
SD
17,56
12,65
9,74
0,64
68,38
log TNF 19 - -
55,26
46,45
35,38
1,70
91,44
1,77
GST (Unid/mL
enzima)68 13 0,010
TNF 19 - -
31 12 0,000
Catalase (K/g
Hb)49 15 0,102
n n
Cometa (UA) 31 12 0,000
Média
Cometa (%)
Guimarães Joca, FJ 43
Figura 10 - Distribuição dos Indicadores Biológicos Cometa UA, Cometa % e GST (unidade) do Grupo Exposto à Sílica e do Grupo Laboratório
Møller 56, em um estudo de revisão de literatura, procurou demonstrar
fatores que influenciavam nos resultados do Ensaio Cometa e analisou diversas
padronizações em diferentes estudos realizados em vários países com populações
expostas à diferentes situações. Neste estudo bibliográfico, o autor propõe uma
possível faixa de valor de referência, para populações controles, de 7-11 Cometa
UA. No Grupo Laboratório a média encontrada para UA foi 12,17± 5,2, dentro da
faixa proposta pelo autor.
Neste grupo três indivíduos apresentaram valores em torno de 21 Cometa
UA. Estes indivíduos possuem, além das atividades de trabalho e a presença de
substâncias químicas, o hábito tabagista. Desta forma pode se atribuir, nestes
casos, uma contribuição deste hábito aos valores encontrados.
Os resultados da atividade da enzima GST, demonstram que a exposição à
sílica induziu estresse oxidativo nos trabalhadores avaliados com significância de
Guimarães Joca, FJ 44
p=0,001. É de amplo conhecimento que as EROs são mediadoras dos efeitos
induzidos pela sílica incluindo modificações no DNA, inflamação, fibrose e
injúrias e proliferação celular.
Além disso, se tem como um dos efeitos iniciais da exposição à sílica e fases
iniciais da silicose a depleção dos níveis de antioxidantes em diferentes tipos
celulares e fluídos biológicos. A GSH é um destes antioxidantes impactados. A
Glutationa e as enzimas que fazem parte do ciclo catalítico deste peptídeo tais como a
GST, apresentam associações com alterações dos estados antioxidantes e com o
aumento do estresse oxidativo 88,89.
A Glutatuiona-S-Transferase (GSTs) é uma classe de enzimas com
importante papel fisiológico. As GSTs catalisam a reação de elementos e radicais
oxidantes com o grupamento SH da glutationa neutralizando desta forma seus
sítios eletrofílicos. A determinação da atividade de enzimas deste complexo pode
indicar uma possível correlação entre a diminuição das atividades, como da GST e
o aumento nos níveis de bases de DNA lesadas devido ao dano oxidativo. Esta
interpretação reforça a hipótese de que reações podem levar à formação de
radicais livres podendo aumentar a quantidade de células malignas. A presença de
radicais livres tem sido correlacionada com um grande número de doenças,
indicando que estas espécies não têm um papel etiológico na grande maioria dos
estados patológicos, mas que participam diretamente dos mecanismos
fisiopatológicos que determinam a continuidade e as complicações presentes
nestes processos. Estas alterações implicam em lesões de DNA gerando processos
pré-mutagênicos e podendo levar, em alguns casos, ao câncer 36.
Os resultados encontrados neste estudo refletem estas afirmações. A
atividade da GST apresentou uma média menor na população exposta à sílica.
Neste grupo prevalecem os indivíduos não diagnosticados como doentes e os que
estão na fase inicial da doença.
Os resultados encontrados pelo teste do Ensaio Cometa e da atividade da
GST apontam para o efeito genotóxico primário e secundário que a exposição à
sílica e a silicose acarretam. O teste do Ensaio Cometa também é considerado um
método útil para entender questões relacionadas ao próprio estresse oxidativo em
linfócitos 66. Segundo Dusinska & Collins 49, este ensaio é um teste propício para
medir danos no DNA de diversos tipos em células como linfócitos em populações
Guimarães Joca, FJ 45
humanas seja em exposição ambiental ou ocupacional a diversos agentes
genotóxicos, incluindo substâncias químicas e ao próprio estresse oxidativo, sendo
útil para avaliações de risco.
Com relação ao TNF as análises só foram realizadas no Grupo Exposto a
Sílica. Não sendo possível a comparação entre os grupos.
De um modo geral, fibras e outros particulados possuem comportamento
peculiar frente aos testes de genotoxicidades, sendo seu mecanismo mais
complexo e ainda não totalmente compreendido. Estas peculiaridades têm relação
íntima com o processo inflamatório merecendo “cuidados” na avaliação de seus
efeitos. No passado os estudos se concentravam mais em sistemas de avaliação do
impacto genotóxico primário dos particulados, como, por exemplo, testes in vitro
que incubavam particulados diretamente com amostras de DNA em solução
aquosa. Tais estudos forneciam informações fundamentais, porém é necessária a
avaliação dos mecanismos de danos secundários, principalmente pela participação
de mediadores e diversos efeitos disparados pela exposição a estas substâncias 59.
Para os efeitos genotóxicos de particulados devem ser utilizados testes que
detectem danos ao DNA e alterações dos sistemas antioxidantes endógenos que
reflitam estes danos secundários oriundos do processo inflamatório e o
conseqüente estresse oxidativo. Deste modo tais ensaios permitem investigar e
detectar o comportamento destas fibras em uma potencial situação genotóxica.
Alguns estudos exemplificam estas evidências. Fanizza e colaboradores 90
demonstraram in vitro, através do Ensaio Cometa, o dano ao DNA de caráter
primário e secundário em uma linhagem de células do epitélio pulmonar humano
exposto a diferentes concentrações de um padrão de sílica livre respirável em
cultura de células. Neste estudo os dois tipos de danos foram observados bem
como a relação dose-resposta a tais efeitos. O teste do Ensaio Cometa se insere
nos testes de genotoxicidade que podem ser utilizados para detectar danos ao DNA
com peculiar sensibilidade, nas células de indivíduos expostos a particulados
como a sílica. A determinação da atividade da enzima GST contribui para elucidar
e detectar a participação de EROs na indução dos efeitos genotóxicos secundários.
Outro estudo que também exemplifica este fenômeno observado neste
estudo é o de Zhang e colaboradores 91 que demonstraram com clareza os efeitos
Guimarães Joca, FJ 46
citotóxicos e genotóxicos mediados pelo estresse oxidativo induzido pela
exposição à sílica cristalina em macrófagos alveolares de rato em cultura. Os
autores avaliaram o estresse oxidativo através da determinação do anion
superóxido (O2-) e a formação de H2O2. Alem disso, utilizou o Ensaio Cometa para
avaliar. O trabalho observa a indução da produção de EROs pela exposição à sílica
nestes tipos celulares, o impacto da exposição no sistema antioxidante enzimático
e através do Ensaio Cometa verifica o dano ao DNA causado por tais fenômenos.
Este estudo destaca o quanto é relevante o conhecimento destes mecanismos para
o desenvolvimento de estratégias que possam prevenir ou amenizar os mesmos.
Bașaran e colaboradores 82 demonstraram pela primeira vez o aumento do
dano do DNA em trabalhadores expostos a sílica, através do Ensaio Cometa. A
população de trabalhadores estudadas por Bașaran era oriunda de indústrias de
fundição e cerâmicas. Os resultados de Bașaran mostram a técnica do Ensaio
Cometa como uma promissora ferramenta para o monitoramento biológico de
populações humanas ocupacionalmente expostas a sílica. O presente estudo,
também encontra resultados semelhantes.
4.3.1 Expostos não-silicóticos x Expostos Silicóticos
A Tabela 3 apresenta os resultados dos indicadores biológicos avaliados
dentro da população de trabalhadores expostos à sílica. Foram criados dois
subgrupos desta população: trabalhadores expostos à sílica não doentes (n=47) e
doentes (n=35) para testar se o fator “doença” influenciaria significantemente os
parâmetros analisados. Não houve diferenças significativas para nenhum dos
indicadores. Isto reforça o quanto a exposição é crucial para os efeitos avaliados,
de tal modo que os efeitos da mesma são de tamanha ordem, que o “fator” doença
não altera estes danos.
Pilger e colaboradores 83 detectaram e mensuraram 8-
Hidroxideoxiguanosina, um marcador de lesão oxidativa de DNA, em sangue e
urina de pacientes silicóticos e trabalhadores expostos a quartzo. Os resultados
encontrados convergem com os resultados deste estudo e reforçam que a exposição
à sílica é o fator primordial para estes efeitos tendo o indivíduo desenvolvido
Guimarães Joca, FJ 47
silicose ou não. Neste trabalho, os autores não encontraram diferenças
significativas entre as médias dos níveis de 8-Hidroxideoxiguanosina nos
trabalhadores silicóticos afastados do trabalho e indivíduos que ainda eram
expostos, mas que não apresentavam a doença.
Os resultados deste estudo tornam mais fortes os argumentos de Pilger e
colaboradores 83. O Ensaio Cometa comportou-se como um bom marcador de
efeito da exposição à sílica, porém não parece ser uma ferramenta eficaz para
predizer a doença (silicose).
