View
41
Download
6
Category
Preview:
DESCRIPTION
Metodos de análisis microbiologicos de alimentos
Citation preview
1
MANUAL DE PRCTICAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA BASICA
Y
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE NUTRICION
ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA
Y PARASITOLOGIA
DPTO. CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS ICB, UACJ.
DRA. EVANGELINA OLIVAS E. Y
M. EN C. LUIS ROBERTO ALARCON
2
AGRADECIMIENTOS:
A TODOS LOS PROFESORES DE LA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA Y
PARASITOLOGIA, POR SUS VALIOSAS SUGERENCIAS EN LA ELABORACION DE ESTE
MANUAL.
3
CONTENIDO: Pag.
Portada.1
Agradecimientos..2
Contenido..3
Reglamento de laboratorios4
Introduccin a la Microbiologa.6
Bacteriologa7
Prctica # 1 Microscopa.9
Prctica # 2 Inoculacin y Aislamiento de Bacterias .12
Prctica # 3 Tcnicas Microscpicas de Bacterias .........16
Prctica #4 Medios de Cultivo ....20
Prctica # 5 Nutricin Microbiana .24
Prctica # 6 Factores Fsicos sobre microorganismos...26
Prctica # 7 Crecimiento Bacteriano..28
Prctica # 8 Metabolismo Bacteriano....33
Prctica # 9 Variaciones Genticas.. ..40
Prctica # 10 Control de los Microorganismos, efecto de agentes qumicos....42
Prctica # 11Microbiota Normal Humana ....44
Prctica # 12 Relacin Husped Parsito....46
Prctica # 13 Bacterias en el Ambiente..49
Prctica # 14 Eumycetos...51
Prctica # 15 Protozoarios.54
2 PARTE Microbiologa Alimentos..56
Bibliografia ..102
4
REGLAMENTO PARA ESTUDIANTES
INTRODUCCION
Este reglamento regir la actitud, el comportamiento y el desempeo del estudiante
dentro de los laboratorios de Microbiologa y tiene como finalidad evitar riesgos al personal y
estudiantes que laboran en l, ya que el laboratorio es un rea donde se manejan
microorganismos patgenos, parsitos y algunos compuestos qumicos peligrosos. Asimismo, se
debe cuidar el equipo valioso como son los microscopios y el material delicado como la
cristalera.
REGLAS
1. Todos los alumnos debern asistir con bata blanca larga y el cabello recogido. 2. La entrada al laboratorio quedar restringida exclusivamente a los alumnos inscritos 3. Se PROHIBE INTRODUCIR AL LABORATORIO CUALQUIER ALIMENTO O
BEBIDA, para evitar el riesgo de contaminacin con microorganismos patgenos.
4. Est estrictamente PROHIBIDO FUMAR dentro del laboratorio. 5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debindose colocar estas
en los lockers de la entrada de
6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se deber comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de contaminacin con los
microorganismos patgenos o parsitos manejados en las prcticas.
7. Se nombrar un jefe de mesa quien ser el responsable del cuidado del material y equipo y de que la mesa quede aseada y desinfectada. Tambin vigilar que todos los integrantes
de la mesa se laven las manos con antisptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibir
del profesor los microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo
de las prcticas, y posteriormente los devolver en las mismas condiciones que los
recibi, a excepcin de los materiales especiales indicados por el profesor. (ejemplo
cultivos). En caso de algn dao al material o aparatos, los alumnos integrantes del
equipo estarn obligados a reparar dicho dao en forma que indique el profesor.
8. Para tener derecho a la evaluacin final en la teora, el alumno deber tener el 80 % de asistencia.
9. Para poder tener derecho a la asistencia se dar 10 minutos como retardo 10. La calificacin final de la materia de Microbiologa quedar constituida por la puntacin
obtenida en la prctica y en la teora, cuya suma se efectuar en la forma siguiente:
a) La calificacin final obtenida en el laboratorio tendr un valor del 30 % de la calificacin final total.
b) La calificacin total de la teora corresponder al 70 % de la calificacin final. c) La suma de ambas calificaciones (teora y prctica) ser igual al 100 %. d) El alumno no podr acreditar la materia si obtiene calificacin reprobatoria en el
laboratorio o en la teora. Debe aprobar ambas para promediarse.
11.- El alumno deber capacitarse con la NOM-087 sobre la Separacin, Tratamiento y
Destino de los Residuos Biolgico- Infecciosos
5
Introduccin.- El Sistema Nacional de Salud debe garantizar la prestacin de servicios para
promocin, prevencin, diagnstico, tratamiento y rehabilitacin de la salud, regulando los
servicios mdicos para que respondan a las demandas y necesidades de la poblacin.
Los servicios mdicos deben ser de alta calidad en todos los establecimientos,
independientemente del subsector de salud al que pertenezcan, ya sea pblico, social o privado.
Las soluciones tecnolgicas que se instrumenten en los establecimientos objeto de esta norma,
deben ser el resultado de las demandas de actividades de promocin y prevencin de la salud, as
como aqullas dirigidas al diagnstico y tratamiento de las diversas patologas. Se debe indicar
qu tecnologas diagnsticas, teraputicas y de rehabilitacin se utilizarn en los
establecimientos mdicos para atender correctamente tales demandas, lo cual integra el programa
mdico.
La indicacin o el uso de las tecnologas para la salud dependen de la motivacin, de los
conocimientos, de las habilidades y las capacidades del personal de salud y de una correcta
organizacin funcional de los establecimientos de atencin que asegure realizar las actividades
mdicas. Para ello es indispensable contar con una adecuada integracin de la infraestructura y el
equipamiento.
En esta norma se presentan los requisitos mnimos de infraestructura y equipamiento para
hospitales y consultorios de atencin mdica especializada, incluyendo la infraestructura y el
equipamiento para ejercer actividades directivas y de formacin de personal de salud, establecido
como obligatorio por la Ley General de Salud y su Reglamento en materia de prestacin de
Servicios de Atencin Mdica.
1. Objetivo
Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos mnimos de
infraestructura y de equipamiento para los hospitales y consultorios que presten atencin mdica
especializada.
2. Campo de Aplicacin Esta Norma Oficial Mexicana es obligatoria para todos los hospitales
de los sectores pblico, social y privado, cualquiera que sea su denominacin, que realicen
internamiento de enfermos para la ejecucin de los procesos de diagnstico, tratamiento mdico.
6
MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA
INTRODUCCION.
La microbiologa es la rama de la biologa encargada del estudio de los microorganismos, seres
vivos pequeos (del griego mikros "pequeo", bios, "vida" y - -loga, tratado, estudio, ciencia), tambin conocidos como microbios. Es la ciencia de la biologa
dedicada a estudiar los organismos que son slo visibles a travs del microscopio: organismos
procariotas y eucariotas simples. Son considerados microbios todos los seres vivos
microscpicos, estos pueden estar constituidos por una sola clula (unicelulares), as como
pequeos agregados celulares formados por clulas equivalentes (sin diferenciacin celular);
estos pueden ser eucariotas (clulas con ncleo) tales como hongos y protistas, procariotas
(clulas sin ncleo definido) como las bacterias. Sin embargo la microbiologa tradicional se ha
ocupado especialmente de los microorganismos patgenos entre bacterias, virus y hongos,
dejando a otros microorganismos en manos de la parasitologa y otras categoras de la biologa.
Aunque los conocimientos microbiolgicos de que se dispone en la actualidad son muy amplios,
todava es mucho lo que queda por conocer y constantemente se efectan nuevos
descubrimientos en este campo. Tanto es as que, segn las estimaciones ms habituales, slo un
1% de los microbios existentes en la biosfera han sido estudiados hasta el momento. Por lo tanto,
a pesar de que han pasado ms de 300 aos desde el descubrimiento de los microorganismos, la
ciencia de la microbiologa se halla todava en su infancia en comparacin con otras disciplinas
biolgicas tales como la zoologa, la botnica o incluso la entomologa.
Al tratar la microbiologa sobre todo los microorganismos patgenos para el hombre, se
relaciona con categoras de la medicina como patologa, inmunologa y epidemiologa.
La Microbiologa se puede definir, sobre la base de su etimologa, como la ciencia que trata de
los seres vivos muy pequeos, concretamente de aquellos cuyo tamao se encuentra por debajo
del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga
determinado por la metodologa apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los
microorganismos. Con la invencin del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue
de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 aos
su progreso se limit casi a una mera descripcin de tipos morfolgicos microbianos, y a los
primeros intentos taxonmicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los "sistemas
naturales" de los Reinos Animal y Vegetal.
Tras la Edad de Oro de la Bacteriologa, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch, la
Microbiologa qued durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada,
estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Qumica, que le
aportara varios avances metodolgicos fundamentales.
7
BACTERIOLOGIA
La Bacteriologa es una disciplina de la Microbiologa, que ha estado presente a lo largo de la
historia de la humanidad.
Las bacterias son responsables de millones de muertes de personas a nivel mundial.
Entre algunas enfermedades infecciosas bacterianas, causantes de grandes epidemias que han
mermado la poblacin, se encuentran: la difteria, clera, tuberculosis, sfilis, ttanos, tos ferina, y
fiebre tifoidea. Sin embargo, tambin existen infecciones bacterianas que aunque estn asociadas
en menor frecuencia como causa de muerte, son un problema de salud pblica en pases en vas
de desarrollo como el nuestro, entre las que podemos mencionar: diarreas (causadas por Shigella
o Escherichia coli), infecciones de vas urinarias, faringoamigdalitis, gonorrea, tracoma y
brucelosis.
CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS
De acuerdo al rbol de la Vida de Woese, microbilogo creador de la nueva taxonoma
molecular basada en la comparacin entre especies de la fraccin 16s del ARN ribosomal, se
proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los que se incluye a todos los seres
vivos, aunque existen controversias.
