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Identificação e caracterização de Identificação e caracterização de genes e fatores relacionados à genes e fatores relacionados à
floculação e desenvolvimento de floculação e desenvolvimento de uma levedura industrial não uma levedura industrial não
floculantefloculanteAline Rodrigues
Orientação: Dr. Gonçalo A. G. Pereira
Projeto de Doutorado
Sumário
PARTE I
Leveduras industriais Floculação Objetivos Metodologia
PARTE II
Genes relacionados ao estresse oxidativo Objetivos Metodologia / Resultados Parciais
PARTE IPARTE I
FLOCULAÇÃOFLOCULAÇÃO
LEVEDURAS INDUSTRIAISLEVEDURAS INDUSTRIAIS
Principais fatores que influenciam no
processo de fermentação para
produção de etanol
Capacidade fermentativa das
leveduras
Resistência das leveduras às condições de
estresses submetidas
Leveduras iniciais
Leveduras selvagens
IsoladIsoladasas
BG-1 (Usina Barra Grande)CR-1 (Usina Cresciumal)SA-1 (Usina Santa Adélia)CAT-1 (Usina Catanduva)PE-2 (Usina da Pedra)
LEVEDURAS INDUSTRIAISLEVEDURAS INDUSTRIAIS
.Linhagens selvagens selecionadas pela capacidade de predominar sob as condições físico, química e microbiológicas presentes na dorna
.Condições de estresse adverso:
alta contaminação
bacteriana alta acidez
altas temperatura
s
?
AGREGADOS MULTICELULARESAGREGADOS MULTICELULARES - FLOCULAÇÃO!! -- FLOCULAÇÃO!! -
PROBLEMAS CAUSADOS PELA FLOCULAÇÃOPROBLEMAS CAUSADOS PELA FLOCULAÇÃO
Floculação Decréscimo de rendimento Prejuízos !!!
• . Redução da área de contato das leveduras com o meio
• . Problemas na circulação do líquido nas tubulações
. Reversível dependente de cálcio
Controlado geneticamente!!
GENES RELACIONADOS À FLOCULAÇÃOGENES RELACIONADOS À FLOCULAÇÃO
FAMÍLIA FLO
FLO1FLO5FLO9FLO10
OUTROS GENES ?FLO8
MSS11GTS-1
Floculação controlada por 3 genes
FLO8
outros 2 genes desconhecidos
OBJETIVOSOBJETIVOS
Desenvolver uma levedura industrial que não apresente o fenótipo floculante, independente das condições encontradas nas dornas.
Objetivos específicos:
. Identificar e caracterizar os genes reguladores envolvidos no processo de floculação;
. Desenvolver mutantes para os genes selecionados em uma linhagem de levedura de laboratório
. Desenvolver mutantes para os genes selecionados em uma linhagem de levedura industrial
Demais objetivos: Identificar características gênicas de linhagens industriais relacionadas com resistências a estresses presentes nas dornas.
outros 2 genes desconhecidos
MAPEAMENTOComparação do genoma entre isolados haplóides
originários da mesma linhagem, mas com
características distintas quanto ao fenótipo
floculante.
SEQUENCIAMENTO
Identificadas composições de genes diferentes
para cada isolado e polimorfismos nos
variados alelos
Seleção dos GENES ALVOS
METODOLOGIAMETODOLOGIAFLOCULAÇÃO - IDENTIFICAÇÃO DOS GENES DE INTERESSE
Seleção dos GENES ALVOS
Estudos de transformação para desenvolvimento de
mutantes FLOCULAÇÃO - DELEÇÃO DE GENES ESPECÍFICOS
Delitto Perfetto - nenhuma marca de seleção será deixada no final do processo de deleção de cada locus
ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO
Leveduras serão desfloculadas, ressuspendidas em tampão de floculação;
A floculação será induzida por Ca2+;
Capacidade de floculação: F=(1-B/A)x100%,
onde A=A600 antes das células serem agitadas em tampão de floculação e B=A600 após 6 min sem agitação
ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO – ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO – PE-2PE-2
não flocula
em laboratór
io!!
- Ensaios de laboratório -
tentativas para induzir a floculação
da PE-2 diferentes
temperaturas
diferentes concentraçõ
es de bactérias
contaminantes
variação de pH
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO RELACIONADOS AO
ESTRESSE OXIDATIVOESTRESSE OXIDATIVO
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO
ESTRESSE OXIDATIVOOUTRAS CONDIÇÕES ADVERSAS
desafios que as leveduras
encontram nas dornas para sobreviver e fermentar
SNO/SNZMPR
resistência a alguns
fenômenos de estresse
Estudo pode ser importante
para a manipulação genética de
leveduras industriais
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO
GENES SNO/SNZ EM LEVEDURAS
SNZSNZ
SNZ2SNZ2SNZ1SNZ1 SNZ3SNZ3
SNSNOO
Coregulados durante a fase de crescimento até a
fase estacionária e durante a limitação de
nutrientes
SNO e SNZ em leveduras – envolvidos na síntese de vitamina B6 e vitamina B1
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO
GENES SNO/SNZ EM LEVEDURAS
S288c
SNO1/SNZ1 - região mediana do braço direito do cromoss. XIIISNO2/SNZ2 - braço esquerdo do cromoss. XIVSNO3/SNZ3 -braço esquerdo do cromoss. VI
Teloméricos!!