Além disso, a exposição à sílica parece possuir peculiaridades quanto à
dinâmica do contato deste agente tóxico e a temporalidade do mesmo. De modo
que, mesmo encerrada a intensa exposição à sílica, a mesma permanece em contato
com as células do indivíduo já exposto. Este pressuposto indica que o sistema de
“clearance” celular não consegue ser efetivo para este agente, permanecendo em
contato com o organismo do indivíduo. Desta forma, tem um significado relativo a
interrupção da exposição, pois o indivíduo, uma vez exposto, apresentará
conseqüências biológicas, apesar de cessada a exposição.
A exposição à sílica é impactante com uma magnitude que a faz predominar
em relação ao efeito da silicose. Segundo Donaldson & Tran 92, a inflamação
disparada pela exposição à sílica persiste após esta exposição. Estes fatos
permitem a discussão de que seria mais promissor o entendimento e
desenvolvimento de indicadores que consequentemente possibilitem o melhor
entendimento do impacto da exposição à sílica no organismo humano. Estes
indicadores devem revelar a dinâmica dos fenômenos relacionados como a indução
do estresse oxidativo, a inflamação desencadeada, e os danos genotóxicos
primários e secundários. Estes marcadores poderiam ser utilizados para identificar
precocemente eventos que poderiam ainda ser reversíveis.
Guimarães Joca, FJ 48
Tabela 5 - Indicadores biológicos avaliados dentro da população de trabalhadores expostos a sílica
p
0,32 0,651log TNF 11 1,72 0,64 8 1,83
0,65 0,446
TNF 11 99,95 84,63 8 79,74 38,98 0,540
GST (Unid/mL
enzima)36 1,74 0,61 31 1,62
16,70 0,486
Catalase (K/g
Hb)23 37,8 8,53 25 33,19 10,60 0,105
Cometa (%) 19 47,74 9,57 12 44,42
SD
Cometa (UA) 19 57,26 14,14 12 52,08 22,27 0,433
Exposto não-doente Exposto doente
n Média SD n Média
4.3.2 Idade
Para averiguar se a idade poderia estar atuando como fator de
confundimento para alguns dos indicadores biológicos mensurados, os
trabalhadores expostos foram agrupados em dois grupos de idade: Grupo 1 (de 26
a 50 anos) e Grupo 2 (de 51 a 72 anos). Não houve diferenças significativas entre
os dois grupos para nenhuma das análises biológicas (Tabela 6). Além disso, os
resultados sugerem que nos parâmetros onde ocorreram diferenças significativas
para os grupos expostos e não expostos à sílica, os efeitos da exposição tiveram
uma maior significância, não sendo a idade um fator importante.
Pilger e colaboradores 83 também não encontraram, em relação à idade,
diferença significativa para o parâmetro de dano ao DNA utilizado ao avaliar
população de trabalhadores expostos à sílica e pacientes silicóticos
Existem controvérsias na literatura sobre a influência do fator idade nos
resultados do teste do Ensaio Cometa. Møller 56 discute alguns aspectos que
podem influenciar nos resultados do Ensaio Cometa em populações “saudáveis”,
dentre eles a idade. Os resultados encontrados nesta revisão são contraditórios,
Guimarães Joca, FJ 49
não possuindo consenso, Cemeli, Baumgartner e Anderson 93 sugerem que os
fatores de confundimento tais como: gênero, idade, hábitos de vida, alimentação,
história genética dentre outros não devem ser analisados de forma isolada e que a
associação destes fatores com os indicadores biológicos tem uma dinâmica
complexa.
Tabela 6 - Indicadores Biológicos e o fator idade.
.
p
0,58 0,8151,79110,461,738log TNF
0,42480,34
0,79511,48
Grupo 1 Grupo 2
n Média SD n Média SD
Cometa (UA) 14 55 17,48 17 55,47 18,16 0,942
Cometa (%) 14 45,79 14,35 17 47
Catalase (K/g
Hb)20 37,273 9,73 29 34,07 9,70 0,262
GST (Unid/mL
enzima)33 1,76 0,68 35 1,64 0,60 0,460
TNF 8 76,23 48,42 11 102,50
Grupo 1 (de 26 a 50 anos) e Grupo 2 (de 51 a 72 anos).
4.3.3 Estaleiro
Uma atividade produtiva que há muito possui uma significante expressão no
que diz respeito à exposição ocupacional à sílica e a silicose é o setor de reparo e
construção naval. A operação de jateamento de areia é a principal causa desta
exposição oferecendo alto risco de silicose e é a atividade que mais apresenta
casos graves desta doença. Segundo a OIT 2, é importante notar que qualquer jato
abrasivo, mesmo que não contenha sílica, pode oferecer o risco à silicose, se usado
para remover materiais que contenham sílica, como resquícios de moldes de areia
em perfis metálicos. Ainda no relatório deste programa, a indústria naval possui
uma prevalência desta doença de 23,6% sendo a atividade de jateamento de areia a
principal causa.
Guimarães Joca, FJ 50
Com o objetivo de verificar se existiam diferenças significativas entre o
grupo exposto á sílica, os resultados dos indicadores biológicos foram comparados
segundo a atividade de trabalho. Nenhuma das análises apresentou diferença
significativa entre os dois grupos (Estaleiro n=59 / Não estaleiro n=25). Neste
estudo 35 indivíduos foram considerados silicóticos sendo que 19 destes
pertencem à indústria naval.
4.4 Raio-X e categorias da doença
Os processos inflamatórios, de uma maneira geral, em suas fases iniciais
apresentam um perfil mais agudo e intenso que é seguido de a uma cronificação do
mesmo onde começam a participar citocinas regulatórias que muitas vezes
coincidem com fenômenos fibrogênicos. Uma característica peculiar da silicose é
que o processo inflamatório é persistente e é sustentado pelos processos oxidativos
em todas as etapas da patologia 92.
Foram testados através de ANOVA diferenças significativas entre as
categorias Normal, Cat1, 2 e 3 e o grupo Laboratório. Não foram encontradas
diferenças significativas entre os resultados do Ensaio Cometa, da Catalase e do
TNF dentro do grupo exposto á sílica entre as diferentes classificações de Raios-X
(referentes às categorias da doença), através da aplicação do Teste de Student.
Somente foi encontrada diferença entre as categorias para a GST. A seguir estão
descritos os resultados, discriminados por indicador biológico (Tabela 7).
Guimarães Joca, FJ 51
Tabela 7 - Indicadores Biológicos e as diferentes Categorias de Raio X
-
-
-
15
12,08 g,h,i,j
30,87
13 2,35 l,m,n
-
Laboratório
n Média
12 12,17 c,d,e,f
123
Catalase (K/g Hb)
24 37,00
39,00 d 3
Cometa (%) 22 47,20 g 3 32,33 h
n Média n
Cometa (UA) 22 56,00 c 3
34,45
Categoria Normal Categoria 1
n Média
9
GST (Unid/mL enzima)
39 1,80 a,l 11 1,19 a,b,m
9
10
TNF 12 96,00 2 47,45 2
log TNF 12 1,70 2 1,51 2
Categoria 2 Categoria 3
Média n Média
62,33 e
1,58 n
89,60
1,94
3
3
5
6
3
3
59,00 f
50,00 j
34,50
2,00 b
104,00
2,00
51,33 i
31,13
. pa = 0,029 / pb = 0,043 / pcdefghij = 0,000 / plmn = 0,001
4.4.1 Ensaio Cometa
No que diz respeito ao Ensaio Cometa, todas as categorias de Raios-X do
grupo exposto à sílica possuíram resultados significativamente diferentes dos
resultados do Grupo Laboratório, sendo o p = 0,000.
Estes resultados confirmam os achados anteriores (Tabela 4) onde o grupo
de trabalhadores expostos à sílica apresentou valores bem mais altos do que o
Grupo Laboratório, evidenciando novamente o quanto à exposição a este
particulado é suficiente para gerar danos ao DNA dos linfócitos destes
trabalhadores. O fator doença não foi significativamente influente com relação a
este dano gerado, fato originado pela exposição. Este aspecto retoma a discussão
sobre a utilização do Cometa como um indicador relacionado à exposição à sílica,
independente das fases da doença. A Figura 11 apresenta a distribuição dos
valores de Cometa UA entre as categorias da doença e do Grupo Laboratório.
Guimarães Joca, FJ 52
laboratorioCategoria 3Categoria 2Categoria 1Normal
CATEGORIAS RX
100
80
60
40
20
0
Co
met
aUA
média=56 +/-14,1média=62,33+/-34,33
média=59 +/-11,53
média=39 +/-27,6 média=12,17+/-5,2
Figura 11 - Distribuição dos valores do Cometa UA entre as categorias da doença e no Grupo Laboratório
4.4.2 Catalase
Não foram encontradas diferenças significativas entre os resultados de
nenhum dos grupos e subgrupos no que diz respeito à atividade da Catalase. Isto
também confirma os achados anteriores (Tabela 3). Encontra-se na literatura
evidências da catalase desempenhar papel protetor em macrófagos alveolares de
rato expostos in vitro à sílica cristalina de modo a inibir significantemente a
toxicidade e o estresse oxidativo induzido pela exposição. Além disso, esta enzima
mostrou capacidade de evitar danos ao DNA induzidos pela exposição 91. Porém,
Yvonne e colaboradores 94, verificaram, em experimento in vivo, o aumento da
expressão de enzimas antioxidantes em ratos expostos à sílica. Para todas as
enzimas do sistema antioxidante avaliadas no estudo não foi encontrada alterações
significativas com relação à atividade. O mesmo não foi encontrado nos animais
expostos a amianto que tiveram aumento da atividade da enzima Catalase. Com
relação e expressão destas enzimas somente a Catalase não teve um incremento
nos animais expostos á sílica.