Los dominios Archeae y Bacteria corresponden a las clulas procariotas, una de cuyas
caractersticas es la de carecer de membrana nuclear. Con base en el estudio de fsiles y
modelos, se calcula que emergieron hace unos 3.6 - 4 billones de aos. Su importancia radica en
el hecho de haber desarrollado una pared celular o membrana externa que les confiri, desde el
principio, de autonoma y proteccin con respecto a su medio ambiente. Desde entonces
constituyeron la forma de vida ms abundante en el planeta en trminos de biomasa y nmero de
especies. A pesar de su menor complejidad en relacin a Eucarya, los integrantes de los
8
dominios Archeae y Bacteria pueden vivir en hbitats extremos: se les encuentra en las
profundidades de la Tierra, sobreviviendo gracias al lento catabolismo del carbono orgnico
depositado en los sedimentos, y en las profundas fuentes hidrotermales submarinas.Se acepta la
aparicin del dominio Eukarya, con membrana nuclear y orgnulos ms desarrollados, desde
hace unos dos billones de aos; de este dominio derivan todos los organismos eucariontes uni y
multicelulares. Otra clasificacin de los seres vivos muy utilizada es la propuesta por Whitaker y Margulis. Ellos clasifican a los organismos en cinco reinos, Animalia, Plantae,
Fungi, Protista y Monera, en ste ltimo reino se incluyen todas las bacterias.
MORFOLOGA BACTERIANA
9
PRACTICA #1
MICROSCOPIOS Y MICROSCOPIA
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Que el alumno se familiarice con las partes del microscopio de luz, con su manejo y sus
cuidados y que conozca el fundamento de las diferentes clases de microscopios.
INTRODUCCION.
El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en el
laboratorio de microbiologa, debido a que proporciona la amplificacin o agrandamiento
aparente que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista, con una
amplificacin desde cien a cientos de miles de veces. Las dos categoras de microscopios
disponibles son los microscopios pticos (de luz) y los microscopios electrnicos.
I. EL MICROSCOPIO OPTICO (de luz):
Utiliza un sistema de lentes pticos que va amplificando la imagen sucesivamente y comprende: -
microscopio de campo claro -microscopio de campo obscuro -microscopio de fluorescencia -
microscopio de contraste de fases.
1. El Microscopio de Campo Claro: Es el instrumento ms ampliamente utilizado para microscopa de rutina. Aqu el rea observada est brillantemente iluminada y los objetos en estudio
aparecen ms obscuros. Generalmente producen un aumento til de unos l000 dimetros. La
amplificacin se logra mediante el uso de sistemas de lentes diseadas y acomodadas para
proporcionar la amplificacin en forma ptima. Presenta lentes en el condensador, en los objetivos y
en los oculares. La lente del condensador enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la
muestra. Algunos de los rayos de luz de este cono pasan directamente a la lente del objetivo para
formar el fondo de luz o campo claro. Los rayos de luz que chocan con los objetos
(microorganismos) que hay en la muestra y se "curvan", son conducidos a la lente del objetivo para
formar una imagen del objeto. La imagen es amplificada por la lente ocular. Comnmente los
microscopios estn equipados con tres objetivos montados en una plataforma llamada revlver, que
al hacerse girar pone a uno de ellos en la lnea del condensador. y cada uno proporciona distinto
grado de aumento El poder de resolucin de un microscopio est determinado por la longitud de onda
de la luz y por una propiedad del objetivo y de la lente del condensador.
Sistema mecnico: Base, brazo, cuerpo del tubo, tubo intercambiable del microscopio, platina, revlver, objetivos de de 10, 40 y 100 X, tornillo macromtrico, tornillo micromtrico,
condensador y diafragma.
2 Microscopio de Campo Oscuro: Es similar al de campo claro, excepto que va equipado con un condensador de campo oscuro y una abertura numrica baja. Esta clase de condensador dirige los
rayos de luz dentro del campo de la muestra, formando un angulo tal, que solo los rayos que chocan
contra el objeto que hay en el campo de la muestra son refractados (curvados) y penetran en el
objetivo. As, el objeto queda brillantemente iluminado y destaca sobre el fondo oscuro (campo
oscuro)
3 Microscopio de Fluorescencia: Est equipado con una fuente de luz ultravioleta, varios filtros y un condensador de campo obscuro. Se usa para examinar muestras teidas con colorantes de
10
fluorocromo, denominados fluorescentes, los cuales absorben energa de longitudes de ondas cortas
invisibles, pero emiten ondas de longitudes de onda mayores visibles y el fenmeno es denominado
fluorescencia. Esta tcnica permite la identificacin rpida de algunos microorgnismos.
4 Microscopio de contraste de fases: Es un tipo de microscopio ptico que permite un mayor contraste entre substancias de diferente grosor o diferente ndice de refraccin, mediante el uso de un
condensador y un objetivo especiales que controlan la iluminacin del objeto, de manera que acenta
las ligeras diferencias en el espesor o en los ndices de refraccin de las estructuras celulares. Las
diferencias se revelan en forma de distintos grados de brillo o de oscuridad (un mejor contraste),
pudiendo localizarse estructuras dentro de la clula sin teir, que no son visibles en la microscopa de
campo claro.
EL MICROSCOPIO ELECTRONICO
Emplea haces de electrones en lugar de ondas de luz, para producir una imagen amplificada. Un
campo magntico substituye a las lentes. Es posible lograr amplificaciones de un milln de veces, las
que posteriormente se logran ampliar ms en la imagen fotografiada. Esto hace posible la
observacin de microorganismos tan pequeos, que no se ven con el microscopio ptico, como los
virus. -Microscopio electrnico de transmisin: Un haz de electrones finamente enfocados,
pasa a travs de un corte ultradelgado del especimen. Los electrones son enfocados a una
pequea rea de la muestra y la iluminan, apareciendo con reas claras y obscuras. La resolucin
de es de 2.5 nm y la amplificacin es de 10,000 X a 100,000
X.
- Microscopio electrnico de Barrido: Resuelve el problema de seccionar los especmenes,
permitiendo observar clulas completas. Unos electrones son dirigidos a la superficie de la
muestra y otros colectados para formar la imagen tridimensional.
MATERIALES Y METODOS:
EJERCICIO PARA EL TRANSPORTE Y MANEJO DEL MICROSCOPIO:
1. El transporte del microscopio de un lugar a otro debe ser muy cuidadoso. Con una mano se debe sujetar del brazo, mientras se coloca la otra mano bajo la base para
sostenerlo, mantenindolo en posicin vertical. Esto evita el desprendimiento de algunas de las partes que no son fijas.
2 Nunca deposite el microscopio en la orilla de la mesa, sino a unos cm de distancia del borde. 3 No toque las lentes con los dedos. 4 No juegue con los componentes del instrumento. Si no funciona en forma adecuada, notifquelo al profesor y no intente arreglarlo usted mismo.
5 No permita que ningn reactivo qumico entre en contacto con alguna parte del microscopio, a excepcin del aceite de inmersin usado con la lente de l00 X.
6 Limpie las lentes slamente con papel especial para lentes (papel seda) sobre todo al terminar de usarlo, para que no queden restos de aceite de inmersin.
EJERCICIO DE ENFOQUE 1 En base a las indicaciones del profesor vaya identificando las diferentes partes que constituyen el microscopio.
2 El profesor le proporcionar una preparacin fija de bacterias en un portaobjetos para el ejercicio.
3 Encienda el microscopio. 4 Mueva cuidadosamente el revlver y coloque el objetivo de 10 X sobre la platina.
11
5 Coloque en la platina un portaobjetos con un especimen y ajstelo en el carro. Haga coincidir el haz de luz del condensador con el especimen.
6 Mueva el tornillo macromtrico para acercar el objetivo de 10 X a la platina, totalmente hasta el tope.
7 Posteriormente, sin dejar de observar a travs del ocular, mueva lentamente el tornillo macromtrico para ir alejando el objetivo de 10 X, hasta detectar una imagen o un color en la
preparacin; enseguida mueva lentamente el carro en la platina. Si la imagen se mueve, indicar que
est enfocando la preparacin. Mueva el tornillo micromtrico y afine el enfoque. Una vez logrado el
enfoque, ya no suba ni baje el tornillo macromtrico, solo use el micromtrico. Si se desenfoca,
vuelva a repetir el proceso.
8 A continuacin mueva el diafragma y determine la cantidad de luz ms efectiva para la observacin.
9 Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 10X y cambie al objetivo de 40 X. Ajuste el enfoque con el tornillo micromtrico. Con el diafragma determine la cantidad de luz
adecuada .
10 Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 40X y coloque una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. A continuacin mueva de nuevo el revlver con cuidado, dejando
que la lente del objetivo de 100 X quede en contacto con el aceite. Ajuste el enfoque con el
micromtrico. Si no lo logra, regrese directamente al objetivo de 10 X, sin pasar por el de 40 X para
no ensuciarlo con el aceite y vuelva a enfocar. El aceite aumenta la cantidad de luz que pasa a la lente
del objetivo.
11 Al terminar, mueva el revlver antes de sacar la preparacin y enseguida limpie el aceite de la lente, con papel seda. Puede usar un pauelo desechable por el lado que no suelta pelusa. No
utilice algodn ni otros materiales.
12 Nunca olvide retirar la preparacin de la platina al terminar, ni limpiar el aceite del lente 100X .
13 Apague el microscopio y enrolle el cable.
RESULTADOS, DISCUSION y CONCLUSIONES.
Haga dibujos de las observaciones a diferentes amplificaciones. Explique con un
esquema la formacin de la imagen que se observa
Comente su experiencia obtenida al hacer las observaciones y las dificultades
encontradas, as como las ventajas y desventajas que not en la tcnica.
CUESTIONARIO.
1 Cmo se forma la imagen del microscopio? 2 Por qu se usa el aceite de inmersin con el objetivo de 100 X slamente. 3 Consulte la literatura y describa otras clases de microscopio no mencionadas.
12
PRACTICA #2
INOCULACION
Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Desarrollar las tcnicas comunes de inoculacin en medios de cultivo y las tcnicas de
aislamiento. Comprensin del fundamento en cada caso.
INTRODUCCION.
Las bacterias se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos denominados medios de
cultivo, cuyos componentes son muy variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del
estudio.
