View
1
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
1
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Program
Kismolekulájú „klasszikus” neurotranszmitterek a
korai idegi elköteleződés során: a glutaminsav és
GABA rendszer vizsgálatai a neuronképzés
folyamataiban, in vitro
doktori (PhD) értekezés
Varju Patrícia
Témavezető: Dr Madarász Emília
Készült a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti
Orvostudományi Kutató Intézetében
Budapest, 2002
2
Kismolekulájú „klasszikus” neurotranszmitterek a korai idegi elköteleződés során:
a glutaminsav és GABA rendszer vizsgálatai a neuronképzés folyamataiban, in
vitro
Készítette:Varju Patrícia
Témavezető: Dr Madarász Emília
Készült a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutató Intézetében
Budapest, 2002
ÖSSZEFOGLALÁS
A felnőtt idegrendszerben a glutaminsav és a GABA az idegsejtek közötti kommunikáció kémiai
mediátorai. Bebizonyosodott, hogy az idegrendszer korai fejlődése során ezek a neurotranszmitterek
befolyásolják a neurális progenitor sejtek osztódását és differenciációját, hatást gyakorolnak a fiatal
neuronok nyúlványosodására, migrációjára és fontos szerepet játszanak a szinaptogenezisben is. A
neuroektoderma sejtekben lezajló differenciálódás in vitro vizsgálatát olyan sejtvonalak megalapítása
tette lehetővé, melyek korlátlan osztódóképességük mellett megőrzik neurális fejlődési potenciáljukat.
Laboratóriumunk munkatársai transzgenikus, p53–deficiens, 9 napos egérembrió elő- és középagy-
hólyagjából izoláltak immortalizált neuroepiteliális progenitor sejtvonalakat, melyek közül az eddig még
nem jellemzett NE-7C2 sejtvonallal kezdtem el dolgozni. Az NE-7C2 sejtvonal korai fejlődési állapotot
reprezentáló neurális progenitor sejtekből áll, amelyek all-trans retinsav (ATRA) hatására jól
meghatározott lépéseken keresztül idegi irányba differenciálódnak.
Munkám célja az volt, hogy az in vitro neurogenezis jellemző stádiumaiban meghatározzam a
glutaminsav hatásait közvetítő ionotróp receptorok megjelenését és lehetséges szerepét az idegi
elköteleződés során, továbbá hogy feltérképezzem a glutaminsav - GABA átalakulásért felelős
enzimcsalád, a glutaminsav dekarboxiláz (GAD) embrionális és felnőtt formáinak expressziós mintázatát,
tanulmányozzam az idegsejt-fenotípus kialakításában esetlegesen betöltött szerepüket. Kísérleteim során
molekuláris biológiai, biokémiai és immuncitokémai módszerekkel meghatároztam az AMPA és NMDA
receptor alegységek expressziós mintázatát és sejtes lokalizációját, valamint vizsgáltam a funkcionális
receptorok megjelenését és szerepét az in vitro neurogenezis alatt. Az embrionális ill. felnőtt GAD
mRNS- és fehérje-formák expressziós mintázatát és sejtes lokalizációját molekuláris valamint
sejtbiológiai módszerekkel jellemeztem az in vitro idegsejt-képzés folyamán. Immuncitokémiai
vizsgálatokkal azonosítottam az in vitro differenciáció során megjelenő GABA-t tartalmazó sejteket és
vizsgáltam a GABA sejten belüli eloszlását .
Eredményeim megmutatták, hogy az NE-7C2 sejtek neurális differenciációja során a glutaminsav
ionotróp receptorokon át képes befolyásolni a progenitorok osztódását és a fiatal neuronok
nyúlványosodást. A GABA szintéziséért felelős GAD enzimek embrionális formái a korai idegi
elköteleződési folyamatokban juthatnak szerephez, míg a felnőtt formák a neuronok érése során
expresszálódnak.
3
Glutamic acid and GABA in the early stages of neurogenesis: studies in the course
of in vitro neural cell fate decision
Done by: Patricia Varju
Supervisor: Emília Madarász PhD
Institute of Experimental Medicine of Hungarian Academy of Sciences
Budapest, 2002
SUMMARY
In the adult nervous system glutamic acid and GABA are mediators of synaptic communication.
During embryonic development these neurotransmitters regulate mitotic division if neural progenitors and
influence migration, neurite elongation and synapse formation. Continuously proliferating cell lines
capable to differentiate into neural cells could serve as in vitro models for studies on neurogenesis by
early embryonic neuroectoderm.
Previous works from our laboratory demonstrated that immortalized neuroepithelial cell lines could
be established from the anterior vesicles of 9-day-old p53-/- mouse embryos. The NE-7C2 cell line was
one of the isolated p53-/- neuroectodermal clones. NE-7C2 cells represent neuroectodermal progenitors in
an early developmental stage. All-trans retinoic acid treatment of NE-7C2 cells elicited the establishment
first the neuronal and than the astroglial features during well-characterized developmental phases.
The aim of my work was to determine the time-schedule of the appearance of ionotropic glutamate
receptor subunit proteins and the fully active forms of these receptors in the course of in vitro neuron
formation and to study the expression pattern of embryonic and adult forms of glutamic acid
decarboxylases (GADs) during the establishment of neuronal phenotype. Molecular biological and
biochemical methods were used to describe the expression pattern of the AMPA and NMDA type
glutamate receptors. The possible roles of these receptors were investigated by Ca2+-imaging techniques
during the well-characterized stages of in vitro neurogenesis. The time-schedule of the expression of
embryonic and adult forms of GADs were also analyzed and some possible functions of the protein
isoforms have been suggested. The distribution of cells containing glutamate receptor subunit proteins or
GABA was analyzed by immunocytochemical methods.
The results demonstrate that the activation of ionotropic glutamate receptors can influence the
neuronal cell fate determination. AMPA-gated channel activation may alter the mitotic activity of
progenitors and the network formation of young neurons, while NMDA receptor functioning gets role in
later phases of neuronal cell differentiation. The increased responsiveness to glutamate indicates that both
AMPA and NMDA receptor mediated activities can influence the process elongation and network
formation by maturing neurons. The embryonic forms of GAD67 enzyme could play a role in early steps
of neuron formation while the full-length forms were detected at the period of neuronal maturation.
4
TARTALOMJEGYZÉK
ÖSSZEFOGLALÁS 2
TARTALOMJEGYZÉK 4
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 7
BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS 9
I. KISMOLEKULÁJÚ NEUROTRANSZMITTEREK, MINT FEJLŐDÉSREGULÁLÓ
ANYAGOK 11
I./1 A glutaminsav 12
1.1 Az AMPA-vezérelt ioncsatornák 13
1.1.1 Szerkezet 13
1.1.2 Az AMPA receptorok farmakológiai sajátosságai 15
1.2 A kainát receptorok 16
1.2.1 Szerkezet 16
1.2.2 A kainát vezérelt receptorok farmakológiai jellemzése 17
1.3 NMDA receptorok 18
1.3.1 Szerkezet 18
1.3.2 Az NMDA receptorok farmakológiai jellemzése 21
1.4 Az ionotróp glutamát receptorok előfordulása és szerepe az idegrendszer embrionális
fejlődése során 22
I./2 A GABA 24
2.1 A GABA-szintézis szabályozása: GAD formák 26
2.2 Rövidített GAD fehérjék 28
II. AZ IDEGSEJT IRÁNYÚ ELKÖTELEZŐDÉS KORAI LÉPÉSEINEK
TANULMÁNYOZÁSA AZ EGYEDI SEJTEK SZINTJÉN 31
III. AZ ALL-TRANSZ RETINSAV SZEREPE AZ IDEGRENDSZER EMBRIONÁLIS
FEJLŐDÉSE SORÁN 33
IV. CITOSZKELETÁLIS ÁTRENDEZŐDÉSEK A NEURONÁLIS DIFFERENCIÁCIÓ
SORÁN 34
IV./1. A köztes filamentum fehérjék 35
IV./2 A mikrotubuláris rendszer 36
CÉLKITŰZÉSEK 38
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 39
I. AZ ALKALMAZOTT SEJTTENYÉSZTÉSI KÖRÜLMÉNYEK 39
I./1 Sejtek fenntartása, kezelése 39
I./2 Kromoszóma-preparátumok készítése 39
II. SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR VIZSGÁLATOK 40
II./1 Ionotróp glutamát receptor alegységek kódoló RNS formáinak kimutatása 40
5
1.1 AMPA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása 41
1.2 NMDA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása 41
II./2 GAD65 és GAD67 transzkriptumok kimutatása 41
III. WESTERN BLOT ANALÍZIS 42
III./1 Fehérjeminták készítése szubcelluláris frakcionálással 42
III./2 Fehérjetartalom meghatározása 43
III./3 Western blot 43
3.1 NMDA receptor alegység fehérjéinek kimutatása 43
3.2 GAD fehérjeformák kimutatása 44
IV. IMMUNCITOKÉMIAI VIZSGÁLATOK 45
IV./1 Neuron-és gliaspecifikus fehérjék kimutatása 45
IV./2 NMDA receptor NR1 és NR2B alegységeinek kimutatása 46
IV./3 GAD fehérjeformák kimutatása 46
V. A TENYÉSZETEK SEJT ILL. IDEGSEJT-TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA 47
V./1 A tenyészetek sejtszámának meghatározása a tenyészetek életképességének mérésével 47
V./2 Idegsejtek számának meghatározása immuncitokémiával 47
V./3 Idegsejtek mennyiségi meghatározása in situ ELISA módszerrel 48
VI. SEJTEN BELÜLI SZABAD CA2+-SZINT MEGHATÁROZÁSA
MIKROFLUORIMETRIÁVAL 49
VII. AZ EXTRACELLULÁRIS GLUTAMÁT KONCENTRÁCIÓJÁNAK
FLUORIMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA SEJTEK FOLYADÉKKÖRNYEZETÉBŐL 50
2. TÁBLÁZAT 51
3. TÁBLÁZAT 52
EREDMÉNYEK 53
I. AZ NE-7C2 SEJTVONAL JELLEMZÉSE 53
I./1 Az p53 -/- NE-7C2 sejtvonal kromoszóma-készletének változása a sejtvonal
immortalizációja során 53
I./2 AZ NE-7C2 sejtvonal progenitor sajátságainak meghatározása 57
II. IONOTRÓP GLUTAMÁT RECEPTOROK SZABÁLYOZOTT IDŐBELI MEGJELENÉSE
AZ IN VITRO NEUROGENEZIS SORÁN 63
II./1 NMDA-vezérelt glutamát receptorok kimutatása NE-7C2 sejtek indukált
neurogenezise során 63
1.1 NMDA receptor alegységek expressziója NE-7C2 sejtekben 63
1.2 NMDA receptor alegységek fehérjeformáinak kimutatása Western blot és
immuncitokémia segítségével 67
1.3 Funkcionális NMDA-csatornák megjelenése NE-7C2 sejtek indukált
neurogenezise
során 71
6
II./2 AMPA receptorok kimutatása NE-7C2 sejtekben és szerepük a neuronális
differenciáció
korai szakaszában 78
2.1 AMPA receptor alegységek expressziós mintázata NE-7C2 sejtek idegi irányú
differenciációja során 78
2.2 Funkcionális Ampa-csatornák kimutatása NE-7C2 sejtek fejlődési stádiumaiban 78
2.3 Funkcionális AMPA receptorok szerepe folytonosan osztódó ill. neuronális
irányban differenciálódó NE-7C2 sejtekben 83
2.4 Az extracelluláris folyadék glutaminsav tartalmának vizsgálata NE-7C2 sejtek
felülúszó médiumából 85
III. GLUTAMINSAV DEKARBOXILÁZ FORMÁK EXPRESSZIÓJA ÉS A GABA-
SZINTÉZIS KAPCSOLATA NE-7C2 SEJTEK INDUKÁLT NEUROGENEZISE SORÁN
88
III./1 GAD mRNS formák expressziójának vizsgálata 88
III./2 Rövidített és teljes hosszúságú GAD fehérje-formák időbeli megjelenése NE-7C2
sejtek in vitro indukált neurogenezise során 92
III./3 GAD fehérjeformák sejtszintű lokalizációjának vizsgálata forma-specifikus
ellenanyagokkal 94
III./4 NE-7C2 sejtek GABA-tartalma az in vitro indukált neurogenezis különböző
stádiumaiban 98
LEGFONTOSABB EREDMÉNYEK 100
4. TÁBLÁZAT 101
MEGBESZÉLÉS 102
I. Az NE-7C2 sejtek korai neuroektodermális fejlődési állapotot reprezentáló progenitorok 102
II. Ionotróp glutamát receptorok az in vitro indukált neurogenezis alatt 108
II./1 Sejtfelszíni NMDA receptorok a fiatal neuronok nyúlványelongációs szakaszában
jelennek meg 108
II./2 Az NE-7C2 sejtek mind indukálatlan, mind indukált állapotban funkcionális AMPA
receptorokat expresszálnak 112
II./3 A Ca2+-tranziensek jelentősége az idegrendszer embrionális fejlődése során 115
III. Az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban ill. az indukció korai szakaszában
embrionális
GAD fehérjéket expresszálnak, melyeket az érett neuronokban felvált a felnőtt GAD65
forma 118
LEGFONTOSABB KÖVETKEZTETÉSEK 123
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 124
IRODALOMJEGYZÉK 125
7
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK
AET – aminoethylthioammonium bromide
ATRA – all-trans retinsav
BCIP – 5-bromo-4-kloro-3-indolyl foszfát
BSA – borjú szérum albumin
[Ca2+]IC – intracelluláris Ca2+ -szint
cDNS – komplementer DNS szál
CNS – központi idegrendszer
CRABP – Cellular Retinoic Acid Binding Protein
DAB – DiAmino-Benzidine
DMSO – dimetil-szulfoxid
dNTP – dezoxinukleotid-trifoszfát
E1-21 – embrionális fejlődés napjai
EC – embrionális karcinóma
ELISA – Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ER – endoplazmatikus retikulum
ES – embrionális stem sejt
FCS – fötális borjú savó
FITC – Fluoreszcein IzoTioCianát
GAD – glutaminsav dekarboxiláz enzim
GAPDH – glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz
GFAP – gliális fibrilláris savas fehérje
iGluR – ionotróp glutamát receptor
IP3R – inozitol trifoszfát receptor
IZ – intermedier zóna
KL – kortikális lemez
Map – mikrotubulus asszociált fehérje
MEM – Minimal Essential Medium
mGluR – metabotróp glutamát receptor
8
MTT – (3–(4,5 Dimethylthiazol–2–yl)–2,5diphenyltetrazólium–bromide,
NBT – nitro blue tetrazólium
N-CAM – neurális sejtadhéziós molekula
NFH – nehéz neurofilamentum fehérje
NFL – könnyű neurofilamentum fehérje
NFM – közepes neurofilamentum fehérje
N-tubulin – III β-tubulin
ORF – Open Reading Frame vagy nyitott leolvasási keretet
P0- – posztnatális fejlődés napjai
PBS – Phosphate Buffered Saline
PCR – polimeráz lánc reakció
PLL – poli–L–lizinnel
PLP – piridoxál-foszfát
RaIDH – retinal dehidrogenáz
RAR – retinsav receptor
RARE– Retinoic Acid Response Element
RT-PCR – reverz transzkripcióval kapcsolt polimeráz lánc reakció
RXR – retinoid X receptor
RXRE – Retinoid X Response Element
RyR – ryanodin receptor
SDS – Sodium-Dodecyl Sulfate
SVZ – szubventrikuláris zóna
TBS – Tris-pufferelt sóoldat
TM – transzmembrán
VDCC - feszültségfüggő Ca2+-csatorna
VZ – ventrikuláris zóna
9
BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A megtermékenyített petesejt által hordozott genetikai anyag kódolja mindazt az
információt, ami a gerinces idegrendszert felépítő billiónyi idegsejt és gliasejt kialakításához lehetőséget ad. Azok, a minden gerinces élőlényben hasonló módon lejátszódó fejlődési folyamatok, genetikus és epigenetikus mechanizmusok, amelyek az idegsejtek nagyfokú fenotipikus variabilitását eredményezik, nagyrészt még ismeretlenek.
Az embriogenezis korai szakaszában a zigótából kialakul egy háromrétegű embrió, ami magába foglalja az elsődleges germinatív rétegeket, az ektodermát, a mezodermát és az endodermát. A neurális ektoderma (velőlemez) kialakulását a mezodermális és ektodermális sorsot indukáló faktorok gátlása eredményezi. Az így kialakuló velőlemezből (1. A ábra) fejlődik ki az idegszövet. A velőlemezt felépítő sejtek szaporodása és morfológiai megváltozása következtében kialakul a velőárok (1. B ábra) és a velőlemez szélein található velősáncok egymáshoz közelednek (1. C ábra), majd összeolvadnak, kialakítva a zárt velőcsövet (1. D és E ábra). Ezzel egyidőben a velőlemez szélein található sejtek leválnak a velőcsőről és létrehozzák a velőlécet (1. E ábra). A velőcső záródása nem egyidőben történik az embrió teljes hosszában, hanem a brachiális régióban megindulva terjed rostrális és caudalis irányokban. Végül mind az elülső, mind a farki neuropórus is bezáródik és a neuroektoderma teljes hossza mentén kialakul egy zárt cső. A velőcső elülső régiójának különböző mértékű növekedésével és tágulásával kialakul az idegrendszer anterior régiójának előagyi, középagyi és utóagyi szakaszokra való tagolódása (Gilbert, 1991).
A neuroepitéliumot kezdetben folytonosan osztódó idegi őssejtek építik fel és osztódásaikkal növelik a kamra falát. Az őssejtek közük sok időről időre - eddig még csak részben ismert szignálok hatására - az osztódást befejezve kilép a sejtciklusból és posztmitótikus neuronná alakul a korai fejlődés során. A posztmitótikus sejtek kapcsolata megszakad a kamrafallal és kivándorolnak a ventrikuláris zónából (VZ).
A neuronok képződése, majd idegsejtté való elköteleződése lejátszódhat akkor is, ha a progenitorokat kiemeljük eredeti környezetükből. A neuronok régió- és rétegspecifikus érése, „finom” elköteleződése azonban az embrionális agyszöveti
10
11
környezet függvénye. A pán-morfogenetikus fejlődés és a régióspecifikus érés lezajlásához olyan hatásokra van szükség, amelyeket összefoglalóan környezeti faktoroknak neveznek. A környezeti faktorok lehetnek nem-diffúzibilis jelmolekulák, amelyek a közvetlen kontaktusokon át megvalósuló sejtes kommunikáció mediátorai (delta/notch és ephrin/Eph receptor útvonalak), vagy diffúzibilis, nagyobb távolságokon át is ható jelmolekulák. A kialakult idegszövet klasszikus kismolekulájú neurotranszmittereiről feltételezik, hogy korai embrionális stádiumokban diffúzibilis jelmolekulák szerepét töltik be (LoTurco et al., 1991; Komuro and Rakic, 1993; Zheng et al., 1994; Behar et al., 1996).
I. Kismolekulájú neurotranszmitterek, mint fejlődésreguláló anyagok
A felnőtt idegrendszerben a neurotranszmitterek az idegsejtek közötti
kommunikáció kémiai mediátorai. Ez a speciális szerep valószínűleg ősibb, parakrin
funkcióból fejlődhetett ki, hiszen az alacsonyabbrendű élőlényekben ezek az anyagok a
sejtek közötti diffúziós szignalizáció feladatát töltik be. Ez az elgondolás olyan kísérleti
eredmények alapján született, melyek bebizonyították, hogy a „klasszikus”
neurotranszmitterek legtöbbje (serotonin, dopamin, norepinefrin, GABA, acetilkolin,
glutaminsav) megtalálható a primitív élőlényekben (csalánozók, laposférgek), nem idegi
szövetekben és olyan korai embrionális állapotokban is, ahol az idegrendszerre jellemző
kommunikációs formák még nem fejlődtek ki (Lauder, 1993). Farmakológiai kísérletek
sora mutatja, hogy a kismolekulájú aminosav-neurotranszmitterek morfogenetikus
aktivitással rendelkeznek és befolyásolják a proliferáció, sejtvándorlás és differenciáció
eseményeit primitív és evolúciósan fejlett élőlényekben (Lauder, 1993, LoTurco et al.,
1995; Behar et al., 1996; Ma et al., 1998; Haydar et al., 2000; Nguyen et al., 2001).
Ezek a filogenetikailag ősi funkciók – úgy tűnik - működnek az idegrendszer fejlődése
során is, ahol ezek a kismolekulájú neurotranszmitterek befolyásolják a neurális
progenitor sejtek osztódását és differenciációját, valamint hatást gyakorolnak a fiatal
neuronok nyúlványosodására és migrációjára.
Az alábbiakban a glutaminsav és GABA korai idegi elköteleződésben eddig
megismert szerepére, valamint a két aminosav hatásait közvetítő szignál transzdukciós
rendszerek ismertetésére térek ki.
12
I./1 A Glutaminsav
A glutaminsav a kifejlett gerinces élőlények idegrendszerében a legfontosabb
serkentő neurotranszmitter szerepét tölti be. Neuroexcitiátoros tulajdonságának
felfedezése (Curtis et al., 1959) óta eltelt 40 évben farmakológiai, elektrofiziológiai és
molekuláris biológiai kísérletek segítségével sikerült leírni a glutamát-közvetítette
szinaptikus jelátviteli folyamatok részleteit.
Mára két fő glutamát receptor típust különböztetünk meg: az ionotróp (iGluR) és
metabotróp (mGluR) receptorokat. A metabotróp receptorok közé olyan sejtmembránon
átívelő 7 transzmembrán (TM) szerkezettel jellemezhető fehérjék tartoznak, melyek a
sejtmembrán intracelluláris oldalán G-fehérjét kötnek. A mGluR receptorokat három
csoportba osztjuk szekvencia-homológia, agonista-szelektivitás és a sejten belül aktivált
szignál-transzdukciós útvonal alapján. Az mGluR receptorok az embrionális fejlődés
során már igen korai fejlődési stádiumokban kimutathatók és fontos szerepet játszanak a
fiatal neuronok Ca2+-homeosztázisának szabályozásában (McCool et al., 1998; Flint et
al., 1999). A felnőtt idegrendszerben főleg prae- ill. extraszinaptikus lokalizáció
jellemző rájuk és a neurotranszmitter-ürülés szabályozásában tulajdonítanak igen fontos
szerepet ezen receptoroknak. Mivel a mGluR-k neurogenezisben játszott szerepével
nem foglalkozom a dolgozatban, ezért további részletes jellemzésükre nem térek ki.
Az ionotróp receptorokat felépítő fehérjék a sejtmembránt áthidaló ioncsatornákat
alakítanak ki, melyeken keresztül glutamát kötődésének hatására ionáram indul meg a
membrán két oldala között. Az ionotróp receptorokon belül megkülönböztetünk
NMDA-vezérelt, AMPA-vezérelt és kainát típusú csatornákat, melyek specifikus
agonistáikról kapták elnevezésüket. Az elmúlt években azonban született néhány olyan
kísérleti eredmény, amelyek alapján valószínű, hogy mind az AMPA (Wang and
Durkin, 1995; Wang et al., 1997; Kawai and Sterling, 1999), mind a kainát típusú
receptorok (Ziegra et al., 1992; Rodriguez-Moreno and Lerma, 1998; Lee et al., 2000)
kapcsolódhatnak G-fehérjével és G-fehérje közvetített szignál-transzdukciós
útvonalakon keresztül is befolyásolhatnak sejtélettani folyamatokat.
13
1.1 Az AMPA-vezérelt ioncsatornák
1.1.1 Szerkezet
Az AMPA receptorok 4-féle alegységből GluR1-4 épülhetnek fel. Minden
alegység glikozilált, kb. 900 aminosav hosszúságú és 65-75% szekvencia-homológiát
mutat (Nakanashi et al., 1990; Sakimura et al., 1992). Az alegységek 3 TM régióból és
egy membránba ívelő hurokból (TM2) épülnek fel (2. A ábra, Bennett and Dingledine,
1995), az N-terminális régió extracelluláris, míg a C-terminális régió intracelluláris
orientációjú (2. B ábra). A funkcionális receptorok tetramer (Rosemund et al., 1998;
Madden, 2002) szerkezetűek és a TM2 domén vesz részt az ioncsatorna pórusának
kialakításában (2. C ábra). Az S1 és S2 extracellulárisan elhelyezkedő hurkok
tartalmazzák az agonista-kötő régiókat (2. B ábra; Keinänen et al., 1997). Az
intracellulárisan elhelyezkedő C-terminális farok szerepe az alegységek membránhoz
való szállítása majd kihorgonyzása (PDZ-doménen keresztül) és a jel továbbítása
citoplazma felé (Bigge, 1999). Az intracelluláris régió foszforilációs helyeket is
tartalmaz, melyek a receptor aktivitásának szabályozásában játszanak szerepet.
Az AMPA-vezérelt receptorok ionszelektivitását a receptorok alegység-
összetétele határozza meg. GluR2 alegység jelenlétében az ioncsatorna alacsony Ca2+-
permeabilitással és lineáris áram-feszültség görbével jellemezhető (Sommer et al., 1990;
Jonas and Burnashev, 1995), míg GluR2 hiányában az ioncsatorna nagymértékben
áteresztővé válik Ca2+-ra és kettősen rektifikáló áram-feszültség összefüggést mutat. A
GluR2 alegység ionszelektivitásáért egyetlen, a TM2 domén 586. pozíciójában
elhelyezkedő aminosav a felelős. Míg a GluR2 alegység ezen pozícióját egy pozitívan
töltött arginin (R) foglalja el (2. C ábra), a többi AMPA receptor alegység ezen
pozíciójában egy töltést nem hordozó glutamin (Q) található (2. C ábra). A Q/R
aminosav-csere a GluR2 alegységben az mRNS adenozinjának editálásával jön létre az
14
15
adenozin-deamináz enzim1 segítségével (Hume et al., 1991; Verdoorn et al., 1991;
Burnashev et al., 1992; Paupard M-C et al., 2000). A GluR2 mRNS editációja nagyon
hatékony és szinte 100%-a az agyi GluR2 alegységeknek editált formában van jelen a
patkányban (Sommer et al., 1991).
Az AMPA receptor alegységeket kódoló génekről “alternatív splicing”2
mechanizmusával kétféle típusú fehérje keletkezhet attól függően, hogy a Flip vagy a
Flop exon kerül be az érett mRNS-ekbe (2. A ábra). A Flip forma lassú
deszenzitizációjú, míg a Flop forma gyors deszenzitizációs kinetikával jellemezhető. A
Flip formák által kialakított receptorokon keresztül hosszan elhúzódó ionáram alakulhat
ki. A Flop formák AMPA receptorba épülése esetén rövid ideig tartó, nagy amplitúdójú
ionáram jön létre, melynek a szinaptikus jelátvitelben lehet jelentősége. A TM3 és TM4
domének között található egyik arginin RNS-editáció mechanizmusával glicinre
cserélődhet (3. A ábra), mely a deszenzitizáció utáni receptor “recovery” idejét
csökkenti le (Lomeli et al., 1994).
1.1.2 Az AMPA receptorok farmakológiai sajátosságai
Az AMPA receptorokat eredetileg mint quiskalát-vezérelt ioncsatornákat írták
le, és csak később sikerült megmutatni, hogy az AMPA a szelektív ligandumuk (a
1 Napjainkig két olyan enzimet azonosítottak emlősökben, amelyeknek adenozin-deamináz
aktivitása van: ADAR1 (dsRNS-specifikus adenozin-deamináz) és az ADAR2 (dsRNS-specifikus editáz
1, más néven RED1). A fehérjecsalád harmadik tagja a RED2, amely struktúrálisan ugyan nagyfokú
hasonlóságot mutat, de nem tudja deaminálni a kettős szálú RNS-t. Az ADAR1 és ADAR2 a legtöbb
szövetféleségben expresszálódik, míg a RED2-t eddig csak idegrendszerben írták le. Az ADAR2
enzimnek in vitro szubsztrátjai az AMPA/kainát típusú receptorokat és az 5HT-2C receptort kódoló
mRNS-sek. Az ADAR2 először az E17 embrionális korban sikerült kimutatni, amely időpontban az
AMPA-típusú receptor GluR2 alegysége 99% editált formában van jelen. Ez az eredmény azt
valószínűsíti, hogy vagy az ADAR1 vagy egy másik, eddig még nem karakterizált enzim a felelős a
GluR2 editációért.
2 Az alternatív hasítás kifejezést az angol „alternative splicing” magyar megfelelőjeként
használom a dolgozat során. A „splicing” vagy hasítás az mRNS érése során történik, amikor az intron
kivágódik és az exonok összekapcsolódnak. Mind az intronok, mind az exonok végein találhatók ún.
„splice site”-ok vagy hasitási szekvenciák, melyek megmutatják a spliceosoma-nak az exon/intron
határokat.
16
quiskalát a metabotróp receptoroknak is agonistája). 3[H]AMPA-kötés leszorítási
vizsgálata a következő agonista erősségi sorrendet adta GluR1, GluR2 és GluR3
alegységekből felépülő rekombináns receptorokon: quiskalát > AMPA = domoát >
glutamát > kainát.3 (Fletcher and Lodge, 1996). Az AMPA, quiskalát és glutamát által
kiváltott ionáramok gyorsan lecsengenek és a receptor deszenzitizálódik, míg a kainát
által aktivált receptor kevésbé érzékeny a deszenzitizációra
Az AMPA receptorok kompetitív antagonistái két vegyületcsoportból kerülnek
ki: a quinoxalinedion-típusú vegyületek (CNQX, NBQX, DNQX) és a
decahydroisoquinoline vegyületek (LY293558, YM90K; Fletcher and Lodge, 1996). Az
AMPA receptorokon egymással átfedő pozícióban található egy pozitív és egy negatív
alloszterikus modulációs hely is. A negatív modulációs helyre kötő 2,3 benzodiazepine
típusú vegyületek (GYKI52466, GYKI53655; Tarnawa et al., 1989) a receptor nem-
kompetitív antagonistái és szelektívek az AMPA receptorokra. A pozitív alloszterikus
modulátorok a pirrolidin típusú vegyületek közül (aniracetam, piracetam) ill. a
benzothiadiazid (ciklotiazid4, diazoxid) csoportból kerülnek ki és a receptor agonista
hatására bekövetkező deszenzitizációját csökkentik (Fletcher and Lodge, 1996). Mivel a
két alloszterikus modulációs hely egymással átfedő pozícióban található a receptoron, a
drogok együttes jelenléte és relatív koncentrációja befolyásolhatja e szerek hatását.
1.2 Kainát receptorok
1.2.1 Szerkezet A kainát receptor alegységeknek két csoportra osztjuk: az alacsony (GluR5-7) és
a magas (KA1, 2) kainát affinitással rendelkező alegységek csoportjára. Számos más
kainát-kötő fehérjét is leírtak alacsonyabbrendű gerincesekben (összefoglalja Ziegra et
al., 1992; Lerma et al., 2001), de ezek a fehérjék nem alakítanak ki funkcionális
3 Az AMPA receptorok további agonistái az ibotén sav (Hansen et al., 1995) és a különböző
willardiine származékok (Wong et al., 1994), valamint az AMPA terc-butil analóg vegyülete, az ATPA is
(Krogsgaard-Larsen et al., 1994).
4 A ciklotiazid a flip formák deszenzitizációját csökkenti szelektíven, míg egy másik vegyület, a
PEPA, a flop variánsok által képzett csatornák deszenzitizációját gátolja.
17
ioncsatornákat. A kainát receptor alegységeket is kb. 900 aminosav építi fel, 3 TM
domént és egy membránba ívelő hurokrégiót (TM2) különíthetünk el a fehérjében,
hasonlóan az AMPA receptor alegységekhez. A funkcionális receptor kialakításában 4
alegység vesz részt. GluR5-7 alegységek homomer és heteromer kombinációban is
kialakíthatnak funkcionális receptort, míg a KA1 és KA2 alegységek csak GluR5-7
alegységgel funkcióképesek. A GluR5 és GluR7 alegységek esetében több izoformát is
leírtak, amelyek „alternatív hasítás”-sal keletkeznek; hasonló variánsok a többi alegység
esetében nem ismertek. A szerkezeti variabilitás másik forrása lehet a GluR5 és GluR6
alegységek esetében (Egebjerg and Heinemann, 1993) az RNS editálás az alegységek
Q/R pozíciójában (TM2 szegmensben) , az editáció mértéke azonban alacsonyabb, mint
a GluR2 alegység esetében. Két további pozíciót azonosítottak még az alegységek TM1
szegmensében, amelyek szintén editálódhatnak: az I/V pozíció, ahol valinra cserélődhet
az izoleucin (Köhler et al., 1993); ill. a Y/C pozíció, ahol tirozin cserélhet le egy
ciszteint. Az RNS editálás az idegrendszer fejlődése során szabályozott folyamat
(Paschen et al., 1997) és az ioncsatorna Ca-permeabilitását szabályozza a kainát
receptorok esetében is.
1.2.2 A kainát-vezérelt receptorok farmakológiai jellemzése
A kainát receptorok általánosan használt agonistái a kainát és a domoát (az
általuk kiváltott válasz gyorsan deszenzitizálódik) annak ellenére, hogy mindkét
agonista képes aktiválni az AMPA receptorokat is (nem deszenzitizálódó válaszokat
létrehozva).5 További receptor agonisták a glutamát γ-szubsztitúciójával előállított
analógok (LY339434; Small et al., 1997; valamint a SYM2081, Zhou et al., 1997) és a
halogén-szubsztituált willardiine és azawillardiine származékok (Swanson et al., 1998).
A nagy affinitású kötőhelyeken (KA1 és KA2 alegységek) a kainát >domoát > glutamát
> AMPA, míg az alacsony affinitású kötőhelyeken a domoát > kainát > glutamát >
AMPA agonista-erősségi sorrend mérhető.
Az kainát receptorok egyetlen szelektív antagonistája az NS102 (Verdoorn et al.,
1994). További antagonistái a receptornak a quinoxalinedion vegyületek (DNQX,
CNQX, NBQX; Lerma et al., 2001) és a decahydroisoquinolinok (LY382884;
5 Az AMPA azonban nem, vagy csak nagyon kis mértékben képes aktiválni a kainát receptorokat.
18
Bleakman et al., 1996), melyek mindegyike mutat aktivitást AMPA receptorokon is. A
kainát receptorok deszenzitizációját csökkentő alloszterikus modulátorok a növényi
lektinek közül kerülnek ki (konkanavalin A; Mayer and Vyklicky, 1989).
Ismert alegység-összetételű, „tiszta” kainát receptorok kainát hatására gyorsan
deszenzitizálódnak, amely megkülönbözteti őket az AMPA receptoroktól (Bleakman
and Lodge, 1998). A receptorok aktivációjuk után egy átmeneti, nem aktiválható
állapotban kerülnek, melynek időtartama a receptor alegység-összetételétől is függ.
1.3 NMDA Receptorok
1.3.1 Szerkezet
Az NMDA receptorokat egyedinek tekinthetjük a glutamát-vezérelt receptorok
között, mivel kettős ligandumkötés (glutamát és glicin; Meguro et al., 1992) és
depolarizáció (a Mg2+-blokk feszültségfüggő felfüggesztése; Mayer, 1998) egyidejűleg
szükséges a csatorna kinyitásához. Az NMDA receptor alegységeket szekvencia-
homológia alapján három csoportba osztjuk: az NR1 alegység; az NR2A-D alegységek;
ill. az NR3A, B alegységek csoportjára (Monyer et al., 1992; Ciabarra et al., 1995;
Chatterton et al., 2002). Az NR1 alegység 8-féle izoformája ismert, melyek 3 exon (N1,
C1 és C2) alternatív jelenlétével keletkeznek (3. ábra; 1. táblázat; Hollmann et al.,
1993).
Variáns N1 C1 C2 C2’
NR1-1a - + + - NR1-1b + + + - Nr1-2a - - + - NR1-2b + - + - NR1-3a - + - + NR1-3b + + - + NR1-4a - - - + NR1-4b + - - +
1. táblázat
Az NR1 mRNS alternatív hasítása során keletkező formák elnevezése a Hollmann által
bevezetett nevezéktan alapján.
