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UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
MEDICINA
Disciplina de Microbiologia Humana
AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA
2015
ÍNDICE
LEMBRETES IMPORTANTES.........................................................................................3
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS.............................................................................3
MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA.................................5
MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO.....8
CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS.....................................................10
GENÉTICA BACTERIANA (CONJUGAÇÃO)..............Erro! Indicador não definido.
DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS....................16
STREPTOCOCCUS..........................................................................................................17
STAPHYLOCOCCUS.......................................................................................................20
PSEUDOMONAS..............................................................................................................24
ENTEROBACTÉRIAS......................................................................................................26
LEMBRETES IMPORTANTES
1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o
uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em
uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do
ambiente fora do laboratório.
2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são
realizados.
3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente
(derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de
qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc).
4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.
5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.
6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que
deixe os pés expostos.
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS
Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório
da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso da
atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente deverá
ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo menos
uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em seu
relatório, mesmo que o entregue.
Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de
forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos
experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais
que duas folhas.
3
Docentes:
Bacteriologia
Prof. Dr. Augusto Cezar Montelli
Prof. Dr. Josias Rodrigues
Prof. Dr. Rodrigo Tavanelli Hernandes
Profa. Dra. Vera Lúcia Mores Rall
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MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA
Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das
lâminas será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram
coradas e estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas
pelo método de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração
(como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco
ou bacilo). Além das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a
observação de uma lâmina contendo um esfregaço de escarro apresentando
bacilos álcool-ácido resistentes (que não se coram pelo método de Gram) e
corada pelo método de Ziehl-Neelsen.
A) Coloração de Bactérias pelo Método de Gram
Material:- Lâminas contendo o esfregaço de bactérias
- Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool 95%
e fucsina.
Procedimento:a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1
minuto.
b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol.
Esperar 1 minuto.
c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto,
deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a
inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados
quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos.
d) Lavar a lâmina em água corrente.
e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30
segundos a 1 minuto.
f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de
filtro.
g) Observar ao microscópio e desenhar.
5
Observar e Desenhar:
Lâmina B (Staphylococcus aureus)
Forma:________________
Arranjo:________________
Gram: ________________
Lâmina A(Escherichia coli)
Forma:________________
Arramjo:________________
Gram:_________________
Lâmina C (Streptococcus agalactiae)
Forma:________________
Arranjo:________________
Gram: ________________
6
Lâmina E(Neisseriasp.)
Forma:________________
Arranjo:_________________
Gram:_________________
Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR)(Mycobacteriumtuberculosis)
Lâmina contendo um esfregaço de
escarro de um paciente com
tuberculose, corada pelo método de
Ziehl-Neelsen, apresentando bacilos
álcool-ácido resistentes (BAAR).
7
MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO
A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias
Material:- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura B (Staphylococcus aureus)
- Cultura C (Streptococcus agalactiae)
- Caldo sintético
- Caldo comum
- Caldo glicosado (caldo comum mais glicose)
- Alça de níquel cromo
Procedimento:1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.
2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte.
3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).
4. Anotar os resultados.
Cultura Crescimento em:
caldo
sintético
Caldo
comum
caldo
glicosado
A (Escherichia coli)
B (Staphylococcus aureus)
C (Streptococcus agalactiae)
Lâmina D (Bacillus cereus)
Forma:________________
Arranjo:________________
Gram: ________________
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B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano
Material:
- Meio de Tiogel
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura D (Pseudomonas aeruginosa)
- Cultura F (Clostridiumsp.)
- Agulha de níquel cromo
Procedimento:Com a agulha de níquel cromo, semear as culturas A e D em tubos
de tiogel. Colocar todos os tubos na estufa a 37C por aproximadamente 18
horas. No dia seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a
localização do crescimento. A cultura F será semeada no Laboratório de
aula prática do Departamento de Microbiologia e Imunologia, e observada
juntamente com as culturas A e D.
Culturas
Local de crescimento no meio de Tiogel: Classificação
SuperfícieToda
extensão
Base do
Meio
A (Escherichia coli)
D (Pseudomonas aeruginosa)
F (Clostridium sp.)
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CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS
A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada
ou não.
Material:- Cultura A em salina (Escherichia coli, bactéria não esporulada)
- Cultura E em salina (Bacillus cereus, bactéria esporulada)
- Tubo contendo 1 ml da solução salina esterilizada
- Placas de Petri contendo ágar nutriente
- Banho-Maria a 60º C
- Alça de Níquel cromo
Procedimento:1. Inocule (com a alça de níquel cromo) as suspensões bacterianas A e E no
quadrante correspondente ao tempo 0’.
2. Coloque o tubo com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 5', 10' e 15',
retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri
(proceda exatamente como no item 1).
3. Deixe a placa na estufa a 37 C até o dia seguinte.
4. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do
tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++,
conforme a intensidade de crescimento).