El material que se inocula en el medio se denomina inculo. Cuando se inocula un medio
como el agar nutritivo u otros medios con agar en cajas de Petri, por el mtodo de "siembra por estra
cruzada en placa", las clulas quedan separadas individualmente. Durante la incubacin, las clulas
microbianas individuales se reproducen tan rpidamente que en 18 a 24 hs producen masas visibles a
simple vista, denominadas colonias. Cada colonia que se observe diferente, presumiblemente es un
cultivo puro de una sola clase de bacterias. Si dos clulas microbianas procedentes del inculo
original quedan muy cerca una de la otra sobre el medio de agar, las colonias que resultan pueden
quedar mezcladas o muy juntas. La siembra por estra permite aislar las bacterias que dan lugar a
colonias separadas y posteriormente, transfiriendo una sola colonia a un medio nuevo, se permite el
desarrollo de un cultivo puro bacteriano.
MATERIALES Y METODOS.
I. TECNICA DE LA ESTRIA CRUZADA EN PLACA (inoculacin y aislamiento de bacterias) 1 En todas las siembras siguientes deber quemar el asa al rojo vivo en la flama del mechero, antes y despus de usarla.
2 Con el asa bacteriolgica previamente quemada y enfriada en el rea de esterilidad, siembre una mezcla de dos o ms bacterias en una placa de agar nutritivo. Desarrolle el mtodo de siembra de
la estra cruzada en placa, girando la caja al ir rayando hasta formar un pentgono, siguiendo las
indicaciones del profesor, con el fin de ir diluyendo el inculo. Al final de la siembra las bacterias
quedarn bien separadas unas de otras. Al terminar, no olvide quemar el asa de nuevo. Con un
marcador indeleble marque cada caja con una clave para identificarla. Determine las caractersticas
coloniales de las diferentes especies sembradas.
3 Siembre por separado en placas del mismo medio, cultivos puros de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Serratia
marcescens y Streptococcus faecalis. Desarrolle el mtodo de siembra de la estra cruzada en placa.
13
Marque las cajas. Incube igual que las anteriores. Describa las caractersticas coloniales de cada
especie.
4 Invierta todas las cajas (la tapa hacia abajo) para evitar la evaporacin. Incube a 35 C por 24 hs.
II. INOCULACION EN TUBO CON MEDIO LIQUIDO. 1 Inocule una asada de cada bacteria por separado, en tubos con caldo nutritivo. Deje un tubo testigo sin inocular.
2 Inocule por estra las bacterias en tubos con agar nutritivo inclinado. 3 Incube todos los medios sembrados a 37 C por 24 hs. 4 Note el desarrollo de colonias bacterianas separadas en los medios slidos en placa. En el caso de los medios lquidos, note slo una turbidez, un sedimento o una pelcula Haga deducciones y
explique.
III. SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO SOLIDO (agar inclinado y agar sin inclinar).
1 Siembre separadamente bacterias en tubos con medio slido inclinado, por estra. 2 Siembre por picadura en el centro, con una asa recta (sin anillo) las mismas bacterias por separado en tubos con medio slido sin inclinar.
3 Incube todos los tubos igual que en los puntos anteriores.
Anote detalladamente sus resultados en todos los experimentos. Compare sus resultados
personales con los de los otros equipos. Note las diferencias en el tipo de crecimiento de
cada bacteria en los medios slidos y en los lquidos.
Haga un cuadro de resultados con los datos de la morfologa colonial, en base a la forma,
tamao, color, etc. en la siembra de las diferentes bacterias en medio slido. Explique los
resultados y los errores cometidos al estriar. Note la diferencia en el tipo de crecimiento de
las bacterias en el medio lquido y deduzca si esta tcnica sera til para aislar bacterias.
Explique a qu se debe la formacin de colonias en el medio slido.
14
Resultados, Discusion y Conclusiones
Fig. 5 esterilizacin de asa
Fig. 6 siembra en tubo con agar
inclinado
Fig. 7 siembra en medio lquido Fig. 8 Tcnica de estra cruzada
15
16
PRACTICA #3
TECNICAS MICROSCOPICAS
DE BACTERIAS.
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Conocer y desarrollar las tcnicas microscpicas comunes para observar, teir y medir a
las bacterias y sus estructuras.
INTRODUCCION
El tamao tan pequeo de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya que su
tamao promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrmetros (m) de dimetro. En cuanto a su
forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, curvos y
helicoidales. Los extremos de los bacilos pueden ser redondos, angulares o agudos y
pueden ser mviles o inmviles. Las esfricas (cocos) pueden presentarse solas, en pares,
en tetradas, en cadenas o en racimos.
Las caractersticas morfolgicas de las bacterias se pueden apreciar mediante tcnicas
microscpicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del estudio directo al
microscopio de clulas vivas en su forma, disposicin y tamaos naturales, han sido
antagonizadas por el hecho de que, el ndice de refraccin del protoplasma de los
microbios se acerca al del agua y por ello, las clulas y sus estructuras no pueden
diferenciarse en forma neta entre s, ni del lquido en que estn includas. El estudio
microscpico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes,
aprecindose su forma y tamao.
Preparacin en fresco:
Permite observar en los microorganismos su movilidad, color, tamao, forma y
agrupacin en condiciones naturales, cuando estn vivos, sin alteraciones. Sin embargo,
la observacin es difcil debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre el ndice
de refraccin del medio y de los microorganismos. Este problema se resuelve utilizando
el microscopio de campo oscuro y el de contraste de fases.
La preparacin en fresco es utilizando un portaobjetos normal, con cubreobjetos encima. -Otra forma
es la preparacin en en gota suspendida, utilizando un portaobjetos excavado y un cubreobjetos.
Tcnicas de tincin: Tcnicas de tincin simples o directas:
Tien homogneamente la clula y solo utilizan un colorante, que puede ser azul de metileno,
safranina, cristal violeta, etc.
Tcnicas de tincin compuesta o diferencial:
Requieren combinaciones de dos o ms colorantes, como en la tcnica de Gram, la de Ziehl Neelsen,
tincin de esporas, etc.
17
Algunas de estas tcnicas permiten la demostracin de estructuras especficas como cpsula, flagelos,
esporas, etc. Otras tien selectivamente bacterias de un grupo especfico.
Tinciones negativas:
En realidad no colorean los microorganismos, ya que el colorante se limita a depositarse en el campo
del rededor, delimitando las clulas. Esto se explica debido a que las bacterias presentan muchas
cargas negativas asociadas con la pared, membrana y citoplasma, siendo repelidos los colorantes con
carga cida.
MATERIALES Y METODOS
I. Preparacin en fresco.
En este tipo de preparacin se perdern varios detalles de las bacterias.
A partir de cultivos en medio lquido: cargar el asa bacteriolgica con una gota de cultivo en
medio lquido, depositarla en el portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos (procurando que no
queden burbujas de aire).
- A partir de cultivos en medio slido: colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con
ayuda del asa. Cargar el asa (estril) con una pequea cantidad de bacterias de una colonia y
resuspenderlas en la gota de agua. Haga dibujos de lo observado. Detalle la forma,
agrupacin, color, movilidad (cilios,flagelos, deslizamiento,browniano), etc. Nota: tenga en cuenta que el calor desprendido por el foco luminoso ir secando la
preparacin y como consecuencia habr perdida de movimiento.Adems podran aparecer
corrientes de lquido que pueden dificultar la observacin de la muestra.Cuando se observen
estos efectos se levanta el cubreobjetos y aadir ms lquido o bien, aplicar parafina o esmalte
en los bordes del cubreobjetos
. Diga si pudo observar la forma de las clulas y su agrupacin.
II. Tcnica de elaboracin de frotis bacterianos (antes de la tincin)
1 Queme el asa al rojo vivo en la flama del mechero y djela enfriar en el rea de esterilidad 2 Destape un cultivo bacteriano lquido junto a la flama del mechero y tome con el asa una gotita del cultivo, depositndola en el centro de un portaobjetos limpio; extienda con el asa para
hacer un frote.
3 Si el cultivo no es lquido, coloque una gotita de agua destilada con el asa, en el centro de un portaobjetos. Queme el asa y djela enfriar, tomando a continuacin una poca de la masa bacteriana
de la superficie del medio, para hacer una suspensin de bacterias en la gotita del porta. Enseguida
extienda con el asa para hacer un frote.
4 Deje secar el frote al aire libre. 5 Fije la preparacin con calor, pasndola tres veces sobre la flama del mechero en forma rpida.
III.Tinciones Diferenciales Tincin
de Gram. 1 Prepare un frote de cada una de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus subtilis
2 Despues de fijar los frotes, cbralos con cristal violeta durante un minuto y enjuague con agua.
3 Cubra con lugol durante un minuto y lave con agua. 4 Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.
18
5 Cubra con safranina medio minuto y lave con agua. 6 Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 100 X con aceite de inmersin. 7 Las bacterias teidas de rojo se consideran gramnegativas; las de morado, grampositivas. 8 Note las diferencias en la observacin de bacterias teidas con las no-teidas. 9 Explique el mecanismo qumico ocurrido durante la tincin.
Tcnica de Ziehl-Neelsen 1 Haga un frote con Mycobacterium sp., djelo secar al aire libre y fjelo con calor. 2 Coloque encima un pequeo rectngulo de papel filtro (2 x 3 cm). Aplique unas gotas de carbol-fucsina sobre el papel, para humedecerlo bien y deje actuar 5 min., calentando la preparacin por el reverso cuidadosamente hasta emisin de vapores, sin permitir
la ebullicin. No deje secar el colorante, aplicando ms, si lo requiere.
3 Retire el papel con una pinza y enjuague con agua y escurra. 4 Decolore con alcohol cido, uno a dos min. y lave con agua. 5 Cubra con azul de metileno por 1-2 min y lave con agua corriente. 6 Deje secar y observe al microscopio. 7 Las bacterias teidas de rojo se consideran cido-resistentes (BAAR) 8 Las azules son no-cido resistentes.
Explique el mecanismo qumico ocurrido durante la tincin.
Tincin negativa de cpsula.
1 En el extremo de un portaobjetos coloque una gota de suspensin bacteriana de Klebsiella pneumoniae o Leuconostoc en agua. Adicinele una gota de tinta china y mezcle con el asa.
2 Con otro porta extienda la preparacin, como para realizar un frote. Deje secar al aire libre. No se requiere fijar con calor.
3 Cubra la preparacin con safranina por un minuto y lave con agua rpidamente y con cuidado, para no despegar la preparacin.
4 Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 y a 100 X.
Tincin de endosporas bacterianas.
