View
617
Download
4
Category
Preview:
Citation preview
Ana Indrayati
Gambar tahapan umum kloning
Fisik Kimia Enzimatis
Lokasi protein di dalam sel
Protein intrasel-protein ekstrasel
Protein intrasel
Protein ekstrasel
Perbandingan protein yang diekspresikan di periplasma, sitoplasma atau ekstrasel
Sitoplasma Jumlah besar Bercampur dengan protein lain Agregat-badan
Periplasma Jumlah sedikit Relatif murni Ikatan disulfida terbentuk
Ekstrasel Volume besar bercampur dengan media pertumbuhan Perlu
inklusi (tidaklarut)
pemekatan
Cara isolasi protein intrasel dan ekstraselProtein Protein intrasel Protein ekstrasel Pemisahan sel
Pemecahan selPemisahan Pemekatan protein Pemekatan protein Kromatografi kolom
Protein intrasel
Protein yang terdapat dan bekerja di dalam sel
Enzimatis: lisozim (mengkatalisa pemutusan ikatan 1-4 betaglikosidik peptidoglikan bakteri. EDTA: mengikat kation divalen (menstabilkan dinding sel), zymotase, litikase
Kimia: deterjen: mengganggu permeabilitas dinding selsehingga lipoprotein membran larut
Fisis: sonikasi (gelombang suara dengan frekuensi tertentu)
Sentrifugasi dan pemekatan protein
Protein ekstrasel
Protein yang diekskresi keluar sel
Protein berada dalam media pertumbuhan sel
Sentrifugasi dan pemekatan protein
Pemekatan protein1. SALTING IN-SALTING OUT Dalam air murni protein sukar larut
Penambahan garam-kelarutan proteinmeningkat karena ion anorganik dari garam mengikat protein dan mencegah agregasi (salting in)
Konsentrasi garam tinggi-garam lebihcenderung mengikat air dan menyebabkan agregasi sehingga molekul protein mengalami presipitasi (salting out)
Gambar ultrafiltrasi
2. ULTRAFILTRASI
Kromatografi kolom
penukar ion (muatan total protein )exclusion (bentuk dan ukuran protein) afinitas (protein mengikat ligan spesifik)
Karakter asam amino penyusun protein
Contoh urutan asam amino penyusun protein MAFELPNLPYGFRALEPHIDQQTMEIHH
DKHHNTYVTKLNAAVEGTDLESKSIEEI VANLDSVPENIQTAVRNNGGGHLNHSLF WELLTPNSEEKGTVVDKIKEQWGSLDAF KEEFANQAAARFGSGWAWLVVNDGKLEI VTTPNQDNPLTEGKTPILGLDVWEHAYY LKYQNKRPDYISAFWNVVNWEKVDELYN AAK
Superoksida Dismutase (SOD) bakteri
Kromatografi exclusion/ size exclusion chromatography (SEC)
o Memisahkan protein berdasarkan ukuran (BM) o Kolom: menggunakan gel berpori dengan ukuran tertenu dan seragam o Molekul kecil akan memasuki pori dari gel o Elusi: molekul besar-molekul sedang-molekul kecil
Kromatografi penukar iono Memisahkan protein berdasarkan muatan
o Kolom kation: muatan total protein negatifo Kolom anion: muatan total protein positif
Prinsip kromatografi afinitas
PROTEIN FUSI- Pemurnian protein satu tahap
Definisi: Efektif dan efisien Sampel protein sedikit Spesifik
Protein fusi
Dikonstruksi pada tingkat DNA Fusi gen pengkode protein
target dengan gen pengkodeligan tertentu
Tersedia pada vektor ekspresi atau dikonstruksi sendiri
Contoh: Poli-His Tag (kolom nikel) Chitin Tag (kolom kitin)
Vektor ekspresi yang
membawa poli-His
Vektor ekspresi yang membawa poli-His
Pemurnian protein-kolom nikel
CBD tidak tersedia di plasmid
Pemurnian protein-kolom kitin
SDS PAGE
Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electroforesis Analisa protein kualitatif Mengetahui ukuran protein dan memonitor pemurnian protein Denaturasi protein: SDS: protein menjadi bermuatan negatif dan linier Beta merkaptoetanol: memutus ikatan disulfida Perebusan (5 menit, 100oC)
Berat molekul protein: marka protein (standar) yang sudah diketahui ukurannya
SDS: protein linier, negatif
Akrilamid-bisakrilamid: membentuk pori
Contoh hasil SDS-PAGE
Elektroforesis dua dimensi: 2D
Contoh hasil 2-D
2-D atau 2-DE
Informasi: muatan dan ukuran protein Analisa protein hasil ekspresi gen, deteksi marker penyakit,
penelitian kanker, kemurnian protein-memisahkan protein hinggaribuan secara cepat
Dimensi 1: protein dipisahkan berdasarkan muatan (titik isoelektrik)-Iso electric focusing (IEF) Protein denaturasi: urea-memutus ikatan hidrogen tetapi tidak
mengubah muatan Gel: gradien pH, medan listrik sehingga protein akan terpisah
berdasarkan muatan dan akan berhenti setelah muatan protein netral (titik isoelektrik)
Dimensi 2: protein dipisahkan berdasarkan ukuran - SDS PAGE
Pemotongan dengan enzim carboxy peptidase
Hanya terbaca sekitar 30 asam amino
Pemetaan peptida
Protein dipotong secara enzimatik atau kimiawi sehingga dihasilkan fragmen-fragmen peptida-dianalisa
Sekuensing protein
Informasi: urutan asam amino penyusun protein
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant assay)
Reaksi antigen-antibodi Protein yang akan diidentifikasi (antigen) direaksikan dengan antibodi spesifik (yang hanya mengenali protein target)
Latihan soal
Recommended