A catalase é uma enzima de difícil saturação de modo a conseguir reduzir
H2O2 em altas concentrações, porém sua eficiência algumas vezes é comprometida
pela baixa concentração deste substrato. A reação enzimática da catalase requer
duas moléculas de H2O2 93.
Guimarães Joca, FJ 53
4.4.3 GST
Os resultados para a atividade de GST apresentaram diferenças
significativas entre as seguintes categorias: Categoria “Normal” e a Categoria 1 (p
= 0,029) sendo a média da categoria normal superior à média da Categoria 1; entre
a Categoria 1 e a Categoria 3 (p = 0,043), de modo que a média da categoria 1 foi
inferior à média da Categoria 3.
Foram observadas diferenças significativas entre o Grupo laboratório e
determinadas categorias: entre o grupo laboratório e a Categoria “Normal”, a
Categoria 1, e a Categoria 2. Não houve diferença entre o Grupo laboratório
(média=2,3) e a Categoria 3 (média=2,0). Este fato demonstra uma recuperação
ao “longo” das categorias da doença, após uma inicial depleção. Estes resultados
vão ao encontro dos resultados já demonstrados anteriormente neste estudo, entre
os grupos expostos e não expostos e o comportamento dos sistemas antioxidantes
frente à exposição à sílica e à própria silicose, como já discutido acima. A Figura
12 apresenta a distribuição dos valores da atividade de GST entre as categorias e o
Grupo Laboratório.
Na exposição à sílica e no início do processo da silicose, existe uma inicial
depleção dos níveis de antioxidantes em diferentes tipos celulares e fluídos
biológicos frente ao estresse oxidativo. Este fato é seguido de uma recuperação
destes níveis. Além disso, já foi demonstrado que ocorre a diminuição dos níveis
da própria GSH nos pulmões na fase inicial da silicose e também apresenta um
aumento da mesma na fase mais tardia da patologia. O mesmo ocorre com a
relação à GSH eritrocitária que apresenta uma dinâmica ao longo das etapas da
doença similar à ocorrida pela mesma nos pulmões 88.
Outro fenômeno que talvez possa ajudar a entender esta dinâmica
relacionada à depleção e “recuperação” da atividade da enzima GST é a dinâmica
da responsividade imunológica e o característico processo inflamatório induzido
pela exposição à sílica e persistente na progressão da silicose. A persistência da
inflamação induzida pela exposição à sílica é sustentada justamente pela liberação
de oxidantes nos espaços alveolares que acarretam inclusive a ativação de
sinalizações celulares relacionadas ao aumento da expressão de citocinas pró-
Guimarães Joca, FJ 54
inflamatórias como a interleucina-1 e o próprio TNF- α 29. Além disso, a GSH é
um protetor antioxidante importantíssimo intra e extracelular frente a oxidantes,
que possui papel chave na sinalização e controle dos processos inflamatórios que
acometem os pulmões 46.
laboratorioCategoria 3Categoria 2Categoria 1Normal
CATEGORIAS RX
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
GS
T (
un
id/m
L e
nzi
ma)
154
66
56
média= 1,8+/-0,64média=1,58+/-0,62
média=2,0+/-0,42
média=1,19+/-0,46
média=2,35+/-0,71
Figura 12 - Distribuição dos valores da atividade de GST entre as categorias e o Grupo Laboratório
4.4.4 TNF
Os indicadores biológicos foram comparados entre os sub-grupos e não
foram observadas diferenças significativas entre o Grupo 1 e o Grupo 2 para
nenhum dos mesmos resultados, com exceção das médias dos dois grupos para o
log de TNF que apresentaram diferença significativa com um p igual a 0,028. A
distribuição deste parâmetro está representada na Figura 13.
Diversos tipos de evidência subsidiam que a patogênese da silicose envolve
o descontrole de fenômenos imunológicos 24. Portanto, é importante que se
entenda melhor como se comportam os processos imunológicos nesta
fisiopatologia. Algumas citocinas caracteristicamente alteradas na silicose podem
ser avaliadas como marcadores em tais estudos.
Guimarães Joca, FJ 55
Figura 13 - Distribuição do Log de TNF nos Grupos de idade.
Fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina pleiotrópicas expressa por
diferentes células frente a processos infecciosos ou a diversos tipos de injúria.
Esta citocina classicamente pró-inflamatória pode participar de processos
biológicos diversos como morte, proliferação e diferenciação celular. Isto
acontece tanto com implicações nos processos homeostáticas quanto no disparo
e/ou em processos patogênicos 95.
O TNF-α está não só relacionado como um elemento ativo no processo
inflamatório da silicose e no desenvolvimento da fibrose ocorrente na mesma,
mas, além disso, vem-se atribuindo a ele importante papel na carcinogenese
pulmonar induzida por poeiras. Estas características mostram como a influência
desta citocina não está “linearmente” restrita ao processo inflamatório de forma
isolada e direta, possuindo uma complexa mecanística biológica 24.
Já se demonstrou em rato a elevada expressão de TNF e também IL-1 em
células mononucleares e células dos sítios da lesão mesmo após a cessação da
exposição à sílica, demonstrando desta forma a importância desta citocina no
processo inflamatório persistente e lesivo nesta patologia 96.
O processo oxidativo inicial da exposição à sílica se mostra muito
importante no disparo dos mediadores dos fenômenos lesivos e persistentes da
silicose, como indica estudo de Gossart e colaboradores 97, onde se observa que
Guimarães Joca, FJ 56
em ratos expostos à sílica submetidos a um pré-tratamento com um
“neutralizador” de radicais livres, apresentam uma diminuição na produção de
ROS e de TNF em macrófafos alveolares e desta forma, revertiam o estado da
patologia pulmonar 96. Resultados similares foram encontrados por Barrett e
colaboradores 98 que observaram a diminuição da expressão e produção de TNF em
macrófagos murinos expostos à sílica que foram tratados com antioxidantes, como
dentre estes a GSH.
Um estudo experimental com ratos demonstrou que animais jovens
apresentam um aumento significativo de TNF e de células inflamatórias no lavado
broncoalveolar, o que não ocorre nos animais mais velhos.
Tal fenômeno também foi similarmente observado in vitro através de
ensaios com a exposição à sílica de macrófagos oriundos de animais mais velhos.
Corsini e colaboradores 99 já haviam demonstrado também em ratos o declínio com
a idade da produção de TNF em macrófagos alveolares em animais modelos de
silicose aguda. Nestes animais não só a produção de TNF é menor como também
um estresse oxidativo menos intenso.
Deste modo, especula-se que com o envelhecimento diminui a sensibilidade
para alguns efeitos da silicose, o que não se refere somente as citocinas bem como
também aos fenômenos do estresse oxidativo 99.
Os resultados apresentados neste estudo demonstram que os indivíduos
pertencentes ao Grupo 2 embora apresentam idades superiores bem como maior
tempo de exposição não apresentaram diferenças significativas, quando comparadas
com o Grupo 1. Estes aspectos não foram suficientemente fortes para demonstrar
alterações nos indicadores biológicos testados, com exceção do log de TNF.
4.5 Hábito de fumar
4.5.1 Na População exposta à sílica
A fim de averiguar se o tabagismo poderia estar influenciando os resultados
dos indicadores biológicos principalmente no que diz respeito aos resultados do
Guimarães Joca, FJ 57
Ensaio Cometa, foram formados dois sub-grupos no Grupo Exposto à sílica dos
indivíduos que “já fumaram” e que “nunca fumaram”. Não foram encontradas
diferenças significativas para nenhum dos parâmetros avaliados. Em estudo de
uma população de trabalhadores expostos a sílica e pacientes silicóticos, não foi
encontrada diferença significativa entre o hábito de fumar e os níveis 8-
hidroxideoxiguanisina, indicador de dano oxidativo no DNA, porém no grupo
silicótico houve correlação significativa dos níveis deste indicador, hábito de
fumar e o volume respiratório cruzado. Estes resultados indicam uma interferência
do tabagismo nestes parâmetros 83.
Mak e colaboradores 100 avaliaram o risco de Doença Pulmonar Obstrutiva
Crônica (DPOC) em indivíduos fumantes com a doença, comparando com
controles fumantes saudáveis, através da investigação da atividade das enzimas
Catalase e da Manganês Superóxido-Dismutase (Mn-SOD) e do polimorfismo -262
C>T e Ala16Val das respectivas enzimas. Não foram encontradas diferenças
significativas na distribuição dos diferentes genótipos ou freqüência de alelos
entre pacientes e controles para ambas as enzimas. Entre controles saudáveis ou
pacientes com DPOC, não foram observadas diferenças de atividade da SOD. A
Catalase eritrocitária apresentou atividade significativamente maior em pacientes
com DPOC que em controles saudáveis. O aumento na atividade catalase
eritrocitária em pacientes chineses com DPOC provavelmente indica disfunção no
sistema de defesa oxidante/antioxidante, porém não está claro se esse aumento é
compensatório ou um fator patogênico.