PARTE IIPARTE II
IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS INDUSTRIAISINDUSTRIAIS
Vitamina B6
Metabolismo de
aminoácidos
Forma biologicame
nte ativa PLP
Em S. cerevisiae
Precursor da tiamina (Vitam.
B1)
Vitamina B1
Cofator tiamina
pirofosfato
Essencial para a
utilização do açúcar
Fermentação
ALTA ALTA DEMANDA DE DEMANDA DE TIAMINA NOS TIAMINA NOS AMBIENTES AMBIENTES
INDUSTRIAIS !!INDUSTRIAIS !!!!
AUMENTO DA REGULAÇÃO DOS
GENES DE METABOLISMO DA
TIAMINA EM LEVEDURAS DE
FERMENTAÇÃO E DE DIVERSOS AMBIENTES
INDUSTRIAIS
TIAMINA NO TIAMINA NO MEIOMEIO
Efeito negati
vo Fase inicial de crescimento
das células de levedura
Consequência do efeito
repressor de tiamina na
biossíntese de PLP
Diminuição resultante no
conteúdo celular da
vitamina B6
Muitas vias metabólicas
são reprimidas
PARTE IIPARTE II
IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS INDUSTRIAISINDUSTRIAIS
. CNVs (variação no número de cópias)- genoma de 5 linhagens industriais
. 72 CNVs exclusivas de linhagens industriais –importantes amplificações dos genes teloméricos SNO e SNZ - SNO2/SNZ2 e SNO3/SNZ3
. Linhagens industriais – perderam genes SNO/SNZ do cromoss. VI, mas apresentaram hibridizações em vários outros cromossomos
Inibição do crescimento induzida por
tiamina/açúcar
linhagem de
laboratório
S288cNenhuma das cinco leveduras industriaisapresentaram o fenótipo de crescimento
tiamina-repressível
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO
GENES MPR EM LEVEDURAS
MPR – pode conferir uma vantagem adaptativa às condições adversas das dornas de fermentação : estresse oxidativo, resistência à temperatura elevada e alta concentração de etanolDiminuição de níveis intracelulares de ROS quando as células de levedura são expostas à condições de estresse oxidativo como choque térmico, peróxido de hidrogênio, congelamento ou tratamento com etanol
SNO/SNZ e MPR - número de cópias elevado
linhagem industrial X linhagem de laboratório (S288c)
Vantagem adaptativa Bom desempenho fermentativo
Objetivos específicos:Objetivos específicos:
Analisar esporos de uma linhagem industrial (PE-2), relacionando o número de cópias desses genes (SNO/SNZ e MPR) com a eficiência nos ensaios fermentativos e resistência a estresses
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO
OBJETIVOSOBJETIVOS
Identificar características gênicas de linhagens industriais relacionadas com resistências a estresses presentes nas dornas
OBTENÇÃO DOS ESPOROS HAPLÓIDES
Asco
Esporulação
Dissecção de
tétrades
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO
RESULTADOS PARCIAISRESULTADOS PARCIAIS
30 tétrades linhagem PE-
2 (isolado JAY270)
120 esporos haplóides4
esporos viáveis
120 esporos haplóides
PARTE IIPARTE II
ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO
RESULTADOS PARCIAISRESULTADOS PARCIAIS
PFGETransferência dos géis de PFGE para membranas de hibridização
Southern-blot
Segregação dos genes SNO/SNZ e MPR
Avaliar o número de cópias desses genes em cada esporo haplóide isolado, e localização cromossômica
Ensaios fermentativos e de resistência a estresses
CARIOTIPAGEM POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO
(PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Construção das Sondas
Genes Primers
SNO/SNZSNO/SNZ F: 5’TACGGATTTGTAAGAGTTCCT3’
SNO/SNZ R: 5’CCCAAATGTATTGCATATGAC3’
MPRMPR1 F: 5’TTCAACCGTTAGCCGACTCT3’
MPR1 R: 5’ATGAGGCACCAGTCCAATTC3’
SOUTHERN-BLOT – GENES SNO/SNZ
PRÓXIMAS ETAPAS DO PROJETOPRÓXIMAS ETAPAS DO PROJETO
FLOCULAÇÃO
Deleção do gene FLO8
Ensaios floculação – PE-2
GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO
Análises de Southern-blot
Ensaios fermentativos e resistência a estresses
Obrigada!Obrigada!!!!!
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