19
20
Az NR1 alegység extracelluláris részén elhelyezkedő N1 kazetta jelenléte
csökkenti a receptor glutamát-affinitását, megnöveli az ionáram amplitúdóját és
befolyásolja a receptor Zn2+ és spermin érzékenységét (Zukin and Bennett, 1995;
Rumbaugh et al., 2000). A C1 kazetta olyan szekvenciákat kódol, melyek az
intracellulárisan elhelyezkedő fehérjékkel való kapcsolódást közvetítik. Ilyen fehérjék
pl. a könnyű neurofilamentum fehérje (NFL; Ehlers et al., 1998) vagy a yotiao (Lin et
al., 1998). A C1 exon területén azonosítottak protein kináz C által foszforilálódó
helyeket is (Tingley et al., 1997; Zheng et al., 1999). A C2 exon beépülése a fehérjébe
azt eredményezi, hogy a fehérje csak NR2 alegységek jelenlétében tud a
sejtmembránhoz szállítódni, NR2 alegység hiányában a citoplazmában raktározódik
(McIlhinney et al., 1996; Okabe et al., 1999). Amennyiben a C2 exon nem kerül bele az
NR1 fehérjébe, az exon végén található Stop kodon hiányában a transzláció
továbbmegy, és egy C2’ szakasz kerül a fehérje C-terminális végére (3. ábra). Azok a
variánsok, amelyek C2’ részletet tartalmaznak, kapcsolódni tudnak a PSD95 horgonyzó
fehérjéhez (Kornau et al., 1995).
Az NR2 alegységeknek nincs ismert splice-variánsuk. A receptor alegységek a
már korábban leírt 4 TM domén szerkezettel jellemezhetők, de az NR2 alegységek
intracelluláris C-terminális régiója jóval hosszabb, mint az AMPA és kainát receptor
alegységek esetében.
Az NR3 alegységek TM2 doménje és S1 ill. S2 ligandumkötő régiója eltér az
NR1 és NR2 alegységeknél megismert szerkezettől, részletes jellemzésükre nem térek
ki.
Az NR1 alegység önmagában is képes ioncsatorna kialakítására in vitro, de az
ionáram amplitúdója igen alacsony homomer NR1 csatorna esetében A funkcionális
ioncsatorna in vivo 4 alegységből áll össze, melyben minimum egy NR1 alegység és
bármilyen típusú NR2 alegységek vannak jelen (Monyer et al., 1992). Az NMDA
receptor TM2 doménjében a receptor ionszelektivitását meghatározó aminosav-
pozícióban (azaz a Q/R helyen) minden esetben aszparagin található (Mishina et al.,
1991), melynek következtében az NMDA receptorok Ca2+-t eresztenek át nagy
mennyiségben. Az NMDA receptorok pórusában nyugalmi állapotban Mg2+ ionok
találhatók (Mayer, 1998), melyek a környező membrán-területek depolarizációjával
21
kimozdíthatók. Tehát a receptor aktivációjához a két agonista (glutaminsav és glicin)
kötődése mellett egyidejű depolarizációra is szükség van a csatorna nyitásához.
Az NR1/NR2/NR3 összetételű ioncsatornák Ca2+-permeabilitása csökken a
beépülő NR3 alegység következtében, ami valószínűsíti, hogy ezen alegységek
domináns negatív formákként viselkednek (Das et al., 1998). Az NR1/NR3 alegység-
kombinációjú ioncsatornák Ca2+-impermeábilis, excitatórikus, glicin-vezérelt
receptorok (Chatterton et al., 2002).
1.3.2 Az NMDA receptorok farmakológiai jellemzése
Az NMDA receptorokon két agonista-kötő régiót azonosítottak: az egyik a
glutamát kötéséért felelős (az NR2 alegységek), míg a másik a koagonista glicint (az
NR1 alegység) köti (Madden, 2002). A receptor glutamát-helyre kötődő legfontosabb
szelektív agonistái az NMDA, quinolinsav és az RS-(tetrazol-5-yl)-glicin, míg a glicin-
helyen a glicin és a D-szerin tud kötődni (Mori and Mishina, 1995; Mothet et al., 2000).
A receptor szelektíven ható kompetitív antagonistái közül a glutamát helyre kötődő DL-
AP5 (DL-2-amino-5-foszfonovaleriánsav), DL-AP7 és LY 235959, valamint a glicin-
helyre kötődő 5,7-diklorokynurén sav, az L-655,708 benzodiazepin-származék és a
quinoxalindion típusú vegyületek közé tartozó MNQX érdemel figyelmet nagyfokú
szelektivitása miatt (Mori and Mishina, 1995). A receptor nem-kompetitív antagonistái
a nyitott csatornában kötődnek és gátolják a csatornán át történő ionmozgást. Ide
soroljuk a dizocilpinek közé tartozó MK-801-t, a fenciklidin-származékokat (TCP,
PCP), a ketamint és a memantint (Mori and Mishina, 1995).
Az NMDA-vezérelt ioncsatornák működését számos vegyület és ion is
befolyásolja, melyeket a recetor alloszterikus modulátorainak neveznek. Ide tartoznak a
szulfhidril-csoportot tartalmazó (redox) reagensek, amelyek erős oxidáló ill. redukáló
hatással bírnak (Lazarewicz et al., 1989), az etanol (Lovinger et al., 1989), a spermin és
spermidin (Araneda et al., 1999; Zhang et al., 1994), a nitrogén-monoxid (Manzoni et
al., 1992) és a proton (Traynelis and Cull-Candy, 1991).
22
1.4 Az ionotróp glutamát receptorok előfordulása és szerepe az
idegrendszer embrionális fejlődése során
Az idegrendszer embrionális fejlődése során az ionotróp glutamát receptor
alegységek expressziós mintázata változik. A patkány neurogenezise során az 5 kainát
receptor alegység mRNS-e már igen korán kimutatható (embrionális fejlődés 12. napján
[E12]; Gallo et al., 1995; Maric et al., 2000), de a [3H]kainát kötés és a fehérje
nagymennyiségű kifejeződése a funkcionális receptorok kialakulását követően, kb. két
nappal később (E14) indul (Bahn et al., 1994). Ebben az embrionális időszakban a
kainát receptor alegységeket a még nagyrészt osztódó progenitorok és frissen
differenciálódott migráló neuronok expresszálják (Gallo et al., 1995; Scherer and Gallo,
1998; Maric et al., 2000).
Az AMPA receptor alegységek az embrionális fejlődés során szintén igen korán
megjelennek és expressziójuk időben és térben is meghatározott mintázatot követ.
Legkorábban a GluR3 és GluR4 alegység mRNS-ket mutatták ki patkányban és egérben
az embrionális fejlődés 10. napján a neurális csövet felépítő, nestin-tartalmú idegi
progenitor sejtekben (Schererer and Gallo, 1998). A GluR1 és GluR2 alegység mRNS-
ek E12.5 embrionális korban voltak először kimutathatók teljes egér agyból készült
homogenátumokból (Simonian and Herbison, 2001). E14 kortól mind a négy AMPA
receptor alegység mRNS-e expresszálódott (Monyer et al., 1991). Amíg azonban a
GluR2 alegység a szürkeállomány teljes területén előfordult, addig a másik 3 alegység
expressziója kisebb területekre korlátozódott. Az embrionális fejlődés során az
expresszálódó GluR alegységeknek csaknem 100%-a Flip forma volt (Monyer et al.,
1991). A Flip forma expressziója a posztnatális fejlődés (P) során végig megmaradt, a
Flop forma expressziója azonban csak P9-P12 időszakban indult meg (Monyer et al.,
1991). A Flop forma viszonylag késői beépülése az AMPA receptorokba egybeesik a
nagymértékű szinaptogenezis idejével az előagyi területen (Aghajanian and Bloom,
1967). Az idegrendszer embrionális fejlődése során az NMDA receptor alegységek
közül a legkorábban az NR1, ill. az NR2 alegységek közül az NR2B és az NR2D
alegységek expresszálódnak patkányban és egérben (E13; Monyer et al., 1992;
Watanabe et al., 1992, 1993). Az NR3-s alegységek embrionális expressziója még nem
tisztázott. Azonban amíg az NR1 és NR2B alegységek szinte minden agyi régióban
előfordulnak, az NR2D alegység mRNS-e a köztiagy és agytörzs területeire
23
korlátozódik. Az NR2A és NR2C alegységek szintje a posztnatális időszakban válik
jelentőssé, mellyel egyidőben az NR2D alegység expressziója nagymértékben
visszaszorul (Monyer et al., 1992). A kifejlett idegrendszerben az NR2 alegység mRNS-
ek régió-specifikus eloszlást mutatnak, míg az NR1 alegység a teljes idegrendszer
területén expresszálódik (Monyer et al., 1992; Watanabe et al., 1992, 1993). Az NR2C
alegység főleg a kisagyban, az NR2D a talamusz és agytörzs területein, az NR2A az
agykéreg és a hippocampusz míg az NR2B az előagyi területen fordul elő.
Funkcionális glutamát receptorok már igen korán, a szinaptikus ingerület-átvitel
kifejlődése előtt megjelennek az idegrendszer embrionális fejlődése során. AMPA
receptorokat mutattak ki E13 korú patkány embrió előagyából disszociáltatott, BrdU-t
inkorporáló neurális progenitor sejtekben (Maric et al., 2000), ill. a VZ területét
elhagyó, már posztmitótikus neuronokban. Ez alapján feltételezhető, hogy az elsőként
kialakuló, Ca2+-permeábilis AMPA receptorok szerephez juthatnak a progenitorok
osztódásának szabályozásában és a posztmitótikus fiatal neuronok migrációjában (Métin
et al., 2000; Simonian and Herbison, 2001). Az embrionális fejlődés késői szakaszában
az AMPA receptorok Ca2+-permeábilitása lecsökken és előfordulásuk főleg a
szinaptikus területekre korlátozódik. E14 korból származó, disszociáltatott patkány
agytörzsi progenitorsejtek életképességét szintén befolyásolni lehetett AMPA/kainát
receptor agonistákkal és antagonistákkal (Bardoul et al., 1997), ami alapján valószínű,
hogy ezen receptorok fontos szerepet játszanak a neuronok túlélésének szabályozásában
az idegrendszer embrionális fejlődésének kritikus stádiumaiban.
Az első funkcionális NMDA receptorokat az E16 korból származó
szövetszeletekben sikerült kimutatni, a kortikális lemez területére bevándorolt
neuronokon (LoTurco et al., 1991). A funkcionális NMDA receptort expresszáló sejtek
aránya az embrionális fejlődés előrehaladtával folyamatosan emelkedik és a posztnatális
időszakban éri el expressziós maximumát. Az NMDA receptoroknak fontos szerepet
tulajdonítanak a neuronok túlélésének növelésében (Balázs et al., 1988), a nyúlványok
növekedésében (Brewer and Cotman 1989), a neuronok radiális migrációjának
irányításában (Komuro and Rakic, 1993), valamint a nyúlványhálózatok kialakulásában
és a szinaptikus kapcsolatok differenciálódásában (Vallano, 1998).
24
A sejtfelszíni ionotróp ill. metabotróp glutamát receptorok aktiválása a sejten
belül másodlagos hírvivők (Ca2+, ciklikus nukleotidok és foszfolipidek) felszabadulását
váltja ki. Az idegrendszer embrionális fejlődése során az intracelluláris Ca2+ -szint
változások ([Ca2+]IC) sokféle időbeli és térbeli mintázatot mutatnak és fontos szabályozó
szereppel rendelkeznek a progenitorok osztódása, a fiatal neuronok migrációja
(citoszkeletális átrendeződések mediálása), a programozott sejthalál és a trofikus
faktorok kiürítésének folyamataiban. Az [Ca2+]IC változások jellegzetes mintázatainak
kialakítása során a sejtek citoplazmájába kerülő Ca2+ legfontosabb forrásai az
extracelluláris tér és az intracelluláris Ca2+-raktárak (endoplazmatikus retikulum és
mitokondrium). Az intercelluláris közegből a Ca2+ az iGluR-k mellett a feszültségfüggő
Ca2+-csatornákon (VDCC) keresztül juthat a sejt belsejébe, míg az endoplazmatikus
retikulumból a metabotróp (glutamát ill. GABA) receptorok által aktivált IP3R
receptorokon valamint a RyR receptorokon keresztül ürül a citoplazmába a Ca2+.
GABAA receptorok aktivációja Cl- ionok kiáramlását okozza a citoplazmából az
extracelluláris tér irányába, ami depolarizálja a membránt és aktiválhatja a VDCC-kat.
Ezáltal indirekt módon szintén kiválthatja az [Ca2+]IC megemelkedését.
A Ca2+ szignál-transzdukciós szerepének vizsgálatát elősegítették azok a
módszerek, amelyek a Ca2+-érzékeny fluoreszcens festékek (indo-1; quin-2, fura-2), ill.
fehérjék (aequorin) sejtbe juttatásával az [Ca2+]IC dinamikus változásainak érzékeny
mérését tették lehetővé.
I./2 A GABA
A központi idegrendszer (CNS) legfontosabb gátló neurotranszmittere, a GABA
nélkülözhetetlen a legtöbb idegrendszeri funkció szabályozásában. A GABA a központi
idegrendszeren kívül előfordul a petefészekben, a herében, a hasnyálmirigy inzulin-
termelő β-sejtjeiben is (Erdö and Wolff 1990, Tillakaratne et al., 1995; Chessler and
Lernmark, 2000), a pontos szerepe ezekben a szövetekben és sejtekben azonban még
nem teljesen ismert. A GABA-közvetített szignalizáció szabályozásában többfajta
mechanizmust szerepel, melyek közül központi jelentőségű a GABA szintéziséért
felelős glutaminsav dekarboxiláz enzimek (GAD) expressziójának és aktivitásának
modulálása.
25
Az embrionális fejlődés során a GABA már jóval a szinaptogenezis előtt
megjelenik és trofikus faktorként szolgálhat a differenciálódó neuronok számára (Lipton
and Kater, 1989; Meier et al., 1991; Lauder, 1993; Katarova et al., 2000b). Egér és
patkány idegrendszer korai fejlődési szakaszában (E9-E13) a GABA-tartalmú
idegrostok olyan területek mentén nőnek, ahol aktív neurogenezis folyik (Lauder et al.,
1986; Del Rio et al., 2000; Katarova et al., 2000a). A GABAerg útvonalak kifejlődését
azonban megelőzi a GABAA receptor alegységek megjelenése (Laurie et al., 1992; Ma
and Barker, 1995). A korai embrionális stádiumokban (E9-E13) trofikus faktorként
szolgáló GABA-nak egy alternatív forrása lehet a szérumban jelen lévő GABA, amely a
vér-agy gát kifejlődése előtt be tud diffundálni az erek falából az idegszövet
intercelluláris terébe. A szinapszisok kialakulása előtt a GABA kiürülése a rostokból és
axonális növekedési kúpokból a membrán-kötött GABA-transzporterek
megfordulásával (Taylor and Gordon-Weeks, 1991) illetve exocitózissal is megtörténhet
(Gao and van den Pol, 2000). A neurális progenitorok fejlődése során jelentős
mennyiségű (≈ 10 µmol / 100 mg protein) GABA-t mutattak ki a szaglógumó ill. a
kisagy területén is (Miranda-Contreras et al., 1999, 2000) E13 kortól P0 stádiumig. A
GABAerg rostok, a GABA-szintetizáló enzimek, a GABA-ürítő mechanizmusok, a
GABA receptorok és a GABA együttes jelenléte a korai embrionális fejlődés során
megerősíti azt a feltételezést, hogy a GABA trofikus faktor a fejlődő neuronok számára.
A kifejlett idegrendszerben a GABA a posztmitótikus neuronok hiperpolarizációját
idézi elő és ezzel neuronális gátlást hoz létre. Az embrionális fejlődés során egészen az
első posztnatális hétig a GABAA receptor Cl- csatornák aktivációja depolarizációt idéz
elő és ezzel egyidőben megemeli a [Ca2+]IC-t (Cherubini et al., 1991; LoTurco et al.,
1995; Rivera et al., 1999; Owens et al., 1996, 1999). A depolarizáló hatás a
progenitorsejtek magas Cl- ion tartalmával magyarázható (Rivera et al., 1999), amely a
neuronális érés során fokozatosan lecsökken. Az aktivált GABAA receptorokon a Cl--
ionok kiáramlását membrán-depolarizáció követi aktiválva a VDCC-t, amelyeken
keresztül nagymennyiségű Ca2+ jut a sejt belsejébe (Reichling et al., 1994; Serafini et
al., 1998). Az embrionális fejlődés során a GABA trofikus hatásait nagy
valószínűséggel a Ca2+-ionok, mint másodlagos hírvivők közvetítik.
26
2.1 A GABA-szintézis szabályozása: GAD formák
A gerinces idegrendszerben a GABA szintézisét két enzim katalizálja, a 65 kD
és 67 kD molekulatömegű GAD enzimek (4. ábra; Martin and Rimwall, 1993). A két
gad gén génduplikációval keletkezhetett egy közös ősi gad génből kb. 400-560 millió
évvel ezelőtt (Bosma et al., 1999). A felfedezés, hogy a gerincesek GABAerg
idegsejtjeiben két gad gén (Erlander et al., 1991) és két eltérő funkciójú GABA-raktár
(szinaptikus és metabolikus) található adta az ötletet, hogy a GAD65 és GAD67
fehérjék különböző GABA-raktárak feltöltését végzik (Martin and Rimwall, 1993;
Martin et al., 2000). Megerősíti ezt a feltételezést, hogy a gad65 és gad67 gén-kiütött
állatok eltérő fenotípust mutatnak. A gad67-hiányos állatok farkastorokkal születnek és
születés után nem sokkal el is pusztulnak (Condie et al., 1997; Asada et al., 1997). A
gad67+/- heterozigóta állatokban a GABA szintje nagymértékben lecsökken, ami azt
mutatja, hogy a GAD65 jelenléte nem tudja kompenzálni a GAD67 fehérje részleges
elvesztését. Ezzel ellentétben a gad65 gén-kiütött állatok életképesek, de epilepszia
fejlődik ki bennük (Kash et al., 1997), szorongásos viselkedést mutatnak és a neurális
hálózatuk működése is károsul (Stork et al., 2000). Azok az állatok, amelyek genomja
sem a gad65-t sem a gad67-t nem tartalmazza, hasonló fenotípust mutatnak, mint a
gad67-/- állatok. (Ji et al., 1999). Érdekes megemlíteni, hogy bár ezekben az állatokban
az idegrendszer GABA-tartalma elhanyagolhatóan alacsony, az agykéreg, kisagy és
hippocampusz szöveti fejlődése nem sérül E14-P0 korig (Ji et al., 1999).
A két GAD enzimforma eltér kinetikai tulajdonságaiban (Martin et al., 2000),
intracelluláris eloszlásában (Kanaani et al., 1999) és a kofaktor piridoxál-foszfát (PLP)
kötésében is (Kaufman et al., 1991; Martin et al., 2000). Mindkét fehérjén belül
megkülönböztetünk egy N-terminális (a két fehérje ezen szakasza között kb. 23%-os a
szekvencia hasonlóság) és egy C-terminális domént (kb. 73%-os aminosav egyezés). Az
N-terminális domén szabályozza a fehérje sejten belüli célba juttatását, valamint a
GAD65 – GAD67 homo- és heterodimerek kialakítását. A C-terminális régió hordozza
a
27
28
kofaktor-kötő helyet és az enzimaktív régiót (Sheikh and Martin, 1996; Soghomonian
and Martin, 1998). A GAD67 fehérje nagyobb része a citoplazmában található és csak
kis százaléka kerül ki a membránba (Christgau et al., 1991; Kanaani et al., 1999), míg a
GAD65 fehérje főleg membránokhoz asszociálódik (Kanaani et al., 1999; Obata et al.,
1999; Hsu et al., 2000). A GAD65 fehérje sejtmembránhoz való kihorgonyzása
palmitoil-oldalláncok segítségével történik (Christgau et al., 1992), de a palmitoiláció
nem játszik szerepet a fehérje membránhoz való szállításban (Shi et al., 1994). A
GAD67 fehérje membránhoz való targetálása a GAD65 fehérjétől független folyamat
(Kanaani et al., 1999) és valószínűleg a nem-szinaptikus GABA-release-ben lehet
szerepe (Kanaani et al., 1999). A GAD65 fehérjék preszinaptikus lokalizációja és
szinaptikus vezikulákhoz való asszociációja (Hsu et al., 2000) alapján ezen forma
szerepe a GABAerg szinaptikus jelátviteli folyamatokban jelentős (Sheikh and Martin,
1996).
2.2 Rövidített GAD fehérjék
Az embrionális fejlődés során alternatív hasítással embrionális transzkriptumok
(I-80 és I-86; 4. ábra) keletkeznek a gad67 génről (a gad65 gén esetében ilyen termék
nem ismert). Ezek a transzkriptumok magukba foglalnak egy-egy embrionális exont
(7A és 7B), melyek szekvenciája majdnem teljesen azonos (5. ábra). Az embrionális
exonok tartalmaznak egy átfedő Stop/Start kodont (TGATG), mely a fő nyitott
leolvasási keretet (Open Reading Frame; ORF) megszakítja és két ORF-t alakít ki az
mRNS-n belül (5. ábra), így bicisztronikus – két polipeptidet kódoló - transzkriptum
keletkezik (Szabó et al., 1994). Az első leolvasási keret egy 25 kD fehérjét kódol (4., 5.
ábra; GAD25), míg a második leolvasási keretről átírt fehérje 44 kD molekulatömegű
(4., 5. ábra; GAD44; Szabó et al., 1994). Az I-86 transzkriptumban a 7B exon által
kódolt plusz 6 aminosav (GTG ATG) tartalmaz egy újabb Stop kodont (5. ábra), mely
megszakítja a második leolvasási keretet, így erről a transzkriptumról csak egy fehérje,
a GAD25 tud átíródni. Az I-86 mRNS expressziója az embrionális fejlődés korai
időszakára esik (Szabó et al., 1994), amikor az idegrendszert még főleg osztódó
progenitorok és frissen differenciálódott neuronok építik fel (E10.5 – E15.5). Az I-80
mRNS - mely mindkét fehérjét kódolja - expressziós maximuma későbbi fejlődési
29
stádiumokra esik (Szabó et al., 1994), amikor a már kialakult neuronok migrációja
zajlik (E12-E18).
A GAD25 fehérje a teljes hosszúságú GAD67 fehérje N-terminális 212
aminosavát tartalmazza, valamint még 11 aminosavat, amit az embrionális exonok
kódolnak (5. ábra). A GAD25 fehérje csak azokat a regulációs szekvenciákat hordozza,
amelyek a teljes hosszúságú GAD67 enzimen belül a fehérje-fehérje kapcsolatok
kialakítását közvetítik, így a GAD25 fehérje enzimatikus aktivitással nem rendelkezik.
A fehérje főleg korai embrionális stádiumokban fordul elő (E10.5-E12.5; Szabó et al.,
1994), de felnőtt agyban is kimutatható azokon a helyeken, ahol szinaptikus
átrendeződések történnek (Krizbai et al., 2000).
A GAD44 fehérje 15, embrionális exon által kódolt aminosavat hordoz az N-
terminális végén és 381 aminosavat a felnőtt GAD67 fehérje C-terminális régiójából (5.
ábra), magában foglalva a kofaktor-kötő régiót és az aktív centrumot is. In vitro
mérések megmutatták, hogy a fehérje enzimatikus aktivitással rendelkezik (Szabó és
munkatársai, nem közölt adat). A GAD44 fehérje E11 kortól egészen a posztnatális P11
időszakig detektálható, felnőtt állat idegrendszerében azonban nem mutatható ki (Szabó
et al., 1994). A teljes hosszúságú GAD67 fehérje expressziója fordított tendenciát
mutat: embrionális korszakban alig detektálható, mennyisége nagymértékben emelkedik
születés után és a posztnatális 4. héten eléri szintje a felnőttre jellemző értéket. A
fejlődő telencephalon területén az embrionális transzkriptumok átmeneti expressziót
mutatnak az osztódó sejteket tartalmazó VZ és a szubventrikuláris zóna (SVZ) területén
ill. azokon a területeken, ahol migráló neuroblasztok találhatók (Behar et al., 1994;
Katarova et al., 2000a). Ez alapján feltételezhető, hogy az embrionális GAD formáknak
szerepe lehet a neuronblasztok osztódásának szabályozásában, a neuronális
differenciációban és a kialakuló neuronok migrációjában.
A GABA az idegrendszer embrionális fejlődése során sokrétű szereppel rendelkezik.
Korai embrionális stádiumban (E15) mikromoláris koncentrációban adott GABA
befolyásolja a neurális progenitor sejtek osztódását mind a VZ, mind a SVZ területén
(LoTurco et al., 1955; Haydar et al., 2000). Fiatal neuronok random ill.
30
31
irányított mozgását GABA fento- és mikromoláris koncentrációival befolyásolni lehetett
mind frissel izolált sejtek tenyészeteiben (Behar et al., 1996) mind organotipikus
szövetszeletekben (Behar et al., 1998). A neuronális nyúlványhálózatok kialakulása
során a differenciálatlan idegsejtekből érett neuronok fejlődnek és az aktívan mozgó
axonális növekedési kúpok átalakulnak helyhez kötött szinaptikus elemekké. Az
idegsejtek ezen fejlődési stádiumában a GABA receptor agonisták megnövelik a sejtek
metabolikus aktivitását (Hansen et al., 1987; Spoerri, 1988), megemelik adott GABAA
receptor alegységek expresszióját, növelik a már jelen lévő receptorok GABA-kötését
(Kim et al., 1994), valamint indukálják neuron-specifikus fehérjék szintézisét is
(neuron-specifikus enoláz, neurális sejtadhéziós molekula, Belhage et al., 1988).
II. AZ IDEGSEJT IRÁNYÚ ELKÖTELEZŐDÉS KORAI LÉPÉSEINEK
TANULMÁNYOZÁSA AZ EGYEDI SEJTEK SZINTJÉN
A neurogenezis molekuláris- és sejtbiológiai folyamatai in vivo csak korlátozott
mértékben tanulmányozhatóak. Az embriókban a sejtkapcsolatok tetszés szerint nem
változtathatók, fejlődésreguláló anyagok hatásainak mechanizmusa csak részben
tesztelhető. Azonos fejlődési potenciállal rendelkező, neurális progenitor sejtekből álló
primer tenyészetet nem lehet létrehozni, mert az embrionális idegrendszer területén a
progenitorok differenciációja térbeli és időbeli eltéréseket mutat – azaz egy adott
fejlődési stádiumban a jelenlévő sejtek eltérő differenciáltsági állapotokat képviselnek.
A korai fejlődési stádiumban lévő embrionális agyhólyagból izolált primer
sejttenyészetek összetétele és fejlődési potenciálja is heterogén, a primer progenitorok
osztódóképeségüket in vitro hamar elveszítik, fejlődési potenciáljuk megváltozhat. Az
eredményes és ismételhető kísérletekhez sejtösszetétel, fejlődési potenciál és
indukálhatóság tekintetében egyforma sejttömegre lenne szükség.
A neurogenezis korai szakaszának in vitro vizsgálatait olyan folytonosan
osztódó (immortalizált), neurális progenitor sajátságokkal rendelkező sejteken
végezhetjük, amelyekből a differenciáció adott szakaszában jelentős homogén sejttömeg
állhat rendelkezésre. Perifériás idegrendszeri tumorokból előállított sejtvonalak (PC12;
Green and Tischler, 1976), ill. embrionális karcinómákból (EC) izolált multipotenciális
neurális progenitorok (P19, PCC-7, NTera-2) in vitro differenciáltatása széles
32
lehetőségeket kínál a neurogenezis egyes lépéseinek tanulmányozására. A mi
laboratóriumunk azonban olyan modell sejtvonalon kívánt dolgozni, amely nem tumor
eredetű és külső onkogéneket sem hordoz. Laboratóriumunk munkatársai transzgenikus,
p53–deficiens, 9 napos egér embrió (6. ábra) elő- és középagy-hólyagjából izoláltak
immortalizált neuroepiteliális progenitor sejtvonalakat (Schlett and Madarász, 1997). A
funkcionális p53 génnel nem rendelkező egértörzset Livingstone és munkatársai
állították elő (Livingstone et al., 1992). Kísérletek igazolják, hogy funkcionális p53 gén
hiányában az egerek normálisan fejlődnek, de korábban öregszenek (Tyner et al., 2002)
és idős korban megnő a tumorok gyakorisága is (Donehower et al., 1992). Ugyanakkor
a p53 gén hiánya elősegíti az izolált sejtek (pl. fibroblasztok, hematopoietikus őssejtek)
immortalizációját (Donehower et al., 1992; Harvey et al., 1993; Bond et al., 1994; Metz
et al., 1995).
A p53 gén a tumor szupresszor gének családjába tartozik és fontos szerepet
játszik a sejtciklus G1/S ill. G2/M átmenetének szabályozásában (Takimoto and El-
Deiry, 2001). A p53-/- állatok normális fejlődése azonban jelzi, hogy a fehérje hiányát a
sejtek és a szervezet kompenzálni tudja. Önálló transzkripciós faktorként aktiválja a p21
fehérje expresszióját, mely a cdk/cyclin komplexekhez kapcsolódva gátolja a DNS
szintézis megindulásához szükséges transzkripciós faktorok kialakulását (White, 1994;
Peters, 1994), így a sejtek a G1 fázisban megrekednek. A funkcionális p53 hiány másik
– feltételezhetően immortalizációt kiváltó – hatása egyes apoptótikus folyamatok
kiesése lehet (Hughes, et al., 1997; Bates and Vousden, 1996). A fehérje hiányában az
önpusztító program azokban a sejtekben, amelyek genetikai állománya károsodott, vagy
pedig olyan környezeti feltételek közé kerültek, amelyek nem permisszívek a sejt
túléléséhez (pl. növekedési faktorok hiánya) beindul. A p53–deficiens sejtvonalak
esetén a sejtek öregedését jelző telomera-rövidülés funkcionális p53 fehérje hiányában
egy kritikus telomera hossz elérése után nem tudja beindítani a p53-mediált apoptózist
6. ábra 9 napos egér embrió anterior régiójánakhosszmetszeti képe. A kettős nyilak az elő-,közép- és utóagy hólyagok határait jelzik.
33
(Kang and Park, 2001), így az elöregedett sejtek p53 hiányában tovább folytathatják az
osztódást. A p53-deficiens sejtvonalak esetében az immortalizáció több mechanizmus –
a sejtciklus–reguláció sérülése, a meghatározott környezeti feltételek mellett indukálódó
vagy telomera-rövidülés indukálta apoptózis kiesése – révén is kialakulhatott.
A laboratóriumunkban eddig vizsgált p53-deficiens sejtvonalak (NE-4C, NE-
4C/A, NE-4C/B) indukálatlan állapotban folytonosan osztódnak, míg all-trans retinsav–
kezelés (ATRA) hatására ideg– és gliasejteket alakítanak ki (Schlett and Madarász,
1997). A sejtciklusból való kilépésük, végdifferenciálódásuk tehát funkcionális p53 gén
hiányában is lehetséges.
III. AZ ALL-TRANSZ RETINSAV (ATRA) SZEREPE AZ IDEGRENDSZER
EMBRIONÁLIS FEJLŐDÉSE SORÁN
Régóta ismert tény, hogy mind az A–vitamin hiánya, mind többlete súlyos
fejlődési rendellenességek kialakulásához vezet az embrionális fejlődés során. Számos
adat utal arra, hogy ezekért a rendellenességekért nem az A-vitamin, hanem a belőle
kialakuló retinsav szintjének megváltozása a felelős (Durston et al., 1989; Agarwal and
Sato, 1993). Sok multipotenciális sejtvonal esetében bizonyították, hogy retinsav–
kezeléssel szöveti differenciáciálódásra késztethetők (pl. embrionális stem sejtek; PCC-
7, P19, NTera-2, NE-4C). A retinsav fejlődést szabályozó hatása régóta ismert és a
sejtvonalak segítségével in vitro is vizsgálható (Imrik and Madarász, 1981; Jones-
Villeneuve et al., 1982; Henion and Weston, 1994; Schlett and Madarász, 1997).
Számos előnye mellett azonban, az idegrendszeri elköteleződés vizsgálatánál hátrányt
jelent az embrionális karcinóma eredetű sejtek ill embrionális stem sejtek széles
fejlődési potenciálja: a P19 sejtvonal a differenciáltatásra használt retinsav
koncentrációjának függvényében mind fibroblasztok, mind izomsejtek, mind idegi
elemek kialakítására is képes (Jones-Villeneuve et al., 1982; McBurney et al., 1982;
Edwards and McBurney; 1983).
A gerinces embriókban a fejlődés korai szakaszában termelődik retinsav:
madaraknál a Hensen–csomóban, emlősőknél pedig a primitív árok mentén. A retinsav
koncentráció-grádienst alkot az antero-poszterior testtengely mentén, így koncentráció-
34
függő módon képes aktiválni a testtengelyek szerinti (anterior-poszterior, dorzális-
ventrális, mediális-laterális) polarizációt kialakító régió-speifikus (pl. Hox, Otx, Lim,
Emx, En, Pax) gének expresszióját (Simeone et al., 1995; Bally-Cuif and Boncinelli,
1997; Lumsden and Krumlauf, 1996). RXRE– (Retinoid X Response Element) és
RARE–szekvenciák (Retinoic Acid Response Element) találhatók fejlődésreguláló
gének (Hox–géncsalád, Otx–2), illetve a retinsav saját receptorainak (RXRβ)
szabályozó régiójában (Marshall et al., 1994; Chambon, 1996).
Az elülső neuropórus záródása előtti (közép- és késő-gasztruláció) szakaszban
exogén úton bejuttatott retinsav az elülső idegrendszeri struktúrák különböző mértékű
redukciójához, illetve a gerincvelő és a nyúltagy különböző mértékű előreterjedéséhez
vezet (Corcoran, 1998). Molekuláris biológiai vizsgálatok megmutatták, hogy a
retinsav–függő morfológiai változások jól korrelálnak néhány régió–specifikus
transzkripciós faktor expressziós mintázatának megváltozásával (Conlon, 1995;
Simeone et al., 1995; Bally-Cuif and Boncinelli, 1997; Lumsden and Krumlauf, 1996).
Az, hogy az exogén úton bejuttatott retinsav súlyos fejlődési rendellenességek
kialakulásához vezet és hatása koncentrációfüggő, bizonyítja, hogy a retinsav
morfogenetikus hatású anyag. A retinsav nemcsak az idegrendszer fejlődésében játszik
fontos szerepet, hanem a csontrendszer és a végtagok kialakításában is (Simeone et al.,
1995).
IV. CITOSZKELETÁLIS ÁTRENDEZŐDÉSEK A NEURONÁLIS
DIFFERENCIÁCIÓ SORÁN
A retinsav-indukálta idegsejt irányú elköteleződés együtt jár a sejtalak
jellegzetes megváltozásával, melyet a citoszkeletális fehérjék expressziójának
változásában is nyomon követhetünk. A neuronok differenciációja és érése során
megindul a neuron-specifikus enzimrendszerek expressziója, megjelennek a
neurotranszmisszióban szerepet játszó átvivő-anyagok sejtfelszíni receptorai, kialakul
metabolizmus-rendszerük, valamint a szinaptikus komplexek differenciációja is elindul.
A sejtváz dinamikus átépülésre képes alkotói sejt-specifikus, illetve fejlődési
állapot függő összetételben és elrendezésben találhatók a fejlett gerincesek sejtjeiben.
35
Az idegrendszert kialakító progenitorsejtek fenotípus determinációja során a sejtvázban
is mélyreható változások lépnek fel a sejtek osztódása, vándorlása és nyúlványosodása
során. A kialakuló idegsejtek érése folyamán jellegzetesen és reprodukálhatóan
megjelenő vagy eltűnő molekulák kimutatása így jelentősen megkönnyíti egyes
sejtcsoportok ill. elköteleződési lépések azonosítását.