1 Prepare un frote con Bacillus sp. Deje secar al aire libre y fje con calor. 2 Coloque sobre el portaobjetos una tira de papel filtro de menor tamao. Cubra con verde de malaquita en solucin acuosa de fenol. Caliente a emisin de vapores durante 5 min. No permita que
ebulla.
3 Deje enfriar y lave. 4 Agregue safranina 30 seg. Y lave con agua. Deje secar. Observe a 10 y a 100 X.
Tincin de flagelos
1 Hacer un crculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual 2 Se recomienda lavado con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo
de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces.
3 Colocar dentro del crculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensin bacteriana e inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra.
4 Fijar la preparacin al aire ya que si esta operacin se hace usando la flama del mechero se pueden destruir los flagelos.
5 Humedecer la preparacin con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora en tiempo fro.
19
6 Lavar con agua corriente. 7 Secar y observar con objetivo de inmersin.
INTERPRETACION:
Los flagelos se tien bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan flagelos
extremadamente delicados.
Fig. 1 Preparacin de frotis
Fig. 2 Tincin simple
Fig. 3 Tincin endosporas
20
RESULTADOS, N Y
Tincin de Gram
Fig. 3 Tincin de cpsula
Fig. 4 Tincin gram
21
PRACTICA # 4
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Comprender las diferencias qumicas de los diferentes medios de cultivo y las tcnicas para su
preparacin, con el fin de obtener el criterio necesario para su eleccin, en base a las necesidades de
cada bacteria y a los propsitos del laboratorio.
INTRODUCCION.
Los medios de cultivo contienen los nutrientes necesarios para cultivar microorganismos, tales como
bacterias, hongos y otros. Los microorganismos no pueden estudiarse individualmente debido a su
tamao tan pequeo, por lo que solo pueden ser estudiados en poblaciones. Para ello es necesario
cultivarlos en medios artificiales. Los medios de cultivo para los microorganismos pueden ser
slidos, lquidos o semislidos. Los medios lquidos se pueden transformar en slidos al adicionarles
agar, gelatina o gel de slice. Al disminuir la cantidad del agente solidificante, se obtiene el medio
semislido. Antes de preparar un medio de cultivo para el cultivo de cualquier microorganismo, es
necesario entender sus necesidades bsicas. Cualquier medio de cultivo debe contener los siguientes
factores: agua, carbono, energa, nitrgeno, minerales, pH y factores de crecimiento. Los
componentes de los medios son muy variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del
estudio. Los medios sintticos se preparan utilizando una composicin exacta conocida,
generalmente a base de compuestos altamente purificados. Los medios no-sintticos contienen
ingredientes de composicin imprecisa y pueden ser a base de extracto de carne, adicionados de
sangre, suero u otras sustancias complejas.
Los medios selectivos impiden el desarrollo de ciertos grupos microbianos y favorecen el desarrollo
de otros. Por ejemplo puede omitirse una fuente nitrogenada orgnica, adicionando slo una
inorgnica. Pueden adicionarse ciertas sustancias como telurito de potasio, sulfito de bismuto, y
otros. Algunos antibiticos tambin pueden ser aadidos para inhibir. Los medios diferenciales
contienen sustancias nutritivas o indicadoras que permiten desarrollar a las bacterias con una
apariencia colonial distintiva. Los medios para pruebas de caracterizacin e identificacin de los
microorganismos estn adicionados de sustratos especficos y permiten diferenciar unas especies de
otras, en base a su capacidad enzimtica especfica. Medios de enriquecimiento favorecen la
multiplicacin y aumento de un cierto grupo de microorganismos. Aqu se combina un medio
selectivo y la variacin de otros factores como pH, temperatura, iluminacin, aereacin, una fuente
nica de carbono, etc. Medios enriquecidos: algunas bacterias requieren medios especiales,
complejos y sofisticados, ya que son incapaces de crecer en medios comunes.
Medios de mantenimiento: preservan satisfactoriamente la viabilidad de los organismos,
conteniendo concentraciones limitadas de nutrientes.
En la actualidad el trabajo requerido en la preparacin de medios se ha simplificado,
mediante la utilizacin de medios deshidratados que se obtienen comercialmente, en las
variedades deseadas. Algo similar a las mezclas deshidratadas para la elaboracin de
pasteles. Slo se requiere disolver una cantidad conocida en un volumen medido de agua,
repartir en los recipientes necesarios (tubos de ensayo, matraces, frascos, etc.) esterilizar.
22
Un pequeo grupo de microorganismos no se ha logrado cultivar in vitro, hasta la fecha,
como Mycobacterium leprae, Treponema pallidum y las rickettsias.
La esterilizacin de los medios es indispensable antes de usarlos, para eliminar todos los
microorganismos presentes en ellos, cuidando que en los recipientes no vuelva entrar
ningn organismo. En esta forma, slo se cultivarn los organismos deseados. La
esterilizacin es un proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida .
Esterilizar es un trmino absoluto. Algo est estril o no lo est, pero nunca est parcialmente
estril.
Esterilizacin con calor: La temperatura elevada puede inactivar muchas enzimas,
desnaturalizar protenas y como consecuencia la muerte de los microorganismos. El
efecto depende de la temperatura y del tiempo de exposicin.
-El calor hmedo en forma de vapor saturado a presin es uno de los agentes ms utilizados
para la esterilizacin de medios de cultivo. Con el ambiente hmedo se favorece la penetracin ms
rpidamente del calor a la clula, provocando una coagulacin de las protenas. Comnmente se usa
el autoclave, a 121 C, 15 libras de presin, por 15 min.
-El calor seco (aire caliente) utilizado en los hornos, da lugar a la oxidacin de componentes
celulares vitales. Es utilizado en materiales generalmente de vidrio, limpios y secos, como cajas de
Petri, pipetas, algunos instrumentos quirrgicos, etc. Puede esterilizarse a 180 C una hora.
Filtracin: El uso de filtros bacteriolgicos es til cuando se requiere esterilizar sustancias
termolbiles, como vitaminas, aminocidos u otras similares. Estas deben ser adicionadas a los
medios previamente esterilizados, en condiciones aspticas. La incineracin: su uso es limitado,
como en la esterilizacin del asa microbiolgica, cadveres de animales de laboratorio, algunos
desechos de hospitales y otros similares. Reparticin de los medios estriles: Si los medios
esterilizados se van a repartir en cajas de Petri u otros recipientes, stos deben estar estriles y se
debe trabajar dentro del rea de esterilidad.
MATERIALES Y METODOS
Cada equipo de alumnos puede preparar un medio de cultivo diferente, pesando en cada caso la
cantidad indicada en las instrucciones de la etiqueta del medio, para un litro de agua, o la cantidad
que se necesite preparar.
23
I. Medios esterilizados por calor hmedo.
Prepare medio en dos matraces de 500 ml con 200 ml c/u (por ejemplo un medio de mantenimiento como Tripticasa-agar-soya). Para pesar, siga las instrucciones de la etiqueta. Tape con
algodn y un gorro de papel. Esterilice con calor hmedo en autoclave, a 121 C y 15 libras de
presin, durante 15 minutos. Reparta posteriormente en condiciones de esterilidad, en cajas de Petri
cuando el medio estril an est caliente aprox. a 60 C
Prepare tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapn de rosca o de algodn, con 5 ml aprox. de un medio con agar (pueden ser los medios sintticos y no-sintticos de la siguiente prctica); no
apriete los tapones de rosca y esterilice en la misma forma. Deje solidificar la mitad de los tubos (an
calientes) en posicin inclinada. Deje solidificar el resto en forma vertical. Despus de solidificar
apriete los tapones.
Prepare un matraz de 250 ml con 50 ml de medio lquido. Reparta en tubos de 16 x 150 mm, con tapn de rosca o de algodn. Deje flojos los tapones de rosca y esterilice, apretndolos al sacar.
Esterilizacin de material de vidrio vaco con calor seco, en el horno.
1 Para esterilizar algunas pipetas, primero colqueles algodn en la boca, a manera de filtro y ensegida envuelva cada una en una tira de papel, siguiendo las instrucciones del profesor. Esterilice
en el horno a 180 C por una hora.
2 Esterilice cajas de Petri vacas en el horno.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
24
PRACTICA #5
NUTRICION MICROBIANA
OBJETIVO:
Observar el crecimiento de los organismos en diferentes sustratos, relacionando el
mayor crecimiento con requerimientos nutricionales adecuados.
INTRODUCCION
Los requerimientos nutricionales de un microorganismo estn determinados por la composicin
qumica de la clula, por su constitucin gentica y por factores del medio ambiente. Cualquier
sustrato puede constituir una fuente de nutrientes para ciertos microorganismos. Sin embargo, cada
grupo de organismos vara ampliamente en sus caractersticas genticas y por consiguiente tambin
en sus propiedades fisiolgicas y en su capacidad para utilizar y transformar los diferentes
compuestos qumicos. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo con: a) la fuente de
carbono, N, S, P y O que utilicen, y b) segn la fuente de energa. En base a la fuente de C , se
denominan auttrofos a los microorganismos que utilizan CO2 o carbonatos, a diferencia de los
hetertrofos quienes slo son capaces de utilizar como fuente de C diferentes compuestos orgnicos
con varios grados de complejidad. Por lo que respecta a la fuente de energa, los fottrofos
transforman la energa luminosa en energa qumica; los quimitrofos obtienen su energa a partir de
la oxidacin de compuestos qumicos. Existen tambin grupos intermedios que se comportan como
facultativos en las clasificaciones anteriores. Por otro lado, existen algunos microorganismos
llamados prottrofos que requieren factores de crecimiento, es decir , compuestos orgnicos que son
utilizados como precursores o como constituyentes del material celular y que no pueden ser
sintetizados a partir de compuestos de carbono ms sencillos. Los que no requieren factores de
crecimiento son llamados auxtrofos. El ambiente natural donde vive cada microorganismo refleja el
tipo de nutrientes necesarios para su desarrollo. Utilizando medios de cultivo de composicin
qumica definida, se pueden determinar las necesidades nutritivas de un organismo. Al sembrar un
microorganismo en diferentes sustratos, se relaciona el crecimiento en los diferentes nutrientes, con
las caractersticas nutricionales del microorganismo en ese sustrato. Fuentes de nitrgeno y azufre:
Los nitratos y sulfatos pueden ser utilizados por unos microorganismos. Otros slo pueden usar
amonios o sulfuros, o compuestos orgnicos. Algunas bacterias son capaces de reducir el N2
atmosfrico, mediante el proceso denominado fijacin de N2. El fsforo generalmente es usado a
partir de fosfatos. El oxgeno es un nutriente obtenido por todos los organismos en cantidades
abundantes a partir del agua. Sin embargo, la mayora de los organismos son aerobios y requieren
oxgeno en forma molecular (O2) durante la produccin de energa como ltimo aceptor de
electrones. Pocos organismos utilizan otros aceptores finales de electrones.
