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Aula prática de Imunologia ICS - UFBA: Imunofluorescencia
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer,
Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
• A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência.
• De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
• Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.
• Teste qualitativo/semi-quantitativo.
• Método de alta sensibilidade e alta especificidade.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
o FLUOROCROMOS:
• Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.
• 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos.
• Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
o FLUOROCROMOS:
• São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência.
• Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
o MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:
• A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).
• Para deixar passar somente a emissão
secundária desejada, devem-se utilizar filtros
apropriados dependendo da cor
do fluorocromo.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
DIRETA INDIRETA
Detecção de Ag Detecção de AcDetecção de Ag
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
o TIPOS DE REAÇÃO:
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
O anticorpo não ligado é removido por lavagens.
O preparado é observado em microscópio de fluorescência.
Y YY
YY
Y
YAntígeno pesquisado
Conjugado
o VANTAGENS
• Alta especificidade e sensibilidade
• Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.
o DESVANTAGENS
• Alto custo do microscópio de fluorescência
• Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou localizar
• Subjetividade da leitura
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
o APLICAÇÕES
• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
• Em bacteriologia, um dos poucos métodos de IFD ainda usados em laboratória clínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo.
Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente.
O preparado é observado em microscópio de fluorescência.
YY YYYYA preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal.
Y Y YYAntígeno pesquisado
Conjugado
Anticorpo Monoclonal
YY
Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS
Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados.
O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo.
A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência.
YYY Y YYYY YY
Antígeno padronizado
Conjugado
Anticorpo pesquisado
YY
o VANTAGENS• Sensibilidade
• Especificidade
• Reprodutibilidade
• De simples padronização e execução
• O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
• Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos
o DESVANTAGENS• Necessidade de microscópio de fluorescência
• Subjetividade na leitura
• Não-automação
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
o APLICAÇÕES
• Medicina humana
• Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
• Medicina Veterinária
• Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo
gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à
necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
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