IV./1 Az köztes filamentum fehérjék
Az eukarióta sejtváz főbb komponensei a köztes filamentumok (10nm átmérő), a
mikrofilamentumok és a mikrotubulusok. A köztes filamentumokra a többi
citoszkeletális vázelemnél nagyobb sejttípus-specifitás jellemző. A köztes filamentum
szupercsaládba tartozó hat molekulacsaládra egyaránt jellemző, hogy az egyes
családokon belüli nagyfokú homológia ellenére a molekulcsaládok között csak
korlátozott hasonlóságot találtak. Az idegi progenitor sejtek jellegzetes, átmenetileg
expresszálódó köztes filamentum fehérjéje a nesztin6 (Lendhal et al., 1990).
Expressziója az idegsejtek korai fejlődése során lecsökken és érett neuronokból teljesen
el is tűnik (Schlett and Madarász, 1997). Az idegsejtek fejlődése során a
neurofilamentum (NF) fehérjék közül elsőként a NFL és a közepes neurofilamentum
fehérje (NFM) expressziója indul meg, melyet csak késéssel követ a nehéz
neurofilamentum fehérje (NFH) expresszió (Shaw and Weber, 1982; Riederer et al.,
1992). A neurofilamentumok in vivo obligát heteropolimerek, amelyek NFL és NFM
vagy NFH formát tartalmaznak. A három alegység hozzájárulása a heteropolimer
kialakításához jelentősen változik a neuronális differenciáció különböző szakaszaiban.
A neurofilamentumok dinamikus átrendeződése az alegységek foszforilációja révén
szabályozódik mind in vivo, mind in vitro (Lee and Cleveland, 1996). A neurális
nyúlvány-növekedés korai szakaszában a neurofilamentumok csak kis mennyiségben
fordulnak elő a növekvő nyúlványokban, de a nyúlványok stabilizálódása, a szinaptikus
6 Nesztin tranziens expresszióját szintén megfigyelték embrionális és újszülött állatok
izomszövetében (Lendhal et al., 1990; Zimmerman et al., 1994). NFM és NFL ektopikus expressziója volt
megfigyelhető éretlen Schwann sejtekben (Kelly et al., 1992; Roberson et al., 1992) ill. NFH expresszió
T-lymphocitákban és embrionális szívizom-sejtekben (Murphy et al., 1993). Ezen fehérjék
idegrendszeren kívüli expressziójának jelentősége még nem tisztázott.
36
struktúrák differenciációja és a mielin-hüvely kialakulása után a neurofilamentum
fehérjék meghatározó citoszkeletális elemmé válnak az axonokban (Lee and Cleveland,
1996), fenntartva a nyúlvány-rendszer alakját és az axon átmérőjét (Lee and Cleveland,
1996).
A gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP) az asztrociták sejtvázának jellegzetes
köztes filamentum fehérjéje (Dahl and Bignami, 1986).
IV./2 A mikrotubuláris rendszer
A mikrotubuláris rendszert α és β tubulin fehérjék építik fel, melyek
heterodimerekként fordulnak elő. Gerincesekben hat különböző α és hat különböző β
tubulin gén ismert (Sullivan, 1988; Wang et al., 1986), melyek közül 5-5 variáns
expresszióját az idegrendszerben is leírták (Villasante et al., 1986). A β típusú tubulin
fehérjék közül a neuronális differenciáció során a III β-tubulin (N-tubulin) az elsőként
megjelenő izotípus és az egyetlen, amely főleg neuronokban (Asai and Remolona, 1989;
és kismértékben a testis sertoli sejtjeiben (Lewis and Cowan, 1988) expresszálódik.
Jelenlétét kimutatták már a neuronok utolsó osztódása alatt (Dráberová et al., 1998,
Menezes and Luskin, 1994). A N-tubulin elsőként E8 embrionális korban sikerült
kimutatni (Fanarraga et al., 1999), mennyisége nagymértékben emelkedett E13-tól
egészen postnatális P5 korig. A differenciálódó idegsejtekben korábban megjelenő
foszforilálatlan N-tubulin forma a sejtváz plaszticitását biztosítja a nyúlvány-növekedés
korai szakaszában (Ferreira and Caceras, 1992), míg a foszforilált formák a kialakuló
nyúlványokat stabilizálják.
Az idegsejtek fejlődése során a sejtvázat felépítő fehérjék expressziója
fejlődéstanilag meghatározott és függ az expresszáló sejt típusától és a sejt fejlődési
állapotától. Két fő expressziós csoportot különítünk el: a korai és késői expressziójú
fehérjéket. Az első csoportba a Map5 (mikrotubulus-asszociált fehérje; Riederer et al.,
1986), Map2b és Map2c (Binder et al., 1984; Riederer and Matus, 1985) valamint a
juvenilis τ fehérje (Brion et al., 1988) tartozik. Ezek a fehérjék a sejtvázba épülve
biztosítják a sejtváz nagyfokú plaszticitását, mely nélkülözhetetlen a
nyúlványnövekedés és differenciáció során. A késői komponensek, mint az NFL, NFM
(Dahl and Bignami, 1986), Map1a és Map2a (Riederer and Matus, 1985), felnőtt τ
37
fehérje (Binder et al., 1985) és agyszövet-specifikus spektrin (Riederer et al., 1987) a
neuronális struktúrák fenntartása és stabilizálása során döntő jelentőségűek.
38
CÉLKITŰZÉSEK
1. A klasszikus neurotranszmitterek (glutaminsav és GABA) korai neurogenezisben
betöltött szerepének vizsgálatára olyan in vitro modellrendszert kívántam
kialakítani, amely alkalmas a neurogenetikus folyamatok sejtbiológiai és
molekuláris biológiai vizsgálatára. A modellrendszer felhasználásával az idegi
irányú elköteleződés folyamatának biztosan reprodukálható fázisait anatómiai,
citokémiai sajátságok alapján szerettem volna jellemezni.
2. Az in vitro neurogenezis különböző stádiumaiban vizsgálni kívántam a glutaminsav
hatásait közvetítő ionotróp glutamát receptorok megjelenését és lehetséges szerepét
az idegi elköteleződés során. A célok között szerepelt:
a/ az NMDA receptor alegységek mRNS- és fehérje-formáinak kimutatása
b/ funkcionális NMDA receptorok kimutatása
c/ AMPA receptor alegységek expressziójának vizsgálata
d/ Funkcionális AMPA receptorok kimutatása és neurogenezisben betöltött
szerepük vizsgálata
az NE-7C2 sejtek in vitro idegi fejlődése során
3. Feladatul tűztem ki a glutaminsav - GABA átalakulásért felelős enzimcsalád, az
embrionális és felnőtt GAD formák in vitro expressziós mintázatának
feltérképezését és esetleges szerepük tanulmányozását az idegsejt-fenotípus
kialakításában:
a/ az embrionális és felnőtt GAD mRNS- és fehérje-formák expressziós
mintázatának és sejtes lokalizációjának tanulmányozását
b/ GABA-tartalmú idegsejtek azonosítását és eloszlásuk vizsgálatát
az NE-7C2 sejtek in vitro idegi fejlődése során
39
ANYAG ÉS MÓDSZER
I. AZ ALKALMAZOTT SEJTTENYÉSZTÉSI KÖRÜLMÉNYEK
I./1 Sejtek fenntartása, kezelése
Az NE-7C2 sejtvonalat az Idegi Sejtbiológia laboratórium munkatársai állították
elő (Schlett and Madarász, 1997) és fagyasztva különböző passzázsok állnak
rendelkezésre. Az NE-7C2 sejteket 5% CO2 tartalmú, 37°C–os termosztátban poli–L–
lizinnel (PLL) bevont szövettenyésztő petricsészében (Greiner), Minimal Essential
Mediumban (MEM, Sigma) növesztettem, melyhez 10% FCS–t (Fötális Borjú Savó,
Sigma), 4mM glutamint, 40 µg/ml gentamicint és 1.25µg/ml amphotericinB-t adtam. A
sejteket 105 sejt/cm2 sűrűségig engedtem nőni, majd 0.05% tripszin–PBS (Phosphate
Buffered Saline) oldattal felpasszáltam és 5x higításban újra kiültettem őket.
Immuncitokémiai festések során 24 lyukú szövettenyésztő edényeket használtam
üveglemezekkel és 105 sejtet tettem minden lyukba, míg az in situ ELISA mérésekhez
96 lyukú szövettenyésztő tálcákra ültettem ki 104 sejtet minden lyukba. Az [Ca2+]IC
mérésekhez 35mm átmérőjű petricsészékben UV fényt áteresztő üveglemezeken nőttek
a sejtek meghatározott időtartamokig.
All-transz retinsav (Sigma) 0.01M-os, dimetil-szulfoxidban (DMSO, Sigma)
oldott törzsoldatát folyékony nitrogénben tároltam. Ennek 10-4M MEM-ben oldott
munkahigításával közvetlenül állítottam be a 10-6- 10-8 M-os végkoncentrációt a sejtek
folyadékkörnyezetében.
I./2. Kromoszóma-preparátumok készítése
A növekedés log fázisában lévő tenyészeteket 10-7 M végkoncentrációban
kolcemiddel kezeltem 1,5 órán keresztül. A sejteket tripszines kezeléssel felszedtem az
aljzatról és 1000g - n 10 percig tartó centrifugálással összegyűjtöttem. A sejtcsapadékot
0.56% KCl-al 10 percig hipotonizáltam, majd a duzzadt sejteket és citoplazma-mentes
sejtmagokat frissen készített metanol-ecetsav 1:3 arányú keverékével 3-4x fixáltam. A
preparátumot krómkénsavval zsírtalanított tárgylemezre csöppentettem és 24–48 óráig
száradni hagytam. A feldolgozást megelőzően a lemezeket 2% Giemsa–tartalmú (0.66
40
M Na2HPO4, 0.66 M KH2PO4) oldattal 10 percig festettem és 1250x nagyítás mellett
számoltam le a kromoszómákat.
Az NE-7C2 sejtvonal kromoszómaszám-változásait 81 passzázs során követtem.
A vizsgált passzázsokból 50-50 mitózisban megszámoltam a kromoszómákat és
grafikusan ábrázoltam a kromoszómaszámok megoszlását egy-egy passzázson belül (7.
ábra). A vizsgált passzázsokban összeadtam azokat a kromoszómaszámokat, amelyek az
50 és 80 értékek közé estek és elosztattam az összeget az ezen tartományba eső
mitózisok számával. Az így meghatározott értéket a kromoszómaszámok súlyozott
átlagának neveztem.
II. SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR VIZSGÁLATOK
II./1 Ionotrop glutamát receptor alegységek kódoló RNS formáinak
kimutatása
A munka a Stuttgarti Egyetem Sejt- és Immunbiológiai Laboratóriumában Dr
Ulrich Eisel-el való kollaboráció keretében készült.
Kontroll és ATRA-kezelt NE-7C2 sejtek tenyészeteiből Trizol-LS reagens
segítségével (Gibco BRL) totál RNS-t izoláltam és a mintákat kiküldtem a Stuttgarti
Egyetem laboratóriumába (két független mintasorozat), ahol a kísérlet további lépéseit
Dr Schlett Katalin végezte el. Az RT-PCR reakciók során felhasznált pozitív kontroll
RNS-eket 30 napos egér kisagyi és előagyi régióiból PeqGold RNAPure (PEQLAB
Biotech., Erlangen, Germany) felhasználásával készítette. Az RNS-mintákat DNázI-el
kezelte 37°C-on 15 percig, majd az így kapott genomiális szennyezéstől mentes RNS-
ből 3µg-t átírt komplementer cDNS-re a First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI
Fermantas, St. Leon-Rot, Germany) valamint random hexamer vagy. oligodT primerek
felhasználásával. A PCR-reakciókhoz PTC-200 Peltier Thermal Cycler berendezést (MJ
Research Inc., Watertown, MA, USA) és HotStarTaq polimerázt (Qiagen, Hilden,
Germany; 1U / 50µl reakciótérfogat) használt. Az mRNS expresszió mennyiségi
kiértékelése céljából ugyanabban a reakcióelegyben a glicerin-aldehid-foszfát
dehidrogenázt (GAPDH, 11. primer pár) kódoló mRNS-t is felszaporította
párhuzamosan az AMPA és NMDA receptor alegység mRNS-kel. A negatív kontrollok
ugyanazt a reakcióelegyet tartalmazták de templátként RNS szolgált, a pozitív
41
kontrollok esetében pedig előagyi és kisagyi (az NR2C detekció esetén) cDNS-ről
történt az amplifikáció. A PCR termékeket 2%-os, etidium-bromiddal megfestett agaróz
gélen futtatta meg és értékelte ki.
A PCR analízisekhez tervezett primer-párok szekvenciáját az 2. Táblázat
tartalmazza. Az RT-PCR analízisek mindkét mintasorozatból többször lettek
megismételve, az ábrákon egy-egy reprezentatív eredmény szerepel.
II./1/1 AMPA receptor alegység mRNS-einek kimutatása
A PCR reakciómix 1.5 mM MgCl2-t, 0.2 mM dNTPs-t (PEQLAB Biotech.;
Erlangen, Germany) és 0.2 µM primert tartalmazott az 1-3 primer párokkal (2. táblázat)
történő amplifikálás esetén. A PCR reakció egy 15 percig tartó aktiválással indult 95ºC-
on, majd 35 ciklus következett az alábbi hőmérsékleteken: 94ºC 60 sec, 60ºC 60 sec és
72ºC 60 sec. Az amplifikációk egy 72ºC-on 10 percig tartó elongációs szakasszal
zárultak.
II./1/2 NMDA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása
A PCR reakciókeverék 2.5 mM MgCl2-t és 0.4 mM dNTP mixet tartalmazott az
4. és 11. primerekkel (2. táblázat) történő cDNS amplifikáció során, illetve 1.5mM
MgCl2-t és 0.2 mM dNTP mixet a 5-10. primerekkel (2. táblázat) való láncreakció
esetén. A PCR reakció egy 15 percig tartó aktiválással indult 95ºC-on, majd ezt követte
egy 40-szer ismétlődő hőmérsékleti ciklus: 94ºC 60 sec, 72ºC 120 sec (a 4., 6. és 10.
primer párok); 94ºC 60 sec, 62ºC 45 sec, 72ºC 120 sec (5. primer pár); 94ºC 45 sec,
67ºC 60 sec, 72ºC 60 sec (7. és 8. primer pár); 94ºC 60 sec, 63ºC 60 sec, 72ºC 60 sec (9.
primer pár); ill. 30 ciklus 94ºC 60 sec, 55ºC 60 sec, 72ºC 60 sec a 11-es primer pár
esetén. A reakciók egy 10 percig tartó elongációs szakasszal zárultak 72ºC-on.
II./2 GAD65 és GAD67 transzkriptumok kimutatása
A vizsgálatokat a Dr Szabó Gábor által vezetett Genetikai és Molekuláris
Biológiai Laboratóriumban készítettem az MTA-KOKI-ban.
Totál RNS-t izoláltam kontroll és ATRA-kezelt NE-7C2 sejtek tenyészeteiből
(két független mintasorozat) Trizol-LS reagens segítségével (Gibco BRL). 2µg RNS-t
átírtam komplementer cDNS-é a GeneAmp RNA-PCR Kit (Perkin-Elmer) segítségével
42
random hexamer primerekkel. A PCR-reakciókhoz Hybaid Thermal Cycler berendezést
(Thermo Hybaid, UK), Perkin-Elmer vagy Promega Taq polimerázt (1U / 30µl
reakciótérfogat) használtam és a reakció-elegyhez radioaktívan jelölt [32P]dCTP-t
(3000Ci/mmol; Izotóp Intézet, Budapest) is adtam. PCR analízisekhez tervezett primer-
párok szekvenciáját az 2. Táblázat tartalmazza (12 – 15 primer párok). A PCR
amplifikációt egy 95ºC-on 5 percig tartó denaturációval indítottam, majd 31 ciklus
következett az alábbi hőmérsékleteken: 94ºC 45 sec, 58ºC 45 sec, 72ºC 60 sec (12. és
14. primer párok); 94ºC 45 sec, 62ºC 45 sec, 72ºC 90 sec (13. primer pár). A reakció
egy 10 percig tartó elongációs szakasszal zárult 72ºC-on. A negatív kontrollok ugyanazt
a reakcióelegyet tartalmazták de templátot nem adtam a rendszerhez. Az mRNS
expresszió mennyiségi kiértékelése céljából a β-aktint kódoló mRNS-t is
felszaporítottam (15. primer pár) párhuzamosan a GAD mRNS-kel 16-20 cikluson
keresztül ugyanabban a reakcióelegyben. Az amplifikált radioaktív termékeket 1.5% ill.
1.6% etidium-bromiddal festett gélen futtattam és nylon membránra vittem át
(GeneScreen Plus, NEN). Az autoradiogrammok denzitometriás kiértékelését a Scion
Image programmal (Scion Corp.) végeztem el és a GAD-csíkok denzitását β-aktin-ra
vonatkoztatva normalizáltam. A GAD mRNS-ek kimutatását mindkét mintasorozaton
kétszer végeztem el és egy-egy reprezentatív eredményt kiválasztva készítettem el az
ábrát.
III. WESTERN BLOT ANALÍZIS
III./1 Fehérjeminták készítése szubcelluláris frakcionálással
90mm átmérőjű petricsészén növő NE-7C2 sejteket 0.02% EDTA-t tartalmazó
Ca2+, Mg2+-mentes PBS oldattal összegyűjtöttem majd 800g-n centrifugálással
leülepítettem. A továbbiakban minden lépést +4ºC-on végeztem el. A sejteket
tartalmazó csapadékot a felhasználásig -80ºC-on tároltam. A szubcelluláris frakcionálás
céljából a sejteket kézi sejt-homogenizátorral (Sigma) feltártam 300 µl pufferben
(pH=7.4), amely 10 mM HEPES-t, 250 mM szacharózt [valamint 1 mM
aminoethylthioammonium bromide (AET) és 0.2 mM PLP-t a GAD fehérjeformák
esetében] és proteáz-gátlókat tartalmazott (100 mM phenylmethylsufhonyl fluorid, 10
mM benzamidine, 1 µg/ml leupeptin, antipain, pepstain, aprotinin). Ezután a
43
sejthomogenátumot lecentrifugáltam 2000g-vel 5 percig, hogy a sejtmagokat
eltávolítsam. A felülúszót és 16000g-vel centrifugáltam tovább 30 percig, hogy
elválasszam a nagyobb sejtalkotókat és membrán-darabokat (durva membrán-frakció).
A felülúszó citoplazmás frakció eltávolítása után a csapadékot feloldottam 100 µl
pufferben, amely 10 mM HEPES-t, 150 mM NaCl-t és az előzőekben felsorolt proteáz-
gátlókat tartalmazta. A durva membrán frakciót ezután jégen inkubáltam 1 órán
keresztül. A GAD fehérjeformák kimutatása esetében a durva-membrán frakciót 100µl
2% TritonX-114-t tartalmazó pufferben oldottam vissza, amely 10 mM HEPES-t, 150
mM NaCl-t, 1mM AET-t, 0.2 mM PLP-t és az előzőekben felsorolt proteáz-gátlókat is
tartalmazta. A membrán-mintákat elhomogenizáltam és lecentrifugáltam 16000g-vel 30
percig. A felülúszó frakció a TritonX-114 oldható durva-membrán frakció nevet kapta.
A keletkező csapadékot 50µl pufferben oldottam vissza, amely 150 mM NaCl-t, 10 mM
HEPES-t, 1 mM AET-t, 0.2 mM PLP-t és proteáz-gátlókat tartalmazott (TritonX-114
oldhatatlan durva-membrán frakció).
III./2 Fehérjetartalom meghatározása
A minták fehérjetartalmának meghatározását Bradford módszere szerint
végeztem (Bradford 1976) a Biorad Standard Protein Assay felhasználásával. A 0.1 N
NaOH-ban felvett mintákat Bradford reagenssel 10 percig inkubáltam. Az oldatok
abszorbanciáját ELISA-reader segítségével mértem 595 nm hullámhosszon (405 nm
referencia hullámhossz mellett). Kalibráláshoz borjú szérum albumin (BSA)
koncentráció-sort használtam (0.1-20 µg/µl koncentráció-tartományban). A minták
fehérjetartalmát 1µg/µl-re állítottam be Laemmli-puffer (Laemmli et al., 1970)
segítségével
III./3 Western blot
III./3.1 NMDA receptor alegység fehérjéinek kimutatása
A citoplazmás és durva membrán frakciókból vett mintákat 2x töménységű
minta-pufferben (125mM Tris-HCl, pH 6.8; 6% glicerin; 4% SDS; 10% β-
merkaptoetanol és 0.0025% brómfenol kék) felvettem és 1 órán keresztül inkubáltam
37ºC-on. A mintákat ezután 12% poliakrilamid gél zsebeibe vittem fel (10 µg fehérje /
zseb NR1 és NR2B esetében valamint 10 és 60 µg fehérje / zseb NR2A esetében) és a
44
fehérjéket elektroforézissel elválasztottam. A fehérjék szeparálása BioRad Mini Protean
II készülék segítségével 50mA áramerősség mellet 1 órán át tartott (Futtató puffer: 192
mM glicin, 25 mM Tris bázis). A gélből a fehérjéket átblottoltam (blottoló puffer: 192
mM glicin, 25 mM Tris bázis, 20% metanol) nitrocellulóz membránra (Immobilon NC-
pure, Millipore) 80V-on 50 percig, majd 90V-on 10 percig. Az aspecifikus kötőhelyek
lefedésére a membránt 30 percig rázattam Tris-pufferelt sóoldatban (TBS; 50 mM Tris,
100mM NaCl; pH=7.4), amely 0.05% Tween-20-t és 2% BSA-t tartalmazott. A
membránokat egy éjszakán keresztül inkubáltam az I. réteg ellenanyagokkal. A kísérlet
céljától függően az alábbi ellenanyagokat használtam: anti - NR1 (0.5 µg/ml;
Chemicon), anti - NR1 (1 µg/ml; az ellenanyag M. Watanabe-tól származik, Watanabe
et al., 1998), anti - NR2A (1 µg/ml,; Upstate Biotechnology), anti - NR2A (1 µg/ml; az
ellenanyag M. Watanabe-tól származik) és anti - NR2B (1 µg/ml; Transduction
Laboratories). A membránokat ezután háromszor mostam TBS-oldattal, amely 0.05%
Tween-20-t tartalmazott (TBST), majd alkalikus foszfatázzal konjugált anti-nyúl vagy
anti-egér IgG (Jackson Immuno-Research Laboratories) 1:10000 higított oldatával
(TBST-ben) jelöltem a membránt 1 órán keresztül, szobahőn. A membránokat
háromszor mostam TBST oldattal, majd a kötött ellenanyagot 5-bromo-4-kloro-3-
indolyl foszfát (BCIP, 0.165 µg/ml; Sigma) és nitro blue tetrazólium (NBT, 0.33 µg/ml;
Sigma) alkalikus puffer-oldatában (0.1M Trizma-base, 5mM MgCl2 és 0.1M NaCl;
pH=9.5) tettem láthatóvá.
III./3.2 GAD fehérjeformák kimutatása
A GAD fehérjeformákat Katarova Zóya módszere alapján mutattam ki
(Katarova et al., 1990). A korábban leírt három szubcelluláris frakcióból
(citoplazmatikus frakció, TritonX-114 oldható és TritonX-114-oldhatatlan durva
membrán frakciók) vett mintákat Laemmli-pufferben forraltam 5 percig, majd 12%-os
gélen futtattam (15µg fehérje / zseb, BioRad Mini Protean II) 50mA áramerősség
mellett a már korábban említett futtató puffer felhasználásával. A fehérjéket ezután
átblottoltam nitrocellulóz membránra (Hybond-C, Amersham) lépcsősen növelve a
feszültséget. A kis molekulatömegű GAD25 és GAD44 fehérjéket 60V-on 20 percig,
majd 80V-on 30 percig blottoltam, a GAD65 és GAD67 fehérjéket 60V-on 10 percig,
80V-on 40 percig, majd 90V 10 percig transzferáltam. A membránokat ezután 2% BSA-
45
TBST oldatban inkubáltam 30 percig, hogy az ellenanyag aspecifikus kötődését
lecsökkentsem, majd egy éjszakán keresztül inkubáltam a következő I. réteg
ellenanyagok valamelyikével: # 6799 poliklonális szérum, mely az összes GAD-formát
felismeri (1/2000; Katarova et al., 1990), a GAD65 fehérje ellen termeltetett GAD6
monoklonális ellenanyag (1/500; Developmental Studies Hybridoma Bank, Chang and
Gottlieb, 1998) és # 8876 poliklonális szérum, amely az embrionális GAD25 fehérjére
specifikus (1/1000; Szabó et al., 1994). A membránokat ezután háromszor mostam
TBST-oldattal, majd alkalikus foszfatázzal kapcsolt anti-nyúl (Jackson Immuno-
Research Laboratories) vagy anti-egér (Promega) IgG 1:10000-re higított oldatában
(TBST-ben) rázattam 1 órán keresztül szobahőn. Az ellenanyaggal megjelölt fehérjéket
BCIP és NBT előbbiekben leírt oldatával festettem meg.
IV. IMMUNCITOKÉMIAI VIZSGÁLATOK
Az immuncitokémiai vizsgálatokhoz a sejteket 12 mm átmérőjű, PLL-el bevont
üveg fedőlemezen (Erie Scientific) tenyészettem 24-lyukú szövettenyésztő edényekben
(Greiner). Az immunfestések során felhasznált ellenanyagokat a 3. táblázat foglalja
össze.
IV./1 Neuron-és gliaspecifikus fehérjék kimutatása
A tenyészeteket PBS oldatával mostam, majd 4%-os paraformaldehid oldatban
(Taab; PBS-ben oldva) fixáltam 20 percig szobahőmérsékleten. A GABA
kimutatásához 4% paraformaldehid és 0.1% glutáraldehid frissen készített oldatával
fixáltam 10 percig. Háromszori mosás után TritonX-100 0.1%-os oldatával (5 percig,
szobahőn) átjárhatóvá tettem a sejtfelszíni membránokat. Ezt követően 1% BSA-PBS
vagy 5% FCS-PBS oldatban inkubáltam a tenyészeteket 1 órán keresztül, hogy az
aspecifikus kötődést megakadályozzam. Vizsgálataimban az alábbi ellenanyag-
higításokat alkalmaztam: N-tubulin (Dráberová et al., 1998) 1/1000, gliális fibrilláris
savas fehérje (GFAP, Sigma) 1/1000, szinapszin I (Chemicon Int.) 1/500, szinaptofizin
(Sigma) 1/500, neurofilament 68 kD (NFL, Sigma) 1/500, neurofilament 145 kD (NFM,
Sigma) 1/500, neurofilament 200 kD (NFH, Sigma) 1/500, Map2 (Sigma) 1/1000 és
nesztin (Pharmingen) 1/1000. A tenyészetek háromszori mosása (PBS) után biotin-
(Vector) ill. fluoreszcein izotiocianát-(FITC; Sigma) kapcsolt másodlagos antitesteket
46
adtam a tenyészetekhez 1/500 higításokban 1 órán keresztül. A fluoreszcens festékkel
jelölt preparátumokat Mowiol 4.88 (Polysciences) segítségével üveg tárgylemezekre
ragasztottam és Zeiss Axiophot fluoreszcens mikroszkóppal értékeltem ki. A normál
fénymikroszkópos vizsgálatokhoz harmadik rétegként avidin-biotin komplexet (Vector)
adtam 1/500 higításban 45 percig, majd az immunjelet 3-3’-diamino-benzidin (0.55
mg/ml TBS-ben; pH=7.6) és 0.3% H2O2 oldatával tettem láthatóvá.
IV./2 NMDA receptor NR1 és NR2B alegységeinek kimutatása
A tenyészeteket 4%-os paraformaldehid oldattal fixáltam 20 percig
szobahőmérsékleten, majd háromszori mosás után a tenyészetek egy részét TritonX-100
0.1 %-os oldatával permeabilizáltam a fent leírtak szerint. Ezt követően 1% BSA-PBS
oldattal 1 órán keresztül blokkoltam a nem-specifikus kötőhelyeket. Az ellenanyag
higítások a következők voltak: anti-NR1 (K21322, az ellenanyagot M. Herkert-től kapta
a munkacsoport, Herkert et al., 1998) 1/100, anti-NR1 (Pharmingen) 1/500, anti-NR2B
(K83084, az ellenanagot szintén M. Herkert-től kapta Madarász Emília, Herkert et al.,
1998) 1/100 és anti-NR2A (Upstate Biotochnology) 1/500. Az immunreakciót egyrészt
anti-egér IgG FITC-el hívtam elő, másrészt biotin, majd avidin-biotin komplex
segítségével amplifikáltam és DAB-csapadékkal tettem láthatóvá az előzőekben leírtak
alapján.
IV./3 GAD fehérjeformák kimutatása
A GAD fehérjeformák kimutatását 4% paraformaldehid fixálás előzte meg 20
percig, majd a fixált tenyészeteket 1% BSA-TBST oldattal permeabilizáltam és
blokkoltam. Első rétegként a következő ellenanyagokat használtam a felsorolt
higításokban: # 6799 (1/1000), N65 (1/500, a 65kD GAD fehérjeformát ismeri fel; az
ellenanyagot Szabó Gábor munkacsoportja kapta P. DeCamilli-től; Solimena et al.,
1993), # 8876 (1/1000, a 25 kD GAD fehérje ellen lett termeltetve) és affinitás-tisztított
# 8877 (GAD44 fehérjére specifikus poliklonális ellenanyag, melyet Szabó Gábor
munkacsoportja állítatott elő; 1/100). Az első réteg ellenanyagokat 48 óráig hagytam a
tenyészeteken +4ºC-on. A tenyészetek háromszori mosását követően biotinnal jelölt
anti-egér IgG vagy anti-nyúl IgG (1/1000, Vector) ellenanyagokkal inkubáltam 1 órán
keresztül, majd ezt követően sztreptavidin peroxidázzal (1/1000, Sigma) szintén 1 órán
47
át. Az immunjel további erősítéséhez biotinnal kapcsolt tyramidot (TSA Biotin System,
NEN) is használtam 1/100 higításban, majd az így megjelölt immunkomplexet
sztreptavidin-Cy3 (1/1000, Sigma) ill. avidin-FITC (1/500, Vector) segítségével tettem
láthatóvá. A festett tenyészeteket hordozó fedőlemezeket Mowiol 4.88-al
tárgylemezekre ragasztottam és az immunjelet BioRad konfokális lézer mikroszkóppal
valamint Zeiss Axiophot fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltam.
V. A TENYÉSZETEK SEJT- ILL. IDEGSEJT-TARTALMÁNAK
MEGHATÁROZÁSA
V./1 A tenyészetek sejtszámának meghatározása a tenyészetek életképességének
mérésével
A mérési módszer a sejtek anyagcsere-aktivitását határozza meg a redukáló
képesség mérése által. A sejteket 96 lyukú műanyag szövettenyésztő tálcán
növesztettem 100 µl tápfolyadékban. Az MTT (3–(4,5 Dimethylthiazol–2–yl)–
2,5diphenyltetrazólium–bromide, Sigma) reagens törzsoldatát (1.25 mg/ml) –20°C–on
tároltam. A sejttenyészetekhez 12.5 µg MTT reagenst adtam 60 µl tápfolyadékban
oldva. A sejtekben található NADH2 és NADPH2 a tetrazóliumsót kék színű
formazánkristállyá redukálja, így a sejtekben található kristályok mennyisége arányos
lesz a redukáló-kapacitással. A kék formazánkristályok megjelenése után 140 µl savas
izopropil–alkoholt (100 ml 2–propanol, 0.6 ml cc HCl) adtam a tenyészethez a
kristályok és a sejtek feloldása végett. 10 perc állás után optikai tisztaságig
szuszpendáltam az oldatot és ELISA készüléken kettős hullámhosszon lemértem
(referencia hullámhossz: 630 nm; mérési hullámhossz: 570 nm). A tenyészetekben mért
optikai denzitás adatok arányosnak mutatkoztak a tenyészetekben lévő élő sejtek
számával.
V./2 Idegsejtek számának meghatározása immuncitokémiával
Az egy fedőlemezen található összes idegsejtet sejtszámolással határoztam meg.
A neuronokat N-tubulin immunfestéssel azonosítottam (lásd korábban), majd 400x
nagyítás mellett látóterenként megszámoltam az idegsejtek számát.
48
Minden esetben három testvértenyészet adatait vettem fel (n=3) és kiszámítottam
a tenyészetekben átlagosan egy látótérre eső N-tubulin immunreaktív sejtek számát. Ezt
követően ezekből az átlagokból meghatároztam a három tenyészetben átlagosan egy
látótérre eső neuronok számát és kiszámítottam az ettől való eltéréseket is. A
szignifikanciát kettős T-teszt segítségével határoztam meg.
*: p<0.05; **: p<0.005
V./3 Idegsejtek mennyiségi meghatározása in situ ELISA módszerrel
A sejtek PLL-el bevont 96 lyukú műanyag szövettenyésztő tálcán nőttek
(Greiner). A fixálás és tritonozás az immuncitokémiai módszereknél leírtakkal
megegyezett. A fixált, permeabilizált sejteket N-tubulin specifikus ellenanyaggal
jelöltem (1:5000, egér IgG, monoklonális). Foszfát pufferes (PBS) mosások után anti-
egér IgG-HRPO (horse radish peroxidase, Sigma) ellenanyaggal inkubáltam a
tenyészeteket (1:10000 higítás, 1.5 óra), majd a peroxidáz szubsztrátjaként citrát
pufferben oldott (24 mM citromsav, 51 mM Na2HPO4 x 2H2O) orto-fenilén-diamint
(OPD, 2mg/ml; 10 µl cc H2O2 / 50ml puffer) használtam előre meghatározott ideig. Az
enzimreakciót 4.5 M kénsav oldatával állítottam le. A színreakciót ELISA fotométer
(SLT Labinstruments Company) segítségével detektáltam, melynek során a mérési
hullámhossz 492 nm, a referencia hullámhossz pedig 405 nm volt. A reakció
intenzitását a két hullámhosszon mért adszorpció különbsége adta (OD492 - OD402).
Az N-tubulin tartalmakat 9-9 párhuzamosan kezelt testvértenyészetben
határoztam meg minden egyes mérési időpontban ill. kezelési csoportban, és
kiszámoltam az egy tenyészetre átlagosan jellemző N-tubulin értéket és a hozzá tartozó
szórást is.
A szignifikanciát kettős T-teszt segítségével határoztam meg.
*: p<0.05; **: p<0.005
49
VI. SEJTEN BELÜLI SZABAD CA2+-SZINT MEGHATÁROZÁSA
MIKROFLUORIMETRIÁVAL
A vizsgálatokhoz felhasznált sejteket PLL-el bevont üveglemezen (22 mm
átmérő) növesztettem. A mérés előtt 1 µM Fura-2/AM-t (Molecular Probes, Eugene,
OR, USA) tartalmazó oldattal inkubáltam a sejteket 45 percig CO2-inkubátorban, Mg2+-
jelenletében (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM glükóz és
10 mM HEPES; pH=7.4) vagy hiányában (140 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.6 mM CaCl2,
10 mM glükóz és 10 mM HEPES; pH=7.4). A mikrofluorimetriás vizsgálatok inverz
Nikon TDM Diaphot epifluoreszcens mikroszkóp fűthető tárgyasztalán történtek, 100x
objektív nagyítás mellett. A kalciumot kötött Fura-2 formát 340 nm, a kalciumot nem
kötő formát pedig 380 nm hullámhosszú fénnyel gerjesztettem. Az emittált fény
intenzitását 520 nm hullámhosszon detektáltam fotosokszorozó (D104 Microscope
Photometer, PTI, South Brunswick, NJ, USA) segítségével. Az intracelluláris Ca2+-
tartalom változásait a két intenzitás-érték hányadosából képzett arány (F1/F2) mutatta
meg (Felix program, Gryenkiewicz et al., 1985).