O mesmo tipo de estudo foi realizado, utilizando-se a atividade da enzima
GST e seus polimorfismos, com o objetivo de se determinar o papel dos genótipos
que regulam glutationa S-transferase (GST) e sua atividade plasmática na patogênese
da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Para tanto, foram avaliados 163
pacientes com DPOC e 163 controles saudáveis, ambos fumantes. Não houve
diferenças significativas na distribuição dos diferentes genótipos do polimorfismo do
GSTT1, GSTP1 e GSTM1 entre pacientes com DPOC e controles saudáveis. A
atividade da GST foi significativamente maior em pacientes comparados com os
controles, independentemente de suas diferenças genotipicas, não sendo encontrada
diferença de atividade entre os níveis de obstrução ao fluxo aéreo.
Guimarães Joca, FJ 58
4.5.2 No Grupo Laboratório
No Grupo Laboratório também foram formados dois subgrupos quanto ao
hábito de fumar em indivíduos que “já fumaram” e “nunca fumaram”, como pode
ser visto na Figura 18. Na maioria dos parâmetros não ocorreu diferença
significativa entre os subgrupos, mas quanto aos resultados do Ensaio Cometa,
observou-se diferença altamente significativa entre as médias dos subgrupos com
um p igual a 0,001. O subgrupo dos que “já fumaram” com uma média de 19,3 UA
± 2,1 e o subgrupo dos que “nunca fumaram” com uma média de 9,6 UA ± 3,4.
Figura 14 - Distribuição dos valores do Ensaio Cometa em relação ao hábito tabagista no Grupo laboratorio.
Em um estudo realizado por Lu e Morimoto 101, homens fumantes japoneses
foram avaliados quanto aos efeitos causados no DNA pelo cigarro, através de
ensaio Cometa. Quebras de DNA foram significativamente associadas aos anos de
fumo, à quantidade de maços de cigarro/ano e aos níveis de nicotina e alcatrão
(mg/dia). E os níveis de alcatrão mostraram ser preditores significativos do
momento de cauda do Cometa. Estes resultados sugerem que os níveis de
exposição ao cigarro por alcatrão e a nicotina (mg/dia) seriam um parâmetro
sensível na apreciação da genotoxicidade do cigarro nestes indivíduos.
Guimarães Joca, FJ 59
No entanto, segundo o levantamento realizado por Møller 56, o tabagismo
não se apresentou como um forte determinante de genotoxicidade detectado pelo
teste de Ensaio Cometa, sendo necessário um estudo mais consistente para afirmar
tal efeito.
É interessante ressaltar que o tabagismo se confirma como um fator de
exposição para o Ensaio Cometa no Grupo Laboratório, diferente do que se
observa na População de trabalhadores expostos a sílica. Estes resultados
confirmam que no caso dos trabalhadores expostos á sílica, a exposição
ocupacional parece sobrepujar um possível efeito do tabagismo nos níveis dos
indicadores. Enquanto no Grupo Laboratório, a exposição ocupacional não parece
ser fator importante, estando estes indivíduos mais susceptíveis aos efeitos do
tabagismo.
4.6 Correlações
4.6.1 Log TNF x Anos de exposição à sílica
Ao se correlacionar os resultados de TNF (que não apresentou distribuição
normal) normalizados em Log TNF com o tempo de exposição (em anos), foi
encontrada uma correlação negativa entre tais parâmetros (r= – 0,501, p=0,029 e
n = 19). Esta correlação mantém a tendência dos resultados encontrados ao
comparamos os níveis de TNF nos distintos grupos quanto ao tempo de exposição,
onde se observou no Grupo 1, com menor tempo de exposição uma média de Log
TNF superior ao valor da média do Grupo 2 que contém os trabalhadores com
maior tempo de exposição.
4.6.2 Idade x Anos de exposição à sílica
A correlação idade versus tempo de exposição obteve um r= 0,318, p=
0,004 e n de 80 trabalhadores. Esta correlação parece evidenciar que quanto mais
idoso for o indivíduo maior será o tempo de exposição. Estes indivíduos parecem
Guimarães Joca, FJ 60
permanecer no mesmo tipo de ocupação por muito tempo ampliando assim o
tempo de exposição.
4.6.3 GST x TNF normalizado por logaritimização (Log TNF)
Em relação à correlação feita entre os resultados da atividade da GST e
entre o log dos resultados do TNF obteve-se uma correlação positiva (r = 0,562,
p= 0,015 e n= 19). Esta correlação provavelmente se deve a dinâmica entre o
processo oxidativo e o processo inflamatório.
Os mediadores liberados pelos macrófagos através da interação entre os
mesmos e de suas interações com o microambiente alveolar “orquestram” diversos
fenômenos induzidos pela exposição à sílica e na silicose. Esta cadeia de eventos,
disparadas pela exposição, resulta em injúria pulmonar, inflamação resultante da
mesma, de maneira que podem possuir como desfecho histológico, a fibrose de
tecido pulmonar 102.
Em linhagem de células de macrófagos murinos expostos à sílica cristalina,
observou-se um decréscimo tanto nos níveis de RNAm para TNF, como mais
intensamente , nos níveis da proteína quando na presença de antioxidantes, dentre
os quais a GSH. A mensuração foi comparativa à mesma indução por exposição à
sílica na ausência dos antioxidantes utilizados. Alguns trabalhos sugeriram que
somente a exposição direta à própria partícula de sílica pode desencadear a
liberação de TNF induzida pela exposição. Isto sugere que na exposição à sílica a
capacidade de resposta dos macrófagos seria mediada pelo próprio estrese
oxidativo 98.
Gossart e colaboradores 97 sugeriram a participação do estresse oxidativo
induzido pela exposição à sílica na regulação da expressão de TNF em macrófagos
alveolares de rato. A inflamação não só induz o estresse oxidativo, mas como é
induzida pela mediação do mesmo.
Estes dados além de evidenciarem a relação do estresse oxidativo com o
aumento dos níveis de TNF na exposição à sílica sugerem que este pode
potencialmente determinar a expressão de TNF. Este fato associa os efeitos da
exposição à sílica e os mecanismos destes efeitos, que podem servir para a predição e
Guimarães Joca, FJ 61
antecipação de danos mais tardios e irreversíveis. Além disso, mostra a potencial
proteção aos efeitos da exposição à sílica gerada por antioxidantes, sugerindo que é
fundamental entender as modulações dos sistemas antioxidantes endógenos. A
compreensão destes fenômenos pode servir para utilização destes antioxidantes na
prevenção dos danos causados pela exposição á sílica.
A enzima GST situa-se intimamente inserida e envolvida no processo de
defesa endógeno frente a agentes oxidantes como os radicais livres geradores do
estresse oxidativo. Esta enzima multifuncional protege os componentes celulares
contra o estresse oxidativo que estes possam estar submetidos 103.
Castro 104 observou que pacientes silicóticos apresentavam elevados níveis
séricos de TNF nas primeiras fases da doença, mas em indivíduos da Categoria 3
estes níveis apresentavam valores menores.
Estes achados possuem uma relação com a habilidade da enzima GST em
responder prontamente a exposição à sílica e na silicose. Os resultados da
atividade da enzima GST que apresentam uma inicial depleção nas primeiras
etapas da silicose e em trabalhadores expostos à sílica “normais”, é acompanhada
de uma recuperação desta atividade na Categoria 3. Esta categoria apresenta uma
média que se aproxima do valor mediano dos indivíduos não expostos à sílica.
Estes achados podem refletir justamente esta dinâmica discutida sobre a relação
entre o estresse oxidativo e a expressão do TNF.
Deste modo, a atividade desta enzima, sua depleção, sustentação ou
aumento podem funcionar como indicadores do estresse oxidativo. Os achados
neste estudo indicam que esta enzima tem uma relação com o estado de estresse
oxidativo e podendo regular a expressão de TNF, permitindo assim sugerir que a
enzima GST tem uma capacidade preditora para a expressão de TNF induzida pela
exposição à sílica.
4.7 Análises de Regressão Linear
A partir das correlações obtidas foram conduzidas separadamente modelos
de análise de regressão linear controladas pela idade para verificar se os
parâmetros que se correlacionaram com o Log de TNF (Tempo de exposição (TE)
Guimarães Joca, FJ 62
e GST) poderiam predizer alterações significativas nos níveis deste indicador
(Figuras 19 e 20). A idade não interferiu nos modelos, não sendo considerada,
portanto um fator de confundimento (Tabela 5).
4.7.1 Modelo 1
Esta análise de regressão linear foi realizada pelo método “enter” onde a
variável dependente foi Log TNF e a independente TE. Neste modelo, os
resultados encontrados (r2 = 0,261 e p = 0,0026) demonstram que a capacidade da
variável tempo de exposição em predizer os níveis de Log TNF é de 26,1 %. Este
modelo de regressão apoia a discussão feita anteriormente sobre estas variáveis.
Além disso, devem ser levados em consideração fatores além da exposição efetiva
à sílica, como o período total de permanência da sílica nos pulmões, o período de
afastamento da exposição ou período de latência, que podem ter influência na
ocorrência de silicose. Neste estudo, o TE médio foi de 15,2 anos com mínimo de
1 ano e máximo de 45 anos. No presente estudo, o TE médio foi de 19 anos sendo
o tempo mínimo de 10 meses e máximo de 44 anos. Este resultado reforça a
afirmação, devendo a variável TE ser mais bem explorada nos estudos desta
doença ocupacional.
Figura 15 - Correlação da atividade da GST e os níveis de TNF.