Resultados:Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função
do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++) na
tabela abaixo.
Cultura Tempo de aquecimento
0’ 5’ 10’ 15’
A (Escherichia
coli)
E (Bacillus cereus)
10
B) Efeito de agentes químicos sobre as bactérias: antisséptico para enxague bucal
Material: 03 zaragatoas estéreis
Anti-séptico bucal de uso comercial
01 placa de ágar-nutriente
Procedimento:1. Divida uma placa de ágar nutriente em 3 quadrantes, marcando A (antes
do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo
tratamento).
2. Friccionar uma zaragatoa estéril na mucosa da bochecha e semear no
quadrante A em ziguezague.
3. Bochechar com parte do o anti-séptico bucal fornecido por 1 minuto.
4. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material
semeando no quadrante B.
5. Bochechar novamente com o anti-séptico bucal por 1 minuto.
6. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta do material semeando no quadrante
C.
7. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.
Resultados:Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento microbiano com cruzes
(de + a ++++) na tabela abaixo.
A B C
Crescimento
Microbiano
A (antes do tratamento)
B (depois do primeiro tratamento)
C (depois do segundo tratamento)
12
C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias: álcool iodado a 0,1%
Material: 01 tubo contendo aproximadamente 1 mL de álcool iodado a 0,1%
01 tubo contendo salina estéril
01 Placa de ágar-nutriente
03 zaragatoas estéreis
Procedimento:1. Umedeça uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Após retirar o excesso
de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a
vigorosamente no dorso de uma das mãos;
2. Passe a zaragatoa em área correspondente à metade de uma placa com ágar
nutriente;
3. Umedeça uma segunda zaragatoa em álcool iodado a 0,1% e esfregue no
dorso da outra mão;
4. Aguarde 2 minutos para que haja ação do antisséptico;
5. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando
cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Inocule, passando a
zaragatoa na superfície da outra metade da placa com ágar nutriente;
6. Incube a placa na estufa, durante uma noite.
7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo.
Resultados:Observe a intensidade do crescimento microbiano anotando com cruzes
(de + a ++++) na tabela abaixo.
Antes do Tratamento
Depois do Tratamento
Crescimento Microbiano
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GENÉTICA BACTERIANACONJUGAÇÃO
Material: 01 Placa de MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal)
01 Placa de MacConkey contendo Cloranfenicol (Clo)
01 placa de ágar MacConkey contendo Nal + Clo
Culturas A (Escherichia coli C600, lac-), B (Escherichia coli J53, lac+) e M
(cultura A + cultura B) em meio líquido
Alça de níquel cromo
Procedimento:1. Semeie as amostras A, B e a mistura (M) nas placas contendo meio
seletivo MacConkey, com antibóticos (Nal + Clo), conforme o esquema abaixo.
2. Para controle das culturas A e B, semeie cada uma das culturas recebidas
para essa aula prática em placas de ágar MacConkey contendo Nal e Clo
(separadamente), visando definir a capacidade das amostras em fermentar da
lactose e o perfil de resistência.
3. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte.
Resultados:
15
Registre os resultados obtidos na tabela abaixo:
Bactéria
Crescimento em ágar
MacConkey:Fermentação
da lactose
Padrão
de ResistênciaNal Clo Nal + Clo
A
B
M
Nal (ácido nalidíxico, 50 g/mL), Clo (cloranfenicol, 50 g/mL)
Quais as hipóteses possíveis para explicar o ocorrido?
Como você poderia comprovar a sua hipótese utilizando métodos
moleculares?
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Análise Molecular do Experimento de Conjugação
Eletroforese do DNA em gel de agarose das amostras A, B e da resultante da
mistura M
Atividade:
Identifique o perfil plasmidial de cada uma das amostras empregadas
nessa aula prática no gel apresentado acima.
Perfil Plasmidial
Amostra
1
2
3
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DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS
Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby
Material:- Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos
contendo drogas distintas
- Régua
- Tabela de referência
Procedimento:1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento.
2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no
quadro abaixo.
Droga Concentração (g/ml)
Diâmetro do halo de inibição do
crescimento
Interpretação*
12345
* S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário.
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STREPTOCOCCUS
EXERCÍCIOS
A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E.Verificar
o tipo de hemólise.
Cultura Hemólise
C
D
E
B) Observar a coloração de Gram das culturas C e E.
Cultura C Cultura E
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C) Prova da catalase.
Colocar sobre a cultura C(em caldo) e sobre uma cultura controle positivo
(Staphylococcus aureus) algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e
anotar o resultado (Positivo = formação de bolhas).
Catalase
Cultura C
Staphylococcus aureus (Controle
+)
D) Prova de sensibilidade à bacitracina.
Princípio: O princípio desta prova baseia-se na inibição de crescimento do
Streptococcus pyogenes (-hemolítico, grupo A) frente a uma pequena
quantidade de bacitracina.