Az NMDA-t (Sigma; 100 µM), AMPA-t (Tocris; 100 µM), ω-conotoxin-
MVIIC-t (Tocris 1 µM) és nifedipint (Tocris; 1 µM) mikrokapilláris segítségével
nitrogéngáz túlnyomással a sejtek közvetlen környezetébe injektáltam, míg a D,L AP5-t
(Tocris; 500 µM), KCl-t (20 mM) és GYKI52466-t (100 µM, Tarnawa Istvántól kapta a
munkacsoport) közvetlenül a mérőoldatba higítottam. Az NMDA-hatásokat 10 µM
glicin, az AMPA-hatásokat 10 µM ciklotiazid jelenlétében mértem. A mérések során
kiválasztottam a tenyészetből egy-egy sejtet és a fotosokszorozó nyílását leszűkítettem a
kiválasztott sejt sejttestére. Ha a hatóanyagokat (D,L AP5 és GYKI52466) a
mérőoldatba adagoltam, az adott mérés befejeztével a tenyészetet nem használtam
tovább. A mikrokapilláris segítségével bejuttatott nifedipin és conotoxin esetében egy-
egy tenyészedényből három sejtet regisztráltam egymástól távol eső területekről, és
ezután a tenyészetet további mérésre nem használtam.
50
VII. AZ EXTRACELLULÁRIS GLUTAMÁT KONCENTRÁCIÓJÁNAK
FLUORIMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA SEJTEK FOLYADÉK-
KÖRNYEZETÉBŐL
A méréseket a Semmelweis Egyetem Biokémiai Intézetében, Dr Tretter László
irányításával, Környei Zsuzsa segítségével végeztem. A tenyésztő-médium
glutaminsav-koncentrációjának meghatározásához három-három párhuzamosan kezelt
sejtkultúra felülúszóját használtam fel minden mérési időpontban. A tenyészetek
tápfolyadékából 650 µl mintát vettem és 1000 rpm mellett 10 percig centrifugáltam. A
sejtes törmeléktől mentesített felülúszókból 600 µl-t a mérésig -20 Co-on, lefagyasztva
tároltam. A mérés megkezdése előtt a felolvasztott mintákat szérummentes táppal
(MEM, 900 µl) dializált glutamát-dehidrogenáz enzimmel (40 µl GDH, 60 U/ml,
Sigma) és NADP+-al (30 µl, 1mM végkoncentráció, Reanal) 1570 µl -re egészítettem ki.
Az elegyet 20 percig sötétben inkubáltam, majd Perkin-Elmer LS-50
spektrofluoriméteren 350 nm hullámhosszú fénnyel történő gerjesztés mellett 460 nm-
en mértem a keletkezett NADPH fénykibocsátását. A fluoreszcencia-intezitás adatokból
a glutaminsav-tartalmat ismert koncentrációjú glutamát oldatokkal készített kalibrációs
sor alapján számoltam ki.
51
Primer
Pár Primer szekvencia Pozíció
(bp) Termék mérete (bp)
Forward 5´ctccttctgtggggccctcc3’ 1 GluR1 Reverse 5´cccaggatggcgttgaggcg3’
557-576 904-885 347 bp
Forward 5´cggcgtgtaatccttgactgc3’ 2 GluR2 Reverse 5´cctctgcttccgaagattgcg3’
815-835 1156-1136 341 bp
Forward 5´ccaggttctgaaacacctcc3’ 3 GluR4 Reverse 5´gtgtcattgcccagagtaggc3’
1023-1042 1387-1367 364 bp
Forward 5´gacaagagcatccacctgagcttcc3´ 4 GluRζ1 N1 Reverse 5´agcgtcgtcctcgcttgcagaaagg3´
481-505 777-753
297 bp (N1 nem tart.) 360 bp (N1 tart.)
Forward 5´tgtgtccctgtccatactcaag3´ 5 NR1 C1 Reverse 5´gtcgggctctgctctaccactc3´
2406-2427 2712-2693 307 bp
Forward 5´atgcccctgccaccctcacttttg3´ 6 NR1 C2, C1 Reverse 5´gcagctggccctcctccctctca3´
2501-2524 2881-2859
381bp (C1 and C2 tart.) 270bp (C2 tart.)
Forward 5´ggagaagggtactccagcgctgaac3´ 81-105 7 NR2A Reverse 5´agtctgtgaggagataaaatccagc3´ 360-335 280 bp
Forward 5´gcaagcttctgtcatgctcaacatc3´ 456-480 8 NR2B Reverse 5´gctctgcagcttcttcagctgattc3´ 675-651 220 bp
Forward 5´actccttggtgcttgggcagg3´ 811-831 9 NR2C Reverse 5´cagcacctgcagctgctgctc3´ 1231-1211 421 bp
Forward 5´cttggctcctccacagagcaacagc3´ 481-505 10 NR2D Reverse 5´cctcttctgccgcccggaaaacagg3´ 778-754 298 bp
Forward 5´tgatgacatcaagaaggtggtgaag3´ 805-829 11 GAPDH Reverse 5´tccttggaggccatgtaggccat3´ 1044-1022 240 bp
Forward 5’gctggaaggcatggaaggtttta3’ 438-461 12 embGAD Reverse 5’tgagccccatcaccgtagca3’ 662-682 244 bp
Forward 5’gatacttggtgtggcgtagccc3’ 85-107 13 GAD67 Reverse 5’acgggtgcaatttcatatgtgaacata3’ 633-660 575 bp
Forward 5’ggctctggcttttggtccttc3’ 13-32 14 GAD65 Reverse 5’tgccaattcccaattatactcttga3’ 426-450 438 bp
Forward 5’agctgagagggaaatcgtgc3’ 569-588 15 aktin Reverse 5’gatggaggggccggactcat3’ 1048-1067 498 bp
Forward 5’ccaagcccggagcctaacgc3’ 263-282 16 GluR6 Reverse 5’ccagccaccccaagagacag3’ 621-640 337 bp
Forward 5’cacggagccccccaagctgc3’ 410-429 17 KA1 Reverse 5’cagccgtcacttgccagttc3’ 777-786 348 bp
Forward 5’gcccagtggactgccctctc3’ 142-161 18 KA2 Reverse 5’ccactctggccttggctggg3’ 480-498 317 bp
2. táblázat
Az RT-PCR vizsgálatok során felhasznált primerek szekvenciája, elhelyezkedésük a
vonatkozó cDNS-n és az általuk közrefogott szakasz hossza.
52
Ellenanyag IgG típus Forrás Higítás Felhasználásanti-nesztin egér IgG Pharmingen 1/1000 IC anti-N-tubulin egér IgG P. Dráber 1/1000 IC, ELISA anti-MAP2 egér IgG Sigma 1/1000 IC anti-NFM egér IgG Sigma 1/500 IC anti-NFH egér IgG Sigma 1/500 IC anti-synapsin I egér IgG Chemicon 1/500 IC anti-GFAP egér IgG Sigma 1/1000 IC anti-NR1 egér IgG Pharmingen 1/500 IC anti-NR1 nyúl IgG Chemicon 0.5 µg/ml WB anti-NR1 K21322 nyúl IgG M Herkert 1/100 IC anti-NR1 egér IgG M. Watanabe 1 µg/ml WB anti-NR2A nyúl IgG Upstate Biotechnology 1 µg/ml WB anti-NR2A egér IgG M. Watanabe 1 µg/ml WB anti-NR2B egér IgG Transduction Laboratories 1 µg/ml WB anti-NR2B K83084 nyúl IgG M Herkert 1/500 IC anti-panGAD 6799 nyúl IgG Z. Katarova 1/1000 IC, WB anti-GAD25 8876 nyúl IgG G. Szabó 1/1000 IC, WB anti-GAD44 8877 nyúl IgG G. Szabó 1/100 IC anti GAD65 GAD6 egér IgG Hibridóma Bank 1/500 WB anti GAD65 N65 nyúl IgG M. Solimena 1/500 IC anti-GABA nyúl IgG Sigma 1/1000 IC 3. táblázat
Az immuncitokémiai (IC), in situ ELISA és Western blot (WB) vizsgálatok során felhasznált ellenanyagok specifikációja és az alkalmazott ellenanyag-higítások.
53
I. Az NE-7C2 sejtvonal jellemzése
I./1 Az p53 -/- NE-7C2 sejtvonal kromoszóma-készletének változása a sejtvonal
immortalizációja során
Az NE-7C2 neuroektodermális sejtvonal p53-hiányos (Livingstone et al., 1992),
transzgenikus, 9 napos egér embrió elő- és középagyhólyagból kiültetett primer
tenyészetből nyert 1-sejt eredetű klón (Schlett and Madarász, 1997). A primer idegi
tenyészetben a tenyésztés 4. hetében megjelenő proliferáló gócok izolálásával NE9
„master” sejttenyészet, majd a „master” tenyészetben kialakuló, neurális sejtadhéziós
(N-CAM) fehérjét expresszáló epiteloid sejtcsoportokból egy-sejt klónozássa E9
vonalakat állított elő Dr Madarász Emília. Ezekből másodlagos klónozással Dr Schlett
Katalin több sejtvonalat (NE-4C, NE-7C2) hozott létre. A sejtvonalak külső onkogént
nem hordoznak, spontán immortalizációjuk a funkcionális p53 fehérje hiányában
következett be. Mivel a p53 fehérje fontos szerepet játszik a genetikai állomány
integritásának megőrzésében, megvizsgáltuk a sejtek kromoszóma-állományának
feltételezett ingadozásait az NE-7C2 p53-/- sejtvonal folyamatos fenntartása során.
A tenyészeteket a növekedés log-fázisában kolcemiddel kezeltem (10-7 M) 1.5
órán keresztül. A kolcemid a magorsó fonalak épülését megakadályozva gátolja a
kromoszómák két utódsejtbe való szétvándorlását, így a mitózis gátlásával egyrészt
felszaporodnak a metafázisban lévő sejtek, másrészt a kondenzálódott kromoszómák a
sejtmembránon belül maradnak. A kolcemid kezelést követően a sejtek duzzasztásával
izoláltam és fellazítottam a sejtmagokat, majd a kiszabaduló kromoszómákat Giemsa-
festéssel tettem láthatóvá („Anyag és Módszer” fejezet). Az NE-7C2 sejtvonal
kromoszómaszám-változásait 60 passzázs, azaz kb. 300 sejtduplikációs ciklus során
követtem. A vizsgált passzázsokból 50-50 sejtben számoltam meg a kromoszómákat és
grafikusan ábrázoltam a kromoszómaszámok megoszlását a vizsgált sejtpopulációban
(7. ábra). Meghatároztam a kromoszómaszámok súlyozott átlagát is vizsgált
passzázsokban az “Anyag és Módszer” fejezetben leírtak alapján (8. ábra).
54
55
A p53-hiányos, 9 napos egér embrió agyhólyagjából kiültetett primer tenyészetből 3
átültetés után nyert (NE9m) „master” vonalban a sejtek nagy része az egérre jellemző
40-es kromoszómaszámmal rendelkezett (7. ábra). Megfigyelhető azonban, hogy a
sejtek egy kisebb hányada az eredeti kromoszómakészlet kétszeresének megfelelő
kromoszómaszámmal jellemezhető. Az NE9m tenyészetből klónozással nyert E9
tenyészetben jelentősen megnőtt a kétszeres kromoszómaszámú sejtek állománya és
igen kis százalékban hexaploid kromoszóma-állományú sejtek is kimutathatók voltak
(7. ábra). A primer tenyészetben megjelenő proliferáló sejtek többsége, amelyek a
sorozatos átültetések során elszaporodtak, tehát a kétszeres kromoszómaszámmal
rendelkeztek.
A sejtvonal fenntartása során a kromoszómaszám a korai passzázsokban (10p - 35p)
a 70-es érték körül ingadozott. Az első 35 passzázs alatt (150 sejtosztódás) a
kromoszómaszám a kezdeti 70-es értékről fokozatosan csökkent. A kromoszómaszám
súlyozott átlagának vizsgálata alapján megállapítottam, hogy a sejtek kromoszóma-
készlete a sejtosztódások számával nem lineárisan csökken, hanem egy adott érték, a 60
kromoszóma felé tart (8. ábra). A különböző passzázsokból nyert kromoszóma-
preparátumokban folyamatosan jelen voltak 3x kromoszómaszámmal rendelkező sejtek
is (7. ábra), bár csak kis százalékát adták a teljes populációnak.
A diploid egér kromoszómaszámtól eltérő genom-méretű sejtek elszaporodása
jól mutatja, hogy a p53 fehérje fontos szerepet játszik a genom stabilitásának
fenntartásában. Hiányában megnő a rendellenes kromoszómaszámú sejtek aránya. A
megfigyelés azt is jelzi, hogy bizonyos többlet kromoszómával rendelkező sejtek
szelektív előnnyel rendelkezhetnek társaikkal szemben. Hasonló
kromoszómaduplikációs és kromoszómavesztési tendenciát mutatott egy másik p53-/-
sejtvonal is (NE-4C; Varju P., 1997; szakdolgozat), ahol a duplikált
kromoszómakészlettel rendelkező sejtek a sejtvonal fenntartása során fokozatosan
elveszítették a kromoszómaállomány egy részét és a sejtek kromoszómakészlete a 60-s
érték körül stabilizálódott. Az NE-4C és NE-7C2 esetében a szelektív előnyt biztosító
kromoszómaszám 1.5 x haladta meg a normál sejtek kromoszómaszámát (n=40).
A kromoszóma-készlet vizsgálata tehát megmutatta, hogy a sejtek kromoszóma-
készlete a p53 fehérje hiányában a „normálistól” eltérő értéket mutat, amely azonban
stabilizálódik a sejtvonal fenntartása során.
56
57
I./2 Az NE-7C2 sejtvonal progenitor sajátságainak meghatározása
Az NE-7C2 sejtvonal sejtjei 10% FCS-t tartalmazó tápoldatban epitél jellegű
sejtek monolayer tenyészeteként nőnek (9. A ábra). Növekedésük letapadásfüggő,
szaporodásuk mértéke a sejtszám növekedésével csökken (kontakt gátlás
mechanizmusa). A folytonosan osztódó sejtek a neurális progenitorok jellegzetes
marker fehérjéjét, az intermedier filamentum fehérjék családjába tartozó nesztint
expresszálják (9. B ábra). A sejtvonal sejtjei nagy sejtsűrűség mellett, kis gyakorisággal
spontán is képesek idegsejtté differenciálódni (kb. 1000 sejtből 1). A spontán
differenciálódott sejtek kisméretű sejttesttel és általában egy, el nem ágazó nyúlvánnyal
jellemezhetők (9. C ábra).
Asztroglia irányú sejtdifferenciációt indukálatlan tenyészetekben nem
tapasztaltunk.
A neurális progenitorsejtek idegi irányú differenciációját növekedési faktorok és
vitamin-származákok egyaránt elősegíthetik. Korábbi kutatási eredmények azt mutatták,
hogy a PCC7 (Pfeiffer et al., 1981; Imrik and Madarász, 1991), P19 (Jones-Villeneuve
et al., 1982) és NTera-2 (Damjanov et al., 1984) embrionális teratokarcinóma
sejtvonalak retinsav adására idegi irányban differenciálódnak. A laboratóriumunkban
már korábban jellemzett p53-/- sejtvonal, az NE-4C, ATRA hatására szintén
nagymértékű neuronális differenciációt mutatott (Schlett and Madarász, 1997). Az
irodalmi adatok és saját eredményeink alapján az NE-7C2 sejtvonalon a növekedési
faktorok közül az NGF, EGF, IGF-1 valamint az A-vitamin származék ATRA
neuronális differenciációt indukáló hatását vizsgáltam meg. A növekedési faktorok (1-
20 ng/ml) és az ATRA alkalmazott koncentrációit irodalmi adatok és saját
eredményeink alapján állapítottam meg. A neuronális differenciáció során az idegi
irányban elkötelezett sejteket N-tubulin tartalmuk alapján immuncitokémiával
azonosítottam és mennyiségüket in situ ELISA módszerrel határoztam meg a kezelések
7. napján. Az NE-7C2 sejtvonal sejtjeit a vizsgált növekedési faktorok nem késztették
idegi irányú differenciálódásra. ATRA 10-8 – 5x10-6 M koncentrációja növekvő mértékű
neuronális differenciációt indukált (10. ábra). A legmagasabb koncentráció esetében a
sejtek mintegy 50%-a idegsejtté fejlődött. Az NE-7C2 sejteket a továbbiakban 10-6 M
végkoncentrációjú retinsavval indukáltam, mivel ez a
58
59
koncentráció már igen jelentős differenciációt váltott ki, de még nem járt jelentős
mértékű sejtpusztulással.
ATRA 10-6 M koncentrációjának hatására az NE-7C2 sejtek jól meghatározott,
reprodukálható lépéseken keresztül differenciálódnak morfológiailag fejlett
idegsejtekké. Az első N-tubulin immunreaktív idegsejtek az ATRA-indukció 2. napján
jelennek meg a differenciálatlan sejtek tetején, általában csepp alakú sejttesttel és egy
rövid nyúlvánnyal jellemezhetők (11. A ábra). Az indukció 4. napjára a neuronok száma
jelentősen megemelkedik, a nyúlványok száma megnő és elágazásokat alakítanak ki
(11. B ábra). Az indukció 6. napjára a neuronális sejttestek kompakt aggregátumokba
tömörülnek és a nyúlványok kötegelődve hagyják el az aggregátumok területét (11. C
ábra). Az indukció 10. napjára szinte minden neuronális sejttest aggregátumba ágyazott
és közöttük a kapcsolatot nyúlványkötegek biztosítják (11. D ábra).
A neuronális differenciáció során jellegzetes módon változik a köztes
filamentum rendszer is. Az in vivo csak neuronokra jellemző neurofilamentum fehérjék
közül az NFL és NFM (12. A ábra) formákat sikerült kimutatnom az indukció 4.
napjától kezdve. Az immunpozitív sejtek száma fokozatosan nőtt a neuronális fejlődés
előrehaladtával. Az NFH jelenlétét csak az indukció második hetében tudtam detektálni
(12. B ábra) a sejttestekben és a nyúlványokban, illetve a nyúlványok növekedési
kúpjaiban (12. B ábra inszert). A köztes filamentum rendszer mellett a mikrotubuláris-
rendszer összetétele is változott a neuronális differenciáció során. Az N-tubulin, amely a
progenitorok utolsó osztódása után már jelen van, a posztmitótikus neuronok teljes
élettartama során kimutatható (11. ábra). A mikrotubulus-asszociált fehérjék közül a
Map2, melyet in vivo főleg dendritekben és sejttestekben sikerült kimutatni, az NE-7C2
sejtek indukciójának 6. napjától detektálható (12. C ábra).
Az indukció 8. napjától a morfológiailag fejlett neuronok teljes citoplazmájában
kimutatható a szinapszin-I (12. D ábra) és a szinaptofizin (12. E ábra), a preszinapszisok
működésében fontos fehérjék. Jelenlétük arra utal, hogy a sejtek közötti szinaptikus
kommunikáció kialakításában szerepet játszó komponensek szintézise is megindul a
tenyészetekben.
60
Az ATRA-indukció során megjelenik az idegszövet másik jellemző sejttípusa,
az asztroglia is (12. F ábra). Az első asztroglia típusú sejtek az indukció 10. napjától
61
62
azonosíthatók GFAP tartalmuk alapján. Számuk folyamatosan nő az indukció
előrehaladtával. Az asztrogliasejtek nem egyenletes eloszlásban jelentkeznek a
tenyészetekben, hanem szigetszerű kis csoportokban helyezkednek el. A GFAP
immunpozitív sejtek a neuronális gócok belsejében mutathatók ki először, majd
megjelennek az idegsejt-aggregátumok körül is. A megfigyelés arra utal, hogy az
asztroglia irányú differenciációhoz neuronok által szekretált faktorok jelenlétére lehet
szükség.
Immuncitokémiai módszerekkel az oligodendroglia sejtek által expresszált
fehérjék közül sem a galaktocerebrozid, sem a mielin bázikus fehérje jelenlétét nem
sikerült kimutatni hosszú – 10-30 napos – indukció során sem. Annak igazolására, hogy
az oligodendroglia sejtek valóban nem jelennek meg az NE-7C2 sejtek ATRA-
indukciója során, mindkét ellenanyaggal párhuzamosan festettünk primer gliális
tenyészeteket is, ahol pozitívan festődő oligodendroglia sejteket sikerült azonosítani.
Korábbi tanulmányok a P19 sejtvonalon igazolták, hogy retinsav meghatározott
koncentrációja mellet izomsejtek fejlődése indukálható (Manabe and Owens, 2001).
ATRA különböző koncentrációi mellett megvizsgáltam simaizom-specifikus α-actin
jelenlétét a tenyészetekben immuncitokémiai módszerrel. Sem morfológiai, sem
immuncitokémiai evidenciát nem találtam simaizom-sejtek differenciálódására a
tenyészetekben.
Az NE-7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise jól reprodukálja az in vivo
megfigyelt idegi sejtdifferenciálódás morfológiai jelenségeit. A továbbiakban a
tenyészetben lejátszódó idegsejt-képzést modellként használtam az idegi
sejtdifferenciáció során bekövetkező változások tanulmányozására és a biokémiai /
molekuláris biológiai jelenségek és sejtmorfológiai változások közötti korreláció
megállapítására.
63
II. Ionotrop glutamát receptorok szabályozott időbeli megjelenése az in vitro
neurogenezis során
II./1 NMDA-vezérelt glutamát receptorok kimutatása NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során
II./1.1 NMDA receptor alegységek expressziója NE-7C2 sejtekben
NE-7C2 sejtek neuronális differenciációja során vizsgáltuk az NMDA-vezérelt
ioncsatorna alegységeinek expresszióját. A Stuttgarti Egyetem Sejt és Immunbiológiai
Tanszékével kollaborációban Dr Schlett Katalin szemikvantitatív RT-PCR vizsgálatokat
végezett el az általam küldött RNS-mintákból.. A polimeráz láncreakciókban felhasznált
primereket a 2. táblázat tartalmazza. Vizsgáltuk az NR1 alegység különböző splice-
variánsainak (ábra) valamint az NR2A, NR2B, NR2C és NR2D alegységek
megjelenését és a transzkripció változásait az indukált neurogenezis során. A
transzkriptumok relatív expressziós szintjének meghatározásához belső viszonyítási
alapként a GAPDH (glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz) mRNS 30 cikluson
keresztül amplifikált mennyisége szolgált.
Az NR1 alegység három olyan kazettát tartalmaz (N1, C1 és C2), amelynek a
kódoló exonjai az mRNS érése során kivágódhatnak a transzkriptumból (13. ábra). Ez a
folyamat az alternatív exon-használat, melynek eredményeként egy génről többféle
funkcionális fehérje keletkezhet. Hogy meghatározható legyen, hogy az NR1 alegység
mely variánsainak mRNS-e van jelen, a stuttgarti intézetben három primer párt (2.
táblázat; 4., 5. és 6. primer párok) terveztek a transzkriptum 5’ ill. 3’ végeire. A 4-es
primer pár az N1 kazettát (5. exon) határoló szekvenciát ismeri fel (13. ábra). Abban az
esetben, ha az exon bennmarad az érett mRNS-ben, egy 360 bp hosszúságú terméket
kapunk a PCR reakció eredményeként, ha azonban kivágódik, a termék mérete 297 bp
lesz. Az 5. primer pár (13. ábra) „sense” tagja a C1 kazettát (21. exon) határoló
szakaszra specifikus, míg „antisense” tagja a C1 kazettán belüli szekvenciát köti meg.
Így csak akkor keletkezik termék, ha a 21. exon bennmarad az érett mRNS-ben. A 6.
primer pár (2. táblázat, 13. ábra) egyik tagja a 21. exon 5’ határoló régióját ismeri fel, a
másik tagja a C2 kazettára (22. exon) specifikus. Amennyiben a 21. és a 22. exon is
bekerül az érett mRNS-be, a termék mérete 381 bp lesz. Ha az érett mRNS csak a 22.
exont tartalmazza,
64
65
270 bp hosszúságú terméket fogunk kapni. Abban az esetben, ha a 22. exont kivágódik
az RNS-ből, PCR termék nem keletkezik. A 22. exont kivágódása során az exon végén
található STOP szignál is kivágódik, így a transzláció során a riboszóma továbbhalad és
átírja a C2’ szekvenciát, amelynek a végén egy újabb STOP szignál helyezkedik el. Az
NR1 variánsok megnevezését Hollmann által megalapított nevezéktan (Hollmann et al.,
1993) alapján használom a dolgozat során (1. táblázat).
Az NR2A, B, C és D alegységek génjeiről csak egyfajta kódoló mRNS
keletkezik, így a 7-10. primer párok esetében egyfajta PCR termék szaporodik fel.
Az indukálatlan sejtek sokféle NR1 variánst expresszáltak. A transzkriptumok
jelentős része tartalmazta mind a C1, mind a C2 kazettát, de az N1 kazettát nem (14.
ábra, NR1-1a splice-forma). A csak C1-t vagy csak C2-t tartalmazó mRNS-ek szintén
expresszálódtak, de lényegesen alacsonyabb szinten (14. ábra, NR1-2a, -3a variánsok).
ATRA-indukálta neurogenezis során fokozatosan emelkedett az NR1 transzkriptum
összmennyisége, és az indukció 7. napjától N1 kazettát is tartalmazó mRNS formákat is
sikerült kimutatni (14. ábra, NR1-b variánsok). Az indukció korai szakaszában (0-4
napig) az NE-7C2 sejtek főleg olyan NR1 mRNS-t expresszáltak, amely tartalmazta
mind a C1, mind a C2 doméneket. Az indukció előrehaladtával megemelkedett azoknak
az mRNS-eknek a mennyisége is, amelyek csak az egyik - vagy a C1 vagy a C2 - exon
kazettát tartalmazták. A morfológiailag jól fejlett idegsejtek (indukció 10. napja)
minden NR1 splice-variánst expresszáltak.
Az NR2 alegységek közül az NR2A és NR2D alegységek transzkriptumait már
indukálatlan NE-7C2 sejtek is expresszálták. E két transzkriptum mennyisége a
neuronális differenciáció során az alapszinthez képest nem változott nagymértékben. Az
NR2B alegységet kódoló mRNS szinte alig volt detektálható az indukálatlan mintában
és az indukció korai szakaszában (0-4. napig, 14. ábra). Az indukció második hetében a
transzkriptum mennyisége nagymértékben nőtt (14. ábra). Az NR2C alegység nem volt
kimutatható sem a proliferáló, sem a neuronális irányban differenciálódó sejtek
tenyészeteiből (14. ábra).
66
67
Az mRNS-vizsgálatok azt mutatták, hogy az NE-7C2 in vitro neurogenezis során
elsősorban az NR1 mennyisége és variánsainak száma, valamint az NR2B
transzkriptum mennyisége nő.
II./1.2 NMDA receptor alegységek fehérjeformáinak kimutatása Western blot és immuncitokémia segítségével
Hogy meghatározzam, hogy az indukció egyes szakaszaiban mely alegységek
fehérjeformái fordítódnak le, továbbá hogy képet kapjak az egyes fehérjeformák sejten
belüli elhelyezkedéséről, szubcelluláris frakciókat (durva-membrán és citoplazma
preparátumokat) készítettem és azokban Western blot segítségével mutattam ki a
vizsgált NMDA receptor alegység fehérjeformákat.
Az NR1 alegység különböző variánsainak kimutatására kétféle ellenanyagot
használtam: pan-NR1 (Watanabe et al., 1998, 15. ábra) amely a fehérje N-terminálisán
elhelyezkedő, minden splice variánsban megtalálható 4. – 51. aminosavakat ismeri fel;
C2-NR1 (Chemicon) amely a C2 kazetta aminosav szekvenciájára specifikus (891. –
920. aminosavak, 15. ábra). Pozitív kontrollként felnőtt egér előagyból (EA) készített
homogenátumot vittem fel a gélekre.
A pan-NR1 ellenanyag a citoplazma és durva-membrán frakciókban egy 116 kD
méretű sávot festett mind az indukált, mind az indukálatlan mintákban (15. ábra). A
durva-membrán frakcióban egy kisebb molekulatömegű csík is azonosítható volt, mely
az előagyi mintában szintén festődött. A kettős csík arra utal, hogy legalább kétféle NR1
splice-forma van jelen NE-7C2 sejtekben, de nem kizárható a fehérje degradációja sem.
A C2-NR1 ellenanyag segítségével C2 kazettát tartalmazó fehérjeformát sikerült
kimutatni a citoplazma frakciókból az indukció minden stádiumában, és az indukálatlan
tenyészetek citoplazma és durva-membrán frakcióiban is (15. ábra). A citoplazma
frakcióban a fehérje mennyisége az indukció előrehaladtával csökkent.
Az NR2B alegységet a C-terminális 892. – 1051. aminosav-szekvenciát
felismerő ellenanyaggal (BD Transduction Laboratories) csak az indukció 10. napján
sikerült kimutatnom, akkor is csak a durva-membrán frakcióból (15. ábra). A fehérje kb.
180 kD-
68
69
nak megfelelő csíkot adott, ami az egér agyban megállapított 175 kD molekulatömeggel
jó egyezést mutat.
Az NR2A alegységet két, a fehérje C-terminális részére specifikus ellenanyag
(Upstate Biotechnology, Watanabe NR2A-C, Watanabe et al., 1998) segítségével is
megpróbáltam kimutatni. Mivel az Upstate Biotechnology által gyártott ellenanyag
érzékenyebbnek bizonyult, az ábrákon az ezzel kapott eredmények szerepelnek. Annak
ellenére, hogy a kódoló RNS jelentős mennyiségben expresszálódott (14. ábra), az
NR2A alegység fehérjét 10 µg fehérjemennyiségből - ami többi alegység kimutatására
elegendő volt – nem sikerült megbízhatóan kimutatnom (15. ábra) egyik ellenanyaggal
sem. Az előagyi mintából ugyanakkor az ellenanyagok egy 170 kD molekulatömegű
fehérjét festettek meg, amely megfelel a már korábban megállapított
molekulatömegnek. 60 µg fehérje futtatása után mindkét ellenanyag két csíkot festett
(15. ábra) a citoplazmás frakciók mindegyikében. A durva-membrán frakcióban az
indukció 6. és 10. napján két halványan festődő csík jelent meg, melyek valamivel
kisebb molekulatömegűek voltak, mint az előagyból kimutatott fehérje. Az eredmények
arra utalnak, hogy a fehérje degradálódik, vagy éretlen, poszttranszlációs
módosításoktól mentes formában van jelen NE-7C2 sejtekben.
Az NR2C alegységet kódoló mRNS-t nem tudtam kimutatni, így erre a fehérjére
Western blot analízist sem végeztem. Az NR2D alegységre specifikus ellenanyag a
kísérletek elvégzése idején nem volt kereskedelmi forgalomban, ezért ezt az alegységet
fehérjeszinten nem tudtam vizsgálni.
A Western blot analízist követően az NMDA receptor alegységek sejten belüli
eloszlását immuncitokémiai festéssel próbáltam meghatározni. Az NR1 alegység
sejtszintű lokalizációjának kimutatására egy poliklonális (K21322, Herkert et al., 1998)
és egy monoklonális (660. – 811. aminosav-szekvencia; Pharmingen) ellenanyagot
használtam. Mindkét ellenanyag a fehérje összes variánsát felismeri és a fehérje
extracellulárisan elhelyezkedő részleteire - az első TM domént megelőző szakasz ill. a
III. és IV TM domén közötti extracelluláris hurok régió - specifikus. Amennyiben a
sejtek membránját átjárhatóvá tettem TritonX-100-al, a sejten belül elhelyezkedő NR1
fehérjét is láthatóvá tudtam tenni. Ha a sejteket nem permeabilizáltam, akkor elsősorban
a
70
71
membránba kihorgonyzott receptor alegységek festődtek. Mindkét ellenanyag ugyanazt
a festődési mintázatot mutatta, de a festés erősebb volt a K21322 szérummal. A 16.
ábrán (A, B és C) a K21322 ellenanyaggal festett sejtek felvételei szerepelnek. Annak
ellenére, hogy Western blot segítségével a fehérje kimutatható volt már az indukálatlan
tenyészetekben ill. az indukció korai szakaszában is, indukálatlan tenyészetekben nem
sikerült specifikus festést bizonyítanom sem sejten belül, sem a sejtek felszínén. Az
első. háttérből kiváló - festődő idegsejtek az indukció 5. napján jelentek meg és számuk
folyamatosan nőtt az indukció előrehaladtával. Az ATRA-kezelés 8. napjától szinte
minden nyúlványos sejt festődött a nem-permeabilizált tenyészetekben (16. A, B ábra).
A festődés igen erős volt a sejttesten és a nyúlványok proximális régiójában (16. B
ábra). Ezekben a tenyészetekben az aljzatsejtek nem festődtek. Ha a tenyészeteket
permeabilizáltam, a neuronok mellett egyes kiterült, lapos aljzatsejtekben is erős
festődés jelentkezett (16. C ábra). A festődés mintázata alapján arra következtettünk,
hogy a fehérje intracelluláris vezikulákban található.
Az NR2A alegység a Western blot kísérletek alapján igen alacsony szinten van
jelen. A rendelkezésemre álló kétféle ellenanyag a fehérje C-terminális, intracellulárisan
elhelyezkedő régiójára specifikus, így a festéseket permeabilizált tenyészeteken
végeztem el. Háttér feletti festődést egyik ellenanyaggal sem kaptam (ábra nem szerepel
róla).
Az NR2B fehérjét olyan poliklonális szérummal (K83084, Herkert et al., 1998)
tettem láthatóvá, mely a fehérje extracellulárisan elhelyezkedő N-terminális 439. – 453.
aminosavaira specifikus. Immunjelölt sejteket az indukció 8. napjától sikerült
azonosítani (16. D ábra). A festődés igen erős volt a sejtmag körül ill. a nyúlványok
kezdeti szakaszain (16. E ábra).
Az NR2D alegységre specifikus ellenanyag nem állt rendelkezésünkre a
kísérletek elvégzése idején, így a fehérje sejten belüli lokalizációját nem vizsgáltam.
II./1.3 Funkcionális NMDA-csatornák megjelenése NE-7C2 sejtek indukált
neurogenezise során
A funkcionális NMDA-csatornák megjelenését NE-7C2 sejtek
plazmamembránjában az NMDA hatására bekövetkező [Ca2+]IC változásainak
72
73
detektálásával követtem nyomon Fura-2 mikrofluorimetriával. A sejtmembránon
átdiffundáló Fura2/AM Ca2+-indikátort az intracelluláris észteráz enzimek membrán-
impermeábilis formává alakítják át, így a töltési idő elteltével az inkubáló-médiumban
maradt felesleges festéket eltávolítva (3x mosás pufferrel) kizárólag a sejten belül
csapdába esett Fura-2 fluoreszcenciáját mérjük. Az [Ca2+]IC változásait úgy számoltam
ki, hogy az NMDA adása előtti szintet 100%-nak vettem és megállapítottam, hogy
NMDA hatására hány százalékkal emelkedett meg az [Ca2+]IC az alapszinthez
viszonyítva. Az NMDA alkalmazott koncentrációját dózishatás görbe (17. ábra) alapján
állapítottam meg.
Indukálatlan tenyészetek sejtjeiben 100 µm NMDA hatására az [Ca2+]IC nem
változott (18. A ábra). Az indukció korai szakaszában (3. nap) a sejtek szintén nem
adtak NMDA-indukálta Ca2+-választ (18. A ábra). A neurogenezis első hetének végére
jelentek meg az első olyan sejtek, melyek NMDA adására az [Ca2+]IC megemelésével
válaszoltak (18. A ábra). Az NMDA-reszponzív sejtek neuronális morfológiával
rendelkeztek, az aljzaton elhelyezkedő nem-neurális sejtek NMDA-specifikus Ca2+-
szint emelkedést nem mutattak. Az indukció 6 - 8 napja között a nyúlványos sejtek
közül kevés válaszolt NMDA adására, az indukció 10. napjától kezdve azonban minden
neuronális morfológiájú sejt szignifikáns [Ca2+]IC emelkedéssel válaszolt NMDA-ra (18.