Guimarães Joca, FJ 63
Figura 16 - Correlação do tempo de exposição à sílica e TNF
Guimarães Joca, FJ 64
Tabela 8 - Modelo de Regressão Linear com Variável Dependente: Log TNF
Regressão Linear com Variável Dependente: Log TNF
Variável Independente N Sig N r2 Sig r2 β Sig β
Modelo 1 -0,501 0,029 0,261 0,0026 0,237 0,04
GST
Modelo 2 0,562 0,008 0,316 0,01 0,692 0,12
Tempo de exposição
Obs: Ambos controlados pela idade
4.7.2 Modelo 2:
Esta análise de regressão linear foi realizada pelo método “stepwise” onde a
variável dependente foi Log TNF e as independentes: Tempo de Exposição e
Atividade da enzima GST. Neste modelo, a variável tempo de exposição foi
retirada pelo método e os resultados encontrados (r2 = 0,316 e p = 0,010)
demonstram que a capacidade da variável GST em predizer os níveis de Log TNF
é de 31,6 %. Este resultado possui expressiva plausibilidade biológica,
confirmando o envolvimento do estresse oxidativo na regulação da produção de
mediadores inflamatórios como o TNF, e desta forma sua influencia direta no
curso e/ou persistência da inflamação e conseqüentemente no desfecho fibrótico
do tecido pulmonar. Este achado permite sugerir que a atividade da enzima GST
pode ser utilizada nos estudos da silicose como um indicador biológico de efeito,
pois se envolve de maneira precoce nos eventos iniciais que antecedem os efeitos
irreversíveis desencadeados pela exposição à sílica.
4.8. Tuberculose / Doença
A exposição à sílica além de desencadear diversos efeitos impactantes ao
organismo humano, e desenvolver a doença silicose também pode disparar outras
fisiopatologias. A exposição à sílica tem sido relacionada ao desenvolvimento de
diversas doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide, lúpus eritematoso
sistêmico, esclerose sitêmica, e também doença renal crônica. A inflamação intensa
disparada pela exposição à sílica é uma característica em comum entre as patologias.
Guimarães Joca, FJ 65
Além, é claro do possível desenvolvimento de câncer pulmonar desencadeado pela
exposição 10,96.
Dentre as doenças associadas à exposição à sílica e à silicose, a tuberculose
tem destaque sendo conhecida como “silico-tuberculose”. A associação entre a
silicose e a tuberculose já é conhecida há muitos anos, e estudos recentes apontam
também que a exposição à sílica mesmo que sem desenvolvimento da silicose podem
aumentar a predisposição à tuberculose 14,105. Além disso, existem evidências
experimentais que a sílica altera os mecanismos de resposta imunológica dos pulmões
como o impacto prejudicial da exposição à sílica nas funções e atividades dos
macrófagos, propiciando desta forma, uma vulnerabilidade dos expostos à sílica a
exposição ao Bacilo de Koch, aumentando a chance do desenvolvimento da
Tuberculose nestes indivíduos 22.
Estima-se que o risco de trabalhadores silicóticos desenvolverem
tuberculose em relação a pacientes saudáveis controle varia de 2,8 a 49 vezes 22.
Com objetivo de avaliar a associação destas doenças neste estudo, foi realizado
um cálculo de Risco Relativo (RR) (Tabela 9).
Tabela 9 - Tabela de Contingência com Trabalhadores Doentes e Não Doentes que desenvolveram tuberculose.
Já teve Tuberculose 4 12 16
Nunca teve Tuberculose 42 23 65
Total 46 35 81
Exposto não doente Exposto doente Total/Tuberculose
Foi encontrado um RR de 3,8 (95 % de intervalo de confiança-0,162 e
0,921) para os trabalhadores silicóticos desenvolverem tuberculose, onde 75 %
destes que já tiveram tuberculose.
O risco estimado refere-se a “determinação” do fator doença (silicose) no
desenvolvimento da tuberculose. Estes resultados demonstram um importante risco
dos pacientes silicóticos de desenvolverem tuberculose. Isso demonstra o quanto a
mecanística desta fisiopatologia pode impactar de uma maneira global o sistema
imunológico do organismo silicótico. É claro que estes efeitos se somam a outros
Guimarães Joca, FJ 66
acarretados pela prévia exposição à sílica onde a inflamação desencadeada pela
exposição e sua persistência são fatores importantes para o desenvolvimento da
tuberculose.
É importante lembrar que nenhum dos trabalhadores do Grupo estudado,
possuía tuberculose “ativa” diagnosticada, tendo em vista que este era um critério
de exclusão dos sujeitos da amostra.
4.9. Tabagismo / Doença
Muitos estudos contemplam a multicasualidade das doenças associadas ao
tabagismo. O tabagismo na escala de reconhecimento como causa de doenças
pulmonares “ambientais, tem igual importância que as exposições ocupacionais.
Alguns efeitos e danos já são reconhecidamente oriundos da associação entre
exposições ocupacionais e o tabagismo. A exposição a poeiras minerais impacta,
de maneira distinta, indivíduos fumantes e não fumantes, de modo que,nos
fumantes, observa-se um predomínio de padrões obstrutivos. Apesar de ser difícil
a quantificação comparativa nas exposições isoladas, é notório que os efeitos da
exposição combinada são mais intensos que os efeitos da exposição isolada.
Alguns estudos mostram esta associação aditiva dos efeitos da exposição a
particulados como a poeira de carvão e à própria sílica associadas ao tabagismo 106.
Brown, 107 realizou um estudo onde fumantes com menor exposição
desenvolveram com mais freqüência a silicose do que indivíduos não fumantes que
foram expostos à doses similares de poeira cristalina. Estes dados realmente
refletem uma possível e relevante contribuição do hábito tabagista para o
desenvolvimento da silicose.
Foi observada uma freqüência dentro do grupo dos trabalhadores com
silicose diagnosticada (doentes) que corresponde a 68,75% de indivíduos que já
fumaram e 31,25% de indivíduos que nunca fumaram. Para o total de
trabalhadores expostos à sílica que nunca fumaram, 64,3% dos indivíduos não
foram diagnosticados como silicóticos e 35,7% de indivíduos com silicose
diagnosticada. No grupo dos trabalhadores expostos à sílica aqui estudados, não
Guimarães Joca, FJ 67
foi possível observar uma associação significativa entre tabagismo e silicose
(Tabela 10).
Tabela 10 - Trabalhadores silicóticos e não silicóticos e o hábito tabagista
Já Fumou 27 22 49
Nunca Fumou 18 10 28
Total 45 32 77
Exposto não doente Exposto doente Total/Tabagismo
4.10. Tabagismo / Tuberculose
O tabagismo está intimamente relacionado com a tuberculose. Uma alta
prevalência de tabagismo entre os fatores de risco para a tuberculose é encontrada
em diferentes estudos desde 1918 108.
A relação epidemiológica entre o hábito tabagista e a tuberculose é bastante
conhecida onde este hábito aumenta o risco da infecção e também está associado às
taxas e reincidência da doença e de mortalidade. Diferentes e recentes revisões
apontam o tabagismo fortemente associado com o aumento das taxas de infecção por
tuberculose. A literatura sugere que os fumantes são até duas vezes mais suscetíveis a
adquirirem tuberculose 108,109.
Neste estudo, os trabalhadores foram agrupados quanto ao hábito do tabagismo
formando em um mesmo grupo, os fumantes e os ex-fumantes (já fumaram) e os
trabalhadores que nunca fumaram no Grupo exposto á sílica. Entre os trabalhadores
que já tiveram tuberculose encontrou-se uma freqüência de 80% que já fumaram e
apenas 20 % nunca fumaram. Entre os trabalhadores que já apresentaram tuberculose
o número de trabalhadores que já fumaram é 4 vezes maior que o número de
trabalhadores que nunca fumaram. Entre os trabalhadores que nunca tiveram
tuberculose 57,8 % já fumaram e 24,3 % nunca fumaram (Tabela 11).
Os dados encontrados neste estudo não expressaram com significância o
hábito de fumar como um fator “determinante” para o desenvolvimento da
tuberculose. Estes trabalhadores já estão sujeitos às duas situações que
Guimarães Joca, FJ 68
contribuem para o desenvolvimento da tuberculose; a exposição à sílica e / ou à
silicose. O hábito de fumar aumenta o risco para infecções respiratórias diversas
através de alterações fisiológicas, desde disfunções vasculares, à desregulação do
sistema imunológico diminuindo a eficiência da resposta inflamatória no controle
de bactérias patogênicas, inclusive com a diminuição da liberação de citocinas
pró-inflamatórias necessárias para uma resposta imunológica efetiva. Atribui-se
também ao fumo o aumento da virulência bacteriana 110.
Tabela 11 - Quadro contendo os trabalhadores que já tiveram tuberculose e que já fumaram ou nunca fumaram.
Já Fumou 37 12 49
Nunca Fumou 27 3 30
Total 64 15 79
Nunca tiveram tuberculose Já tiveram tuberculose Total/Tabagismo
4.11 Sensibilidade e Especificidade do Ensaio Cometa
Com o intuito de testar a capacidade de predição do teste do Ensaio Cometa
foi aplicada a análise de curvas Receiver Operator Characteristic (ROC) através,
das atividades de Catalase e da GST, destes indicadores biológicos. Este método
testa a capacidade discriminatória de um teste para considerar casos “normais” e
“anormais”, considerando aí as possibilidades de acerto, falsos positivos e falsos
negativos. Embora este teste seja normalmente utilizado para diagnóstico de
doenças, também pode ser empregado em casos onde se deseja e testar à
sensibilidade e especificidade de indicadores.
