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18/03/2019
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Indução neural: determinação do eixo inicial/definição do domínio
neural
1. Indução da formação da PLACA NEURAL pelo Mesoderma (Mudança na forma celular, expressão de marcadores gênicos)
1. Associação da Placa Neural com a Notocorda subjacente; constrição apical nas células da borda da Placa Neural
1. Dobramento da Placa Neural
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1. A convergência do Tubo Neural é uma combinação de fatores: Pressão lateral e constrição nos pontos de dobradiça e extensão convergente
1. Fusão do Tubo Neural na porção dorsal concomitante com a Migração da Crista Neural
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O QUE INDUZ AFORMAÇÃO DOSISTEMA NERVOSO?
Prêmio Nobel em 1935
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Resultados:1. Gerou dois eixos embrionários=
DUPLICAÇÃO AXIAL
1. O segundo embrião é composto de células doadoras E aceptoras.
Conclusão:O Lábio dorsal do blastóporo tem capacidade INDUTIVA
O ORGANIZADOR
Propriedades do Organizador:
1. Inicia Gastrulação 2. Participa do
Mesoderma Dorsal3. Induz formação de
tecido Nervoso a partir do Ectoderma
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https://www.youtube.com/watch?v=rSIurckMtfU
(A origem das células do blastóporo dorsal (Organizador)
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A fertilização em anfíbios é seguida pela ROTAÇÃO CORTICAL, que forma o CRESCENTE CINZA
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Crescente cinza
O Organizador da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero)
Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões?
a) Porque dividiu o ovo pela metade
b) Foi um resultado aleatório
c) Porque dividiu o crescente cinza.
d) Porque dividiu o Organizador.
Spemann, 19381
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Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões?
a) Porque dividiu o ovo pela metade
b) Foi um resultado aleatório
c) Porque dividiu o crescente cinza.
d) Porque dividiu o Organizador.
Spemann, 19381
Propriedades do Organizador:
1. Inicia Gastrulação 2. Participa do
Mesoderma Dorsal3. Induz formação de
tecido Nervoso a partir do Ectoderma
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No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário?
a)Fator de transcrição (proteína nuclear)b)Receptor de membranac)Ligante de membranad)Proteína extracelular secretada
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No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário?
a)Fator de transcrição (proteína nuclear)b)Receptor de membranac)Ligante de membranad)Proteína extracelular secretada
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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?
1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?
Spemann, 1938
Pergunta: O ovo recém-fertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente?
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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?Sem Crescente cinza não há região dorsal
ENTÃO, qual o elemento ativo no crescente cinza?
1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?
Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Transcrição zigóticaCrescente
CinzaOrganizador
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1. Expressão na região dorsal
1. Capaz de causar duplicação axial
3. Ser de origem materna
Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:
Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:
1. Expressão na região dorsal
1. Capaz de causar duplicação axial
1. Capaz de compensar pelo efeito do UV
1. Ser de origem materna
•A TRANSCRIÇÃO no embrião de Xenopus só ocorre NA BLÁSTULA
•Os fatores indutivos do Organizador estão presentes ANTES da blástula
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U.V.
Quantidades crescentes de Ultravioleta alteram o desenvolvimento embrionário
U.V.
Dor
sal
Vent
ral
Dor
sal
Vent
ral
O tratamento com UV inibe a rotação cortical, altera a localização de Dsh, que passa de dorsal para homogêneo
Western Blot para DshDishevelled
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Heasman, J. Development 124, 4179-4191 (1997)
Membros da Família Wnt
Obs.: Wnt=Wingless +int
Via de sinalização Wnt
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controle Injetados com XDsh
O Dsh, assim como o Wnt, causa duplicação axial
Sokol et al.,Development 121:1637-1647 (1995)
1. Expressão na região dorsal
1. Capaz de causar duplicação axial
1. Ser de origem materna
Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:
Candidato: Wnt/Dsh
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Dor
sal
Vent
ral
O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas
Western Blot para Dsh
1. Expressão na região dorsal
1. Capaz de causar duplicação axial
1. Ser de origem materna
Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:
Candidato: Wnt/Dsh
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Dor
sal
Vent
ral
O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas
Western Blot para Dsh
Antes da Transcriçãozigótica
1. Expressão na região dorsal
1. Capaz de causar duplicação axial
1. Ser de origem materna
Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:
Candidato: Wnt/Dsh
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O embrião de Xenopus expressa beta-catenina desde cedo
vent
ral
dors
al
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1. Expressão na região dorsal
1. Capaz de causar duplicação axial
1. Ser de origem materna
Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades:
Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)
Schohl and Fagotto Development 129, 37-52 (2002)
Localização da beta-catenina na blástula de Xenopus
ventral dorsal
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1. Expressão na região dorsal
1. Capaz de causar duplicação axial
1. Ser de origem materna
Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades:
Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)
Development 1992 Mar;114(3):699-709.Organization and regulation of cortical microtubules during the first cell cycle of Xenopus eggs.Schroeder MM, Gard DL
O centríolo do esperma organiza a polimerização dos microtúbulos que resultam na rotação cortical
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Slide 37 da Profa Nathalie:
A rotação cortical desloca elementos citoplasmáticos especificamente para o crescente cinza
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1. Fertilização
1. Polimerização polarizada dos microtúbulos pelo aster espermático
1. Rotação cortical
1. Concentração de Dsh na região vegetal-dorsal
1. Inibição de GSK-3 na região vegetal-dorsal
1. Atividade da beta-catenina na região vegetal-dorsal
Região Ventral
Região Dorsal
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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?