A ábra). Ha a sejteket az NMDA-receptorok kompetitív antagonistájával inkubáltam
(DL AP5), az NMDA kiváltotta [Ca2+]IC-szint emelkedés elmaradt (18. B ábra).
Az NMDA-kiváltotta választ nagymértékben meghatározza a mérőoldat
összetétele (Monyer et al., 1994; Mayer, 1998). 2 mM extracelluláris Mg2+ jelenlétében
a neuronok csak 20 mM KCl jelenlétében mutattak NMDA-specifikus [Ca2+]IC
emelkedést (19. A ábra). 20 mM KCl önmagában kismértékben megemelte a sejtek
nyugalmi Ca-szintjét, de a jellegzetes Ca-csúcs elmaradt. Mg2+-mentes közegben
viszont az NMDA képes volt kiváltani a [Ca2+]IC-szint megemelkedését depolarizáció
nélkül is (19. B ábra). Az ábrákon az NMDA-kiváltotta válaszokat a Ca++-kötött és
szabad Fura-2 arányaként adtam meg és a tényleges Ca++-koncentráció változásokat
nem számoltam ki.
Az [Ca2+]IC emelkedéséért az NMDA receptorok aktiválása mellett a VDCC
csatornák is felelősek lehetnek. Az NMDA-csatornákon beáramló Ca2+-ionok a
sejtmembrán depolarizációját okozhatják, amely aktiválhatja a sejtmembránban
74
75
76
elhelyezkedő VDCC-kat. Depolarizációt előidézhetünk mesterségesen is, az
extracelluláris K+ koncentráció megemelésével. Egy testvér sejtvonalon (NE-4C)
végzett elektrofiziológiai mérések (Herberth et al., 2002) megmutatták, hogy 30 mM
KCl jelenlétében az indukálatlan sejtek membránpotenciálja a Nerst egyenletnek
megfelelően változik. Indukálatlan tenyészetben az NE-7C2 sejtek 30 mM KCl adására
nem mutattak [Ca2+]IC emelkedést (20. A ábra). Az indukció során a differenciálódó
neuronok az indukció 7. napjától már válaszoltak KCl-ra, majd az indukció második
hetének végére jelentős [Ca2+]IC változással reagáltak a KCl adásra (20. B ábra). A
VDCC egyik típusa, az L-típusú Ca2+-csatorna (Catteral and Striessnig, 1992)
nifedipinnel, míg a főleg neuronális típusú N-, P- és Q-csatornák ω-conotoxin MVIIC-
vel blokkolhatók (Sather et al., 1993). Hogy megállapíthassam, hogy az NMDA-
kiváltotta [Ca2+]IC növekedést mennyiben okozhatta a különböző VDCC-k aktivációja,
az NMDA kiváltotta sejtválaszokat nifedipin és ω-conotoxin - irodalmi adatok alapján
meghatározott koncentrációinak – jelenlétében is mértem. Az ábrákon a Ca2+-beáramlás
mértékét a Ca2+-kötött és szabad Fura-2 emissziós hányadosaként adtam meg (F1/F2). A
nifedipin hatását 12 napig indukált NE-7C2 neuronokon vizsgáltam, a görbe 8 neuron
válaszának átlagát mutatja nifedipin jelenlétében és hiányában, Mg2+-mentes közegben.
Az NMDA kiváltotta [Ca2+]IC-szint emelkedést a nifedipin (1 µM) kb. 40%-al
csökkentette (21. A ábra). Az ω-conotoxin (1 µM) ennél kisebb mértékű, kb. 10%-os
csökkenést okozott az NMDA-kiváltotta Ca2+-válaszokban (21. B ábra). Ebből arra
következtettem, hogy az NMDA-csatornán át beáramló Ca2+-ionok mellett a
depolarizáció által aktivált VDCC-kon át beáramló Ca2+-ionok tovább emelik az
[Ca2+]IC szintet.
77
78
II./2 AMPA receptorok kimutatása NE-7C2 sejtekben és szerepük a
neuronális differenciáció korai szakaszában
II./2.1 AMPA receptor alegységek expressziós mintázata NE-7C2 sejtek
idegi irányú differenciációja során
Az AMPA receptor alegységek expresszióját - a Stuttgarti Egyetem Sejt és
Immunbiológiai Tanszékével végzett kollaborációs munka keretében Dr Schlett
Katalinnal, szemikvantitatív RT-PCR módszer segítségével vizsgáltuk az NE-7C2
sejtek in vitro indukált neurogenezise során. Az AMPA-típusú ionotróp glutamát
receptorok 4 alegységét kódoló gének (GluR1-4) közül a kísérletek végzése idején
három egér gén (GluR1, 2 és 4) szekvenciája volt ismert (NM_008165, NM_013540,
NM_019691). Az adatok hiányában a GluR3 alegység expresszióját nem tudtuk
vizsgálni.
Indukálatlan tenyészetekben (K) a három vizsgált alegység közül csak a GluR4
alegység expresszálódott (22. ábra). Az alegység mRNS szintje gyakorlatilag
változatlan maradt a retinsav- indukció teljes időtartama alatt, csak az indukció 10.
napján látszott kismértékű emelkedés a transzkriptum mennyiségében (22. ábra). A
GluR2 alegység transzkriptum az indukció 3. napjától volt detektálható és az mRNS
szintje folyamatosan emelkedett az indukció előrehaladtával (22. ábra). A GluR1
alegység az indukció 2.-4. napján igen alacsony szinten expresszálódott, az indukció
előrehaladtával azonban a transzkriptum mennyisége nagymértékben emelkedett és az
indukció 7. napjától már jelentős mennyiséget ért el (22. ábra).
II./2.2 Funkcionális AMPA-csatornák kimutatása NE-7C2 sejtek fejlődési
stádiumaiban
A funkcionális AMPA-csatornák jelenlétét NE-7C2 sejtek sejtfelszíni
membránjában az intracelluláris Ca2+-szint AMPA hatására bekövetkező változásának
detektálásával követtem nyomon Fura-2 mikrofluorimetriával. Az AMPA receptorok
Ca-permeabilitását a receptorok alegység-összetétele szabályozza. A GluR1, 3 és 4
79
80
alegységekből felépülő AMPA-csatornák nagymértékű Ca2+ ion áteresztő-képességgel
jellemezhetők (Bleakman and Lodge, 1998), míg a GluR2 alegység editált formájának
beépülése eltolja a receptor szelektivitását az egyértékű kationok irányába (Bleakman
and Lodge, 1998). Amennyiben a receptorok elveszítik Ca2+ -permeabilitásukat, az
81
[Ca2+]IC szintet a VDCC-k aktivációja emelheti meg, melyet az AMPA receptorokon
beáramló kationok által létrehozott membrán-depolarizáció aktivál. Ha azonban a sejtek
VDCC-ái nem aktiválódnak és csak Ca-impermeábilis AMPA receptorok találhatók
bennük, akkor ezzel a módszerrel nem tudjuk kimutatni a funkcionális AMPA
receptorokat. Mivel az AMPA-receptorok igen gyorsan deszenzitizálódnak, a méréseket
mindig 10 µM ciklotiazid (az AMPA receptor deszenzitizációját gátló szer; Bleakman
and Lodge, 1998) jelenlétében mértem. A mérések során a receptor agonistájaként
AMPA-t használtam, amely a kainát receptoroknak csak nagyon gyenge agonistája
(Bleakman and Lodge, 1998). Az AMPA és ciklotiazid alkalmazott koncentrációját
irodalmi adatok alapján állapítottam meg. A válaszok AMPA-specifikus voltát az
AMPA receptorok specifikus gátlószerének adagolásával igazoltam (23. B ábra).
Indukálatlan sejteken végzett mikrofluorimetriával az elkötelezetlen
progenitorsejtek kb. 40%-ában szignifikáns mértékű [Ca2+]IC emelkedést tapasztaltam
100 µM AMPA hatására (23. A ábra). A többi – látszólag azonos - sejtben nem láttam
ilyen irányú változást. Indukálatlan NE-7C2 sejtek a vizsgált AMPA-receptor
alegységek közül a GluR4-t expresszálták, mely homomer - egyféle alegységtípusból
felépülő - csatornák kialakítására is képes. Indukálatlan sejtekben tehát az AMPA
hatására bekövetkező [Ca2+]IC emelkedéséért a homomer GluR4 csatornák lehetnek a
felelősek. Mivel depolarizáló KCl hatására a sejtekben nem volt mérhető [Ca2+]IC-szint
emelkedés (20. A ábra), a VDCC-k szerepe a [Ca2+]IC-szint emelkedésben
elhanyagolható lehet.
Az indukció 8-10. napjain végzett mikrofluorimetriás mérések azt mutatták,
hogy nem minden neuronális morfológiájú sejtben emelkedik meg az [Ca2+]IC AMPA
hatására (23. A ábra), a nyúlványos sejtek egy jelentős részében az [Ca2+]IC nem
változott az alapszinthez képest. Az indukció előrehaladtával a GluR2 alegység
beépülése a receptorba a Ca2+-permeabilitás elvesztését jelentheti (ha az alegység
editálódik) és ebben az esetben az [Ca2+]IC emelkedésének forrása csak a VDCC-on át
beáramló Ca2+ ion lehet. Mivel a kísérletek végzése idején a laboratórium még nem
rendelkezett a VDCC-ra specifikus drogokkal, így az AMPA hatására bekövetkező
[Ca2+]IC emelkedést nem mértem a VDCC blokkolók jelenlétében. Mivel azonban a
fejlett NE-7C2 neuronokban az NMDA-kiváltotta [Ca2+]IC emelkedésének egy jelentős
részét a VDCC-on keresztül beáramló Ca2+ ionok okozták (21. ábra), ill. KCl hatására is
82
[Ca2+]IC-szint emelkedés volt mérhető indukált sejtekebn (20. B ábra), feltételezhetjük,
hogy az AMPA-indukálta Ca2+-válaszban szintén szerepet játszanak a VDCC-k
csatornák. További vizsgálatokkal kell eldönteni a VDCC-k és a GluR2 alegység
jelentőségét az AMPA-kiváltott [Ca2+]IC emelkedésben NE-7C2 sejtekben.
Az AMPA és ciklotiazid jelenlétében mért [Ca2+]IC-szint emelkedést az AMPA-
receptor nem-kompetitív gátlószerének jelenlétében is megvizsgáltam. A GYKI52466
irodalmi adatok alapján hasonlóan hatásos mind a 4-féle AMPA receptor alegységen.
GYKI52466-al 5 percig előinkubáltam a tenyészeteket, majd az AMPA-reszponzív
sejteken a GYKI52466 jelenlétében mért [Ca2+]IC-szint emelkedést a gátlószer adása
előtt mért [Ca2+]IC-szint emelkedéshez viszonyítottam (23. B ábra). Az ábrán szerepelő
reprezentatív eredmény azt mutatja, hogy a GYKI52466 nem tudta teljes mértékben
kivédeni az AMPA adására bekövetkező [Ca2+]IC-szint emelkedést. A GYKI52466
jelenlétében is fennmaradó Ca-szint emelkedést az esetlegesen expresszálódó kainát
receptorok* adhatják, amelyeket az AMPA magas koncentrációja aktiválhat.
*A kainát receptorok ötféle alegység homo- és heteromer kombinációiból épülhetnek fel. A GluR5-7
alegységek homo- és heteromer, míg a KA1 és KA2 alegységek csak heteromer kombinációban alkotnak
funkcionális receptort. Az kainát receptor alegységek közül specifikus oligonukleotid primerekkel Dr
Schlett Katalin vizsgálta a GluR6, KA1 és KA2 alegységek expressziós változásait az in vitro
neurogenezis során. Indukálatlan tenyészetekben a GluR6 és KA2 alegységek mRNS formái igen magas
szinten expresszálódtak és szintjük az indukció időtartama alatt nem növekedett tovább. A KA1 alegység
transzkriptum igen alacsony szinten volt detektálható mind az indukálatlan, mind a 2 napig retinsavval
indukált tenyészetekben. Az indukció 4. napjától szintje megemelkedett és az indukció teljes időtartama
alatt jelen volt a tenyészetekben. Mivel a kainát receptorok neurogenezisben betöltött szerepével a
továbbiakban nem foglalkoztam, az adatok csak kiegészítésként szerepelnek.
83
II./2.3 Funkcionális AMPA receptorok szerepe folytonosan osztódó ill.
neuronális irányban differenciálódó NE-7C2 sejtekben
A glutamát esetleges neurogenezist befolyásoló hatását úgy vizsgáltam, hogy
NE-7C2 sejtek indukálatlan, ill. neuronális irányban differenciálódó tenyészetét az
AMPA receptorok specifikus antagonistájával (GYKI52466, Tarnawa and Vizi, 1998)
kezeltem. A GYKI52466-t kétféle koncentrációban alkalmaztam (5 µM és 50 µM),
mivel ennél magasabb koncentrációkban már toxikusnak bizonyult. A szer toxicitását a
tenyészetekben lévő sejtek életképességének mérésével előzetesen ellenőriztem az
MTT-redukció módszerével (Mosmann, 1983). Az AMPA receptorok szelektív
gátlásának hatását a neurogenezisre a tenyészetekben található N-tubulin immunreaktív
sejtek mennyiségének meghatározásával vizsgáltam a tenyésztés 7. napján,
immuncitokémiai és in situ ELISA módszerrel.
Indukálatlan tenyészetekben a tenyésztés 7. napjára spontán módon is
differenciálódnak N-tubulint expresszáló sejtek (9. C ábra), számuk azonban mindig
igen alacsony (10 látótérben 1 N-tubulin pozitív sejt; 24. A ábra 1. oszlop).
GYKI52466-kezelés hatására a neuronális irányban differenciálódó sejtek száma
nagymértékben megemelkedett. Az antagonista 5 µM koncentrációja mintegy 15x - ére
emeli meg a neuronális irányban differenciálódó sejtek számát (2. oszlop), míg 50 µM -
ban közel 40x az emelkedés (3. oszlop). Ez azonban messze elmarad a retinsav által
előidézett neurogenezis mértékétől, ahol látóterenként átlagosan 29 neuron található (4.
oszlop). Az indukálatlan tenyészetekben GYKI52466 hatására bekövetkező neuronális
differenciáció mértékét in situ ELISA módszerrel is detektáltam. Kezeletlen
tenyészetekben a 7. napon mérhető relatív N-tubulin tartalom igen alacsonynak
mutatkozott (24. B ábra, 1. fekete oszlop). GYKI52466 5 µM koncentrációja nem
okozott változást a relatív N-tubulin tartalomban (2. fekete oszlop) a kezeletlen
tenyészethez viszonyítva.
84
85
Ennek oka az lehet, hogy az in situ ELISA módszer nem elég érzékeny ahhoz, hogy
különbséget tudjon tenni kismértékű eltérések között. Az 50 µM-ban alkalmazott
antagonista kezelés hatására bekövetkező neuronszám-emelkedést (3. fekete oszlop)
már sikerült kimutatnom ezzel a módszerrel is, bár a növekedés mértéke igen alacsony
volt és az értékek közötti különbség a nagy szórások miatt nem volt szignifikáns.
Mivel az indukált neurogenezis során igen nagyszámú neuron differenciálódik
és aztán aggregálódik, a pozitívan jelölt neuronok pontos leszámolása nehezen
megoldható. Retinsavval indukált tenyészetekben a GYKI52466-kezelés neurogenezisre
gyakorolt hatását így in situ ELISA méréssel detektáltam. A GYKI52466-al nem kezelt,
de retinsavval indukált tenyészetekben a relatív N-tubulin tartalom (24. B ábra, 1. fehér
oszlop) jóval meghaladta az indukálatlan tenyészetekben mért értéket. GYKI52466 5
µM koncentrációja a tenyészetekben mérhető N-tubulin tartalmat nem emelte jelentősen
(2. fehér oszlop). Ha azonban 50 µM-ban adtam a tenyészetekhez az antagonistát, az N-
tubulin tartalom csaknem kétszeresére emelkedett (3. fehér oszlop).
A GYKI52466 féléletideje igen rövid a rágcsálókban (Tarnawa and Vizi, 1998).
Kísérleteim során a sejteken a tenyésztő-médiumot, mely az antagonistát is tartalmazta,
24 óránként cseréltem. Ez alatt a 24 óra alatt nagy valószínűséggel teljes mértékben
lebomlott a hatóanyag és így – minden bizonnyal - csak részlegesen sikerült az AMPA
receptorokat gátolni. További kísérletek szükségesek, melyek során stabilabb AMPA
antagonistákat alkalmaznánk és így a kísérlet teljes időtartama alatt ki tudnánk védeni
az AMPA receptorok aktivációját.
Megállapítható, hogy az AMPA receptorok gátlása az indukálatlan
tenyészetekben neurogenezist indukál, a retinsavval indukált tenyészetekben pedig
fokozza a neurogenezist.
II./2.4 Az extracelluláris folyadék glutaminsav tartalmának vizsgálata NE-
7C2 sejtek tenyésztő médiumában
Az NE-7C2 sejtekben jelen lévő NMDA, AMPA és kainát receptorok
természetes agonistája a glutamát. A szervezetünket felépítő sejtek anyagcseréjük során
jelentős mennyiségű glutaminsavat használnak fel. A metabolikus glutaminsav-hatások
86
mellett azonban az idegsejtek és gliasejtek glutamát-felhasználása és érzékenysége
jelentősen eltér a nem-neurális sejtek glutamát anyagcseréjétől.
A neurális sejt-fenotípusok kialakulása során vizsgáltam az NE-7C2 sejtek
folyadékkörnyezetének glutamát-tartalmát. A vizsgálatokhoz két tenyésztési hét alatt
gyűjtöttem mintákat három-három párhuzamosan kezelt indukált, illetve indukálatlan
tenyészet tápközegéből, és az extracelluláris glutamát koncentrációját fluorimetriás
módszerrel határoztam meg a Semmelweis Egyetem Biokémiai Tanszékén, Dr Tretter
László és Dr Környei Zsuzsa segítségével.
Indukálatlan tenyészetekben az extracelluláris glutamát koncentrációja 7 µM és
12 µM között ingadozott (25. ábra). Az indukció első 3 napján a glutamát
koncentrációja kismértékben csökkent (25. ábra), de nem különbözött jelentősen az
indukálatlan tenyészetekben mért értékektől. Az indukció 4. napjától azonban a
glutamát szintje a 4 - 5 µM közé csökkent és ezen az alacsony értéken maradt az
indukció további szakaszában (25. ábra). Az indukált tenyészetek alacsony
extracelluláris glutamát szintje jelzi, hogy a neurális irányban elköteleződött sejtek
megnövekedett mértékben képesek környezetükből a glutamátot eltávolítani.
87
88
III. GAD FORMÁK EXPRESSZIÓJA ÉS A GABA-SZINTÉZIS KAPCSOLATA
NE-7C2 SEJTEK INDUKÁLT NEUROGENEZISE SORÁN
A glutaminsav extracelluláris szintjének aktív szabályozottsága jelezte, hogy a
glutaminsav felhasználás a neuronális érés során jelentősen változhat. Az idegsejtek
glutaminsav anyagcseréjének egyik fontos ága a glutaminsav → GABA átalakulás,
amelynek kulcsenzime a GAD. Megvizsgáltam, hogy az NE-7C2 sejtek neuronná
fejlődése során megjelenik-e a GAD, és a fejlődés melyik stádiumára tehető a fokozott
GABA szintézis kialakulása.
Az GAD mRNS ill. fehérje-formák kimutatását az MTA-KOKI Molekuláris
Biológiai és Genetikai Laboratóriumával kialakult közös munka keretében Dr Szabó
Gábor és Dr Katarova Zója szakmai irányítása mellett végeztem.
III./1 GAD mRNS formák expressziójának vizsgálata
Az NE-7C2 sejtek neuronális differenciációja a során a gad65 és gad67 gének
transzkripciós aktivitását szemikvantitatív RT-PCR módszer segítségével
tanulmányoztam olyan primer párok felhasználásával, amelyek különbséget tesznek az
embrionális és felnőtt korban expresszálódó GAD mRNS formák között. A gad67
génről két, majdnem teljesen egyforma embrionális transzkriptum keletkezhet (I-80, I-
86, 5. ábra; Szabó et al., 1994). Az I-80 mRNS a csak embrionális korban átíródó 7A
exont tartalmazza, míg az I-86 mRNS által kódolt transzkript a 7B embrionális exont
hordozza (5. ábra), melynek szekvenciája plusz 6 bázist tartalmaz a 7A exonhoz képest.
Mindkét exonban található egy átfedő STOP/START kodon, míg a 7B exonban a plusz
6 bázis egy extra STOP kodont kódol (5. ábra), mely meggátolja a transzlációt az
mRNS további szakaszáról. A 12. primer pár (2. táblázat) „antisense” tagja (26. ábra)
olyan szekvencia részletet ismer fel, amely mind a 7A mind a 7B exonban megtalálható,
míg a „sense” primer az embrionális exonokon kívül eső 5’ szekvenciára specifikus. Így
a 12. primer párral felszaporítható termék mind az I-80-ról, mind az I-86-ról
keletkezhet. A teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló transzkriptumban nincs jelen
egyik embrionális exon sem, így a 6. és 8. exonok egymás mellé kerülnek. A 13. primer
pár (2. táblázat)
89
90
„antisense” tagja a 6. és 8. exonok egymással szomszédos szekvencia-részleteit ismeri
fel (3 bp a 6. exonból és 24 bp a 8. exonból) és köti meg (tehát az embrionális formákat
nem), míg a „sense” primer a gad67 gén azon szakaszára lett tervezve, amely genom
által kódolt gad67 „pseudogén”-ben nincs jelen (26. ábra, Brilliant et al., 1990). A 14.
primer pár a GAD65 fehérjét kódoló mRNS-t ismeri fel (26. ábra). Belső standardként
β-aktint szaporítottam 16-20 cikluson keresztül a 15. primer pár segítségével. A β-aktin
gén expresszióját függetlennek tekintjük mind a sejtciklustól, mind a differenciációtól,
azaz mennyiségét állandónak vettük az indukció teljes időtartama alatt. A felhasznált
primerek szekvenciáját az 2. táblázat tartalmazza.
Az indukálatlan NE-7C2 sejtek alacsony szinten expresszálták az embrionális
transzkriptumokat (27. A, A’ ábra). Az ATRA indukálta neurogenezis során az
embrionális formák expressziós szintje átmeneti emelkedést mutatott. Az indukció 2.
napján a transzkriptum szintje nagymértékben megemelkedett és a 4. napra elérte
maximumát (27. A, A’ ábra). Ez az időszak egybeesik a neuronális nyúlványok
megjelenésének szakaszával. Az indukció előrehaladtával az embrionális mRNS-ek
szintje folyamatosan csökkent és elérte a kiindulási mennyiséget az indukció második
hetének végére (27. A, A’ ábra). A teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló mRNS-t
az indukálatlan, folytonosan osztódó sejtek nem expresszálták (27. B, B’ ábra). A
transzkriptum az indukció 2. napjától volt detektálható, szintje folyamatosan emelkedett
az indukció előrehaladtával, és az indukció 12. napjára jelentős mennyiségben volt jelen
(27. B, B’ ábra). Az embrionális ill. felnőtt GAD67 mRNS-formák expressziójának
időbeli mintázata alapján megállapítható, hogy az embrionális 7A és 7B exonok
expressziója a neuronális fejlődés szigorúan meghatározott szakaszaira korlátozódik.
A GAD65 fehérjét kódoló mRNS-formát csak indukált sejtekből sikerült
kimutatni (27. C, C’ ábra). A transzkriptum már az indukció korai szakaszában alacsony
szintű expressziót mutatott, de szignifikáns mennyiségben csak az indukció 7. napjától
expresszálódott. Az indukció későbbi szakaszában az mRNS szintje nem emelkedett
tovább (27. C, C’ ábra).
91
92
III./2 Rövidített és teljes hosszúságú GAD fehérje-formák időbeli megjelenése NE-
7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise során
Hogy meghatározzam, milyen GAD fehérje-formák transzlálódnak az ATRA-
indukció különböző szakaszaiban, Western blot analízist végeztem NE-7C2 sejtek
tenyészeteiből készített szubcelluláris frakciókból (lásd „Anyag és Módszer” fejezet). A
GAD fehérjeformák kimutatásához korábban már karakterizált ellenanyagokat
használtam: 1) # 6799 poliklonális szérum (Katarova et al., 1990), mely mind az
embrionális, mind a felnőtt GAD formákat felismeri, 2) # 8876 poliklonális szérum,
(Szabó et al., 1994) a 25 kD tömegű rövidített formát ismeri fel ill. 3) a 65 kD formára
specifikus GAD6 monoklonális ellenanyag, (GAD6 hibridóma sejtvonal felülúszó;
Hibridóma Bank; Chang and Gottlieb, 1988). Pozitív kontrollként 13 napos egér-embrió
(E13) ill. újszülött kisállat (P0) előagyából készített fehérje-mintákat futtattam a
géleken.
Alacsony feszültségtartományban végzett blottolás mellett (lásd „Anyag és
Módszer” fejezet) főleg a kis molekulatömegű embrionális formákat lehetett kimutatni.
Mind a 25 kD, mind a 44 kD embrionális forma a TritonX-114 oldhatatlan durva-
membrán frakcióban jelentkezett, más frakciókban jelenlétüket nem sikerült igazolni. A
# 6799 és a # 8876 ellenanyag igen hasonló GAD25 fehérje-expressziós mintázatot
mutatott, a 28. ábrán a # 8876 ellenanyaggal kapott blot szerepel. A GAD25 fehérje már
indukálatlan progenitorokban detektálható volt (28. A ábra). A viszonylag alacsony
mRNS szint mellett (27. ábra) meglepően magas volt a fehérje mennyisége. A fehérje
szintje az idegi indukció korai szakaszában kismértékben még tovább emelkedett, majd
az indukció 6. napjától igen alacsony szintre csökkent, de az indukció második hetében
is detektálható maradt (28. A ábra). Az indukció korai szakaszában valamint az
indukálatlan sejtekben a fehérje kettős csíkot adott a blottokon (28. A ábra), amely
(Szabó Gábor és mtsai adatai alapján) feltételezhetően posttranszlációs módosítások
során keletkeznek, de a fehérje degradációjának lehetősége sem kizárt.
A GAD44 fehérje nem volt detektálható az indukálatlan sejtekben (28. B ábra).
A fehérje a ATRA-indukció igen szűk időtartományában tranziens módon
transzlálódott. Az indukció 4. napján szintje még igen alacsony, a 6. napra
nagymértékben
93
94
megemelkedett és elérte maximumát (28. B ábra). A fehérje mennyisége a 10. napig
csökkent, majd tejesen el is tűnt az indukció második hetének végére (28. B ábra).
Fokozatosan emelkedő feszültség mellett végzett blottolás során a nagyobb
molekulatömegű tartományba eső GAD fehérje-formák kimutatása is lehetővé vált. A
teljes hosszúságú GAD67 fehérjét azonban nem sikerült kimutatnom egyetlen
szubcelluláris frakcióból sem, annak ellenére, hogy a kódoló mRNS szintje az indukció
második hetében már igen jelentős mennyiséget ért el. Ha a fehérje csak kis
mennyiségben van jelen a sejtekben, akkor elképzelhető, hogy a futtatás során felvitt
15µg totál fehérje nem tartalmazott kimutatható mennyiségű GAD67 fehérjét. Hogy
elkerüljem ezt a hibaforrást, megpróbálkoztam a fehérjét feldúsítani a mintákban
immunprecipitációval ill. ammónium-szulfát precipitációval is. A fehérjét azonban így
sem sikerült kimutatni, amiből arra következtettem, hogy vagy az mRNS nem
transzlálódik, vagy a fehérje életideje nagyon rövid az indukció általam vizsgált
szakaszában.
A GAD65 fehérjét a TritonX-114 oldható durva-membrán frakcióban tudtam
csak kimutatni. A fehérje az indukció 6. napján jelent meg alacsony szinten,
mennyisége az indukció 10. napjától emelkedett, párhuzamosan a neuronok érésével
(28. C ábra).
III./3 GAD fehérjeformák sejtszintű lokalizációjának vizsgálata forma-
specifikus ellenanyagokkal
Hogy meghatározzam, melyek azok a sejtek, amelyek a különböző GAD fehérjéket
expresszálják, immuncitokémiai vizsgálatokat végeztem az indukció különböző
szakaszaiban az egyes fehérjeformákra specifikus ellenanyagokkal. A festések során az
immunjelet tyramid szignál amplifikációval erősítettem és a festéseket normál
fluoreszcens ill. konfokális lézer mikroszkóppal értékeltem.
NE-7C2 sejtek indukálatlan tenyészetében a GAD25 fehérje alacsony szinten
majdnem minden sejtben detektálható volt a poliklonális 8876 szérummal. Az
immunreaktivitás a teljes sejttestet kitöltötte (29. A ábra). Az alacsony intenzitású
immunjelet specifikus festésnek tekintettem, mivel a Western blot analízis is
megerősítette a fehérje jelenlétét. A retinsav-indukálta idegi differenciáció a fehérje
95
expressziójának megemelkedését eredményezte a neuronális irányba elköteleződő
sejtekben (29. B, C ábra). Az ellenanyag mind a sejtmag körüli, igen kis kiterjedésű
sejttestben (29. B ábra), mind a hosszú nyúlványokban jól látható fluoreszcens jelet
adott (29. C ábra). A nem-neurális sejtek festődése a háttértől nem tért el.
A GAD44 fehérje kimutatására nyúl poliklonális szérumot használtam (# 8877),
melyet affinitás-tisztítottam bakteriálisan expresszáltatott GAD44 fehérje-szekvencián
(Szabó et al., 1994). Az indukálatlan sejtekben immunfestést nem láttam. Az első
immunreaktív sejtek az indukció 4. napján voltak azonosíthatók (30. A ábra) és az
immunjel a citoplazma marginális zónájában dúsult fel. Az indukció 7 - 10. napjára az
immunjelölt sejtek száma megnőtt (30. B és C ábra) és a festődés mind a perinukleáris
régióban mind a nyúlványok proximális szakaszán erős volt. A differenciáció későbbi
szakaszában a jelölt sejtek száma nagymértékben csökkent és az indukció 12. napjára
nem találtam jelölt sejtet a tenyészetekben.
A GAD65 fehérjére adott specifikus festődést (N65 ellenanyag, Solimena et al.,
1993) elsőként az indukció 7. napján detektáltam a neuronális morfológiával
jellemezhető sejtekben. Az indukálatlan aljzatsejtek nem festődtek GAD65-specifikus
szérummal. Az indukció 10. napjára az idegsejt legtöbbje jelölődött (31. A-F ábra) és a
fehérje mind a sejttestben, mind a nyúlványokban jelen volt.
Mivel nincs olyan ellenanyag, amely a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét meg
tudná különböztetni rövidített szekvenciájú variánsaitól, szelektív festést erre a formára
nem tudtam elvégezni. A fehérjét sem Western blot, sem immunprecipitáció
segítségével nem tudtam detektálni, tehát nagy valószínűséggel nincs jelen az indukció
általunk vizsgált szakaszában.
96
97
98
III./4 NE-7C2 sejtek GABA-tartalma az in vitro indukált neurogenezis különböző
stádiumaiban
Az in vitro indukált neurogenezis során az NE-7C2 sejtek két olyan GAD
fehérjét (GAD65 és GAD44) is expresszáltak, amelyek a gluatminsavból GABA-t
tudnak előállítani. A GABA-t tartalmazó sejteket immuncitokémiai festéssel
azonosítottam retinsavval indukált ill. indukálatlan tenyészetekben. Az indukálatlan
sejtek, amelyek csak GAD25 formát expresszálnak, nem tartalmaztak
immuncitokémiailag detektálható mennyiségű GABA-t (32. A ábra). Immunreaktív
sejteket nem láttam az indukció 2. és 4. napján sem. Az indukció 6. napján (32. B ábra)
jelentek meg az első magas GABA-tartalmú sejtek és számuk folyamatosan nőtt az
indukció előrehaladtával (32. C-D ábra). A festődés kitöltötte a teljes citoplazmát és a
nyúlványokat, erősen megjelölve az axonális növekedési kúpokat (32. E és F ábra). Az
indukció későbbi szakaszában (8-10. nap) a nyúlványokon elhelyezkedő varikozitások
szintén erősen jelölődtek.
99
100
LEGFONTOSABB EREDMÉNYEK
1. Az NE-7C2 sejtvonal megalapítása során kezdeti genetikai instabilitást tapasztaltam,
mely fokozatos kromoszómaszám-vesztéssel járt. A sejtvonal
kromoszómaszáma a 30. passzázstól (kb. 100 sejtduplikációs ciklus eltelte után)
kezdve stabilizálódott, és a normál egér genomnál másfélszer több kromoszómát
tartalmazó vonal alakult ki.
2. Az NE-7C2 sejtvonal korai fejlődési állapotot reprezentáló neurális progenitor
sejtekből áll. A sejtvonal ATRA-indukálta neurogenezise jól karakterizált
progenitor stádiumok szukcessziós sorozata, mely megfelelő modellként
szolgálhat a korai neurogenezis meghatározott lépéseinek tanulmányozására.
3. Az in vitro neuronális differenciáció során az idegsejtek nyúlványnövekedésének
szakaszában megjelennek a sejtek felszínén funkcionális NMDA receptorok,
melyek aktivációja az [Ca2+]IC megemelkedését okozza.
4. Mind az indukálatlan, mind az indukált NE-7C2 sejtek funkcionális AMPA
receptorokat expresszálnak, amelyeken át a progenitor sejtek osztódása is
szabályozható.
5. A funkcionális NMDA és AMPA receptorok együttes jelenléte idején az
extracelluláris tér glutaminsav-tartalma lecsökken.
6. A glutaminsavból GABA-t előállító GAD67 fehérjecsalád embrionálisan megjelenő
fehérjéi (GAD25, GAD44) az indukálatlan sejtekben ill. a fiatal neuronokban
expresszálódnak. A teljes hosszágú GAD65 forma jelenléte a késői indukciós
periódust, a neurális érés időszakát jellemezi.
7. GABA-t akkumuláló idegsejteket csak azokban a stádiumokban sikerült kimutatni,
amikor a GAD44 és/vagy a GAD65 fehérje már jelen volt.
101
102
MEGBESZÉLÉS
Az agy fejlődése során az idegszövetet felépítő neuronok és gliasejtek
differenciálódása különböző progenitor-stádiumok térben és időben egymást követő
sorozataként valósul meg. A folyamat szabályozásában a genetikai tényezők mellett a
környezeti (sejtes és kémiai) faktorok is fontos szerepet töltenek be. Az elmúlt években
számos szekretált molekuláról (növekedési faktorok, hormonok és neurotranszmitterek)
bebizonyosodott, hogy szerepet játszik a proliferáció, differenciáció, migráció és
neuronális túlélés folyamatainak szabályozásában az idegrendszer kialakulása során. A
kifejlett idegrendszerben „klasszikus neurotranszmitterként” ismert molekulák az
idegrendszer érése alatt mindvégig jelen vannak a progenitorsejtek környezetében
(Miranda-Contreras et al., 1998; 1999; 2000) és jelfogó receptoraik is kifejeződnek a
sejtek felszínén jóval a szinaptogenezis megindulása előtt (Sah et al., 1997; Haydar et
al., 2000; Maric et al., 2000). Az utóbbi 10 évben számos olyan tanulmány jelent meg,
amely bizonyítja, hogy a neurotranszmitterek fejlődésreguláló anyagokként viselkednek
az idegrendszer embrionális fejlődése során (LoTurco et al., 1995; Behar et al., 1996;
Ma et al., 1998; Haydar et al., 2000; Nguyen et al., 2001).