MATERIALES Y METODOS.
1. Siembre separadamente los organismos Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus sp,. y un
hongo o un alga, en cada uno de los siguientes medios en tubo con agar inclinado
a) 15 gr de agar
b) 15 gr de agar + 0.5 gr de K2HPO4 + 0.5 gr de MgSO4 . 7H2O
c) 15 gr de agar + 10 gr de glucosa + 1 gr de NH4Cl + 0.5 gr de K2HPO4
+ 0.5 gr de MgSO4 . 7H2O
25
d) 15 gr de agar + 0.2 gr de extracto de levadura + 10 gr de glucosa + 1 gr de NH4Cl +
0.5 gr de K2HPO4 + o.5 g de MgSO. 7H2O
e) Agar nutritivo.
f) Sabouraud.
Todas las cantidades son para 1000 ml de agua destilada.
1 Deje un tubo de cada medio como control sin sembrar.
2 Incube todos los cultivos a 30C, por 48 hs, excepto las algas, que durarn varios das.
3 La mitad de los tubos con algas se incuban a temperatura ambiente en la obscuridad y el resto bajo la luz.
4 Determine las diferencias en la abundancia del crecimiento y obtenga conclusiones, en base a los nutrientes de cada medio, para cada organismo.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.
26
PRACTICA #6
FACTORES FISICOS
SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Comparar la susceptibilidad de diferentes organismos ante diferentes factores fsicos del ambiente,
observando sus modificaciones en el crecimiento.
INTRODUCCION
Para obtener el crecimiento ptimo de los microorganismos, no solo son indispensables los
requerimientos nutricionales, sino otros factores ambientales tanto fsicos como qumicos. Un agente
fsico es una condicin fsica o propiedad fsica que causa un cambio. La humedad, la temperatura, la
presin osmtica, el pH, las radiaciones y los filtros son ejemplos de agentes fsicos. El crecimiento
de los microorganismos se modifica al cambiar los factores ambientales. El conocimiento de los
factores ambientales nos permite explicar la distribucin de los organismos en la naturaleza; por otro
lado, el conocimiento de los factores limitantes del crecimiento microbiano se puede utilizar para su
control, sobre todo en el caso de organismos que son patgenos, que causan deterioro en los
alimentos o que dan lugar a prdidas econmicas en diferentes formas.
MATERIALES Y METODOS.
I. Determinacin de la temperatura ptima de crecimiento de algunas bacterias.
La temperatura ambiental es uno de los factores fsicos ms importantes que afectan directamente el
funcionamiento de las enzimas bacterianas, mismas que se inactivan por debajo de la mnima y por
encima de la mxima. La temperatura ptima de crecimiento de un microorganismo es la temperatura
a la cual se multiplica a su mxima velocidad.
1 Siembre tres lotes de tubos de agar nutritivo inclinado con las bacterias E. coli, Pseudomonas aeruginosa,, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Salmonella sp., S. aureus y otras.
2 Incube el primer lote a temperatura de refrigeracin, durante 24 hs y anote el resultado del crecimiento en cruces. Diga cul bacteria es psicroflica.
3 Incube el segundo lote de las mismas bacterias a temperatura ambiente . 4 Incube el tercer lote de bacterias en una incubadora a 37 C. 5 Determine la temperatura ptima para cada bacteria, que ser donde se observe el mejor crecimento. Con una cruz indique el crecimiento mnimo, con dos regular y con tres cruces el
mximo.
6 Tambin determine si alguna bacteria produjo pigmento a cierta temperatura.
II. Efecto letal de la temperatura sobre las bacterias.
Los organismos varan ampliamente en cuanto a su susceptibilidad a temperaturas elevadas. En este
experimento se determinar: a) el punto trmico mortal (temperatura a la cual un organismo muere en
diez minutos) y b) el tiempo trmico mortal (temperatura requerida para matar una bacteria
esporulada en diez minutos).
1 Divida el reverso de una placa de agar nutritivo en cinco partes, con un marcador.
27
2 A partir de un cultivo de E. coli de 24 hs en caldo nutritivo, siembre por estra cerrada una divisin de la placa de agar nutritivo. Marque el reverso con una clave.
3 Coloque el tubo en un bao mara a 60 C y caliente. Tome una asada a intervalos de diez minutos y siembre cada vez en uno de los sectores de la placa de agar. El tiempo total de
calentamiento ser de cuarenta minutos.
4 Determine el punto trmico mortal en E. coli. 5 Otro grupo de estudiantes puede trabajar igualmente con una bacteria esporulada como Bacillus subtilis (un cultivo de 48 hs o ms), para determinar el tiempo trmico mortal.
III. El calor hmedo combinado con elevacin de la presin atmosfrica.
Aqu queda includa la tcnica de esterilizacin en autoclave, utilizada en la preparacin de
medios de cultivo.
IV. Influencia de la presin osmtica. El crecimiento bacteriano puede ser afectado grandemente
por las cantidades de agua que entran o que salen a la clula. Cuando el medio que rodea a un
organismo es hipotnico (contiene pocos solutos) resulta una presin osmtica mayor dentro de la
clula, excepto para algunas especies marinas que no son afectadas. La pared celular de la mayora
de las bacterias es tan fuerte y rgida, que un hinchamiento celular ligero, generalmente es inaparente.
Sin embargo, cuando las bacterias son colocadas en una solucin hipertnica (contiene ms cantidad
de solutos) su crecimiento puede ser inhibido considerablemente. El grado de inhibicin depender
del tipo de soluto y de la naturaleza del organismo; el citoplasma se deshidrata y el agua sale de la
clula, causando una plasmolisis. En estos casos la clula es inhibida en ausencia de agua celular
suficiente. En casos extremos hay una inactivacin enzimtica permanente y las clulas no se
recuperan en soluciones isotnicas.
1 Prepare 2 series de 6 tubos de caldo nutritivo adicionado de NaCl en diferentes concentraciones, al 0.85%, 3.5%, 7 %, 10% y 15% y un control sin NaCl y mrquelos.
2 Prepare dos series de 6 tubos de caldo nutritivo adicionado de Sacarosa al 3.0%, 7.5%, 15%, 30% y un control sin sacarosa y mrquelos.
3 Inocule una serie de tubos de cada compuesto con 0.1 ml (por tubo) de Escherichia coli y otra serie con Staphylococcus aureus. Homogenice cada tubo.
4 Incube a 37 C por 28 hs. 5 Registre la turbidez de los tubos y comprelos entre s. Concluya.
V. Influencia del pH 1 Prepare dos series de tubos con caldo nutritivo y con diferentes pH (3.0, 5.0, 7.0 y 9.0) 2 Inocule una serie con 0.1 ml de Escherichia coli y otra serie con la levadura Saccharomyces cerevisiae
3 Incube la bacteria a 37 C y la levadura a 28 C. 4 Registre la turbidez presentada y compare.
VII. Efecto de la luz ultravioleta.
Siembre una placa de agar nutritivo con E. coli por estra y exponga la caja abierta por 5 min a la luz
ultravioleta. Incube igual que en el punto anterior. Determine si hay crecimiento bacteriano.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
28
PRACTICA #7
CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Desarrollar algunas tcnicas comunes para medir el crecimiento bacteriano en poblaciones, tanto
en clulas viables como en clulas vivas y muertas, comprendiendo su fundamento y aplicacin.
INTRODUCCION El trmino crecimiento en las bacterias se refiere a cambios cuantitativos en la poblacin total de
las bacterias, es decir un aumento en la masa total de clulas, ms bien que a cambios en un
organismo en forma individual. Con frecuencia el inculo contiene miles de organismos y el
crecimiento slo denota el incremento del nmero o de la masa, por encima del inculo original.
El mtodo caracterstico de reproduccin bacteriana es la fisin binaria transversal; una clula se
divide en dos. En este caso, si se parte de una sola bacteria, el incremento de la poblacin se hace
en progresin geomtrica: una bacteria produce dos, dos dan cuatro, cuatro dan ocho; ocho dan
dieciseis, y as hasta 2n (smbolo del ltimo nmero, es decir el nmero mximo de clulas que
eventualmente alcanzara la poblacin). El tiempo de generacin se refiere al intervalo de tiempo
requerido para que la clula se divida, o lo que es lo mismo, para que la poblacin se duplique).
Muchos estudios bacteriolgicos requieren la determinacin del nmero de bacterias presentes
en una unidad de volumen. Los recuentos se pueden efectuar por diferentes mtodos, ya sea
contando solo clulas vivas o tambin vivas y muertas. La cantidad y tipo de microorganismos
en una muestra dependen de la composicin qumica de la misma y de los tratamientos a que
haya sido sometida. El mtodo de conteo elegido depende del objetivo del conteo. En esta forma,
se puede determinar la presencia o ausencia de microorganismos, as como su nmero presente
en el material de estudio. Un conteo total establece el grado de contaminacin microbiana.
Conociendo el nmero se puede estandarizar la concentracin de inculos y seguir la dinmica
poblacional de un cultivo puro y muchos otros estudios.
Mtodos de conteo directos al microscopio: Permiten efectuar el conteo de las clulas totales vivas y muertas. Su ventaja es que son rpidos.
-Conteo microscpico directo por el mtodo de Breed: Un volumen conocido de la
muestra (generalmente 0.01 ml) se extiende sobre un portaobjetos normal, en una superficie
conocida. Se examina en un microscopio calibrado, donde se conoce el dimetro del campo
microscpico. Se cuentan las clulas en diversos campos. Se obtiene el valor medio de clulas
por campo y se multiplica por el nmero de campos microscpicos comprendidos en la
preparacin. El resultado corresponde al nmero de clulas en el volumen extendido (0.01 ml).