Acúmulo de beta catenina nuclear.
1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?
Spemann, 1938
Pergunta: O ovo recém-fertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente?
Este pedaço é só endoderma!
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Crescente cinza
A região DORSAL da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero)
No experimento acima, ocorreu uma duplicação na blástula aceptora e uma duplicação do início da gastrulação.O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?
a)Nada, porque o embrião se regenera.b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizadorc)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizadord)Ausência de gastrulação porque faltariam células.
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No experimento acima, ocorreu uma duplicação do na blástula aceptoar e uma duplicação do início da gastrulação.O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?
a)Nada, porque o embrião se regenera.b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizadorc)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizadord)Ausência de gastrulação porque faltariam células.
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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?
Acúmulo de beta catenina nuclear.
1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?Sem Crescente Cinza não há Organizador e não há gastrulação.
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1. Mas beta-catenina é uma proteína nuclear, e o efeito do Organizador depende de uma proteína secretada…
Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Crescente Cinza
Organizador
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Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Crescente Cinza
Organizador
?
Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Dsh no pólo vegetal
Dsh no crescente cinza
Transcrição zigótica
Organizador
Neural
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Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Dsh no pólo vegetal
Dsh no crescente cinza
Transcrição zigótica
Organizador
2. Transcrição zigótica do que?
COMO É FORMADO O ORGANIZADOR?
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Propriedades do Organizador:
1. Inicia Gastrulação 2. Participa do
Mesoderma Dorsal3. Induz formação de
tecido Nervoso a partir do Ectoderma
O Organizador de Spemann fica no MESODERMA DORSAL
Organizador de Spemann
Crescente cinza
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Após a gastrulação, as células do Organizador irão formar a notocorda
QUAL É A RELAÇÃO ENTRE
O CRESCENTE CINZA,BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!!
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Como é formado o MESODERMA?
Nieuwkoop, anos 70O pólo vegetal SECRETA elementos que induzem o
mesoderma mesmo antes da transcrição zigótica.
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?
Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma
Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:
1. Capaz de induzir MESODERMA
1. Expresso no pólo vegetal
1. Ser de origem materna
Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:
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Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do pólo vegetal que induzem o Mesoderma
Mas, VegT é uma proteína nuclear.....
VegT
Como é formado o MESODERMA DORSAL?
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Dale and Slack, 1987Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)
a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais
b) Os blastõmeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas
c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior
d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza
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Dale and Slack, 1987Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)
a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais
b) Os blastômeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas
c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior
d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza
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Dale and Slack, 1987Blastômero dorsal do pólo vegetal é capaz de induzir mesoderma DORSAL no ectoderma
NASCE O CENTRO DE NIEUWKOOP!
Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma Dorsal/Organizador
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5 Dale and Slack, 1987Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?
a) Fator de transcrição (proteína nuclear)
b) Receptor de membranac) Ligante de membranad) Proteína extracelular
secretada
5 Dale and Slack, 1987Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?
a) Fator de transcrição (proteína nuclear)
b) Receptor de membranac) Ligante de membranad) Proteína extracelular
secretada
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Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do polo vegetal DORSAL que induzem o Mesoderma DORSAL
VegTQue elemento materno está na região dorsal ?
QUAL É A RELAÇÃO ENTRE
O CRESCENTE CINZA,BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!!
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(VegT)
O Centro de Nieuwkoop é formado pela sobreposição de VegT e Beta-catenina
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β-catenina
VegT e outros TGF-betas
Mesoderma Dorsal
Mesoderma Ventral
Mas VegT e beta-catenina são fatores de transcrição!!!E são maternais (= antes da transcrição zigótica!)
