Horizontální elektroforéza na agarovém gelu

Horizontální elektroforéza na agarovém gelu

MUDr. Michal Jurajda

ÚPF LF MU

Agarózový gel

Agarózový gel

Příprava agarózového gelu

• Připravit navážku agarózy

• Za míchání smísit s potřebným množstvím pufru

• Zvážit

• Rozvařit

• Doplnit na původní hmotnost dest. Vodou

• Zchladit a přidat EtBr.

Nalévání agarózy

• Připravit nalévací misku (olepit páskou nebo umístit do „formičky“, nasadit hřebínek a zkontrolovat jeho vzdálenost ode dna.

• Umístit na vodorovnou podložku.

• Nalít agarózu o teplotě cca 40 ºC.

• Nechat zchládnout a odstranit hřebínek a pásku

Příprava TBE pufru

• 61,8g kys. borité

• 121,0g TRIS báze

• 7,5g EDTA

• Doplnit do 1000ml destilovanou vodou

• pH 8,0

Nanášecí pufr

• Ficoll– zvyšuje hustotu roztoku, drží roztok na dně

jamky

• bromfenolová modř– vizualizuje roztok při nanášení a migruje v

elektrickém poli

• 300 μl bromfenolové modři 0,125% + 30ml vodného roztoku ficollu 15-20%

Barvení DNA v gelu

• Ethidium bromid

• Zásobní roztok 5mg/ml

• Pracovní koncentrace 0,5-1 μg/ml

• (1-2 μl zásobního roztoku / 10 ml agarózy)

Intenzita elektrického pole

• Obecně 2-10V/cm

• Nejčastěji používáme intenzitu 2-4V/cm

• !pozor! intenzita elektrického pole se počítá ze vzdálenosti elektrod, nikoliv z rozměrů gelu

Pohyb DNA při elektroforéze

• Elektrické pole

• Difúzní pohyb

+

-

Vizualizace a archivace obrazu

Elektroforéza v agarovém gelu

Jak zajistit co nejlepší výsledek?

• Nenanášet velké množství DNA

• Nepoužívat zbytečně vysoké napětí

• Volit správný druh a koncentraci agarózy

• Recyrkulace pufru

• Chladit elektroforézu