Doktori munkám során vizsgáltam a glutaminsav ionotróp receptorainak
megjelenését és lehetséges funkcióit, ill. tanulmányoztam a glutaminsavból GABA-t
előállító GAD fehérjecsalád tagjainak expresszióját az in vitro neuronális elköteleződés
jól jellemzett stádiumaiban. A kísérleteket egy p53-/- immortalizált, neuroektodermális
sejtvonalon, az NE-7C2-n végeztem, melynek tenyészeteiben ATRA-kezelés hatására
neuronok, majd ezt követően asztrogliasejtek differenciálódnak.
I. Az NE-7C2 sejtek korai neuroektodermális fejlődési állapotot
reprezentáló progenitorok
Az idegrendszer embrionális fejlődése során a rövid távolságon - mindössze
néhány sejtet magába foglaló mikrokörnyezeten - belül érvényesülő hatások vizsgálata
és elemzése in vivo körülmények között nehezen megoldható feladat. A korai
embrionális (E9 - E13) fejlődési állapotok in vivo vizsgálatát megnehezíti az embriók
méhen belüli védettsége, a fejlődést szabályozó folyamatok nagyfokú összetettsége,
103
valamint az idegi progenitor sejtek térben és időben eltérő fejlettségi állapota – azaz
heterogenitása. Az embrionális idegszövetből izolált primer tenyészetekben a sejtek
közötti heterogenitás az in vitro tenyésztés során is fennmarad, a kiültetett sejtek csak
korlátozott mértékben őrzik meg progenitor sajátságaikat és néhány osztódás után
differenciálódnak.
A neurogenezis in vitro vizsgálatához olyan homogén sejtpopulációk
nyújthatnak ideális modellt, amelyekben a sejtek azonos fejlődési potenciállal
rendelkeznek és ezeket a tulajdonságaikat a fenntartás során megőrzik, de megfelelő
indukció hatására idegszöveti sejttípusokká differenciálódnak. Amennyiben ezek a
sejtek korlátlan osztódó-képességgel is rendelkeznek, a biokémiai és molekuláris
biológiai kísérletek elvégzéséhez elegendő mennyiségű kiindulási sejttömeget
produkálhatnak. Az idegi irányú elköteleződés tanulmányozására folytonosan osztódó
sejtvonalak állíthatók elő perifériás eredetű idegrendszeri tumorokból (PC12 sejtvonal),
ill. embrionális karcinómákból (P19, PCC-7, NTera-2) izolált sejtekből. Az embrionális
karcinóma eredetű sejtvonalakban azonban a neuronok és asztrogliasejtek kialakulása
mellett izomsejtek és fibroblasztok is differenciálódnak. A széles fejlődési potenciállal
rendelkező embrionális őssejtek is igen eltérő sejttípusok kialakítására képesek.
Folytonosan osztódó sejtpopulációk előállíthatók virális onkogének (v-raf, T-antigén)
progenitorsejtekbe juttatásával, ám számolni kell azzal, hogy a beépülő onkogén
módosíthatja a progenitorok fejlődési sajátságait.
Immortalizált sejtek előállításának egy új módját kínálják azok a transzgenikus
állatok, ahol a sejtciklus vagy programozott sejthalál regulációjában szerepet játszó
gének működése kiesik. A p53 gén-kiütött egerekből izolált sejtek egy része spontán
immortalizációt mutat funkcionális p53 fehérje hiányában (Harvey et al., 1993; Metz et
al., 1995; Schlett and Madarász, 1997).
A p53-/- egér embrió primer neuroepitél sejtjeiből klónozással nyert master
tenyészetekben különböző kromoszóma-készletű sejtpopulációk voltak jelen. Eddigi
adataink szerint az immortalizált sejtvonalak a kétszeres kromszómaszámmal
rendelkező populációból származnak. A jelenség azt jelzi, hogy a kromatin-állomány
növekedése kezdetben szelektív előnyt jelenthet a primer neuroepiteliális sejtek
szaporodásában. Hasonló kromoszómális instabilitást figyeltek meg p53-/- embrionális
fibroblaszt sejtvonalak (Harvey et al., 1993), ill. hematopoietikus sejtek hosszú távú
104
fenntartása esetében is (Metz et al., 1995), megerősítve, hogy a p53 fehérje fontos
szerepet tölt be a kromoszómális integritás megőrzésében. A 100 feletti
kromoszómaszámmal rendelkező sejtek megjelenése NE-7C2 sejtek tenyészeteiben
szintén azt jelzi, hogy a sejtosztódást szabályozó folyamatok sérülnek funkcionális p53
gén hiányában. Az a tény, hogy a poliploid sejtek sosem válnak meghatározóvá a
tenyészetekben azt sugallja, hogy a génállomány egy határ fölötti növekedése hátrányos
lehet a sejtek szaporodása során. Hasonló poliploid megakariocitákat figyeltek meg egy
p53-/- eritroid sejtvonal esetében is (Metz et al., 1995), azonban ezen sejtek aránya
sosem haladta meg az 1%-t a tenyészetekben. Az NE-7C2 sejtvonal további tenyésztése
során a duplikált kromoszómaszám látszólag már nem jelentett előnyt a sejtek
növekedésében. A sejtvonal stabilizációja során a kromoszómaszám n ≈ 3 érték felé
közelít. Feltételezéseink szerint ez a genom-méret egyrészt biztosíthatja a szerzett
előnyök további megtartását, másrészt nem igényli a sejtciklus időtartamának hátrányos
megnövekedését. Hasonló kromoszómaszám csökkenést majd stabilizálódást figyeltünk
meg egy másik p53-/- sejtvonal esetében is (NE-4C; Schlett and Madarász, 1997), ahol
a kezdetben duplikált kromoszómaszámmal rendelkező sejtek kromoszóma-állománya
fokozatosan csökkent a sejtvonal fenntartása során. Érdekes megemlíteni, hogy mind az
NE-7C2, mind az NE-4C sejtvonal esetében a kromoszómaszám csökkenése lelassult az
átültetések számának emelkedésével, és mindkét sejtvonal esetében a kromoszómaszám
a 60-s érték körül stabilizálódott.
A folyamatos kromoszómaszám–vesztés ellenére a sejtek fenotípusa nem
változott és ATRA kezeléssel minden passzázsban indukálható volt a neuronok
kialakulása. Az általam alkalmazott módszerrel azonban csak a kromoszómák számának
csökkenését tudtam regisztrálni. Miután a változó kromoszómaszám nem befolyásolta a
neurális indukciót, fontos lenne megvizsgálni, hogy mely kromoszómák vesznek el,
illetve a neurális fejlődésben szerepet játszó géneket hordozó kromoszómák többszörös
kópiában maradnak-e fenn.
A további kísérletek során olyan passzázs-számú NE-7C2 sejtekkel dolgoztam,
amelyek kromoszómaszáma a 60-s érték körül már stabilizálódott (p30-p60).
Az NE-7C2 sejtvonal sejtjei indukálatlan állapotban epiteliális sejtekre jellemző
alakkal rendelkeznek és a neurális progenitorok markerfehérjéjét, a nesztint
105
expresszálják. Letapadásfüggő növekedésük azt mutatja, hogy a sejtvonal sejtjei p53
fehérje hiányában sem tumorosan transzformáltak. A tenyészetekben kis gyakorisággal
bekövetkező spontán neuronális differenciáció (> 1%) a sejtvonal idegrendszeri eredetét
támasztja alá és bizonyítja, hogy a sejtekben a terminális differenciáció folyamata p53
fehérje hiányában is bekövetkezik. Az indukálatlan tenyészetekben kis gyakorisággal
megjelenő neuronok fenotípusuk alapján (egy rövid, el nem ágazó nyúlvány és
lekerekedett sejttest) egy korai fejlődési stádiumot képviselnek és további
differenciációjukhoz valószínűleg sem a sejtes, sem a folyadékkörnyezet nem biztosít
megfelelő feltételeket. Indukálatlan tenyészetekben az idegszövet másik jellemző
sejttípusa, az asztroglia nem volt kimutatható. A megfigyelés arra utal, hogy az
asztroglia sejtek differenciációjához szükséges környezeti faktorok (sejtes és kémiai)
nem állnak rendelkezésre a differenciálatlan sejtek tenyészeteiben.
NE-7C2 sejtek tenyészeteiben neuronok nagyszámú differenciációját all-trans
retinsav kezeléssel tudtam indukálni. A retinsav neuronális differenciációt indukáló
hatását figyelték meg embrionális stem (ES) sejteken és embrionális karcinóma sejteken
is (P19, Ntera-2), de ezeken a sejtvonalakon nem-neurális fejlődési irányok is
indukálódtak. Az NE-7C2 sejtek tenyészeteiben ATRA kezeléssel csak idegszöveti
típusú fejlődési irány volt kimutatható, tehát az NE-7C2 sejtvonal beszűkült progenitor
potenciálja alapján már egy előrehaladottabb fejlődési stádiumot képvisel, mint az ES
sejtek ill. az embrionális karcinóma eredetű sejtvonalak. Hasonló indukciós sajátságokat
mutatott a laboratóriumunkban már korábban jellemzett p53-/- neuroektodermális NE-
4C sejtvonal is, amelyben ATRA kezelés hatására neuronok és asztroglia sejtek
differenciálódtak (Schlett and Madarász, 1997).
Felmerül a kérdés, hogy az általam használt ATRA koncentráció (10-6 M)
mennyire tekinthető fiziológiás koncentrációnak. Mivel az all-trans retinsav igen
instabil vegyület, mind fény, mind hőmérséklet hatására izomerizálódik, a retinsav egy
jelentős része lebomolhat, mire a sejtekkel kapcsolatba kerül. Így a ténylegesen jelen
lévő ATRA koncentráció az általam megadott értéknél jóval alacsonyabb lehet.
A retinsav-kezelés csak a sejtek egy részét (~ 50%) készteti neuronális ill. gliális
differenciációra. Az el nem kötelezett sejtek egy összefüggő monolayert hoznak létre a
petricsésze felszínén. A differenciálódási folyamat során a neuronális morfológiájú
sejtek nem egyenletesen oszlanak el a tenyészetekben, hanem kisebb csoportokat
106
alkotnak. A tenyészetekben in vitro megfigyelhető nagyszámú differenciálatlan sejt, ill.
neuronok esetében megfigyelt csoportos megjelenési mintázat alapján feltételezhető,
hogy a neuronális sejttípus-determináció folyamata során rövid hatótávolságú
szabályozó folyamatok jelentős szerephez juthatnak. Az idegrendszer embrionális
fejlődése során a részletesen tanulmányozott, közvetlen sejt-sejt kontaktuson alapuló
laterális gátlás (Rooke and Xu, 1998) mechanizmusa által szelektálódnak ki a
progenitorok közül azok a sejtek, amelyek idegsejtekké differenciálódnak. Laterális
gátláshoz hasonló folyamatok működését sikerült korábban kimutatnom NE-7C2 sejtek
ATRA-indukálta neurogenezise során (Varju P. szakdolgozat, 1997), mely valószínűsíti,
hogy az in vitro neurogenezis során a neuronális fenotípus determináció szabályozása
hasonló folyamatok által megy végbe.
A sejtvonal ATRA-indukálta neuronális differenciációja egymásra épülő
fejlődési stádiumok sorozata, melyek jól jellemezhetők a differenciálódó sejtek
alakjával és egyes neuron-specifikus fehérjék megjelenésével (4. táblázat). A neuronok
differenciálódása során elsőként az N-tubulin fehérje mutatható ki a kisnyúlványos
idegsejtek vázrendszerében, majd a NFL és NFM köztes filamentum fehérjék jelennek
meg, amelyeket a neuronok érése során az NFH alegységek megjelenése követ. A
mikrotubulus-asszociált fehérjék közül a Map2 formát mutattam ki NE-7C2
idegsejtekben.
A központi idegrendszer fejlődése során a neuronok egymással szinaptikus
kapcsolatok bonyolult hálózatát alakítják ki. A képződő szinapszisok felépítéséhez
szükséges fehérjék a sejttestben szintetizálódnak és onnan szállítódnak a pre– és
posztszinaptikus felszínekhez. A neurotranszmitterek raktározására szolgáló szinaptikus
vezikulumok membrán–asszociált fehérjéjéi közé tartozó szinapszin-I és szinaptofizin
fehérjék jelenléte jelzi, hogy az NE–7C2 sejtek indukált neurogenezise során a
szinapszisokra jellemző fehérjék expressziója is megindul.
Felvetődik a kérdés, hogy milyen fejlődési stádiumig differenciálódnak az in
vitro kialakuló neuronok. A hosszú ideig életben tartott tenyészetekben további
vizsgálatokkal kell eldönteni, hogy kialakulnak–e működő szinapszisok és
determinálódik-e az idegsejtek neurotranszmitter fenotípusa. A differenciált idegsejtek
egy részében kimutatható jelentős mennyiségű GABA ill. az előállításáért felelős
107
“felnőtt” GAD enzimformák tartós jelenléte arra utalhat, hogy ezen idegsejtek
GABAerg irányba differenciálódó neuronok.
Asztroglia–sajátságú sejtek a neuronális aggregátumok belsejében jelentek meg
elsőként az indukció második hetében, majd egyre nagyobb számban az
aggregátumokat övező területeken is. E megfigyelés alapján arra következtettem, hogy
az asztrogliasejtek kialakulásához neuronok jelenlétére van szükség. Az idegrendszer
embrionális fejlődése során az elsőként differenciálódó sejtek neuronális sajátságokat
mutatnak, a gliális fehérjéket expresszáló progenitorok csak az első neurogenetikus
hullám után jelennek meg. Megállapíthatjuk, hogy az NE-7C2 sejtvonal in vitro
differenciációja során a neuron ill. asztroglia típusú sejtek szekvenciális indukciója jól
követi az in vivo fejlődés időbeli mintázatát.
Az idegszövetben nagy mennyiségben előforduló oligodendroglia sejtek korai
ill. késői fejlődési stádiumaira jellemző fehérjéket (galaktocerebrozid ill. mielin) az NE-
7C2 sejtek indukálatlan és ATRA-al indukált tenyészeteiben nem tudtam kimutatni.
Valószínűsíthető, hogy önmagában az ATRA és a hatására in vitro kialakuló idegsejtek
és asztrogliális elemek nem biztosítanak megfelelő feltételeket az oligodendroglia sejtek
kifejlődéséhez.
Az NE-7C2 sejtek ATRA-indukálta neuronális differenciációja jól
meghatározott és reprodukálható lépéseken keresztül történik, amely lehetőséget ad a
sejtvonal in vitro modell-rendszerként való felhasználására a neurogenetikus folyamatok
lépéseinek tanulmányozására.
108
II. Ionotrop glutamát rceptorok az in vitro indukált neurogenezis alatt
II./1 Sejtfelszíni NMDA receptorok a fiatal neuronok nyúlványelongációs
szakaszában jelennek meg
Annak ellenére, hogy az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban is expresszálnak
NMDA receptor alegységeket, funkcionális NMDA-csatornákat csak a már nyúlványos
idegsejteken sikerült kimutatni. Az NR2 alegységek közül az NR2A és NR2D mRNS-
eit már a proliferáló progenitorokban expresszálódtak és mRNS szintjeik az indukció
során lényegesen nem változtak. Az alegységek expressziójának mértékét az NR1
alegység expressziós változásai nem befolyásolták. Az NR2A alegység fehérje-formáját
ugyanakkor nem sikerült megbízható módon kimutatni. A Western blot analízis során a
felnőtt patkány agyhomogenizátumból kimutatott érett fehérjéhez képest az NE-7C2
sejtek fehérjemintáiban két kisebb molekulatömegű fehérje jelent meg, igen kis
mennyiségben. Az eredmény arra enged következtetni, hogy az NR2A alegység fehérje
gyorsan degradálódik (Huh and Wenthold, 1999) vagy egy éretlen, poszt-transzlációs
modifikációktól mentes (glikozilálatlan) formája termelődik (Portera-Caillau et al.,
1996; Hall et al., 1997; Laurie et al., 1997). NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során
az NR2C alegység mRNS-e nem volt kimutatható, mely utalhat a sejtvonal előagyi
eredetére. Az idegrendszer fejlődése során ugyanis az NR2C alegység igen behatárolt
expressziót mutat, főleg a kisagy területén és a talamuszban fordul elő (Monyer et al.,
1991). Mivel az NR2D alegységre specifikus ellenanyag nem volt kereskedelmi
forgalomban a kísérletek végzése idején, a fehérje jelenlétét nem tudtam igazolni.
Az NR2 alegységek közül az NR2B alegység expressziója időben egyezett a
neurális hálózatok kialakulásával. Az NR2B fehérje csak neuronális sejtekben volt
kimutatható és expressziós szintjének emelkedése jól korrelált a funkcionális NMDA
csatornával rendelkező neuronok nagyszámú megjelenésével. Az NMDA-vezérelt Ca2+-
csatornával rendelkező sejtek számának növekedése a nyúlvány-rendszerek
kialakulásának időszakában és az ezzel egyidőben emelkedő NR2B fehérjeszint azt
valószínűsíti, hogy az NR2B alegységet tartalmazó NMDA receptor komplexumok a
neuronális érési folyamatokban játszanak fontos szerepet. Funkcionális NMDA
109
csatornával rendelkező sejteket azonban már olyan fejlődési stádiumban is sikerült
kimutatni, amikor az NR2B alegység fehérje még nem volt jelen. Az adatok azt
valószínűsítik, hogy ezeknek a receptoroknak a felépítésében NR2D alegységek
vehettek részt.
NR1 alegységet mind a proliferáló, mind a differenciálódó NE-7C2 sejtek
expresszáltak. Az indukálatlan progenitorokban a legfőbb NR1 transzkriptum a C1 és
C2 kazettákat egyaránt tartalmazta. A csak C1-t ill. csak C2-t tartalmazó mRNS-k
indukálatlan NE-7C2 sejtekben igen alacsony szinten expresszálódtak, de mennyiségük
az indukció előrehaladtával emelkedett. A C2 kazetta tartalmú fehérje mennyiségi
változása ellentétes tendenciát mutat a transzkriptum szintjének változásával, ami arra
utal, hogy a C2 exont tartalmazó fehérje képződése transzkripciós és transzlációs
szinten is szabályozott folyamat. A C2 kazettát tartalmazó fehérje szinte kizárólag a
citoplazma frakcióban ülepedett, jelezvén, hogy a fehérje nem transzportálódik a
sejtfelszínre. Az immuncitokémiai festések alapján a sejten belül raktározott fehérje
valószínűleg az ER vagy a Golgi membránokon belül található. Hogy mi lehet a pontos
szerepe ezeknek a sejten belüli NR1 raktáraknak, és vajon a fehérje kikerül-e innen
valaha a sejtfelszínre, nem tudjuk megválaszolni. A funkcionális NMDA csatornák
hiánya az indukció első hetében azt sugallja, hogy az NR1 fehérje nem jut ki a felszínre
és nem épül be funkcionális receptorba annak ellenére, hogy az NR2D alegység mRNS-
e már expresszálódik ebben az indukciós periódusban. Az NR2 alegységek NR1
alegységhez viszonyított késői megjelenése azt jelezheti, hogy a funkcionális csatornák
kialakításának egyik tényezője az NR2 alegység limitált expressziója lehet (Hall and
Soderling, 1997; Pérez-Otaño et al., 2001). Az NMDA csatornák hiánya az indukció
első hetében azt mutatja, hogy az NE-7C2 neuronokban az NMDA receptorok
sejtfelszíni expresszióját szabályozó folyamatok meggátolják, hogy a neuronok egy
adott fejlődési stádium elérése előtt sejtfelszíni NMDA receptorokat fejezzenek ki.
Korábbi irodalmi adatok és saját eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a C-
terminális exonoknak fontos szerepe van az NR1 fehérje sejten belüli transzportjában
illetve a fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakításában. Az elmúlt években több
kutatócsoport is arra a következtetésre jutott nem neurális eredetű expressziós
rendszerekben (HEK 293 sejtvonal, Xenopus oocyta), hogy az NR1 alegység sejtfelszíni
transzportjához és a funkcionális NMDA csatornák megjelenéséhez legalább egyféle
110
NR2 alegység koexpressziója szükséges (Blahos and Wenthold, 1996; McIlhinney et
al., 1996, 1998; Huh and Wenthold, 1999). Azonban a csak neuronokban kimutatható
NMDA receptorokat felépítő alegységek transzportját szabályozó folyamatok nem
neurális eredetű sejtekben nem feltétlenül működnek, így az NMDA receptor
alegységek sejten belüli lokalizációjának vizsgálatára ezek a rendszerek csak korlátozott
mértékben alkalmasak. A központi idegrendszeri eredetű NE-7C2 sejtvonal ATRA-
indukálta neurális differenciációja során megjelenő NMDA receptor alegység fehérjék
sejtfelszíni transzportját az idegsejtekre jellemező intracelluláris környezetben
tanulmányozhatjuk és a tapasztalt jelenségek jól közelítik az NMDA receptor
alegységek transzportját in vivo is szabályozó folyamatokat.
A nyúlványok stabilizációja és a neuronális hálózatok kialakulása idején NE-
7C2 sejtekben az NR1-a mRNS szintje tovább emelkedik és az N1 exont tartalamazó
(NR1-b) transzkriptumok expressziója is megindul. Az N1 exonok expressziójával
egyidőben jelennek meg az NMDA-indukált [Ca2+]IC emelkedések is, azaz az első
funkcionális NMDA-vezérelt csatornák. Az N1 exon késői megjelenése NE-7C2
sejtekben jó egyezést mutat az in vivo (Laurie and Seeburg, 1994; Prybylowski et al.,
2000) és in vitro adatokkal (Asahi et al., 1998), melyek szintén igazolják, hogy az N1
exon relatíve későn expresszálódik a hippocampusz, talamusz és a kisagy neurális
fejlődése során. Az extracellulárisan elhelyezkedő N1 kazetta beépülése az NR1
alegységbe megnöveli az ionáram amplitúdóját, lecsökkenti a receptor agonista-
affinitását és a receptor által deszenzitizált állapotban eltöltött időt (Zukin and Bennett,
1995; Rumbaugh et al., 2000), melyeknek fontos szerepe lehet a neurális hálózatok
alakulása és a szinaptogenezis folyamán.
Funkcionális NMDA receptorokat elsőként a neuronok nyúlvány-elongációja
idején sikerült kimutatni. Ennek alapján feltételezhető, hogy az NMDA receptorok
szerepet játszanak a neurit-növekedésben. Az indukció későbbi szakaszában, az
idegsejt-hálózatok kialakulásával párhuzamosan, egyre nő a sejtfelszíni NMDA
receptorokat tartalmazó sejtek száma. Irodalmi adatok szerint a receptorok fontos
szerepet játszanak a nyúlványok növekedésében (Lipton and Kater, 1989) valamint a
növekedési kúpok irányválasztásában (Zheng et al., 1996), azaz szabályozzák a
nyúlvány-hálozatok kialakulását. Az in vitro indukált neurogenezis során tapasztalt
időbeli egybeesés is ezeket a megfigyeléseket támasztja alá.
111
A NMDA csatornák folyamatos aktivitása megemelheti az [Ca2+]IC szintet,
amely neuronális halálhoz vezethet, ha az extracelluláris térben magas a glutaminsav
koncentráció. Az indukció 4. napjától az NE-7C2 sejtek folyadékkörnyezetében a
glutaminsav-tartalom nagymértékben csökkent (~ 5 µM). Ez a glutaminsav koncentráció
az NMDA receptorokat még teljes mértékben aktiválni tudja (5. táblázat; Mori és
Mishina, 1995), az AMPA receptorokat, amelyek telítéséhez 100-200 µM glutamát
szükséges, azonban már csak korlátozott mértékben aktiválja (5. táblázat; Nishimura et
al., 2000). Az indukció során a sejtek – nagy valószínűséggel a már kialakult neuronok
– jellegzetes glutaminsav transzporterek segítségével alacsony szintre állítják az
extracelluláris tér glutaminsav koncentrációját, megvédve a sejteket a glutaminsav
toxikus hatásaitól. Glutaminsav transzporterek jelenlétét már igen korai embrionális
stádiumokban sikerült kimuatatni a VZ és IZ területén található progenitorokban és a
KL területén található fiatal neuronokban (Sutherland et al., 1996; Furuta et al., 1997).
Ezek a glutaminsav transzporterek a környezet ion-összetételétől függően vagy
felveszik a glutaminsavat vagy éppen fordítva, a sejt belsejéből az extracelluláris térbe
ürítik (Soeda et al., 1997). Tehát a glutaminsav transzporterek egyrészt megvédik a
sejteket a glutaminsav toxikus hatásaival szemben, másrészt lehetővé teszik a
glutaminsav sejtekből való kiürítését még a szinapszisok kialakulása előtt (Sutherland et
al., 1996; Soeda et al., 1997; Métin et al., 2000). A laboratóriumban jelenleg folyó
vizsgálatok hamarosan tisztázzák, hogy mely glutaminsav transzporterek a felelősek a
glutaminsav csökkentett szintjének kialakításáért az indukált neurogenezis
meghatározott szakaszaiban. A tápfolyadék glutaminsav-koncentrációja azonban nem
NR2A NR2B NR2C NR2D
Glutamát affinitás EC50
~1.7 - 3.7 ~ 0.8 ~ 0.2 ~ 0.4
~ 78.6 ~ 92.7 ~232.1 ~132.9
Glicin affinitás EC50 (µM)
~ 2.1 ~ 0.3 ~ 0.2 ~ 0.1
GluR1flip GluR2flip GluR3flip GluR4flip
5. táblázat NMDA és AMPA receptorokglutamát affinitása, ill. aNMDA receptorok glicinaffinitsa homomer receptorokesetében.
112
ad felvilágosítást az egyes sejtek közvetlen környezetében valóban fenálló
koncentráció-viszonyokról. Az alacsony glutamát-szint azonban lehetővé teszi, hogy a
kibocsátott glutaminsav jelmolekulaként működjön a szomszédos sejtek
kommunikációjában.
II./2 Az NE-7C2 sejtek mind indukálatlan, mind indukált állapotban
funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak
Az AMPA receptor alegység mRNS-k expressziója NE-7C2 sejtekben jól követi
az embrionális fejlődés során megfigyelt expressziós mintázatot (Monyer et al., 1991;
Schererer and Gallo, 1998; Herbison and Simonian, 2001). Indukálatlan, folytonosan
osztódó sejtekben csak a GluR4 alegység volt kimutatható, és mennyisége szinte alig
változott a neuronális indukció során. Korábbi irodalmi adatok alapján feltételezhető,
hogy az alegység homomer csatornák kialakítására is képes (Wenthold et al., 1996).
Xenopus oocitában expresszáltatott homomer GluR4 csatornák Ca2+-ionokra nézve
nagymértékű áteresztőképességet mutattak (Hollmann et al., 1991). AMPA hatására
indukálatlan NE-7C2 sejtek felszíni membránjában kimutatott [Ca2+]IC emelkedés jelzi,
hogy a GluR4 (ill. esetlegesen GluR3) alegységekből működőképes AMPA csatornák
épülnek fel indukálatlan NE-7C2 sejtekben. Mivel depolarizáló koncentrációjú KCl
hatására [Ca2+]IC emelkedést nem tudtunk detektálni indukálatlan NE-7C2 sejtekben,
továbbá az indukálatlan sejtek GluR2 alegységet sem expresszáltak, ezért a
citoplazmában mért Ca2+-szint emelkedését a GluR4 (és esetlegesen GluR3)
alegységekből felépülő AMPA csatornákon keresztül beáramló Ca2+ ionok okozhatták.
Az adatok alapján azonban az is megállapítható, hogy AMPA hatására nem
minden sejtben mérhető [Ca2+]IC emelkedés. A funkcionális heterogenitás jelzi, hogy az
eredetileg egy-sejt eredetű sejtvonalon belül különbségek alakulhatnak ki a sejtek
között, melyek megnyilvánulhatnak az eltérő AMPA receptor alegység expresszióban.
Lokális mikrokörnyezetek kialakulására lehetőség nyílhatott a tenyészetekben, mivel a
méréseket a sejtek kiültetésétől számított 48-72 óra után végeztem. Erre az időre –
véleményem szerint – szükség volt, hogy a sejtek tripszinezéssel történő kiültetése után
a sejtfelszíni receptorok regenerációja teljes mértékben megtörténjen. A tenyészeten
belül 2-3 nap eltelte után kialakuló eltérő mikrokörnyezetek befolyásolhatták az egyes
sejtcsoportok GluR4 expresszióját.
113
Az indukció korai szakaszában (0-2 DIV) a domináns AMPA receptor alegység
még mindig a GluR4 volt. Az indukció előrehaladtával a GluR4-t először a GluR2,
majd a GluR1 alegység expressziója követte. Az indukció első hetének végére már mind
a három alegység mRNS szintje jelentős mennyiséget ért el. Mint ahogy azt láthattuk az
NMDA receptor alegységek ill. a GAD67 fehérjeforma esetében is, a transzkriptum
jelenléte nem egyértelmű bizonyíték a fehérjeforma jelenlétére. Mivel a kísérletek
végzése idején a laboratórium még nem rendelkezett AMPA receptor alegységekre
specifikus ellenanyagokkal, az ATRA-indukálta neurogenezis során kialakuló AMPA
receptorok lehetséges alegység összetételét nem tudtam vizsgálni.
Differenciáltatott tenyészetekben az indukció 7-10. napján a neuronok egy
részében sikerült AMPA receptor agonista hatására [Ca2+]IC emelkedést detektálnom.
Ebben a fejlődési stádiumban a GluR2 alegység mRNS-e már igen jelentős mennyiséget
ért el. Miután a GluR2 alegység editációja nagy hatékonysággal lezajló folyamat
(Sommer et al., 1991), ezért az alegység beépülése a receptorba nagymértékben
csökkentheti annak Ca2+-áteresztő képességét (Hollmann et al., 1991). Ebben az esetben
egyrészt akkor emelkedhet meg az [Ca2+]IC, ha I/ a sejtek felszínén vannak olyan AMPA
receptorok is, amelyek nem tartalmaznak (editált) GluR2 alegységet, II/ ha az AMPA
receptorok aktivitása által depolarizált membránban elhelyezkedő VDCC-kon keresztül
Ca2+ ionok tudnak beáramlani a sejt belsejébe. Amennyiben a sejtek Ca2+-impermeábilis
AMPA receptorokat expresszálnak és nem tartalmaznak VDCC-t, ezzel a módszerrel
nem tudjuk kimutatni a funkcionális AMPA receptorokat. Az NE-7C2 sejtek
tenyészetében differenciálódó neuronok KCl-al történő depolarizációját Ca2+ ionok
beáramlása követte, bizonyítva a VDCC-k jelenlétét a vizsgált neuronok felszínén.
További kísérletes bizonyíték a VDCC-k csatornák jelenlétére, hogy az NMDA-által
kiváltott [Ca2+]IC emelkedést nifedipinnel és conotoxinnal is csökkenteni lehetett, ami az
L-típusú ill. neuron-specifikus VDCC-k jelenlétét, és az AMPA-kiváltott [Ca2+]IC
emelkedésben játszott szerepüket igazolja. Ezen mérések alapján azonban még nem
tudjuk megállapítani, hogy a jelen lévő AMPA receptorok tartalmaznak-e editált GluR2
alegységet vagy nem. Ennek az igen fontos kérdésnek az eldöntéséhez további
kísérletek elvégzésére van szükség.
E13 korból származó előagyi progenitorokon végzett vizsgálatok megmutatták,
hogy a folytonosan osztódó, még elkötelezetlen idegi progenitorok nem rendelkeznek
114
funkcionális AMPA receptorokkal (Maric et al., 2000). Az első Ca2+-permeábilis
AMPA receptorok a progenitorok utolsó osztódása idején detektálhatók a ventrikuláris
zónában található ill. az onnan kilépő sejteken (Maric et al., 2000), és úgy gondolják,
fontos szerepük lehet a proliferáció – differenciáció átmenet szabályozásában a VZ
területén. E13.5 embrionális korból származó szeletekben a KL és IZ sejtjei
funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak, de NMDA receptorokat nem (Metin et
al., 2000). Amíg azonban az IZ sejtjei Ca2+-permeábilis AMPA receptorokkal
rendelkeznek, addig a KL területén Ca2+-permeábilis és impermeábilis receptorok
egyaránt előfordulnak (Maric et al., 2000). A differenciálatlan NE-7C2 sejtek AMPA
receptor expresszió tekintetében egy igen korai fejlődési állapotot – az utolsó osztódás
időszakát - reprezentálnak (Ca2+-permeábilis AMPA receptorokat expresszálnak), és az
AMPA receptor alegységek indukció során megállapított expressziós mintázata is jól
megfeleltethető az in vivo neurogenezis során megfigyelt alegység-expressziók időbeni
lefutásával.
A tenyésztés során használt tápközeg glutaminsav-tartalma (8-12 µm) elegendő
ahhoz, hogy aktiválja a GluR4 csatornákat. Az indukálatlan AMPA csatornáinak gátlása
a neuronszám egyértelmű emelkedését eredményezte, jelezve, hogy a mitótikusan aktív
progenitor sejteken jelenlévő AMPA receptorok egyik szerepe a differenciálatlan
állapot fenntartása, az osztódóképesség megőrzése lehet. A hatás kismértékűnek
mutatkozott az ATRA által előidézett neuronszám-változáshoz képest, ami jelzi, hogy
ezen folyamatok szabályozásában az AMPA receptorok által közvetített hatás csak
egyike a szabályozó mechanizmusoknak. Az AMPA receptorok gátlása a neuronális
indukció teljes időtartama alatt az alkalmazott magasabb koncentrációban képes volt
jelentős mértékben fokozni az ATRA által előidézett neurogenezist. A hatás jelentősnek
mutatkozott, mivel a tenyészetekben mért N-tubulin összmennyisége majdnem a
duplájára emelkedett. A redukciós-kapacitás mérések alapján a tenyészetekben a
sejtszám a kezelésektől függetlenül egyformának mutatkozott, így valószínűsíthető,
hogy a neuronok arányának növekedése és nem az összsejtszám változása a felelős a
mért magasabb értékért.
Ezen kísérletek bebizonyították, hogy mind az indukálatlan sejtek, mind az
indukált neuronok által expresszált AMPA receptorok aktiválódnak a tenyésztés során
és fontos szabályozó szerepet játszanak a differenciáció folyamatának szabályozásában.
115
A szignál-transzdukciós útvonal, amelyen keresztül az AMPA receptorok szabályozó
funkciója érvényesül, azonban nem ismert. Nagy valószínűséggel a receptorokon vagy a
VDCC-n keresztül beáramló Ca2+-ion, mint másodlagos hírvivő aktiválja a sejten belüli
jelátvivő kaszkádot és ezáltal kapcsolódhat olyan jelátviteli pályákhoz (MAP-Kináz
kaszlád), melyek a proliferáció / differenciáció szabályozását végzik (Hayashi et al.,
1999). Az NE-7C2 sejtek fenntartása során az AMPA receptorok extracelluláris
glutaminsav által történő aktivációja az osztódó / elkötelezetlen progenitor állapot
fenntartásában játszhat szerepet, mely az ATRA-kezelés által felülírható program.
Mivel azonban funkcionális AMPA receptort csak a sejtek egy részén sikerült
kimutatni, valószínűleg más folyamatok is nagy jelentőséggel bírnak ezen események
szabályozásában. Az indukált sejtek által expresszált AMPA receptorok egyik szerepe
lehet az egyidejűleg jelen lévő NMDA receptorok aktivációjához szükséges
depolarizáció megteremtése, mely eltávolítja a Mg2+-ionokat a receptor pórusából és
ezáltal az átjárhatóvá válik Ca2+-ionok számára.