Multiplicando este valor por 100 se obtiene el nmero total de organismos por ml o por gramo de
muestra.
-Conteo microscpico directo en cmara de Petroff-Hauser: Es una placa de vidrio
con una cuadrcula en depresin donde se deposita la muestra medida. Es posible relacionar el
nmero de clulas observadas en la superficie de un cuadro, con el volumen de esa rea.
Considerando los volmenes en la cuadrcula se puede calcular la concentracin de
microorganismos por ml.
Conteo Turbidimtrico: En una suspensin microbiana, la cantidad de clulas est directamente
relacionada con la turbiedad o densidad ptica de la misma e inversamente relacionada con la
29
cantidad de luz que pasa a travs de ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la
cantidad de microorganismos en la suspensin mediante la determinacin de la turbiedad
mediante un nefelmetro o un espectrofotmetro. Los resultados se comparan con una curva
estndar construda con una suspensin testigo de concentraciones conocidas. La turbiedad que
resulta en la suspensin microbiana se aproxima a la producida por un cierto nmero de clulas
en suspensin. Esta tcnica es til slamente para organismos unicelulares de pocos m, como
las bacterias, lo que les permite mantenerse suspendidos y homogneamente distribudos.
Contadores electrnicos: Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con
microorganismos a travs de un orificio de 5 a 10 m de dimetro, mediante manipulacin con
una micropipeta de mercurio. La resistencia elctrica a travs del orificio est normalizada y se
altera cada vez que un microorganismo pasa a travs de l. La modificacin de la resistencia se
amplifica y se registra electrnicamente.
Mtodos de Conteo en medio de cultivo: Mediante cultivo de la muestra, se detectan nicamente las clulas vivas. En todos los casos se
parte de un volumen o peso de muestra conocido. Conociendo la procedencia de la muestra se
puede esperar la obtencin de cuentas bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se
esperan pocos microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se esperan
cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades conocidas del diluyente, utilizando
solucin salina, agua peptonada u otros.
- Mtodo de las diluciones y vaciado en placa,
- Tcnica de conteo en placa por extensin superficial,
- Recuento por filtro de membrana,
- Siembra en tubo o recuento del nmero ms probable
- Mtodo de la gota o de Miles y Misra.
Otros mtodos: Determinacin del peso seco, determinacin del Nitrgeno en las cluas
cultivadas, medicin de actividades bioqumicas.
MATERIALES Y METODOS.
I. Conteo directo al microscopio Mtodo de Breed:
1 En un portaobjetos limpio y desengrasado, marque un rea de 2 cm cuadrados. Invierta la laminilla.
2 Deposite 0.01 ml de un cultivo y extindalos en el rea marcada del portaobjetos y deje secar a temperatura ambiente.
3 Fije con calor y tia con azul de metileno de Leffler
4 Lave con agua de la llave. Deje secar a temperatura ambiente. 5 Coloque el objetivo micromtrico en la platina del microscopio y observe a 100 X. 6 Mida el dimetro del campo microscpico. 7 Cada divisin del objetivo micromtrico mide 10m (= 0.01 mm = 0.001 cm)
8 Determine la superificie del campo microscpico con la siguiente frmula: r2
en cm x 3.
1416 = Superficie de campo microscpico en cm
9 Determine el nmero de campos microscpicos que existen en la preparacin con la frmula: Superficie de la preparacin = nmero de campos microscpicos Superficie del campo microscpico
30
10 Coloque en la platina del microscopio la preparacin teida de las bacterias y cuente las bacterias en 10 campos. Obtenga el valor medio de organismos por campo microscpico.
11 Calcule el nmero de bacterias que hay en la preparacin (0.01 ml) y en 1 ml del
cultivo, con la frmula: # de bacterias x #de campos = # de bacterias x 100 = # bacterias/ml por
campo microscpicos en la preparacin de cultivo
II. Conteo por el mtodo de las diluciones y vaciado en placa.
Es un recuento de clulas bacterianas vivas slamente.
1 Prepare 7 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con 9 ml de diluyente estril cada uno (agua
peptonada al 0.1 % o una solucin salina isotnica). Mrquelos con las diluciones desde 1 x 10 -2
hasta 1 x 10 -8
.
2 Marque 7 cajas de Petri vacas estriles con los mismos nmeros de las diluciones. Haga duplicados con otras 7 cajas.
3 En condiciones estriles tome 10 ml de una suspensin bacteriana (puede ser E. coli), con una pipeta estril y depostelos en el frasco con diluyente. Descarte la pipeta y colquela en un frasco
con desinfectante.
4. Tape el frasco con la muestra y agite vigorosamente, aprox. 25 veces. Esta ser la dilucin
1:10. 4 Con una nueva pipeta estril tome 1 ml y transfiera al tubo de la dilucin 1:100, mezclando en igual forma. y descartando la pipeta.
5 Con una nueva pipeta distribuya alcuotas de 1 ml a al tubo de la dilucin 1:1000 y a las dos cajas de Petri correspondientes marcadas. Descarte la pipeta.
6 Repita el procedimiento mezclando bien la dilucin 1:1000 y con una nueva pipeta distribuya alcuotas al tubo de la siguiente dilucin y sus dos cajas correspondientes y as
sucesivamente con las siguientes diluciones.
7. Enseguida adicione a cada caja aprox. 20 ml de medio de cultivo previamente fundido y mantenido a
50C. Al tapar cada caja, vaya mezclando el contenido muy cuidadosamente, para que no se derrame
el lquido.
Deje solidificar e incube 24 hs a 37 C.
9 Cuente las colonias desarrolladas, bajo la cmara cuentacolonias. Calcule la cantidad de colonias
por ml o por gr de muestra, mediante la siguiente frmula:
10 Promedio de colonias contadas x recproco de la dilucin = UFC / ml UFC=unidades formadoras de colonias
.
31
III.
Curva de crecimiento. 1 Obtenga un cultivo de E. coli de 24 hs en caldo nutritivo. 2 Siembre 0.l ml del cultivo en tubos con 5 ml de caldo nutritivo. Incube a 37 C. Guarde un tubo control sin inocular.
3 A las cero hs mida la turbidez en un espectrofotmetro. Ajuste el aparato con el control 4 Cada hora saque un tubo de la incubadora y haga la lectura, hasta completar 12 hs. 5 Dibuje una curva de crecimiento.
32
IV. Determinacin turbidimtrica. Esta medicin en un fotocolormetro se basa en el hecho de que
un cultivo de bacterias acta como una suspensin coloidal que intercepta la luz que pasa a travs de
ella. Dentro de ciertos lmites, la cantidad de luz que es absorbida es directamente proporcional a la
concentracin de clulas . Un fotocolormetro es un instrumento con una fotocelda que puede medir
la cantidad de luz que pasa a travs del cultivo. La luz que pasa a travs del cultivo activa un fototubo
que registra el porcentaje de transmitancia en un galvanmetro. Mientra ms alto sea el porcentaje de
transmitancia, ms bajo es el nmero de clulas en suspensin. El aparato debe ser calibrado antes de
cada lectura, con un tubo del medio estril sin cultivo, para establecer el 100 % de transmitancia.
Este mismo experimento permitir medir el crecimiento de una bacteria y obtener su curva de
crecimiento.
1 Siembre 0.1 ml de E. coli en 13 tubos con 10 ml de caldo nutritivo a partir de un cultivo lquido.
2 Incube todos los tubos a 37 C. 3 Deje un tubo con el mismo medio estril, sin inocular, como testigo y gurdelo en el refrigerador.. Este tubo servir para ajustar el fotocolormetro a 100 % de transmitancia, antes de las
lecturas.
4 A intervalos de una hora saque un tubo y determine la transmitancia en el fotocolormetro.
5 Dibuje una curva con los valores obtenidos, conforme se efectu el crecimiento de la bacteria. Con los mismos cultivos de E. coli puede desarrollar simultneamente la curva de
crecimiento, por la tcnica de las diluciones y vaciado en placa inoculando 1 ml (haciendo
diluciones seriadas.) Se puede planear el experimento para empezar a las 7.a.m. y terminar a las
7.00 p.m. Dibuje la curva de crecimiento en papel logartmico. Investigue la frmula para
determinar el tiempo de generacin y compare los resultados con los datos de la literaratura, en
el caso especfico de la bacteria estudiada.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES
33
PRACTICA #8
METABOLISMO BACTERIANO
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Desarrollar tcnicas comunes para observar la accin enzimtica bacteriana en diferentes sustratos,
relacionando los resultados con cada especie. Estos datos son esenciales en su identificacin.
INTRODUCCION. Las clulas de los microorganismos, al igual que las de todos los seres vivos,
por medio de su metabolismo incorporan y transforman los diversos compuestos obtenidos del
medio ambiente, en compuestos requeridos para vivir, para su crecimiento y para su reproduccin.
En estas transformaciones participan diferentes enzimas que catalizan las reacciones de oxidacin,
reduccin, hidrlisis, transferencia de grupos, isomerizacin y sntesis, dando lugar a la degradacin
de los compuestos incorporados ( catabolismo) y a la sntesis de nuevos compuestos ( anabolismo).
Las exoenzimas son secretadas por la clula y actan fuera de ella sobre el sustrato, disminuyendo el
tamao de las molculas complejas en el medio ambiente, hasta lograr un tamao que pueda difundir
al interior de la clula, donde servirn de sustrato a las endoenzimas. Asmismo, cada grupo de
microorganismos muestra una capacidad enzimtica diferente para transformar los compuestos,
regida por su constitucin gentica y por factores ambientales. Pueden poseer una batera reducida de
enzimas actuando sobre pocos sustratos o pueden presentar un amplia variedad de sistemas
enzimticos (actuando sobre gran diversidad de sustratos.