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E agora????!!!!
β-catenina
VegT e outros TGF-betas
Mesoderma Dorsal (Org)
Mesoderma Ventral
?
?
Nieuwkoop
O que é secretado pelo Centro de Nieuwkoop para formar o Organizador?
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β-catenina
VegT
Mesoderma Dorsal (Org)
Mesoderma Ventral
?
?
Nieuwkoop
A presença SIMULTÂNEA dos fatores de transcrição beta-catenina e VegT inicia a transcrição zigótica de genes que codificam proteínas secretadas
Genes do Organizador
?
VegT Beta-Catenina
Nieuwkoop
Organizador
1. Ativado por VegT2. Ativado por beta-cat3. Induz Organizador
4. ZIGÓTICO!!
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Genes do
Organizador
Xnr-1/
Nodal
VegTBeta-Catenina Nieuwkoop
Organizador
1. Zigótico
2. Ativado por VegT
3. Ativado por beta-cat
4. Induz Organizador
O centro de Nieuwkooop no pólo vegetal, secreta Nodal, que
induz a formação do Organizador no mesoderma
Xnrs são expressos zigóticamente
Transc. Zigótica1. Zigótico2. Ativado por VegT3. Ativado por beta-cat4. Induz Organizador
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Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Dsh no pólo vegetal
Dsh no crescente cinza
Transcrição zigótica
Organizador
Nodal(produzido pelo C. Nieuwkoop)
Neural
VegT no pólo vegetal
Propriedades do Organizador:
1. Inicia Gastrulação 2. Participa do
Mesoderma Dorsal3. Induz formação de
tecido Nervoso a partir do Ectoderma por proteínas secretadas
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Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Dsh no pólo vegetal
Dsh no crescente cinza
Transcrição zigótica
Organizador
Nodal
Neural
VegT no pólo vegetal
?
O que é que o lábio do blastóporo dorsal secretaque pode induzir diferenciação neural no ectoderma?
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VIA DE SINALIZAÇÂO DE BMP
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Existem proteínas extracelulares que são inibidores de BMP e atuam evitando a ligação de BMP com o seu Receptor
O lábio do blastóporo dorsal produz inibidores de BMP como Chordin, Noggin e Follistatin.
NOGGINCHORDIN
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Development October 15, 2003 vol. 130 no. 20 4975-4988
Superexpressão de inibidores de BMP induzem um segundo eixo neural.
O que é que o lábio do blastóporo dorsal secretaque pode induzir diferenciação neural no ectoderma?
Inibidores de BMP
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SE inibição do BMP induz destino neural
BMP
Epidermal
Neural
BMP
Epidermal
Neural
ENTÃO BMP induz destino epidermal
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6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma?
a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial.
b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural
c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural
d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural
6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma?
a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial.
b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural
c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural
d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural
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mRNA para receptor dominante negativo de BMP (pg) Normal
Duplicação
0 88% 0
20 52% 27%
200 7% 76%
Suzuki et al. 1994 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 25;91(22):10255-9.
Remoção da via de sinalização de BMP>> neural
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O potencial de cada célula é indefinido
A posição de cada célula em relação a fonte de morfógeno
é interpretada em programas de diferenciação distintos
Gradiente morfogenético
Fator Morfogenético:
Tem efeitos diferentes em doses-diferentes
Ou seja:
Gera um gradiente de resposta a partir da origem do fator
BMC Developmental Biology 2007 7:22
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EpitélioNeural
BMP
BMP4
O ectoderma exposto a altos níveis de BMP = Epitélio
EpitélioNeural
B M P
BMP4
O ectoderma exposto a baixos níveis de BMP = Neural
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BMP
Epidermal
Neural
SE BMP induz epidermal
Epidermal
Neural
ENTÃO ausência de sinal deve favorecer a diferenciação neural
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Epidermal
Neural
ENTÃO ausência de qualquer sinal favorece NEURAL
Modelo de diferenciação neural por default
Redução da densidade de células tronco aumenta a expressão de genes neuraisof neural markers. Evidence for the “default neural state”
Tropepe, V. et al., 2001. Neuron, 30(1), pp.65–78.
Neu
ralm
arke
rsP
lurii
pote
ncy
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Recém-fertilizado
Rotação cortical
Meso-blástula
Gástrula
Dsh no pólo vegetal
Dsh no crescente cinza
Transcrição zigótica
Organizador
Nodal
Neural
VegT no pólo vegetal
Inibidor de BMP
Ausência de qq sinal……..
NeuralModelo de diferenciação neural por default
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E em outros modelos, é parecido?
• Próxima aula
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