II./3 A Ca2+-tranziensek jelentősége az idegrendszer embrionális fejlődése
során
Mára széles körben elterjedt az a tudományos felfogás, hogy az elektromos
aktivitás központi szerepet játszik az idegrendszer embrionális fejlődése során (Moody
et al., 1998). A fejlődés korai szakaszában ezt az aktivitást „spontán” elektromos
aktivitásnak nevezzük, és kialakulásában fontos szerepet tulajdonítanak az [Ca2+]IC
dinamikus változásainak. A fejlődés korai szakaszában a neuronok intracelluláris Ca2+-
szintjében két típusú tranziens emelkedést írtak le: a Ca2+-tüskét és a Ca2+-hullámot. A
tüskék és hullámok nem egyedi jelenségek, hanem egymást követő Ca2+-szint
emelkedések sorozatából állnak, melyek funkcióját az ismétlődések frekvenciája és
amplitúdója kódolja (Spitzer and Ribera, 1998; Spitzer et al., 2000). Az Xenopus
(karmosbéka) idegrendszer kialakulása során a Ca2+-tüskék szerepét leírták a korai K+-
áramok kifejlődésében (Desarmenien and Spitzer., 1991), a GABA immunreaktivitás
kialakulásában (Spitzer et al., 1993) és a GABA-szintetizáló GAD67 mRNS
transzkripciójának szabályozásában (Watt et al., 2000) is. A tranziens Ca2+-hullámok
eddig leírt legfontosabb szerepe a neurit növekedés irányítása (Gu et al., 1994; Spitzer
et al., 2000) a növekedési kúp területén a citoszkeletális átrendeződések szabályozása
116
által (Silver et al., 1990; Gomez et al., 1995). Fontos szerepet tulajdonítanak a Ca2+-
tranzienseknek továbbá a gén-expresszió transzkripciós és transzlációs szintű
szabályozásában is (Barish et al., 1998). Rágcsálókban a szinaptogenezis előtti
időszakban kimutatták a Ca2+-tranziensek szerepét a neuronok migrációjának
szabályozásában (Komuro and Rakic, 1992; 1996), a neuronok differenciációjában (Itoh
et al., 1997) és a neurális hálózatok kialakulásában (Wong et al., 1995).
A Ca2+-tranziensek kialakításában részt vesznek mindazok a receptorok és
ioncsatornák, amelyek lehetővé teszik a Ca2+-ionok mozgását az extracelluláris térből
ill. az intracelluláris raktárakból a citoplazma irányába. Az NE-7C2 sejtek neuronális
differenciációja során NMDA receptorok az indukció 10. napjától minden idegsejten
kimutathatók voltak, AMPA receptorral az indukálatlan ill. az indukált sejtek 10-20%-a
rendelkezett. Az [Ca2+]IC mérései megmutatták, hogy az NMDA és az AMPA is
megemelte a citoszolikus Ca2+-szintet jelezve, hogy az ionotróp glutamát receptorok
szerepet játszanak a Ca2+-tranziensek kialakításában. [Ca2+]IC további emelkedését
idézik elő a membrán depolarizációja által aktivált VDCC-k is, melyek közül mind az
általánosan előforduló L-típusú, mind a neuron-specifikus expresszióval jellemezhető
(N, P és Q-típus) csatornák jelenlétét is sikerült farmakológiai módszerrel kimutatnom
az indukció során.
Az [Ca2+]IC megemelkedése kiváltható a mGluR-ok aktiválásával is (Nakahara
et al., 1997). Ezen receptorok expresszióját nem vizsgáltam, de irodalmi adatok alapján
feltételezhető, hogy jelen vannak a korai neurális fejlődési stádiumokban (van den Pol
et al., 1998). [Ca2+]IC emelkedést idézhet elő továbbá a GABAA receptorok aktiválása is,
amelyek jelenlétét szintén igazolták VZ és IZ sejtjein (van den Pol et al., 1998; Métin et
al., 2000). Az extracelluláris térből beáramló Ca2+ ionok Ca2+-indukálta Ca2+-ürítést
idézhetnek elő az endoplazmatikus retikulumból (ER) RyR-on keresztül ill. a
metabotróp receptorok által aktivált InsP3R-n keresztül is. Az intracelluláris szabad
Ca2+-szintet befolyásoló receptorok és ioncsatornák valamint a sejten belüli Ca2+-
raktárak összehangolt működése alakítja ki azokat az [Ca2+]IC változási mintázatokat,
amelyek kódolják a neuronok számára a környezeti faktorok közvetítette szignálokat.
117
III. Az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban ill. az indukció korai
szakaszában embrionális GAD fehérjéket expresszálnak, melyeket az érett
neuronokban felvált a felnőtt GAD65 forma
A gátló neurotranszmitter GABA és a szintéziséért felelős enzimek, a GAD
fehérjék, valamint a GABA szignalizációs útvonal egyéb komponensei (GABA
transzporterek és receptorok) már jóval a szinaptogenezis előtt jelen vannak a fejlődő
idegrendszerben. A GABA valószínűleg metabolikus komponensként és a sejtek közötti
kommunikáció paracrin/autokrin mediátoraként is működik (Varju et al., 2001a). In situ
hibridizációs vizsgálatok (Katarova et al., 2000a) alapján ma már tudjuk, hogy a
GAD65 és GAD67 mRNS-eket nagymértékben átfedő progenitor-populációk
szintetizálják és hasonlóan a fejlett idegrendszerhez, a két forma a sejten belüli
különböző GABA-raktárak feltöltésében juthat fontos szerephez az embrionális fejlődés
során is. A gerincvelő területén zajló neurogenezis legkorábbi fejlődési stádiumaiban
(Ma et al., 1992), de valószínűleg az idegrendszer más régióiban is (Behar et al., 1993;
Katarova et al., 2000a) az idegi progenitorok csak a rövidített, enzimatikusan inaktív
GAD25 fehérjét tartalmazzák és nincs bennük kimutatható mennyiségű GABA.
Technikai nehézségek miatt nem sikerült kimutatni GABA és különböző GAD formák
kolokalizációját, de eredményeim egyértelműen mutatják, hogy az in vitro neurogenezis
korai szakaszaiban csak az embrionális GAD formák vannak jelen, és expressziójuk
tranziens időbeni lefutást mutat.
A proliferáló NE-7C2 sejtek expresszálnak embrionális GAD mRNS formákat
és kimutatható bennük a GAD25 fehérje. A GABA-produkcióra képes fehérjeformák,
az embrionális GAD44, ill. a teljes hosszúságú GAD65 és GAD67 formák a folytonosan
osztódó, el nem kötelezett sejtekben nincsenek jelen. Indukálatlan sejtekben ill. a
differenciáció korai szakaszában immuncitokémiai módszerrel GABA-t nem sikerült
detektálni, amely alátámasztja az enzimatikus aktivitással rendelkező formák hiányát
ezekben a fejlődési stádiumokban. Az idegrendszer fejlődése során embrionális GAD
mRNS-t és GAD25 fehérje expressziót mutattak ki a VZ osztódó sejtjeiben (Ma et al.,
1992; Behar et al., 1993; 1994); pluripotens ES sejtekben (Bain et al., 1993) és
különböző sejtvonalakban is (Bain et al., 1993; Bond et al., 1990; Katarova Zóya nem
közölt eredményei). Mindezek alapján feltételezhető, hogy az embrionális GAD25
118
forma az idegsejtek elköteleződése és korai differenciációs folyamata során - ma még
nem ismert - szerepet játszhat.
Az enzimatikusan aktív GAD44 fehérje tranziens expressziót mutatott NE-7C2
sejtek indukciója során. A GAD44 expresszió időbeni eltolódása a GAD25 fehérjéhez
képest azt feltételezi, hogy az embrionális GAD transzkripció emelkedése során
elsőként az I-86 mRNS expresszálódik (GAD25 fehérjét kódolja), amelyet az I-80
mRNS expressziója követ, mely mind a két forma szintézisét lehetővé teszi. Az egér
idegrendszer embrionális fejlődése során hasonló szekvenciális expressziós mintázatot
figyeltek meg az I-80 és I-86 transzkriptumok esetében (Szabó et al., 1994).
Ellentétben a GAD25 formával, mely mind az elkötelezetlen, mind a
differenciálódott sejtekben jelen volt, a GAD44 fehérjeforma csak a neuron sajátságokat
mutató sejtekben expresszálódott. A konfokális mikroszkóp segítségével készített
felvételek alapján a sejtekben a GAD44 fehérje mind a sejttest marginális zónájában,
mind a nyúlványok proximális régiójában jelen volt. A GAD25 forma a neuronális
sejttestek mellett a nyúlványok teljes hossza mentén megtalálható volt, ami alapján
feltételezhetjük, hogy a két forma szubcelluláris lokalizációja nem teljesen átfedő.
A GAD25 és GAD44 fehérjék különböző régióit foglalják magukba a GAD67
fehérjének és valószínűleg különböző funkciókat látnak el a neuronális differenciáció
során. A GAD25 fehérje olyan szekvenciákat hordoz, amelyek a sejten belüli célba-
jutattását ill. a fehérje-fehérje interakciók kialakítását közvetítik a teljes hosszúságú
GAD67 fehérjén belül. A GAD44 fehérjétől függetlenül is tud szintetizálódni és
kódolására egy külön transzkriptum is specializálódott az embrionális fejlődés során.
Ennek alapján feltételezhető, hogy szabályozó szerepet játszik az idegi elköteleződés
során. A GAD44 fehérje a teljes hosszúságú GAD67 fehérjéből egy hosszabb régiót
tartalmaz, mely magába foglalja az enzim kofaktor-kötő régióját és enzimaktív
doménjét is. Korábbi in vitro mérési adatok alapján a fehérje képes a glutaminsavból
GABA-t előállítani (Szabó et al., 1994). Annak ellenére, hogy a GAD44 rendelkezik
enzimatikus aktivitással, fénymikroszkópos immuncitokémiai módszerrel nem sikerült
GABA-t kimutatni olyan korai differenciációs stádiumokban (4 DIV), ahol a GAD44
már expresszálódott. Igen alacsony (immuncitokémiai módszerrel nem kimutatható)
mennyiségű GABA (mikro- és fentomoláris) azonban már részt vehet biológiai
119
folyamatokban, és befolyásolhatja a progenitorok proliferációját (LoTurco et al., 1995)
és a fiatal neuronok migrációját (Behar et al., 1996; 1998).
A neurogenezis előrehaladtával mindkét embrionális forma expressziója
lecsökken és a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló transzkriptum válik
meghatározóvá az indukció 10. napja után. Tehát – hasonlóan a fejlődő embrionális
idegrendszerhez – az in vitro neurogenezis során a GAD67 mRNS érési folyamata (az
embrionális 7-es exonok alternatív hasítása) a neuronális differenciáció során
szabályozott és meghatározott fejlődési stádiumokhoz köthető (Szabó et al., 1994).
Annak ellenére, hogy a GAD67 mRNS nagy mennyiségbn kimutatható volt az indukció
10. napjától, a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét nem sikerült kimutatni egyetlen
fejlődési stádiumban sem. Valószínű, hogy transzlációs regulációs mechanizmusok is
befolyásolják a GAD67 fehérje mennyiségét. Eredményeink valószínűsítik, hogy a
GAD67 fehérje csak érett neuronokban ér el jelentős mennyiséget, amely állapot
azonban nem alakul ki az NE-7C2 sejtek in vitro neurogenezisének két hete alatt.
Xenopus embriókon végzett kísérletek megmutatták, hogy a kétéltűek
neurogenezise során a GABA immunreaktivitást (Spitzer et al., 1993) és az xGAD67
(Xenopus GAD67) mRNS expresszióját (Watt et al., 2000) a spontán kialakuló Ca2+-
tranziensek szabályozzák, és a mesterségesen előidézett Ca2+ -tranziensek hasonló
módon upregulálták a xGAD67 mRNS-t. A kísérletek azt is bebizonyították, hogy a
Ca2+-tranziensek frekvenciája a meghatározó az xGAD67 transzkripció szempontjából.
Hasonló változásokat az xGAD65 mRNS és fehérje esetében nem figyeltek meg (Pinal
et al., 1997), ami alátámasztja a két forma eltérő szerepét a neuronális fejlődés során.
Mai tudásunk alapján a gad65 génről egyféle transzkriptum íródik át. Igen
alacsony szintű GAD65 expresszió a neuronális differencició korai szakaszában (4-6
DIV) is kimutatható volt. Az mRNS expresszió a maximumát a 7. napon érte el, melyet
csak késéssel követett a GAD65 fehérje emelt szintje az indukció 10. napján. Az mRNS
és fehérje emelt expressziós szintje közötti eltolódás azt mutatja, hogy a fehérje
mennyisége mind transzkripciós, mind transzlációs szabályozó folyamatok kontrollja
alatt áll.
Az embrionális formák membrán-frakcióban való dúsulása azt feltételezi, hogy
ezen formák esetében a sejten belüli célba-juttatás mechanizmusa más, mint a teljes
hosszúságú GAD67 forma esetében, mely főleg citoplazmában lokalizált (Erlander et
120
al., 1991; Kaufman et al., 1991). Mivel az embrionális formák csak a 7-es exon által
kódolt aminosavakban térnek el a felnőtt formától, nagy valószínűséggel ezen fehérje-
részletek játszanak szerepet a fehérjék membránhoz való kiszállításában. A feltételezés
igazolásához további kísérletek szükségesek, melyek során a kérdéses aminosav-
részleteket más citoplazmatikus fehérjékhez kapcsolva vizsgálhatjuk azok sejten belüli
célba juttatását.
Annak ellenére, hogy mind a GAD65, mind az embrionális GAD formák a
durva-membrán frakcióval ülepedtek, a membránhoz való kötődésük módja eltért. Ezt
bizonyítja, hogy a GAD65 fehérje a TritonX-114 oldható membrán-frakcióban, míg az
embrionális GAD25 és GAD44 formák a TritonX-114 oldhatatlan membrán-frakcióban
dúsultak fel. Meg kell azonban említeni, hogy hasonlóan a GAD65 fehérjéhez, az
embrionális formák egy kis része a citoplazmában marad (immuncitokémiai
eredmények), ahogy azt eredetileg feltételezték a két fehérje szekvenciája alapján.
Hasonló eredményeket mutatott a két fehérje szubcelluláris lokalizációja transzfektált
sejtvonalakon és embrionális extraktumok esetében is (Katarova Z., publikálaltlan
eredmény).
A GABA jelenlétét immuncitokémiai módszerrel az indukció 6. napjától tudtam
kimutatni, amikor a domináns GAD forma a GAD44 volt. A GABA egyenletes eloszlást
mutatott a neuron alakú sejtekben és kirajzolta az axonális növekedési kúpokat is.
Hasonlóan az NE-7C2 sejtekhez, az idegrendszer korai fejlődési stádiumaiból izolált
fiatal idegsejtek is erősen GABA-immunreaktív nyúlványokkal és növekedési kúpokkal
jellemezhetők (Ganguly et al., 2001). Ezen adatok alapján feltételezhető, hogy a GABA
szerepet játszik a növekedési kúpok irányításában és ezáltal az axonok target-
szelekciójában is (Nguyen et al., 2001; Varju et al., 2001).
A GAD65 fehérje upregulációjával egyidőben a GABA megjelenik a
nyúlványok varikozitásaiban is, amelyek gyakorta jelzik a GABAerg sejtek axonjain a
szinapszisok differenciálódását (Umbriaco et al., 1995; Kanaani et al., 1999).
Feltételezhetően a varikozitásokban előforduló GABA előállításáért a GAD65 fehérje a
felelős, míg a GAD44 forma a sejttest és a proximális nyúlvány GABA-pozitivitását
okozza. További kísérletek szükségesek annak megállapítására, hogy milyen szintű
kolokalizációt mutatnak a különböző GAD formák és hogyan korrelál ezekkel a
mintázatokkal a GABA térbeli és időbeli megjelenése. Mindezen kísérletek közelebb
121
vihetnek bennünket annak a kérdésnek a megválaszolásához, hogy vajon milyen
szerepet játszanak az embrionális és felnőtt formák a különböző GABA-raktárak
feltöltésében. Az indukció késői szakaszában (10-12 DIV) a neuronális
nyúlványhálózatok stabilizálódásának idején az embrionális formák expressziója
nagymértékben lecsökken és a GAD65 forma lesz a domináns a sejtekben. A GAD65
fehérje upregulációjával egyidőben a sejtek GABA-tartalma is nő.
Az embrionális és felnőtt GAD mRNS és fehérje formák specifikus és időben
szabályozott megjelenése az embriogenezis során (Szabó et al., 1994) igen nagy
hasonlóságot mutat ahhoz a mintázathoz, amit az NE-7C2 sejtek in vitro
differenciációja során megállapítottam. Adataim azt jelzik, hogy a GAD fehérjék
expressziója és a GABA-akkumuláció megjelenése része az idegsejt fenotípus
kialakításának agyi környezetből kiszakított, regionális elköteleződés lehetőségével nem
rendelkező progenitor sejtek esetében is. A GABA termelés és akkumuláció korai
megjelenése azt sugallja, hogy a kismolekulájú aminosav-származék fontos szerepet
játszik az idegsejt képződésben. A molekuláris mechanizmus és a szerep tisztázása
további kísérleteket igényel, amelyekben az egysejt eredetű idegi progenitor vonalak
fontos modell-rendszert biztosíthatnak.
122
LEGFONTOSABB KÖVETKEZTETÉSEK
1. Az NE-7C2 sejtek ATRA-indukálta in vitro idegi elköteleződése során a
neurogenetikus folyamatok egyes lépései hasonló módon játszódnak le az in vivo
megfigyelt idegsejt fejlődés jelenségeihez. Az NE-7C2 sejtvonal tehát megfelelő in
vitro modell-rendszerként szolgálhat a glutaminsav és GABA neurogenezisben
játszott szerepének vizsgálatára.
2. Ionotróp glutamát receptorok az in vitro neurogenezis teljes időtartama alatt jelen
vannak. Funkcionális AMPA receptorok már elkötelezetlen progenitorsejteken is
megfigyelhetők és a progenitorok osztódásának szabályozásában is szerepet
játszanak, míg az NMDA receptorok később, a neuronok nyúlványosodásának
idején jelennek meg. A glutaminsav a neurogenezis folyamán mindvégig képes lehet
az intracelluláris Ca2+-szint szabályozására.
3. Annak ellenére, hogy a GABAerg fenotípus az indukció késői szakaszában jelenik
meg, a GABA-szintézisre képes enzimformák a neurogenezis korai stádiumaiban is
expresszálódnak. Ezen adatok alapján a korai GABA-szintézisnek a neurális
fenotípus kialakításában lehet jelentősége.
4. Az enzimatikus aktivitással nem rendelkező GAD25 forma jelenléte a még osztódó
progenitorokban és az újonnan kialakuló, fiatal neuronokban arra utal, hogy a
fehérje az idegi progenitorsejtek differenciációja során juthat fontos szerephez.
123
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Madarász Emíliának köszönöm, hogy irányítása mellet végezhettem
kutatómunkámat és hogy átsegített a szakdolgozat, majd a doktori fokozat megszerzése
során felmerülő nem kevés problémán. Az együtt töltött majd 8 év alatt nemcsak
felelősségteljes kutatót, de felnőtt embert is nevelt belőlem.
A laboratóriumban kialakult baráti légkör feledhetővé tette a sokszor
kudarcokkal járó kísérleteket és erőt adott a folytatáshoz. Köszönettel tartozom Környei
Zsuzsának, Schlett Katalinnak, Herberth Balázsnak, Jelitai Mártának, Tárnok
Krisztiánnak, Demeter Kornélnak, Koncz Péternek, Szlávik Vandának és Markó
Károlynak, amiért nemcsak munkatársaim, de barátaim is voltak az elmúlt időszakban.
Dr Schlett Katalinnak és Ulrich Eiselnek külön is szeretném megköszönni az elvégzett
PCR vizsgálatokat, amelyek jelentős mértékben hozzájárultak dolgozatom szakmai
színvonalának emeléséhez.
Köszönöm Dr Szabó Gábornak és Dr Katarova Zoyanak szakmai irányítását és
segítségét, az együtt végzett munka során lehetőségem nyílt molekuláris biológiai
módszerek elsajátítására. A munkacsoportjukkal közösen végzett kísérletek ill. publikált
cikkek doktori dolgozatom szerves részét képezik.
Köszönettel tartozom Dr Tretter Lászlónak és munkatársainak, valamint Dr
Környei Zsuzsának az extracelluláris glutamát-koncentráció fluorimetriás
meghatározásában nyújtott segítségükért.
Szeretném megköszönni Józsa Ildikónak, Csomor Zsuzsának, Vass Évának,
Barabás Liának, Vörös Erzsébetnek és Laczkó Ferencné Évi néninek a munkám során
nyújtott segítségüket.
Szeretném megköszönni Prof. Falus Andrásnak a lehetőséget, hogy konfokális
mikroszkópjukat a rendelkezésünkre bocsátotta és Dr Kovács Péternek pedig hálával
tartozom a képek elkészítése során nyújtott technikai segítségéért.
Családomnak nem tudom eléggé megköszönni feltétlen szeretetüket és
bizalmukat, amelyből mindig erőt tudtam meríteni.
124
IRODALOMJEGYZÉK
Agarwal V. R., Sato S. M. (1993) Retinoic acid affects central nervous system development of Xenopus
by changing cell fate. Mech. Dev., 44: 167-173.
Aghajanian G. K., and Bloom F. E. (1967) The formation of synaptic junctions in the developing rat
brain: a quantitative electron microscopic study. Brain Res., 6: 716-727.
Araneda R. C., Lan J-Y., Zheng X., Zukin S., and Bennett M. L. V. (1999) Spermine and arcaine block
and permeate N-methyl-D-aspartate receptor channels. Biophys. J., 76: 2899-2911.
Asada H., Kawamura Y., Maruyama K., Kume H., Ding R-G., Kanbara N., Kuzume H., Sanbo M., Yagi
T., Obata K. (1997) Cleft palate and decreased brain γ-aminobutyric acid in mice lacking the 67-
kDa isoform of glutamic acid decarboxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 6496-6499.
Asahi M., Hoshimaru M., Hojo M., Matsuura N., Kikuchi H., and Hashimoto N. (1998) Induction of the
N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1 in the immortalized neuronal progenitor cell line
HC2S2 during neuronal differentiation into neurons. J. Neurosci. Res., 52: 699-708.
Asai D. J., and Remolana N. M. (1989) Tubulin isotype usage in vivo: a unique special distribution of the
minor neuronal-specific β-tubulin isotype in pheochromocytoma cells. Dev. Biol., 132: 398-409.
Bahn S., Volk B., and Wisden W. (1994) Kainate receptor gene expression in the developing rat brain. J.
Neurosci., 14: 5525-5547.
Bain G., Ramkumar T. P., Cheng J. M., and Gottlieb D. I. (1993) Expression of the genes coding for
glutamic acid decarboxylase in pluripotent cell lines. Mol. Brain Res., 17: 23-30.
Bally–Cuif L., Boncinelli E. (1997) Transcription factors and head formation in vertebrates. BioEssays,
19: 127–134.
Bardoul M., Drian M. J., and König N. (1997) AMPA/kainate receptors modulate the survival in vitro of
embryonic brainstem cells. Int. J. Dev. Neurosci., 15:695-701.
Barish M. E. (1998) Intracellular calcium regulation of channel and receptro expression in the
plasmalemma: potential sites of sensitivity along the pathways linking transcription, translation
and insertion. J. Neurobiol., 37: 146-157.
Bates S., and Vousden K. H. (1996) p53 in signaling checkpoint: arrest or apoptosis. Curr. Opin. Genet.
Dev., 6: 12-19.
125
Behar T., Schaffner A., Laing P., Hudson L., Komoly S., and Barker J. L. (1993) Many spinal cord cells
transiently express low molecular weight forms of glutamic acid decarboxylase during
embryonic development. Dev. Brain. Res., 72: 203-218.
Behar T., Ma W., Hudson L., and Barker J. L. (1994) Analysis of the anatomical distribution of GAD67
mRNA encoding truncated glutamic acid decarboxylase proteins in the embryonic rat brain. Dev.
Brain Res., 77: 77-87.
Behar T., Li Y-X., Tran H. T., Ma W., Dunlap V., Scott C., and Barker J. L. (1996) GABA stimulates
chemotaxis and chemokinesis of embryonic cortical neurons via calcium-dependent
mechanisms. J. Neurosci., 16: 1808-1818.
Behar T. N., Schaffner A. E., Scott C. A., O’Connell C., and Barker J. L. (1998) Differential response of
cortical plate and ventricular zone cells to GABA as a migration stimulus. J. Neurosci., 18:
6378-6387.
Belhage B., Hansen G. H., Elster L., Schousboe A. (1998) Effects of gamma-aminobutyric acid (GABA)
on synaptogenesis and synaptic function. Perpect. Dev. Neurobiol., 5: 235-246.
Bennet J. A., and DingledineR. (1995) Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane
domains and a channel lining reentrant membrane loop. Neuron, 14: 373-384
Bigge C. F. (1999) Ionotropic glutamate recptors. Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 441-447.
Binder L. I., Frankfurter A., Kim H., Caceras A., Payne M. R., and Rebhun L. I. (1984) Heterogeneity of
microtubule-associated protein 2 during rat brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:
5613-5617.
Binder L. I., Frankfurter A., and Rebhun L. I. (1985) The distribution of tau in the mammalian central
nervous system. J. Cell. Biol., 101: 1371-1378.
Blahos J. and Wenthold R. J. (1996) Relationship between N-methyl-D-aspartate receptor NR1 splice
variants and NR2 subunits. J. Biol. Chem., 271: 15669-15674.
Bleakman D., Schoepp D. D., Ballyk B., Bufton H., Sharpe E. íf., Thomas K., Ornstein P. L., and Kamboj
R. K. (1996) Pharmacological discrimination of GluR5 and GluR6 kainate receptror subtypes by
(3S, 4aR, 6R, 8aR)-6-[2-(1(2)H-tetrazole-5-yl)ethyl)decahydroisoquinoline-3 carboxylic acid.
Mol. Pharmacol., 49: 581-585.
Bleakman D., and Lodge D. (1998) Neuropharmacology of AMPA and kainate receptors.
Neuropharmacology, 37:1187-204.
126
Bond R. W., Wyborsky R. J., and Gottlieb D. I. (1990) Developmentally regulated expression of an exon
containing a stop codon in the gene for glutamic acid decarboxylase. Proc. Natl. Acad. Sci., 87:
8771-8775.
Bond J. A., Wyllie F. S., and Wynford-Thomas D. (1994) Escape from senesence in human diploid
fibroblasts induced directly by mutant p53. Oncogene, 9: 1885-1889.
Bosma P. T., Blázquez M., Collins M. A., Bishop J. D., Drouin G., Priede I. G., Docherty K., and
Trudeau V. L. (1999) Multiplicity of glutamic acid decarboxylases (GAD) in vertebrates:
molecular phylogeny and evidence for a new GAD paralog. Mol. Evol. Biol., 16: 397-404.
Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
using the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248-254.
Brewer G. J., and Cotman C. W. (1989) NMDA receptor regulation of neuronal morphology in cultured
hippocampal neurons. Neurosci Letters, 99: 268-273.
Brilliant M. H., Szabó G., Katarova Z., Kozak C. A., Glaser T. M., Greenspan R. J., and Housman D. E.
(1990) Sequences homologous to glutamic acid decarboxylase cDNA are present on mouse
chromosome 2 and 10. Genomics, 6: 115-122.
Brion J. P., Guilleminot J., Couchie D., Flament-Durand J., and Nunez J. (1988) Both adult and juvenile
tau microtubulue-associated proteins are axon specific in the developing and adult rat
cerebellum. Neuroscience, 25: 139-146.
Burnashev N., Khordorova A., Jonas P., Helm P. J., Wisden Q., Monyer H., Seeburg P. H., and Sakmann
B. (1992) Calcium permeable AMPA/kainate receptros in the fusiform cerebellar glial cells.
Science, 256: 1566-1570.
Catterall W. A. and Striessnig J. (1992) Receptor sites for Ca2+ channel antagonists. Trends Pharmacol.
Sci., 13: 256-262.
Chambon P. (1996) A decade of molecular biology of retinoic acid receptors. FASEB J., 10: 940–954.
Chang Y-C., and Gottlieb D. I. (1988) Characterisation of the proteins purified with monoclonal
antibodies to glutamic acid decarboxylase. J. Neurosci., 8: 2123-2130.
Chatterton J. E., Awobuluyi M., Premkumar L. S., Takahashi H., Talantova M., Shin Y., Cui J., Tu S.,
Sevarino K. A., Nakanashi N., Tong G., Lipton S. A., and Zhang D. (2002) Excitatory glycine
receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature, 415: 793-798.
127
Cherubini E., Gaiarsa J. L., and Ben-Ari Y. (1991) GABA: an excitatory transmitter in early postnatal
life. Tends Neurosci., 14: 5115-519.
Chessler S. D., and Lernmark A. (2000) Alternative splicing of GAD67 results in the synthesis of a third
form of glutamic-acid decarboxylase in human islets and other non-neural tissues. J. Biol.
Chem., 275: 5188-92.
Christgau S., Schierbeck H., Aanstoot H. J., Aagaard L., Begley K., Kofod H., Hejnaes K., and
Baekkeskov S. (1991) Pancreatic beta cells express two autoantigenic forms of glutamic acid
decarboxylase, a 65-kDa hydrophilic form and a 64-kDa amphiphilic form which can be both
membrane-bound and soluble. J. Biol. Chem., 266: 21257-21264.
Christgau S., Aanstoot H. J., Schierbeck H., Begley K., Tullin S., Hejnaes K., and Baekkeskov S. (1992)
Membrane anchoring of the autoantigen GAD65 to microvesicles in pancreatic beta-cells by
palmitoylation in the NH2-terminal domain. J. Cell. Biol., 118: 309-320.
Ciabarra A. M., Sullivan J. M., Gahn L. G, Pecht G., Heinemann S., Sevarino K. A. (1995) Cloning and
characterization of χ-1: a developmentally regulated member of a novel class of the ionotropic
glutamate receptor family. J Neurosci., 15: 6498-508.
Condie B. G., Bain G., Gottlieb D. I., and Capecchi M. R. (1997) Cleft palate in mice with a targeted
mutation in the γ-aminobutyric acid-producing enzyme glutamic acid decarboxylase 67. Proc.
Natl. Acad. Sci., 94: 11451-11455.
Conlon R. A. (1995) Retinoic acid and pattern formation in vertebrates. Trends Genet., 11: 314–319.
Corcoran J. (1998) What are the molecular mechanisms of neural tube defects? Bioessays, 20: 6-8.
Curtis D. R., Phillis J. W., and Watkins J. C. (1959) Chemical excitation of spinal neurons. Nature, 183:
611-612.
Dahl D., and Bignami A. (1986) Neurofilament phosphorilation in development. A sign of axonal
maturation? Exp. Cell. Res., 162: 220-230.
Damjanov I., Clark R. K., Andrews P. W. 1(984) Cytoskeleton of human embryonal carcinoma cells. Cell
Differ. 15: 133-9.
Das S., Sasaki Y. F., Rothe T., Premkumar L. S., Takasu M., Crandall J. E., Dikkes P., Conner D. A.,
Rayudu P. V., Cheung W., Chen H-S. V., Lipton S. A., and Nakanashi N. (1998) Increased
NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature,
393: 377-381.
128
Del Rio J. A., Martínez A., Auladell C., and Soriano E. (2000) Developmental history of the subplate and
developing white matter in the murine neocortex. Neuronal organisation and relationship with
the main afferent systems at embryonic and perinatal stages. Cereb. Cortex., 10: 784-801.
Desarmenien M. G., and Spitzer N. C. (1991) Role of calcium and protein kinase C in development of the
delayed rectifier potassium current in Xenopus spinal neurons. Neuron, 7: 797-805.
Donehower L. A., Harvey M., Slagle B. L., McArthur M. J., Montgomery C. A. Jr, Butel J. S., and
Bradley A. 1(992) Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to
spontaneous tumours. Nature; 356: 215-221.
Dráberová E., Lukaš Z., Ivanyi D., Viklickỳ V., and Dráber P. (1998) Expression of class III β-tubulin in
normal and neoplastic human tissues. Histochem. Cell Biol., 109, 231-239.
Durston A. J., Timmermans J. P. M, Hage W. J., Hendriks H. F. J., de Vries N. J., Heideveld M.,
Nieuwkoop P. D. (1989) Retinoic acid causes an anteroposterior transformation in the
developing central nervous system. Nature, 340: 140-144.
Edwards M. K., S., and McBurney M. W. (1983) The concentration of retinoic acid determines the
differentiated cell types formed by a teratocarcinoma cell line. Dev. Biol., 98: 187-191.
Egebjerg J., and Heinmann S. F. (1993) Ca2+ permeability of unedited and edited versions of the kainate
selective glutamate receptror GluR6. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 755-759.
Ehlers M. D., Fung E. T., O´Brien R. J., and Huganir R. L. (1998) Splice variant-specific interaction of
the NMDA receptor subunit GluRζ1 with neuronal intermediate filaments. J. Neurosci., 18: 720-
730.
Erdö S. L., and Wolff J. R. (1990) γ-aminobutyric acid outside the mammalian brain. J. Neurochem., 54:
363-372.
Erlander M. G., Tillakaratne N. J. K., Feldblum S., Patel N., and Tobin A. J. (1991) Two genes encode
distinct glutamate decarboxylases. Neuron, 7: 91-100.
Fanarraga M. L., Avila J., and Zabala J. C. (1999) Expression of unphosphorilated class III β-tubulin
isotype in neuroepithelial cells demonstrates neuroblast commitment and differentiation. Eur. J.
Neurosci., 11: 517-527.
Ferreira A., and Caceras A. (1992) Expression of the class III β-tubulin isotype in developing neurons in
culture. J. Neurosci. Res., 32: 516-529.
129
Fletcher E. J., and Lodge D. (1996) New developments in the molecular pharmacology of AMPA and
kainate receptors. Pharmacol. Ther., 70: 65-89.
Flint A. C., Dammerman R. S., and Kriegstein A. R. (1999) Endogenous activation of metabotropic
glutamate receptors in neocortical development causes neuronal calcium oscilations. Proc. Natl.
Acad. Sci., 96: 12144-12149.
Furuta A., Rothstein J. D., and Martin L. J. (1997) Glutamate transporter protein subtypes are expressed
differentially during rat CNS development. J Neurosci., 17: 8363-75.
Gallo V., Pende M., Scherer S., Molne M., and Wright P. (1995) Expression and regulation of kainate and
AMPA receptors in uncommitted and committed neural progenitors. Neurochem. Res., 20: 549-
560.
Ganguly K., Schinder A. F., Wong S. T., and Poo M. (2001) GABA itself promotes the developmental
switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell, 105: 521-32.
Gao X-B., van den Pol A. N. (2000) GABA release from mouse axonal growth cones. J. Physiol., 523:
629-637.
Gilbert S. F. (1991) Developmental Biology. Third edition, Sinauer Associates, Inc. Sunderland,
Massachusettes; 155-200 oldalak.
Green L. A., and Tischler A. S. (1976) Establishement of a noradrenergic clonal line of rat adrenal
pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci., 73: 2424-
2428.
Gomez T. M., Snow D. M., and Letourneau P. C. (1995) Characterisation of spontaneous calcium
transients in nerve growth cones and their effect on growth cone migration. Neuron, 14: 1233-
1246.
Gryenkiewicz G., Poenie M., and Tsien R.Y. (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly
improved fluorescence properties. J. Biol. Chem., 260: 3440-3450.
Gu X., Olson E. C., and Spitzer N. C. (1994) Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during
early differentiation. J. Neurosci., 14: 6325-6335.
Hall R. A., and Soderling T. R. (1997) Differential surface expression and phosphorilation of N-methyl-
D-aspartate receptor subunits NR1 and NR2 in cultured hippocampal neurons. J. Biol. Chem.,
272: 4135-4140.
130
Hall R. A., Hansen A., Andersen P. H., and Soderling T. R. (1997) Surface expression of the AMPA
receptor subunits GluR1, GluR2, and GluR4 in stably transfected baby hamster kidney cells. J.
Neurochem., 68: 625-630.
Hansen G. H., Belhage B., Schousboe A., and Meier E. (1987) Temporal development of GABA agonist
induced alterations in ultrastructure and GABA receptor expression in cultured cerebellar
granule cells. Int. J. Dev. Neurosci., 5: 263-269.