MATERIALES Y METODOS
FERMENTACION. Fermentacin de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa y
manitol: En la fermentacin las molculas orgnicas sirven a la vez como donadores de electrones y
como aceptores. Por ejemplo, cuando la glucosa es fermentada por las bacterias del cido lctico,
primero es oxidado a piruvato, produciendo energa. El piruvato entonces, sirve como aceptor de
electrones y es reducido para formar cido lctico, con una produccin total de 2 molculas de ATP
por cada molcula de glucosa oxidada. Los productos finales de la fermentacin dependen del
microorganismo asociado y son muy variados, como cidos, alcoholes, diferentes molculas
orgnicas gases, los cuales pueden ser utilizados en la identificacin del organismo. Los cidos
liberados en el medio bajan el pH y la acidez se detecta mediante la adicin de un indicador de pH al
medio, como el rojo de fenol. Los gases producidos se detectan por medio de un tubo pequeo
(campana de Durham) introducido en forma invertida en el tubo con el medio lquido, donde quedan
atrapados, como una burbuja, en la parte superior de la campana.
1. Siembre tres bacterias como Escherichia coli, Enterobacter, Proteus vulgaris, en tubos de caldo-carbohidratos y campana de Durham. Deje un control sin bacterias. Cada medio se
prepara a partir de caldo rojo de fenol para fermentacin, adicionando por separado el carbohidrato al
0.7 %
2 Incube 24 hs a 37 C. 3 Observe los cambios ocurridos. El vire del indicador de pH a amarillo indica la degradacin del azcar con produccin de cido. La burbuja indica la produccin de gas. El vire a un color rojo
indica la produccin de amonaco y alcalinizacin cuando no se utiliza el carbohidrato.
Fermentacin cido-mixta ( prueba del Rojo de Metilo):
34
Algunas bacterias como las entricas (del tracto gastrointestinal), fermentan la glucosa y producen
grandes cantidades de productos cidos que bajan el pH del medio a 5.0
1 siembre un tubo de medio MR-VP (rojo de metilo-Voges Proskauer) con E. coli y otro con Enterobacter aerogenes.. Deje un tubo testigo sin sembrar.
2 Incube a 37 C por 24-48 hs. 3 De cada tubo transfiera 2 ml a tubos limpios y aada a cada unos 5 gotas de reactivo rojo de metilo. Este indicador de pH es detectado para detectar la acidez, virando a rojo a pH 4.4 y
tornndose amarillo a pH 6.2. Si la fermentacin cido-mixta tom lugar, el rojo de metilo
permanece rojo. Si no ocurri, se desarrolla el color amarillo.
Fermentacin 2,3-butanediol (prueba de Voges Proskauer):
Algunas bacterias fermentadoras de azcares producen 2,3-butanediol como producto principal que
se acumula en el medio. La adicin de KOH al 40% y solucin de alfa naftol al 5 % en etanol
absoluto, revelar la presencia de acetona (acetil-metil-carbinol), un precursor en la sntesis de
2,4butanediol. La acetona en presencia de KOH desarrolla un color rosa. Esta reaccin es acelerada
por la adicin de alfa-naftol. El desarrollo del color es ms favorable en la porcin del cultivo
expuesto al aire, debido a que algo del 2,3-butanediol es oxidado en forma regresiva a acetona,
incrementando as, la intensidad del color en la reaccin. As, con el fin de obtener resultados ms
claros, los cultivos en caldo MR-VP y el reactivo aadido se tapan y se agitan muy suavemente para
aumentar la aereacin y la velocidad de la oxidacin de 2,3-butanediol a acetona.
1. Siembre un tubo de caldo MR-VP con E. coli y otro con Enterobacter aerogenes e
incube 24-48 hs a 37 C. Deje un tubo testigo sin sembrar.
3. Transfiera 5 ml de cada cultivo a otro tubo limpio y aada 10 gotas de KOH al 40 % y 15 gotas
de alfa-naftol a cada tubo y mezcle bien para facilitar la aereacin, lo cual incrementa la
oxidacin. Los resultados positivos son evidentes despus de 30 min, con la aparicin del color
rojo.
RESPIRACION AEROBIA Y ANAEROBIA
Los azcares son comnmente usados como fuente de energa mediante su oxidacin durante la
gliclisis, hasta piruvato, en la que se obtienen 2 ATP por cada molcula de glucosa oxidada. En
presencia de un aceptor de electrones externo (como el O2), el piruvato es oxidado a acetato (Acetil-
CoA), la cual entra al ciclo de Krebs donde es oxidada. En este ciclo la principal funcin es oxidar
varias molculas (remover los electrones y protones). Estos electrones y protones obtenidos entran a
los sistemas de transporte de electrones, donde se genera ms energa en forma de ATP, durante la
fosforilacin oxidativa. Finalmente, los electrones y protones son donados a un aceptor tal como el
O2 o el ( NO3-) que se encuentran en el medioambiente de la clula. Si el O2 es el aceptor de
electrones, este proceso es llamado respiracin aerobia. Si el aceptor es el (NO3-) u otra molcula
inorgnica que no sea O2, es llamado respiracin anaerobia.
Prueba de la oxidasa. Esta prueba detecta la presencia de citocromo oxidasa, enzima que transfiere
electrones del citocromo c al oxgeno. Cuando las colonias de las bacterias son tratadas con el
reactivo oxidasa (oxalato de dimetil-p-fenilendiamino) se tornan de color negro en 30 minutos,
debido a la enzima oxida el reactivo (color negro), mismo que es incoloro en su forma reducida.
1 Siembre una placa de agar nutritivo con E. coli, otra con Pseudomonas aeruginosa (control positivo) y deje una tercera como testigo sin bacterias.
2 Elija en cada placa una colonia aislada de las bacterias y deposite en cada colonia dos gotas de del reactivo oxidasa
3 Las colonias oxidasa positivo se tornan negras.
35
Prueba de la catalasa. La catalasa y la peroxidasa son las enzimas que catalizan el rompimiento del
perxido de hidrgeno H2O2. La oxidasa rompe el H2O2 en agua y O2, siendo importante porque
destoxifica a los organismos aerobios del H2O2, el cual inactiva las enzimas celulares esenciales. Este
se forma durante el metabolismo aerbico, cuando los componentes de la cadena respiratoria donan
electrones al oxgeno molecular.
1 Cultivos en placa de 24 hs de S. aureus como control positivo y otros dos organismos ,a 37 C y un control sin sembrar.
2 Elija una colonia aislada de bacterias en cada placa y agregue, unas gotas del reactivo catalasa (perxido de hidrgeno) sobre las colonias.
3 La actividad de la catalasa se detecta por la formacin de burbujas de oxgeno (una rpida efervescencia) al liberarse oxgeno gaseoso.
Reduccin de nitratos.
En la Respiracin anaerobia, algunos microorganismos utilizan molculas diferentes al
oxgeno como ltimo aceptor de electrones, por ejemplo el nitrato (NO3-
), quedando
reducido a nitrito (NO2-
).
1 Siembre Bacillus subtilis como testigo nitrato-reductasa positivo en tubos con caldo nitrato y campana de Durham. Siembre otros dos tubos con bacterias diferentes y un control sin sembrar.
2 Incube 24-48 hs a 37 C.
1 Observe la presencia de gas en la campana. 2 Agregue 4 gotas de solucin A (cido sulfanlico) y 4 gotas de la solucin B (alfanaftil-amina). Los iones nitrito reaccionan con los reactivos, dando un color rojo. Esto indica que hubo
reduccin de nitratos a nitritos.
HIDROLISIS DE GRANDES MOLECULAS.
En la naturaleza existen grandes molculas y muy complejas, como los polisacridos, las
protenas, los lpidos y los cidos nucleicos. Estas macromolculas son hidrolizadas por
los organismos quimiorganotrficos, mediante la accin de sus exoenzimas hidrolticas,
antes de que la clula pueda utilizarlas como nutrientes. La hidrlisis es el rompimiento
de una molcula por adicin de agua.
Hidrlisis del almidn:
Cuando el almidn (amilosa) es hidrolizado por la accin de exoenzimas amilasas, se
degrada a maltosa (disacrido de dos glucosas) y glucosa. Estos azcares son
transportados al citoplasma de la clula y usados como fuente de carbono y fuente de
energa.
1 Con un marcador divida externamente en cuatro, una caja de Petri con agar-almidn. 2 Siembre por estra en el primer sector a Bacillus subtilis, organismo testigo hidroltico del
36
almidn. En el segundo y tercero siembre otras dos bacterias de actividad desconocida. El cuarto
sector ser un control del sustrato sin microorganismos.
3 Incube48hsaa37C 4 Cubra la superficie de las cajas con lugol y observe la reaccin. Compare con los resultados de las bacterias. Busque halos sin color azul alrededor de las colonias. En el sector control sin
bacterias observe el color azul del lugol con el almidn. El almidn reacciona qumicamente con
Iodo para producir un color azul oscuro, cuando las molculas de Iodo se insertan en los huecos de la
molcula espiralada del almidn (amilosa). Este resultado es debido a que la molcula absorbe ms
luz visible excepto el azul. Si el almidn se rompe en maltosa y glucosa, no se desarrolla ningn
color debido a que desaparece la espiral y no quedan los huecos para que entre el Iodo. Esta ausencia
de color es asociada con la hidrlisis del almidn,
Hidrlisis de la casena.
La casena es una protena encontrada en la leche, Como todas las protenas, est compuesta de
aminocidos que son utilizados por los microorganismos como fuente de energa y fuente de
carbono. Cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y se
vuelve turbio, debido a que la casena reacciona con los iones calcio y forma complejos coloidales
insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima caseinasa cataliza la hidrlisis de la casena, los
aminocidos resultantes se disuelven en el medio acuoso y el medio se torna de nuevo transparente
alrededor de la colonia del microorganismo. Este fenmeno permite detectar la degradacin de la
protena.
1 Divida en cuatro partes con el marcador, una caja con agar-leche descremada. 2 Siembre en un sector Bacillus subtilis, organismo testigo que hidroliza la casena.
1 El segundo y tercer sectores simbrelos con dos bacterias desconocidas. El cuarto sector djelo como testigo sin bacterias.
2 Incube todos los cultivos 48 hs a 37 C. Observe un halo de transparencia alrededor de las colonias que hidrolizaron la casena. Determine cules organismos hidrolizaron la casena.