Técnica: Verificar se ocorre uma zona de inibição de crescimento ao redor do
disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C.
Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento.
resistente: ausência de zona de inibição de crescimento.
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E) CAMP Teste
Princípio:A atividade da hemolisina do S. aureus é aumentada pela atividade
hemolítica do S. agalactiae (-hemolítico do grupo B).
Técnica: Verificar zona de hemólise, em placa de ágar sangue (feito c/ sangue
de carneiro), semeada coma cultura D e S. aureus.
Leitura: resultado - positivo: formação de uma zona de hemólise semelhante à
"ponta de flecha" na união das duas hemolisinas.
negativo: não formação de "ponta de flecha".
F) Prova da bilesolubilidade
Princípio: Esta prova verifica a sensibilidade da bactéria à lise por sais biliares
Técnica: Adicionar 0,1 ml de uma solução a 10% de desoxicolato de sódio a 1
ml da cultura D. Incubar a 37o C e examinar após 15 minutos. Anotar o
resultado. Fazer o mesmo com a cultura E.
Leitura. Resultado positivo (suspensão solúvel) - a cultura fica transparente.
Resultado negativo (suspensão insolúvel) - a cultura permanece turva.
Cultura Bile-solubilidade
D
E
G) Identificação das culturas
Cultura C
Cultura D
Cultura E
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STAPHYLOCOCCUS
A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever
as características das colônias e verificar hemólise.
Cultura Características das Colônias
Hemólise
A
B
B) Observar esfregaço da cultura A, corada pelo método de Gram e desenhar.
Observar ao microscópio e desenhar.
Cultura A
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C) Prova da Catalase
Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle algumas gotas de
água oxigenada. Observar a reação e anotar o resultado.
Cultur
a
Prova da Catalase
A
B
D) Prova da Coagulase
Princípio:
A coagulase é uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sanguíneo.
Técnica:
Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho
a 1%. Incubar a 37oC e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura
B e anotar os resultados.
Resultado positivo - formação de coágulo.
negativo - suspensão inalterada
Cultura Prova da Coagulase
A
B
E) Compilação dos resultados e Identificação das culturas
Hemólise Catalase Coagulase IdentificaçãoCultura A
Cultura B
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PSEUDOMONAS
1. Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.
Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar, também,
a pigmentação verde do crescimento em ágar simples – uma característica
peculiar da espécie.
Cultura Característica das colônias
P. aeruginosa
2. Corar, pelo método de Gram, esfregaço da cultura de Pseudomonas
aeruginosa. Observar ao microscópio e desenhar.
Pseudomonas aeruginosa
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3. Teste de fermentação de Glicose
Observar uma cultura de Pseudomonas aeruginosa e uma de Escherichia
coli em caldo glicosado contendo vermelho fenol ou indicador andrade. Interpretar
a diferença de cor das culturas bacterianas e anotar os resultados na tabela
abaixo.
Cultura Cor da Meio Fermentação da Glicose
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
4. Prova da Citrocromo-oxidase
Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com
uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado.
Cultura Prova da citocromo-oxidase
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
26
ENTEROBACTÉRIAS
1. Observar a coloração das colônias das bactérias A, B e C cultivadas em placas
de ágar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de lactose.
Cultura Coloração da colônia em LactoseMacConkey SSABCD
2. Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e
Citrato de Simmons (conforme orientação nas páginas 26 e27) Anotar abaixo os
resultados (+ ou -) das provas para cada cultura.
Prova CulturaA B C D
CitratoGlicoseGásUreaseH2SLTD*MotilidadeLisinaIndolLactose***LTD = L-triptofano desaminase
** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1)
Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da página 28, identificar
cada uma das culturas.
Culturas: A________________________
B________________________
C________________________
D________________________
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3. Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação
bioquímica.
Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas B e C, utilizando os
soros anti - S. flexnerie anti - Salmonella sp.Anotar os resultados (positivo ou
negativo).
Soro Cultura
B C
Anti - Shigella flexneri
Anti – Salmonella sp.
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Perfil Bioquímico e Motilidade de Algumas Enterobactérias
Prova E. coli Shigella flexneri
Edwardsiella tarda
Salmonella sp
Citrobacter freundii
Klebsiella pneumoniae
Enterobactercloacae
Serratia marcescens
Proteus mirabili
s
Proteus vulgaris
Morganella morganii
Providencia rettigeri
Citrato - - - + ou- + + + + + ou- + ou- - +Glicose + + + + + + + + + + + +Gás + ou- - + + + + + + ou- + + ou- + ou- + ou-Urease - - - - + ou- + + ou- + ou- + ou- + + +H2S - - + + + - - - + + - -LTD* - - - - - - - - + + + +Motilidade + ou- - + + + - + + + + + ou- +Lisina + ou- - + + - + - + - - - -Indol + + ou- + - - - - - - + + +Lactose + - - - + ou- + + ou- - - - - -
*LTD = L-triptofano desaminase
30
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