Idealmente, a utilização da curva ROC que serve para avaliar acurácia
destes indicadores, tem também sido empregada em situações de ausência ou
imperfeição do padrão-ouro. Assim, mesmo que no presente estudo não se tenha o
padrão-ouro, optou-se pela utilização da curva ROC como uma investigação
adicional sobre as qualidades do índice de exposição.
Os resultados com melhor especificidade e sensibilidade obtidos foram 26 e
24 para Cometas em UA e %, respectivamente, sendo adotado o ponto de corte de
Guimarães Joca, FJ 69
25 UA. Este ponto de corte foi utilizado como “padrão” sendo o valor máximo
encontrado para o grupo não exposto, para testar os indicadores enzimáticos de
estresse oxidativo CAT e GST, sendo obtido para a Catalase o ponto de corte de
28,27 (sensibilidade = 80% e especificidade = 100%). Os resultados para a GST
não foram significativos.
Outro ponto de corte utilizado foi o valor de Ensaio Cometa de 40 UA, que,
também, foi utilizado testar os valores das atividades das enzimas Catalase e GST.
O valor de ponto de corte para a Catalase continuou sendo de 28,27 (sensibilidade
= 80% e especificidade= 100%) e os resultados para a GST não significativos.
Estes resultados encontrados confirmam a habilidade do Ensaio Cometa em
detectar com sensibilidade a exposição á sílica e sua estreita relação com o
estresse oxidativo.
Guimarães Joca, FJ 70
5 CONCLUSÕES
� O Ensaio Cometa demonstrou ser um método sensível e confiável na
detecção de danos no DNA, causados pela exposição à sílica, diferenciando
estatisticamente a população exposta da não exposta, sendo possível
considerá-lo um importante indicador de exposição e uma ferramenta útil
em avaliações de danos genéticos de populações expostas a agentes
potencialmente genotóxicos;
� A atividade da enzima GST pode ser utilizada nos estudos da silicose como
um indicador biológico de efeito, pois se envolve de maneira precoce nos
eventos iniciais que antecedem os efeitos irreversíveis desencadeados pela
exposição à sílica. Além disso, apresenta um comportamento dinâmico e
característico ao longo das etapas da silicose.
� Neste estudo foi confirmado o risco importante dos pacientes silicóticos
desenvolverem tuberculose. Isso demonstra o quanto a mecanística desta
fisiopatologia pode impactar o sistema imunológico destes indivíduos.
Estes efeitos se somam a outros acarretados pela prévia exposição à sílica
onde a inflamação desencadeada pela exposição e sua persistência são
fatores importantes para o desenvolvimento da tuberculose.
� O hábito de fumar evidenciou uma associação positiva com o
desenvolvimento da silicose e da tuberculose nos trabalhadores deste
estudo, refletindo desta forma o quanto o tabagismo impacta no sistema
imunológico, seja na susceptibilidade à infecções como no processo
inflamatório.
� Estes resultados confirmam que no caso dos trabalhadores expostos à sílica
a exposição ocupacional parece sobrepujar um possível efeito do tabagismo
nos níveis dos indicadores. Enquanto no Grupo Laboratório, o tabagismo
mostrou-se impactante.
Guimarães Joca, FJ 71
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. IARC - International Agency for Research on Cancer- World Health
Organization- Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans. 1997; 68: 41.
2. OIT - Organização Internacional do Trabalho. Programa Nacional de
Eliminação da Silicose (PNES). Proposta Preliminar, versão de 13 de
dezembro de 2001.
3. WHO - World Health Organization. Crystalline silica, quartz. Concise
International Chemical Assessment Document 24. Geneva. 2000.
4. FUBINI, B. Surface Chemistry and Quartz Hazard. Ann Occup Hyg. 1998;
42(8):521-30
5. MOREIRA LIMA, M. M. T. Universidade Estadual de Campinas -
Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo Dissertação de
Mestrado “Características da Poeira do Processo de Fabricação de Materiais
Cerâmicos para Revestimento: Estudo no Pólo de Santa Gertrudes” Maria
Margarida Teixeira Moreira Lima - Campinas SP. 2007.
6. NIOSH. Health Effects of Occupational Exposure to Respirable Crystalline
Silica - - HAZARD REVIEW - DEPARTMENT OF HEALTH AND
HUMAN SERVICES - Centers for Disease Control and Prevention National
Institute for Occupational Safety and Health - April 2002
7. MS - MINISTÉRIO DA SAÚDE - Secretaria de Atenção à Saúde -
Departamento de Ações Programáticas Estratégicas - Série A. Normas e
Manuais Técnicos - Saúde do Trabalhador - Protocolos de Complexidade
Diferenciada – Pneumoconioses – Brasília – DF – 2006
8. GREENBERG MI, WAKSMAN J, CURTIS J. Silicosis: A Review. Dis
Mon. 2007; 53:394-416,
9. DAHMANN D, TAEGER D, KAPPLER M, BÜCHTE S, D, MORFELD P,
D, BRÜNING T, PESCH B. Assessment of exposure in epidemiological
studies: the example of silica dust. Journal of Exposure Science and
Environmental Epidemiology. 2008; 18 (5): 452–461.
Guimarães Joca, FJ 72
10. STEENLAND K. One agent, many diseases: exposure-response data and
comparative risks of different outcomes following silica exposure.
American Journal of Industrial Medicine. 2005; 48 (1):16–23.
11. RIBEIRO, F. S. N.; CAMARGO, E. A. de; ALGRANTI, E.; WÜNSCH, V.
Exposição ocupacional à sílica no Brasil no ano de 2001. Revista Brasileira
de Epidemiologia. 2008; 11(1): 89-96.
12. WHO - NIOSH - HAZARD REVIEW - Health Effects of Occupational
Exposure to Respirable Crystalline Silica - DEPARTMENT OF HEALTH
AND HUMAN SERVICES - Centers for Disease Control and Prevention
National Institute for Occupational Safety and Health - April 2002
13. MENDES, R. Patologia do Trabalho. 2ª Edição. Atheneu. 2007.
14. TERRA FILHO, M.; SANTOS, U.P. Silicosis. J Bras Pneumol. 2006;32
(1):S41-S7
15. ROSENBERG B, LEVENSTEIN C, PANGLER ES. Change in the world of
occupational health: silica control, then and now. Journal of Public Health
Policy. 2005; 26: 192–202.
16. BREEDING, D. Controlling silica exposures - Occupational Health &
Safety; Oct 1998; 67, 10; ABI/INFORM Global
17. FUJIMURA N. Pathology and pathophysiology of pneumoconiosis. Current
Opinion in Pulmonary Medicine. 2000; 6 (2): 140-144
18. CASTRO, H. A.; SILVA, C. G. VICENTIN, G. Estudo das internações
hospitalares por pneumoconioses no Brasil, 1984-2003. Rev Bras
Epidemiol. 2005; 8(2): 150-60
19. MADL, A.K. et al.. State-of-the-science review of the occupational health
hazards of crystalline silica in abrasive blasting operations and related
requirements for respiratory protection - Journal of Toxicology and
Environmental Health, Part B, 11:548–608, 2008
20. GILBERTI RM, JOSHI GN, KNECHT DA. The Phagocytosis of Crystalline
Silica Particles by Macrophages. American Journal of Respiratory Cell And
Molecular Biology.2008; 39 (5): 619-627
Guimarães Joca, FJ 73
21. OKAMOTO, S. et al. Variation in the ratio of respirable particulates over
inhalable particulates by type of dust workplace. Int. Arch. Occup. Environ.
Health. 1998; 71: 111-116
22. BARBOZA CE, WINTER DH, SEISCENTO M, SANTOS UP, FILHO MT.
Tuberculose e silicose: epidemiologia, diagnóstico e quimioprofilaxia. J
Bras Pneumol. 2008; 34 (11):961-968
23. DING M, CHEN F, SHI X, YUCESOY B, MOSSMAN B, VALLYATHAN
V. Diseases caused by silica: mechanisms of injury and disease
development. International Immunopharmacology. 2002; 2-3: 173– 182
24. HUAUX, F. New developments in the understanding of immunology in
silicosis. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 2007;
7:168–173.
25. RAO, K.M.; PORTER, D.W.; MEIGHAN, T.; CASTRANOVA, V. The
sources of inflammatory mediators in the lung after silica exposure.
Environmental Health Perspectives. 2004; 112 (17): 1679-1685
26. SAPERSTEIN, S.; CHEN, L.; OAKES, D.; PRYHUBER, G.;
FINKELSTEIN, J. IL-1β augments TNF-α–mediated inflammatory
responses from lung epithelial cells. Journal Of Interferon & Cytokine
Research. 2009;29 (5): 273-284
27. POCIOT, F., COMPASSO, S., SCORZA, R., RICHIARDI, P., 1995.
Functional Analysis of a New Polymorphism in the Human TNF Alpha
Gene Promoter. Scand J Immunol. 42:501-504.
28. LOFT, S.; DENG, X.S.; TUO, J.; WELLEJUS, A.; SØRENSEN, M.;
POULSEN, H.E. Experimental study of oxidative DNA damage. Free Pad.
Res. 1998; 29 (6): 525-539
29. FUBINI, B; HUBBARD, A. Reactive oxygen species (ROS) and reactive
nitrogen species (RNS) generation by silica in inflammation and fibrosis.