Hidrlisis de la gelatina. La gelatina es una protena fibrosa que se obtiene al hervir huesos,
cartlgo y otros tejidos conectivos, que al enfriarse forma un gel. Ciertos microorganismos tienen
habilidad para romper la molcula, mediante la exoenzima gelatinasa, liberando aminocidos que se
usan como nutrientes. La gelatina hidrolisada se vuelve lquida.
1 Siembre tubos con gelatina, en el centro por picadura, los organismos Pseudomonas aeruginosa como testigo hidroltico de la gelatina y otras dos bacterias, as como un tubo control sin
sembrar.
2 Incube todos los cultivos 24-48 hs a 37 C. Observe y si es necesario vuelva a incubar. Observe diario.
2. Coloque los tubos en el hielo unos minutos y determine si hay licuefaccin de la gelatina en el
sitio de la picadura.
Hidrlisis de Grasas: Las grasas son steres de glicerina y cidos grasos que requieren la accin de
enzimas lipasas que hidrolicen los enlaces ster entre ambos compuestos, como en los triglicridos,
resultando cidos grasos de cadena larga y glicerol.. Las fosfolipasas hidrolizan los fosfolpidos. En
un medio de cultivo slido con mantequilla se observa un halo transparente alrededor de la colonia
37
del microorganismo que hidroliza la grasa. Estas molculas resultantes son usadas como fuente de
energa y de carbono. La hidrlisis de grasas en los alimentos origina la rancidez, misma que se
refleja en el sabor y olor desagradables. En el medio de cultivo con agar, los cidos grasos liberados
acidifican el medio, lo que puede detectarse mediante un indicador de pH en el medio.
1 Siembre solo el centro de una placa de medio agar-spirit-blue-aceite de olivo, con Proteus mirabilis o con Staphylococcus epidermidis. Deje un control sin bacterias.
2 Incube 48hs a 37C 3 La hidrlisis de grasas es indicada por una zona azul alrededor del crecimiento bacteriano. Donde no hay hidrlisis se conserva el color original del medio (lavanda claro).
Hidrlisis de la urea. La urea o carbamida es una diamida que se degrada por medio de una
amidasa llamada ureasa. Se rompe el enlace del nitrgeno con el carbono, con liberacin de
amonaco y CO2 . El medio con urea es adicionado de un indicador de pH (rojo de fenol). El
amonaco libre alcaliniza el pH y el indicador vira a color violeta.
1. Siembre Proteus vulgaris en tubos con medio urea-agar inclinados e incube 48 hs a 37
C. 2. El cambio de color del medio de naranja a violeta indica la hidrlisis de la urea.
UTILIZACION DE AMINOACIDOS.
Los aminocidos son molculas que contienen un grupo cido (COOH), un grupo amino (NH2) y un
grupo radical (R), y son utilizados por las clulas para la sntesis de protenas. Los aminocidos son
los compuestos orgnicos nitrogenados ms utilizados por los microorganismos, originando la
separacin del grupo carboxilo, del grupo amino o del sulfhidrilo. La descarboxilacin permite la
formacin de aminas, con frecuencia malolientes. La desaminacin puede ser oxidativa, produciendo
un cetocido y amonaco. La desaminacin reductiva es frecuente por los clostridia (anaerobios),
produciendo un cido graso saturado y amonaco.
Utilizacin del Triptofano y produccin de indol
El triptofano es un aminocido que resulta del rompimiento de la mayora de las protenas. Algunas
bacterias producen la enzima triptofanasa que cataliza la separacin de residuos de indol, a partir del
triptofano. La degradacin es intracelular mediante un sistema enzimtico llamado triptofanasa,
dando lugar a amonaco, cido pirvico y tres metabolitos: indol, cido indol-actico y escatol.. El
indol se acumula en el medio de cultivo como un metabolito de desecho, mientras que el resto de la
molcula del triptofano (piruvato y NH4+
) es usada para satisfacer necesidades nutricionales. El indol
puede detectarse en el medio de cultivo, por adicin del reactivo de Kovac, el cual reacciona con el
indol en unos segundos, dando un compuesto rojo insoluble en agua,.
1 Siembre en tubos con caldo triptona la bacteria E. coli como testigo positivo productor de triptofanasa y del metabolito indol. Siembre otras dos bacterias en tubos del mismo medio y deje un
control sin bacterias.
2 Incube 24 hs a 35 C 3 Aada 5 gotas del reactivo de Kovac a cada tubo. El desarrollo de un color rojo indica la presencia de Indol.
Produccin de sulfuros, a partir de aminocidos con azufre.
38
Muchas protenas son ricas en aminocidos con azufre, como la cistena y la metionina, los cuales
son liberados con la hidrlisis de las protenas. La produccin de H2S a partir de aminocidos con
azufre, mediante la enzima desulfurasa, indica la capacidad de los microorganismos para utilizarlos.
El olor del H2S es asociado tpicamente con el de los huevos podridos. Si adems de los aminocidos
con azufre, el medio de cultivo tambin contiene iones ferrosos, stos reaccionan con el H2S,
produciendo sulfuro ferroso (FeS), compuesto insoluble de color negro. El ennegrecimiento del
medio se observa primero donde hay mxima acidez.
1 Siembre tubos con medio de SIM con un Proteus vulgaris como testigo positivo productor de H2S , as como dos bacterias ms y un control sin sembrar.
2 Este medio SIM contiene polipptidos ricos en aminocidos azufrados, principalmente triptofano y adems iones ferrosos. Por lo tanto, en este medio se puede hacer simultneamente la
prueba de produccin H2S y la de Indol
2. Incube 48 hs 35 C. El color negro indica la presencia del sulfuros de un metal pesado..
Prueba de la lisin-descarboxilasa
La descarboxilacin es la separacin de un grupo carboxilo de molculas orgnicas como los
aminocidos, con liberacin de CO2. La descarboxilacin permite neutralizar los ambientes cidos.
Las enzimas descarboxilasas separan los grupos cidos de los aminocidos, produciendo aminas, que
hacen el medio ms alcalino. La descarboxilacin de la lisina puede detectarse en un medio
conteniendo lisina, junto con glucosa y un indicador de pH (prpura de bromocresol), para observar
visulamente los cambios. Los cidos de la fermentacin de la glucosa bajan el pH del medio
induciendo el cambio de color a amarillo . En este punto ocurre la descarboxilacin de la lisina
(activada por la acidez) resultando en la produccin de aminas y neutralizacin del medio y sto hace
que el indicador regrese a su color prpura al neutralizarse el medio.
1. Inocule Salmonella tiphymorium o Proteus mirabilis y otro con Escherichia coli por picadura
en un tubo de medio solido con Agar Lisina Hierro (LIA).
Incube todos los tubos 24 hs a 37 C.
En el medio de cultivo La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro
y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El
purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a
5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto
produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en
medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de
incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo
amarillo.
UTILIZACION DE CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO Y DE ENERGIA.
El medio citrato de Simmons es un medio de composicin definida, adicionado del indicador de pH
Azul de Bromotimol. Cuando la bacteria utiliza el citrato, elimina el cido del medio y el indicador
cambia de verde a azul en las condiciones alcalinas.
39
1 Siembre Escherichia coli como testigo en tubos con citrato, as como otras dos bacterias y un control. Incube igual.
2 El crecimiento indica utilizacin del Carbono. Un color azul indica la formacin de productos alcalinos
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
Como complemento de los resultados agregue las reacciones bioqumicas ocurridas en
cada ejercicio.
APENDICE:
Medio agar Leche descremada:
Triptona..5 gr
Extracto de levadura ....2.5 gr
Dextrosa..1.0
Agar 15 gr Agua destilada ..1000 ml.
Se autoclavea. Por separado se esteriliza la leche descremada. Al vaciar el medio en las placas se le
adicionan 2 ml de leche a cada placa, se mezcla y se deja solidificar.
Medio Agar-almidn: Extracto de
carne..3.0 g Almidn
soluble10 g
Agar..12 g Agua
destilada1000 ml Autoclavear.
Medio Agar Lisina Hierro (LIA) Peptona de gelatina5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Glucosa 1.0 g Lisina10.0 g Citrato de hierro y amonio 0.5g Tiosulfato de sodio0.04 g Purpura de Bromocresol0.02 g Agar 15.02 g
Agua destilada 1000 ml
Suspender 35 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Dejar hidratar por 15 min.
Calentar agitando y hervir por 1 min hasta disolucin. Distribuir y autoclavear. Dejar enfriar con
inclinacin .
40
PRACTICA #9
VARIACIONES GENETICAS BACTERIANAS
OBJETIVO DE LA PRACTICA. Desarrollar algunas tcnicas para inducir mutantes,
comprendiendo su importancia y su aplicabilidad
INTRODUCCION Variaciones temporales: se refieren a variaciones en las bacterias debidas a
factores ambientales y que no incluyen reestructuracin del DNA. Tales variaciones pueden ser
morfolgicas o fisiolgicas y desaparecen tan pronto como los cambios ambientales que las
indujeron desaparecen tambin. Por ejemplo, un cultivo de E. coli al hacerse viejo, cuando los
nutrientes en el medio de cultivo se agotan, las clulas nuevas son ms cortas, cocoides, pero al
inocular la bacteria en un medio fresco, recupera su forma y tamao originales. Variaciones
permanentes: son cambios resultantes de alteraciones en la molcula del DNA, dando lugar a que
permanezcan durante un gran nmero de resiembras de la bacteria. Estas modificaciones son debidas
a mutaciones y ocurren espontneamente. Pueden ser inducidas por factores fsicos y qumicos.
Transferencia de DNA (recombinacion bacteriana): Algunas variaciones permanentes tambin
pueden ser causadas por la transferencia de DNA de un organismo a otro, por diferentes mecanismos
directos, tales como la conjugacin o indirectamente por medio de un fago.
MATERIALES Y METODOS.
I. Aislamiento de mutantes que ilustren la variacin del genotipo (por efecto de la luz
ultravioleta). 1 Siembre 0.1 ml de cultivo de Serratia marcescens en cada una de siete placas de agar nutritivo, y extienda por estra.
2 Destape las cajas bajo una lmpara de luz ultravioleta (use lentes para luz U.V. con el fin de proteger los ojos). Retire las cajas de una en una a intervalos de 6, 30, 60, 90, 120 y 150 segundos.
Deje una caja como testigo sin tratamiento de lu
Recommended