Free Radical Biology & Medicine. 2003; 34 (12) 1507–1516
30. NADIF, R., BOURKARD, E., DUSCH, M., BERNADAC, P., BERTRAND,
J. P., MUR, J. M. AND PHAM, Q. T. Relations Between Occupational
Guimarães Joca, FJ 74
Exposure to Coal Mine Dusts, Erythrocyte Catalase and the Severy of Coal
Worker’s Pneumoconiosis. Occup. Environ Med. 1998; 55:533-540.
31. NADIF, R., JEDLICKA, A., MINTZ, M., BERTRAND, J-P.,
KLEEBERGER, S. AND KAUFFMANN, F. Effect of TNF and LTA
Polymorphisms on Biological Markers of Response to Oxidative Stimuli in
Coal Miners: a Model of Gene-Environment Interaction. J. Med. Genet.
2003; 40: 96-103
32. SABIR, H.U. & ÖZGÜNES, H. Correlation Between Clinical Indicators of
Lead Poisoning and Oxidative Stress Parameters in Controls and Lead-
Exposed Workers. Toxicology. 2004; 195:147-154.
33. PERRI-NADIF, R., PORCHER, J-M., DUSCH, M., MUR, J-M. AND
AUBURTIN, G. Erythrocyte Antioxidant Enzyme Activities in Coal Miners
from Three French Regions. Int Arch Occup Environ Health. 1998; 71: 257-
262
34. GURER-ORHAN, H.; SABIR, H.U.; ÖZGÜNES, H. Correlation Between
Clinical Indicators of Lead Poisoning and Oxidative Stress Parameters in
Controls and Lead-Exposed Workers. Toxicology 2004; 195:147-154
35. ENGELEN, J. J. M. et al. Blood Antioxidant Parameters at Different Atages
of Pneumoconiosis in Coal Workers. Envirn Health Perspect. 1990; 84:
165-172
36. BARREIROS, A. L. B.S.; DAVID, J. M; DAVID, J. P. Estresse oxidativo:
relação entre geração de espécies reativas e defesa do organismo Quim.
Nova. 2006; 29(1):113-123
37. SCHINS, R. P. F. Mechanisms of Genotoxicity of Particles and Fibers
Inhalation. Toxicology 2002; 14:57–78
38. ÖZTÜRK, O. & GÜMÜSLÜ, S. Age-Related Changes of Antioxidant
Enzyme Activities, Glutathione Status and Lipid Peroxidation in Rat
Erythrocytes After Heat Stress. Life Science. 2004; 75:1551-1565
39. MENEGON, A., BOARD, P. G., BLACKBURN, A. C., MELLICK, G. D.
L. E., COUTEUR, D. G. Parkinson-s Disease, Pesticides, and Glutathione
Transferase Polymorphisms. The Lancet 1998; 352:1344-1346
Guimarães Joca, FJ 75
40. AMDUR, M. O., DOULL, J., KLAASEN, C. D. Casarett and Doull’s
Toxicology. New York: Pergamon Press, 1991.
41. MATÉS, J. M., PÉRES-GÓMES, C., CASTRO, I. N. Antioxidant Enzymes
and Human Diseases. Clin Biochem. 1999; 32(8):595-603
42. ALTIN, R., ARMUTCU, F., KART, L., SAVRANLAR, A AND ÖZDEMIR,
H. Antioxidant Response at Early Stages and Low Grades of Simple Coal
Worker’s Pneumoconiosis Diagnosed by High Resolution Computes
Tomography. Int. J. Envirn. Health. 2004; 207:455-462.
43. ILO (International Labour Office) - Guideline for Use of ILO International
Classification of Radiographs of Pneumoconiosis. Occupational Safety and
Health Series 22. Geneva: World Health Organization, 1980
44. EVELO, C. T. A., BOS, R. P AND BORM, P. J. A. Decresed Glutathione
Content and Glutathione S-transferase Activity in Red Blood Cells of Coal
Miners whit Early Stages of Pneumoconiosis. Br J. Ind Med. 1993; 50: 633-
636.
45. CROSS, C.E.; VAN DER VLIET, A.; O'NEILL, C.A.; LOUIE, S.;
HALLIWELL, B. Oxidants, antioxidants, and respiratory tract lining fluids.
Environ Health Perspect. 1994; 102 (10):185-191
46. RAHMAN, I. Regulation of glutathione in inflammation and chronic lung
diseases. Mutation Research. 2005; 579: 58–80
47. RAHMAN, Q.; ABIDI, P.; AFAQ, F.; SCHIFFMANN, D.; MOSSMAN,
B.T.; KAMP, D.W.; ATHAR, M. Glutathione redox system in oxidative
lung injury. Critical Reviews in Toxicology. 1999; 29 (6): 543-568
48. RAHMAN, I. & MACNEE, W. Oxidative stress and regulation of
glutathione in lung inflammation. Eur Respir J. 2000; 16: 534-554
49. DUSINSKA, M. & COLLINS, A.R. The comet assay in human
biomonitoring: gene–environment interactions. Mutagenesis. 2008; 23 (3):
191–205
50. WEISBURGER, J.H. & WILLIAMS, G.M. The Distinction between
Genotoxic and Epigenetic Carcinogens and Implication for Cancer Risk.
Toxicol. Sci. 2000; 57: 4-5
Guimarães Joca, FJ 76
51. YENDLE, J.E.; TINWELL, H.; ELLIOT, B.M.; ASHBY, J. The genetic
toxicity of time: importance of DNA – unwinding time to the outcome of
single-cell gel electrophoresis assays. Mutation Research. 1997; 375:125-
136.
52. RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES; KANAN, E.
Mutagênese Ambiental. Editora da ULBRA 1a edição, 2003.
53. ALBERTINI, R. J., ANDERSON. D. B., DOUGLAS, G. R. et al. IPCS
guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in
humans, Mutation Research. 2000; 463: 111-172.
54. WHO - International Agency for Research on Cancer-IARC Monographs on
the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Silica. 1997; 68: 41
55. SCHINS, R. P. et al. Surface modification of quartz inhibits toxicity,
particle uptake, and oxidative DNA damage in human lung epithelial cells.
Chem. Res. Toxicol. 2002; 15(9): 1166-1173
56. MØLLER, P. The alkaline comet assay: towards validation in
biomonitoring of DNA damaging exposures. Basic & Clinical
Pharmacology & Toxicology. 2006; 98 (4): 336–345
57. ANDERSON, D.; YU, T.W.; MCGREGOR, D.B.. Comet assay responses as
indicators of carcinogen exposure. Mutagenesis. 1998; 13 (6) 539-555
58. OLIVE, P. L. & BANÁTH, J. P. The comet assay: a method to measure
DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 2006; 1 (1): 23-29
59. KNAAPEN, A.M.; ALBRECHT, C.; BECKER, A.; HÖHR, D.; WINZER,
A.; HAENEN, G.R.; BORM, P.; SCHINS, R.P. DNA damage in lung
epithelial cells isolated from rats exposed to quartz: role of surface
reactivity and neutrophilic inflammation. Carcinogenesis. 2002; 23 (7):
1111-1120
60. YAMANO ,Y.; KAGAWA, J.; HANAOKA, T.; TAKAHASHI, T.; KASAI,
H.; TSUGANE, S. & WATANABE, S. Oxidative DNA Damage Induced by
Silica in vivo Environmental Research 1995; 69(2)102-107
Guimarães Joca, FJ 77
61. GREIM, H.; BORM, P.; SCHINS, R.; DONALDSON, K.; DRISCOLL, K.;
HARTWIG, A.; KUEMPEL, E.; OBERDÖRSTER, G.; SPEIT, G. - Toxicity
of fibers and particles - report of the workshop held in Munich, Germany.
Inhalation Toxicology. 2001; 13:737–754,
62. DIZDAROGLU, M. Chemical determination of free radical-induced
damage to DNA. Free Radical Biology & Medicine. 1991; 10 (3-4): 225-
242
63. FAUST, F.; KASSIE, F.; KNASMÜLLER, S.; KEVEKORDES, S.;
MERSCH-SUNDERMANN, V. Use of primary blood cells for the
assessment of exposure to occupational genotoxicants in human
biomonitoring studies. Toxicology. 2004; 198: (1-3): 341–350.
64. TICE, R.R.; AGURELL, E.; ANDERSON, D.; BURLINSON, B.;
HARTMANN, A.; KOBAYASHI, H.; MIYAMAE, Y.; ROJAS, E.; RYU, J-
C.; SASAKI, Y.F. Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines for In Vitro
and In Vivo Genetic Toxicology Testing. Environmental and Molecular
Mutagenesis. 2000; 35: 206-221
65. KASSIE, F.; PARZEFALL, W. & KNASMÜLLER, S. Single cell gel
electrophoresis assay: a new technique for human biomonitoring studies.
Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 2000; 463 (1): 13–31
66. ANDERSON, D.; YU, T.-W.; PHILLIPS, B.J. & SCHMEZER, P. The effect
of various antioxidants and other modifying agents on oxygen-radical-
generated DNA damage in human lymphocytes in the comet assay.
Mutation Research, 1994; 307(1): 261-271.
67. HARTMANN, A; PLAPPERT, U; POETTER, F; SUTER. W; Comparative
study with the alkaline Comet assay and the chromosome aberration test.
Mutation Research/ Genetic toxicology and environmental mutagenesis.
2003; 536 (1-2): 27–38
68. BOECK, M. L.; TOUIL, N.; VISSCHER, G.; VANDE, P. A.; KIRSCH-
VOLDERS, M. Validation and implementation of an internal standard in
comet assay analysis Mutation Research 2000; 469: 181-197
Guimarães Joca, FJ 78
69. COLLINS, A. R.; OSCOZ, A. A.; BRUNBORG, G.; GAIVÃO, I.;
GIOVANNELLI, L.; KRUSZEWSKI, M.; SMITH, C.; ŠTĚTINA, R. The
comet assay: topical issues. Mutagenesis. 2008; 23 (3): 143–151
70. OSHIDA, K.; IWANAGA, E.; MIYAMOTO-KURAMITSU, K.;
MIYAMOTO Y. An in vivo comet assay of multiple organs (liver, kidney
and bone marrow) in mice treated with methyl methanesulfonate and
acetaminophen accompanied by hematology and/or blood chemistry. J
Toxicol Sci. 2008;33 (5):515-24
71. KUMARAVEL, T.S., VILHAR, B.; FAUX, S.P.; JHA, A.N. Comet Assay
measurements: a perspective. Cell Biol Toxicol. 2009; 25 (1): 53–64
72. MOTA, M. A.; NERY, V.; ZAMITH, H.; ABRANTES, S. Determinação da
migração do pentaclorofenol (PCF) a partir de madeira para alimentos por
eletroforese capilar e avaliação do potencial de toxicidade. Revista
Analytica 2007 (29): 67
73. COLLINS, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair. Principles,
Applications, and Limitations. Molecular Biotechnology. 2004; 26 (3): 249-
261.
74. CDC - Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for
preventing the transmission of Mycobacterium tuberculosis in health-care
facilities. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 1994; 43(RR-15):1-104
75. ATS - Standardization of Spirometry-1987 update. Statement of the
American Thoracic Society. Am Rev Respir Dis. 1987;136(5):1285-98
76. AEBI, H. Catalase in Vitro. Methods in Enzymology. 1984; 105: 121-126
77. HABIG, W.H. & JAKOBY, W.B.Assay for Differentiation of Glutathione
S-Transferases. Methods Enzymol. 1981; 77: 398-405
78. SPEIT, G.; TRENZ, K.; SCHÜTZ, P.; ROTHFUß, A.; MERK, O. The
influence of temperature during alkaline treatment and electrophoresis on
results obtained with the comet assay. Toxicology Letters. 1999; 110:73–78
Guimarães Joca, FJ 79
79. SILVA, J. DA; FREITAS, T. R. O.; MARINHO, J. R.; SPEIT, G.;
ERDTMANN, B. An alkaline single-cell gel electrophoresis (comet) assay
for environmental biomonitoring with native rodents Genetics and
Molecular Biology 2000; 23(1):241-245
80. LIMA, R. C et al. Associação entre as características individuais e sócio-
econômicas e os acidentes do trabalho em Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil. Cad. Saúde Pública. 1999; 15(3):569-580
81. ZWERLING, C.; SPRINCE, N. L.; WALLACE, R. B.; DAVIS, C. S.;
WHITTEN, P. S. & HEERINGA, S. G., Risk factors for occupational
injuries among older workers: An analysis of health and retirement study.
American Journal of Public Health. 1996; 86:1306-1309
82. BAŞARAN, N.; SHUBAIR, M.; ÜNDEĞER, Ü.; KARS, A. Monitoring of
DNA damage in foundry and pottery workers exposed to silica by the
alkaline comet assay. America, Journal of Industrial Medicine. 2003; 43:
(6) 602–610
83. PILGER, A. et al. 8-Hydroxydeoxyguanosine in leukocyte DNA and urine
of quartz-exposed workers and patients with silicosis. International
Archives of Occupational and Environmental Health. 2000; 73: (5) 305-310
84. DUŠINSKA, M. et al. Genotoxic effects of asbestos in humans. Mutation
Research. 2004; 553: 91–102
85. ROOS, F. et al. Assessment of potential damage to DNA in urine of coke
oven workers: an assay of unscheduled DNA synthesis. Occupational and
Environmental Medicine. 1997; 54:854-860
86. NARAVANENI, R.; JAMIL, K. Determination of AChE levels and
genotoxic effects in farmers occupationally exposed to pesticides. Human
& Experimental Toxicology. 2007; 26: 723–731
87. BHALLI, J. A. et al. DNA Damage in Pakistani AgriculturalWorkers -
Exposed toMixture of Pesticides. Environmental and
MolecularMutagenesis. 2009; 50:37-45
Guimarães Joca, FJ 80
88. GULUMIAN, M. et al. Mechanistically identified suitable biomarkers of
exposure, effect, and susceptibility for silicosis and coal worker’s
pneumoconiosis: a comprehensive review. Journal of Toxicology and
Environmental Health, Part B. 2006; 9:357–395
89. GUTIERREZ, L. Avaliação do estresse oxidativo sistêmico e órgão-
específico na intoxicação crônica por cloreto de mercúrio – Dissertação de
mestrado – Universidade Federal do Rio Grande do Sul – 2002
90. FANIZZA, C. et al - Cytotoxicity and DNA-damage in human lung
epithelial cells exposed to respirable α-quartz. Toxicology in Vitro. 2007;
21: 586–
91. ZHANG, Z.; SHEN, H. M.; ZHANG, Q. F.; ONG, C. N. Involvement of
oxidative stress in crystalline silica-induced cytotoxicity and genotoxicity
in rat alveolar macrophages. Environmental Research Section A. 2000; 82:
245-252
92. DONALDSON, K.; TRAN, C. L. Inflammation caused by particles and
fibers. Inhalation Toxicology. 2002; 14:5–27
93. CEMELI, E.; BAUMGARTNER, A.; ANDERSON, D. Antioxidants and the
comet assay. Mutation Research. 2009; 681: 51–67
94. YVONNE, M. W. et al. - Expression of Antioxidant Enzymes in Rat Lungs
after Inhalation of Asbestos or Silica - The Journal of Biological
Chemistry. 1992; 267(15): 10625-10630
95. OIKONOMOU, N. et al () Soluble TNF Mediates the Transition from
Pulmonary - Inflammation to Fibrosis. PLoS ONE. 2006; 1(1): 108
96. RIMAL, B.; GREENBERG, A. K.; ROM, W. N. Basic pathogenetic
mechanisms in silicosis: current understanding. Current Opinion in
Pulmonary Medicine. 2005; 11:169–173
97. GOSSART, S. et al.. - Reactive Oxygen Intermediates as Regulators of
TNF-α Production in Rat lung Inflammation Induced by Silica. The Journal
of Immunology. 1996;156: 1540-1548
Guimarães Joca, FJ 81
98. BARRETT, E. G.; JOHNSTON, C.; OBERDÖRSTER, G.; FINKELSTEIN,
J.N. Antioxidant treatment attenuates cytokine and chemokine levels in
murine macrophages following silica exposure. Toxicology and Applied
Pharmacology. 1999; 158 (3): 211–220
99. CORSINI, E.; GIANI, A.; LUCCHI, L.; PEANO, S.; VIVIANI, B.;
GALLI, C. L.; MARINOVICH, M. Resistance to acute silicosis in
senescent rats: role of alveolar macrophages. Chem. Res. Toxicol. 2003; 16:
1520-1527
100. MAK, J.C.W. et al. Polymorphisms and functional activity in
superoxide dismutase and catalase genes in smokers with COPD. - (2007)
Eur Respir J 2007; 30: 684–690 -
101. LU, Y.; MORIMOTO, K. Exposure level to cigarette tar or nicotine is
associated with leukocyte DNA damage in male Japanese smokers.
Mutagenesis. 2008; 23(6):451-5.
102. KELLY, M.; KOLB, M.; BONNIAUD, P.; GAULDIE, J. Re-evaluation
of fibrogenic cytokines in lung fibrosis. Current Pharmaceutical Design,
2003; 9: 39-49
103. GOTO, S. et al. Glutathione S-transferase π localizes in mitochondria
and protects against oxidative stress. Free Radical Biology & Medicine.
2009; 46 (10): 1392–1403
104. CASTRO, H. A. Busca de marcadores inflamatórios Il-1β, Il-6 e TNF
α em trabalhadores expostos a poeiras minerais. [Tese]. Rio de Janeiro
(RJ); Escola Nacional de Saúde Pública – FIOCRUZ, 2000. 169p
105. REES, D.; MURRAY, J. Silica, silicosis and tuberculosis. Int J Tuberc
Lung Dis. 2007; 11(5):474–484
106. ALGRANTI, E. Tabagismo e ocupação: elo de exposições pouco
explorado como estratégia de combate ao tabagismo. Jornal de
Pneumologia. 2001; 27 (4): VII-VIII
107. BROWN, T. Silica exposure, smoking, silicosis and lung cancer-
complex interactions. Occupational Medicine. 2009;59:89–95
Guimarães Joca, FJ 82
108. SLAMA, K. et al.Tobacco and tuberculosis: a qualitative systematic
review and meta-analysis. Int J Tuberc Lung Dis. 2007; 11(10):1049–1061
109. SIDDIQI, K.; LEE, A. C. An integrated approach to treat tobacco
addiction in countries with high tuberculosis incidence. Tropical Medicine
and International Health. 2009; 14 (4): 420-428
110. BAGAITKAR, J.; DEMUTH, R. D.; SCOTT, D. A. Tobacco use
increases susceptibility to bacterial infection. Tobacco Induced Diseases.
2008; 4:12
Recommended