Hansen J. J., Flemming J. S., Lund T. M., Nielsen B., Reinhardt A., Breum I., and Krogsgaard-Larsen P.
(1995) AMPA receptor agonists: structural, conformational and stereochemical aspects.
Krogsgaard-Larsen P. Hansen J. J. (Eds) Excitatory amino acid receptors: Design of agonists
and antagonists. Ellis Horwood, Chichester, UK.
Harvey M., Sands A. T., Weiss R. S., Hegi M. E., Wiseman R. W., Pantazis P., Giovanella B. C., Tainsky
M. A., Bradly A., and Donehower L. A. (1993) In vitro growth characteristics of embryo
fibroblasts isolated from p53-deficient mice. Oncogene, 8: 2457-2467.
Hayashi T., Umemori H., Mishina M., Yamamoto T. (1999) The AMPA receptor interacts with and
signals through the protein tyrosine kinase Lyn. Nature, 397: 72-6.
Haydar T. F., Wang F., Schwartz M. L., and Rakic P. (2000) Differential modulation of proliferation in
the neocortical ventricular and subventricular zones. J. Neurosci., 20: 5764-5774.
Henion P. D., and Weston J. A. (1994) Retinoic acid selectively promotes the survival and proliferation of
neurogenic precursors in cultured neural crest cell populations. Dev. Biol., 161: 243-250.
Herberth B., Pataki Á., Jelitai M., Schlett K., Deák F., Spät A., and Madarász E. (2002) Changes of KCl
sensitivity of proliferating neural progenitors during in vitro neurogenesis. J. Neurosci. Res., 67:
574-582.
Herkert M., Röttger S., and Becker C. (1998) The NMDA receptor subunit NR2B of neonatal rat brain:
complex formation and enrichment in axonal growth cones. Eur. J. Neurosci. 10, 1553-1562.
Hollmann M., Hartley M., and Heinemann S. (1991) Ca2+ permeability of KA-AMPA--gated glutamate
receptor channels depends on subunit composition. Science 252: 851-3.
Hollmann M., Boulter J., Maron C., Beasley L., Sullivan J., Pecht G., and Heinemann S. (1993) Zinc
potentiates agonist-induced currents at certain splice variants of the NMDA receptor. Neuron,
10: 943-954.
Hollmann M., and Heinemann S. (1994) Cloned glutamate receptors. Annu. Rev. Neurosci., 17: 31-108.
131
Hughes P. E., Alexi T., and Schreiber S. S. (1997) A role for the tumour suppressor gene p53 in
regulating neuronal apoptosis. Neuroreport. 8: 5-12.
Huh K-H., and Wenthold R. J. (1999) Turnover analyses of glutamate receptors identifies a rapidly
degraded pool of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit, NR1, in cerebellar granule cells. J.
Biol. Chem., 274: 151-157.
Hume R. I., Dingledine R., and Heinemann S. F. (1991) Identification of a site in glutamate receptor
subunits that controls calcium permeability. Science, 253: 1028-1030.
Hsu C-C., Davis K. M., Jin H., Foos T., Floor E., Chen W., Tyburski J. B., Yang C-Y., Schloss J. V., and
Wu J-Y. (2000) Association of L-glutamic acid decarboxylase to the 70-kDa heat shock protein
as a potential anchoring mechanism to synaptic vesicles. J. Biol. Chem., 275: 20822-20828.
Imrik P., and Madarasz E. (1991) Importance of cell-aggregation during induction of neural
differentiation in PCC-7 embryonal carcinoma cells. Acta Physiol Hung.;78: 345-58.
Itoh K., Ozaki M., Stevens B., and Fields R. D. (1997) Activity-dependent regulation of N-cadherin in
DRG neurons: Differential regulation of N-cadherin , NCAM and L1 by distinct patterns of
action potentials. J. Neurobiol., 33: 735-748.
Ji F, Kanbara N, Obata K (1999) GABA and histogenesis in fetal and neonatal brain lacking both the
isoforms of glutamic acid decarboxylase. J. Neurosci. Res. 33:187-194.
Jones-Villeneuve E. M. V., McBurney M. W., Rogers K. A., and Kalnins V. I. (1982) Retinoic acid
induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. J. Cell Biol. 94:
253-262.
Jonas P., and Burnashev N. (1995) Molecular mechanisms controlling calcium entry through AMPA-type
glutamate channels. Neuron, 15: 987-990.
Kanaani J., Lissin D., Kash S. F., and Baekkeskov S. (1999) The hydrophilic isoform of glutamate
decarboxylase, GAD67, is targeted to membranes and nerve terminals independent of
dimerisation with the hydrophobic membrane-anchored isoform, GAD65. J. Biol. Chem., 274:
37200-37209.
Kang M. K., and Park N. H. (2001) Conversion of normal to malignant phenotype: telomere shortening,
telomerase activation, and genomic instability during immortalization of human oral
keratinocytes. Crit Rev Oral Biol Med, 12: 38-54.
Kash S. F., Johnson R. S., Tecott L. H., Noebels J. L., Mayfield R. D., Hanahan D., and Baekkeskov S.
(1997) Epilepsy in mice deficient in the 65-kDa isoform of glutamic acid decarboxylase. Proc.
Natl. Acad. Sci., 94: 14060-14065.
132
Katarova Z., Szabó G., Mugnaini M., and Greenspan R. J. (1990) Molecular identification of the 62 kd
form of glutamic acid decarboxylase from mouse. Eur. J. Neurosci., 2: 190-202.
Katarova Z., Sekerková G., Prodan S., Mugnani E., and Szabó G. (2000a) Domain-restricted expression
of two glutamic acid decarboxylase in midgestation mouse embryos. J. Comp. Neurol., 424:
607-627.
Katarova Z, McIlhinney JAR, Churchill G and Szabó G (2000b) Subcellular distribution and activity of in
vitro expressed glutamic acid decarboxylase (GAD) forms. Eur. J. Neurosci., 12: Suppl. 11, p.
42.
Kaufman D. L., Houser C. R., and Tobin A. J. (1991) Two forms of the gamma-aminobutyric acid
synthetic enzyme glutamate decarboxylase have distinct intraneuronal distribution and cofactor
interaction. J. Neurochem., 56: 720-723.
Kawai F., and SterlingP. (1999) AMPA receptors activates a G-protein that supresses a cGMP-gated
current. J. Neurosci., 19: 2954-2959.
Keinänen A., Arvola M., Kuusinen A., and Johnson M. (1997) Ligand recognition in glutamate receptors:
insights from mutagenesisof the soluble alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic
acid (AMPA)-binding domain of glutamate receptor type D (GluR-D). Biochem. Soc. Trans., 25:
835-838.
Kelly B. M., Gillespie C. S., Sherman D. L., and Brophy P. J. (1992) Schwann cells of the myelin-
forming phenotype express neurofilament protein NF-M. J. Cell. Biol., 118: 397-410.
Kim H. Y., Sapp D. W., Olsen R. W., and Tobin A. J. (1994) GABA alters GABAA receptor mRNAs and
increases ligand binding. J. Neurochem., 62: 2334-2337.
Komuro H., and Rakic P. (1992) Selective role of N-type calcium channels in neuronal migration.
Science, 257: 806-809.
Komuro H., and Rakic P. (1993) Modulation of neuronal migration by NMDA receptors. Science, 260:
95-97.
Komuro H., and Rakic P. (1996) Intracellular Ca2+-fluctuations modulate the rate of neuronal migration.
Neuron, 17: 275-285.
Kornau H. C., Schenker L. T., Kennedy M. B., and Seeburg P. (1995) Domain interaction between
NMDA receptor subunits and the postsynaptic density protein PSD-95. Science, 269: 1737-1740.
133
Köhler M., Burnashev N., Sakmann B., and Seeburg P. H. (1993) Determinants of calcium permeability
in bith TM1 and TM2 of high affinity kainate receptor channels: diversity by RNA editing.
Neuron, 10: 491-500.
Krizbai I. A., Katarova Z., Szabó G., Parducz A., and Wolff J. R. (2000) Modulation of the truncated
GAD25 by estrogen in the olfactory bulb of adult rats. Neuroreport, 11: 791-794.
Krogsgaard-Larsen P., Madsen U., Ebert B., and Hansen J. J. (1994) Krogsgaard-Larsen P. Hansen J. J.
(Eds) Excitatory amino acid receptors: Design of agonists and antagonists. Ellis Horwood,
Chichester, UK.
Laemmli U. K. (1970) Cleavage of stuctural proteins during the assembly of the head of bacteriophage
T4. Nature, 227: 680-685.
Lauder J. M., Han V. K. M., Henderson P., Verdoorn T., and Towle A. C. (1986) Prenatal ontogeny of
the GABAergic system in the rat brain: an immunocytochemical study. Neuroscience, 19: 465-
493.
Lauder J. M. (1993) Neurotransmitters as growth regulatory signals: the role of receptors and second
messengers. Trends Neurosci., 16: 233-240.
Laurie D. J., Wisden W., and Seeburg P. H. (1992) The distribution of thirteen GABAA receptor subunit
mRNAs in the rat brain. III. Embryonic and postnatal development. J. Neurosci., 12: 41511-
41172.
Laurie D. J., and Seeburg P. H. (1994) Regional and developmental heterogeneity in splicing of the rat
brain NMDAR1 mRNA. J. Neurosci., 14: 3180-3194.
Laurie D. J., Bartke I., Schoepfer R., Naujoks K., and Seeburg P. H. (1997) Regional, developmental and
interspecies expression of the four NMDAR2 subunits, examined using monoclonal antibodies.
Mol. Brain. Res., 51: 23-32.
Lazarewicz J. W., Wrob1ewski J. T., Palmer M. E., and Costa E. (1989) Reduction of disulfide bonds
activates NMDA sensitive glutamate receptors in primary cultures of cerebellar granule cells.
Neurosci. Res. Commun., 4: 91-97.
Lee M. K., and Cleveland D. W. (1996) Neuronal intermediate filaments. Annu. Rev. Neurosci., 19: 187-
217.
Lee Y-H., Fang K-M., Yang C-M., Hwang H-M., Chiu C-T., and Tsai W. (2000) Kainic acid induced
neurotrophic activities in developing cortical neurons. J. Neurochem., 74: 2401-2411.
134
Lendhal U., Zimmerman L., and McKay R. (1990) CNS stem cells express a new class of intermediate
protein. Cell, 60: 585-595.
Lerma J., Paternain A. V., Rodríguez-Moreno A., and López-García J. C. (2001) Molecular Physiology of
Kainate receptors. Pharmacol. Rev., 81: 971-998.
Lewis S. A., and Cowan N. J. (1988) Complex regulation and functional versatility of mammalian α− and
β-tubulin isotypes during differentiation of testis and muscle cells. J. Cell. Biol., 106: 2023-
2033.
Lin J. W., Wyszynski M., Madhavan R., Sealock R., Kim J. U., and Shang M. (1998) Yotiao, a novel
protein of neuromuscular junction and brain that interacts with specific splice variants of NMDA
receptor subunit GluRζ1. J. Neurosci., 18: 2017-2027.
Lipton S. A. and Kater S. B. (1989) Neurotransmitter regulation of neuronal outgrowth, plasticity and
survival. Trends Neurosci., 112: 265-270.
Livingstone L. R., White A., Sprouse J., Livanos E., Jacks T., and Tisty T. D. (1992) Altered cell cycle
arrest and gene amplification potential accompany loss of wild type p53. Cell, 70: 923-935.
Lomeli H., Mosbacher J., Melcher T., Hoger T., Geiger J. R. P., Kuner T., Monyer H., Higuchi M., Bach
A., and Seeburg P. H. (1994) Control of kinetic properties of AMPA receptor channels by
nuclear RNA editing. Science, 266: 1709-1713.
LoTurco J. J., Blanton M. G., and Kriegstein A. R. (1991) Initial expression and endogenous activation of
NMDA channels in early neocortical development. J. Neurosci., 11: 792-799.
LoTurco J. J., Owens D. F., Heath M. J. S., Davis M. B. E., and Kriegstein A. R. (1995) GABA and
glutamate depolarise cortical progenitor cells and inhibit DNA synthesis. Neuron, 15: 255-262.
Lovinger D. M., White G., and Weight F. F. (1989) Ethanol inhibites NMDA-activated ion current in
hippocampal neurons. Science, 243: 1721-1724.
Lumsden A., and Krumlauf R. (1996) Patterning the vertebrate neuraxis. Science, 274: 1109–1114.
Ma W., Behar T., Maric D., Maric I., Barker J. L. (1992) Neuroepithelial cells in the rat spinal cord
express glutamate decarboxylase immunoreactivity in vivo and in vitro. J. Comp. Neurol., 325:
257-270.
Ma W., and Barker J. L. (1995) Complementary expression of transcripts encoding GAD67 and GABAA
receptor α4, β1 and γ1 subunits in the proliferative zone of the embryonic rat central nervous
system. J. Neurosci., 15: 2547-60.
135
Ma W., Liu Q. Y., Maric D., Sathanoori R., Chang Y. H., and Barker J. L. (1998) Basic FGF-responsive
telencephalic precursor cells express functional GABA(A) receptor/Cl-channels in vitro. J
Neurobiol., 35:2 77-86.
Madden D. R. (2002) The structure and function of glutamate receptor ion channels. Nat. Rev. Neurosci.
31: 91-101-
Manabe I., and Owens G. K. (2001) Recruitment of serum response factor and hyperacetylation of
histones at smooth muscle-specific regulatory regions during differentiation of a novel P19-
derived in vitro smooth muscle differentiation system. Circ Res. 88: 1127-34.
Manzoni O., Prezeau L., Marin P., Bockaert J., and Fagni L. (1992) Nitric oxide-induced blockade of
NMDA receptors. Neuron, 8: 653-662.
Maric D., Liu Q-Y., Grant G. M., Andreadis J. D., Hu Q., Chang Y. H., Barker J., Pancrazio J. J., Stenger
D. A., and Ma W. (2000) Functional ionotropic glutamate receptors emerge during terminal cell
division and early neuronal differentiation of rat neuroepithelial cells. J. Neurosci. Res., 61: 652-
662.
Marshall H., Studer M., Pöpper H., Aparicio S., Kuroiwa A., Brenner S., Krumlauf R. (1994) A
conserved retinoic acid response element required for early expression of the homeobox gene
Hoxb-1. Nature, 370: 567-571.
Martin D. L., and Rimvall K. (1993) Regulation of gamma-aminobutyric acid synthesis in the brain. J.
Neurochem., 60: 395-407.
Martin D. L., Hongcheng L., Martin S. B., and Wu S. J. (2000) Structural features and regulatory
properties of the brain glutamate decarboxylases. Neurochem. Int., 37: 111-119.
Mayer M. L., and Vyklicky L. Jr. (1989) Concanavalin A selectively reduces desensitization of
mammalian neuroneal quisqualate receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1411-1415.
Mayer M. (1998) Ion-binding sites in NMDA receptors: classical approaches provide the numbers.
Nature Neurosci., 1: 433-434.
McBurney M. W., Jones-Villeneuve E. M., Edwards M. K. S., and Anderson P. J. (1982) Control of
muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature, 299:
165-167.
McCool B. A., Pin J-P., Harpold M. M., Brust P. F., Stauderman K. A., and Lovinger D. M. (1998) Rat
group I metabotropic glutamate receptors inhibit neuronal Ca2+ channels via multiple signal
transduction pathways in HEK 293 cells. J. Neurophysiol., 79: 379-391.
136
McIlhinney R. A. J., Molnár E., Atack J. R., and Whiting P. J. (1996) Cell surface expression of the
human N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1a requires the co-expression of the NR2A
subunit in transfected cells. Neuroscience, 70: 989-997.
McIlhinney R. A. J., Le Bourdellés B., Molnár E., Tricaud N., Streit P., and Whiting P. J. (1998)
Assembly, intracellular targeting and cell surface expression of the human N-methyl-D-aspartate
receptor subunits NR1a and NR2A in transfected cells. Neuropharmacology, 37: 1355-1367.
Meguro H., Mori H., Araki K., Kushiya E., Kutsuwada T., Yamazaki M., Kumanishi T., Arakawa M.,
Sakimura K., and Mishina M. (1992) Functional characterization of a heteromeric NMDA
receptor channel expressed from cloned cDNAs. Nature, 357: 70-74.
Meier E., Hertz L., and Schousboe A. (1991) Neurotransmitters as developmental signals. Neurochem.
Int., 19: 1-15.
Menezes J. R. L., and Luskin M. B. (1994) Expression of neuron-specific tubulin defines a novel
population in the proliferative layers of the developing telencephalon. J. Neurosci., 14: 5399-
5416.
Metz T., Harris A. W., and Adams J. M. (1995) Absence of p53 allows direct immortalization of
hematopoietic cells by the myc and raf oncogenes. Cell, 82: 29-36.
Métin C., Denizot J. P., and Ropert N. (2000) Intermediate zone cells express calcium-permeable AMPA
receptors and establish close contact with growing axons. J Neurosci., 20: 696-708.
Miranda-Contreras L., Mendoza-Briceno R. V., and Palacios-Pru E. L. (1998) Levels of monoamine and
amino acid neurotransmitters in the developing male mouse hypothalamus and in histotypic
hypothalamic cultures. Int J Dev Neurosci., 16: 403-12.
Miranda-Contreras L., Benitez-Diaz P. R., Mendoza-Briceno R. V., Delgado-Saez M. C., and Palacios-
Pru E. L. (1999) Levels of amino acid neurotransmitters during mouse cerebellar neurogenesis
and in histotypic cerebellar cultures. Dev Neurosci., 21: 147-58.
Miranda-Contreras L., Ramirez-Martens L. M., Benitez-Diaz P. R., Pena-Contreras Z. C., Mendoza-
Briceno R. V., and Palacios-Pru E. L. (2000) Levels of amino acid neurotransmitters during
mouse olfactory bulb neurogenesis and in histotypic olfactory bulb cultures. Int J Dev Neurosci.,
18: 83-91.
Mishina M., Sakimura K., Mori H., Harabayashi M., Uchino S., and Nagahari K. (1991) A single amino
acid residue determinates the Ca2+ permeability of AMPA selective glutamate receptor channels.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 180: 813-821.
137
Moody W. J. (1998) Control of spontaneous activity during development. J. Neurobiol., 37: 97-109.
Monyer H., Seeburg P. H., and Wisden W. (1991) Glutamate operated channels: Developmentally early
and mature forms arise by alternative splicing. Neuron, 6: 799-810.
Monyer H., Sprengel R., Schoepfer R., Herb A., Higuchi M., Lomeli H., Burnashev N., Sakmann B., and
Seeburg P (1992) Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of
subtypes. Science, 256: 1217-1221.
Monyer H., Burnashev N., Lauri D. J., Sakmann B., and Seeburg H. (1994) Developmental and regional
expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors. Neuron, 12: 529-
540.
Mori H, and Mishina M. (1995) Structure and function of NMDA receptor channel. neuropharmacology,
34: 1249-1237.
Mosmann T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation
and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 65: 55-63.
Mothet J-P., Parent A. T., Wolosker H., Brady R. O., Linden D. J., Ferris C. D., Rogawski R. A., and
Snyder S. H. (2000) D-serine is an endogenous ligand for the glycine site of N-methyl-D-
aspartate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 4926-4931.
Murphy A., Breen K. C., Long A., Feighery C., Casey E. B., and Kelleher D. (1993) Neurofilament
expression in human T-lymphocytes. Immunology, 79: 167-170.
Nakahara K., Okada M., and Nakanashi S. (1997) The metabotropic glutamate receptor mGluR5 induces
calcium oscillations in cultured astrocytes via protein kinase C phosphorylation. J. Neurochem.,
69: 1467-1475.
Nakanashi N., Shneider N. A.., and Axel R. (1990) A family of glutamate receptor genes: evidence for
the formation of heteromultimeric receptors with distinct channel properties. Neuron, 5: 569-581
Nishimura S., Hzuka M., Wakamori M., Akiba I., Imoto K., and Barsoumian E. L. (2000) Stable
expression of human homomeric and heteromeric AMPA receotir subunits in HEK293 cells.
Rec. Channels., 7: 139-150.
Nguyen L., Rigo J-M., Rocher V., Belachew S., Malgrange B., Rogister B., Leprince P., and Moonen G.
(2001) Neurotransmitters as early signals for central nervous system development. Cell Tissue
Res., 305: 187-202.
138
Obata K., Fukuda T., Konishi S,. Ji F-Y., Mitoma H., and Kosaka T. (1999) Synaptic localization of the
67,000 mol. Wt isoform of glutamate decarboxylase and transmitter function of GABA in the
mouse cerebellum lacking the 65,000 mol. Wt isoform. Neuroscience, 93: 1475-1482.
Okabe S., Miwa A., and Akado H. (1999) Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell
surface expression of the NMDA receptor GluRζ1 subunit. J. Neurosci. 19: 7781-7792.
Owens D. F., Boyce L. H., Davis M. B. E., Kriegstein A. R. (1996) Excitatory GABA responses in
embryonic and neonatal cortical slices demonstrated by gramicidin perforated-patch recording
and calcium imaging. J. Neurosci., 16: 6414-6423.
Owens D. F., Liu X., and Kriegstein A. R. (1999) Changing properties of GABA(A) receptor-mediated
signalling during early neocortical development. J Neurophysiol., 82: 570-83.
Paschen W., Schmitt J., Gissel C., and Dux E.. (1997) Developmental changes of RNA editing of
glutamate receptor subunits GluR5 and GluR6: in vivo versus in vitro. Dev. Brain Res., 98: 271-
280.
Paupard M-C., O'Connell M. A., Gerber A. P., Zukin R. S. (2000) Patterns of developmental expression
of the RNA editing enzyme rADAR2. Neuroscience., 95: 869-79.
Pérez-Otaño I., Schulteis C. T., Contractor A., Lipton S. A., Trimmer J. S., Sucher N. J., and Heinemann
S. F. (2001) Assembly with the NR1 subunit is required for surface expression of NR3A-
containing NMDA receptors. J. Neurosci., 21: 1228-1237.
Peters G. (1994) Stifled by inhibitions. Nature, 371: 204-205.
Pfeiffer S.E., Jakob H., Mikoshiba K., Dubois P., Guenet J.L., Nicolas J.F., Gaillard J., Chevance G., and
Jacob F. (1981) Differentiation of a teratocarcinoma line: preferential development of
cholinergic neurons. J Cell Biol, 88: 57-66.
Pinal C. S., Cortessis V., and Tobin A. J. (1997) Multiple elements regulate GAD65 transcription. Dev.
Neuroci., 19: 465-475.
van den Pol A. N., Gao X-B., Patrylo P. R., Ghosh P. K., and Obrietan K. (1998) Glutamate inhibits
GABA excitatory activity in developing neurons. J. Neurosci., 18: 10749-10761.
Portera-Cailliau C., Price D. L., and Martin L. J. (1996) N-Methyl-D-Aspartate receptor proteins NR2A
and NR2B are differentially distributed in the developing rat central nervous sytem as revealed
by subunit-specific antibodies. J. Neurochem., 66: 692-700.
139
Prybylowski K., Rumbaugh G., Wolfe B. B., and Vicini S. (2000) Increased exon 5 expression alters
extrasynaptic NMDA receptors in cerebellar neurons. J. Neurochem., 75: 1140-1146.
Reichling D. B., Kyrozis A., Wang J., MacDermott A. B. (1994) Mechanisms of GABA and glycine
depolarization-induced calcium transients in rat dorsal horn neurons. J. Physiol., 476: 411-421.
Riederer B., and Matus A. (1985) Differential expression of distinct microtubule-associate proteins during
brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6006-6009.
Riederer B., Cohen R., and Matus A. (1986) MAP5: a novel microtubule-associate protein under strong
developmental regulation. J. Neurocytol., 15: 763-775.
Riederer B., Zagon I. M., and Goodman S. R. (1987) Brain spectrin (240/235) and brain spectrin
(240/235E): differential expression during mouse brain development. J. Neurosci., 7: 864-874.
Riederer B. M., Monnet-Tschudi F., and Honegger P. (1992) Development and maintanance of the
neuronal cytoskeleton in aggregated cell cultures of fetal rat telencephalon and influence of
elevated K+ concentrations. J. Neurochem., 58: 649-658.
Rivera C., Voipio .J, Payne J. A., Ruusuvuori E., Lahtinen H., Lamsa K., Privola U., Saarma M., and
Kaila K. (1999) The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarising during
neuronal maturation. Nature 397: 251-255.
Roberson M. D., Toews A. D., Goodrum J. F., and Morell P. (1992) Neurofilament and tubulin mRNA
expression in Schwann cells. J. Neurosci. Res., 33: 156-162.
Rodriguez-Moreno A., and Lerma J. (1998) Kainate receptor modulation of GABA release involves a
metabotropic function. Neuron, 20: 1211-1218.
Rooke J. E., and Xu T. (1998) Positive and negative signals between interacting cells for establishing
neural fate. Bioessays, 20: 209-14.
Rosemund C., Stein-Bach Y., and Stevens C. (1998) The tetrameric structure of a glutamate receptor
channel. Science, 280: 1596-1599.
Rumbaugh G., Prybylowski K., Wang J. F., and Vicini S. (2000) Exon 5 and spermine regulate
deactivation of NMDA receptor subtype. J. Neurophysiol., 83: 1300-1306.
Sah D. W., Ray J., and Gage F. H. (1997) Regulation of voltage- and ligand-gated currents in rat
hippocampal progenitor cells in vitro. J Neurobiol., 32: 95-110.
Sakimura K., Morita T., Kushiya E., and Mishina M. (1992) Primary structure and expression of the γ2
subunit of the glutamate receptro channel selective for kainate. Neuron, 8: 267-274.
140
Sather W. A., Tanabe T., Zhang J.-F., Mori Y., Adams M. E., and Tsien R. W. (1993) Distinctive
biophysical and pharmacological properties of class A (BI) calcium channel α1 subunits. Neuron
11: 291-303.
Schererer S. E. and Gallo V. (1998) Expression and regulation of kainate and AMPA receptors in the rat
neural tube. J. Neurosci. Res. 52: 356-368.
Schlett K., and Madarász E. (1997) Retinoic acid induced neural differentiation in a neuroectodermal cell
line immortalised by p53-deficiency. J. Neurosci. Res. 47: 405-417.
Serafini R., Ma W., Maric D., Maric I., Lahjouji F., Sieghart W., and Barker J. (1998) Initially expressed
early rat embryonic GABAA receptor Cl- ion channel exhibit heterogeneous channel properties.
Eur. J. Neurosci., 10: 1771-1783.
Sheikh S. N., and Martin D. L. (1996) Heteromers of glutamate decarboxylase isoforms occur in rat
cerebellum. J. Neurochem., 66: 2082-2090.
Shi Y., Velt B., and Baekkeskov S. (1994) Amino acid residues 24-31 but not palmitoylation of cysteine
30 and 45 are required for membrane anchoring of glutamic acid decarboxylase, GAD65. J. Cell
Biol., 124: 927-934.
Shaw G., and Weber K. (1982) Differential expression of neurofilament triplet proteins in brain
development. Nature, 298: 277-279.
Silver R. A., Lamb A. G., and Bolsover S. R. (1990) Calcium hotspots caused by L-channel clustering
promote morphological changes in neuronal growth cones. Nature, 343: 751-754.
Simeone A., Avantaggiato V., Moroni M. C., Mavilio F., Arra C., Cotelli F., Nigro V., and Acampora D.
(1995): Retinoic acid induces stage–specific antero–posterior transformation of rostral central
nervous system. Mech. Dev. 51: 83–98.
Simonian X. S., and Herbison A. E. (2001) Differing, spatially restricted roles of ionotropic glutamate
receptors in regulating the migration of GnRH neurons during embryogenesis. J. Neurosci., 21:
934-943.
Small B. G., Baker S. R., Rubio A., Ballyk B. A., Hoo K. E., Mandelzys A., Kamboj R., Lodge D., and
Bleakman D. (1997) LY339434, a GluR5 selective kainate receptor agonist. Br. J. Pharmacol.,
122: p59.
Soeda H., Tatsumi H., and Katayama Y. (1997) Neurotransmitter release from growth cones of rat dorsal
root ganglion neurons in culture. Neuroscience, 77: 1187-99.
141
Sommer B., KeinänenK., Verdoorn T. A., Wisdwn W., Burnashev N., Herb A., Köhler M., Takagi T.,
Sakmann B., and Seeburg P. H. (1990) Flip and flop: a cell-specific functional switch in
glutamate-operated channels of the CNS. Science, 249: 1580-1585.
Sommer B., Köhler M., Sprengel R., and Seeburg P. H (1991) RNA editing in the brain controls a
determinant of ion flow in glutamate gated channels. Cell, 67: 11-19.
Soghomonian J. J., and Martin D. L. (1998) Two isoforms of glutamate decarboxylase: why? Trends
Pharmacol. Sci. 19: 500-505.
Solimena M., Aggujaro D., Muntzel C., Dirkx R., Butler M., De Camilli P., and Hayday A. (1993)
Association of GAD-65, but not of GAD-67, with the Golgi complex of transfected Chinese
hamster ovary cells mediated by the N-terminal region. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 90: 3073-7.
Spitzer N. C., de Baca R. C., Allen K. A., and Holliday J. (1993) Calcium dependence of differentiation
of GABA immunoreactivity in spinal neurons. J. Comp. Neurol., 337: 168-175.
Spitzer N. C., and Ribera A. B. (1998) Development of electrical excitability in embryonic neurons:
mechanisms and roles. J. Neurobiol., 37: 190-197.
Spitzer N. C., Lautermilch N. J., Smith R. D., and Gomez T. M. (2000) Coding of neuronal differentiation
by calcium transients. BioEssays, 22: 811-817.
Spoerri P. E. (1988) Neurotrophic effects of GABA in cultures of embryonic chick brain and retina.
Synapse, 2: 111-122.
Stork O., Ji F-Y., Kaneko K., Stork S., Yoshinobu Y., Moriya T., Shibata S., and Obata K. (2000)
Postnatal development of a GABA deficit and disturbance of neural functions in mice lacking
GAD65. Brain Res., 865: 45-58.
Sullivan K. F. (1988) Structure and utilization of tubulin isotypes. Annu. Rev. Cell. Biol., 4: 687-716.
Sutherland M. L., Delaney T. A., and Noebels J.L. (1996) Glutamate transporter mRNA expression in
proliferative zones of the developing and adult murine CNS. J Neurosci. 16: 2191-207.
Swanson G. T., Green T., and Heinemann S. F. (1998) Kainate receptors exhibit differential sensitivities
to (S)-5-iodowillardiine. Mol. Pharmacol., 53: 942-949.
Szabó G., Katarova Z., and Greenspan R. (1994) Distinct protein forms are produced from alternatively
spliced bicistronic glutamic acid decarboxylase mRNAs during development. Mol. Cell Biol. 14:
7535-7545.
142
Takimoto R., El-Deiry W. S. (2001) DNA replication blockade impairs p53-transactivation. Proc Natl
Acad Sci U S A. 98: 781-3.
Tarnawa I., Farkas S., Berzsenyi P., Pataki A., and Andrasi F. (1989) Electrophysiological studies with a
2, 3-benzodiazepine muscle relaxant: GYKI 52466. Eur. J. Pharmacol. 167: 193-199.
Tarnawa I., and Vizi E. S. (1998) 2,3-benzodiazepine AMPA antagonists. Restor. Neurol. Neurosci., 13:
41-57.
Taylor J., and Gordon-Weeks P. R. (1991) Calcium-independent γ-aminobutyric acid release from growth
cones: role of γ-aminobutyric acid transport. J. Neurochem., 56: 273-280.
Tillakaratne N. J., Medina-Kauwe L., and Gibson K. M. (1995) Gamma-aminobutyric acid (GABA)
metabolism in neural and non-neural tissues. Comp. Biochem. Physiol. A. Physiol., 112: 247-
263.
Tingley W. G., Ehlers M. D., Kameyama K., Doherty C., Ptak J. B., Riley C. T., and Huganir R. L.
(1997) Characterization of protein kinase A and protein kinase C phosphorylation of the N-
methyl-D-aspartate receptor NR1 subunit using phosphorylation site-specific antibodies. J. Biol.
Chem. 272: 51157-5166.
Traynelis S. F., and Cull-Candy S. G. (1991) Pharmacological properties and H+ sensitivity of excitatory
amino acid receptor channels in rat cerebellar granule neurons. J. Physiol (London), 433: 727-
763.
Tyner S. D., Venkatachalam S., Choi J., Jones S., Ghebranious N., Igelmann H., Lu X., Soron G., Cooper
B., Brayton C., Hee Park S., Thompson T., Karsenty G., Bradley A., and Donehower L. A.
(2002) p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotypes. Nature, 415: 45-53.
Umbriaco D., Garcia S., Beaulieu C., and Descarries L. (1995) Relational features of acetylcholine,
noradrenaline, serotonin and GABA axon terminals in the stratum radiatum of adult rat
hippocampus. Hippocampus 5: 605-20.
Vallano M. L. (1998) Developmental aspects of NMDA receptor function. Neurobiology 12: 177-204.
Varju P. (1997) Neurogenezis in vitro vizsgálata p53-deficiens, immortalizált neuroepiteliális
sejtvonalakon. Szakdolgozat.
Varju P., Katarova Z., Madarász E., and Szabó G. (2001) GABA signalling during development: new
data and old questions. Cell Tissue Res. 305: 239-246.
Verdoorn T. A., Burnashev N., Monyer H., Seeburg P. H. and Sakmann B. (1991) Structural determinants
of ion flow through recombinant glutamate receptor channel. Science, 252: 1715-1718.
143
Verdoorn T., Johansen T., Drejer J., and Nielsen E. (1994) Selective block of recombinant GluR6
receptors by NS-102, a novel non-NMDA receptor antagonist. Eur J. Pharmacol, 269: 43-49.
Villasante A., Wang D., Dobner P., Dolph P., Lewis S. A., and Cowan N. J. (1986) Six mouse α-tubulin
mRNAs encode five distinct isotypes: Testis-specific expression of two sister genes. Mol. Cell.
Biol., 6: 2409-2419.
Wang D., Villasante A., Lewis S. A., and Cowan N. J. (1986) The mammalian β-tubulin repertoire:
Hematopoietic expression of a novel, heterologous β-tubulin isotype. J. Cell. Biol., 103: 1903-
1910.
Wang Y., and Durkin J. P. (1995) α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, but not N-
methyl-D-aspartate , activates mitogen-activated protein kinase through G-protein βγ-subunits in
rat cortical neurons. J. Biol. Chem., 270: 22783-22787.
Wang Y., Small D. L., Stanimirovic D. B., Morley P., and Durkin J. P. (1997) AMPA receptor mediated
regulation of a Gi-protein in cortical neurons. Nature, 389: 502-504.
Watanabe M., Inoue Y., Sakimura K., and Mishina M. (1992) Developmental changes in distribution of
NMDA receptor channel subunit mRNAs. Neuroreport 3: 1138-40.
Watanabe M., Inoue Y., Sakimura K., and Mishina M. (1993) Distinct distribution of five N-methyl-D-
aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain. J. Comp. Neurol., 338: 377-390.
Watanabe M., Fukaya M., Sakimura K., Manabe T., Mishina M., and Inoue Y. (1998) Selective scarcity
of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum (mossy fiber-recipient layer) of the
mouse hippocampal CA3 subfield. Eur. J. Neurosci. 10: 478-487.
Watt S. D., Gu X., Smith R. D., and Spitzer N. C. (2000) Specific frequencies of spontaneous Ca2+
transients upregulate GAD 67 transcripts in embryonic spinal neurons. Mol Cell Neurosci. 16:
376-87.
Wenthold R. J., Petralia R. S., Blahos J. II., and Niedzielski A. S. (1996) Evidence for multiple AMPA
receptor complexes in hippocampal CA1/CA2 neurons. J Neurosci 16: 1982-9.
Westmoreland J. J., Hancock C. R., and Condie B. G. (2001) Neuronal development of embryonic stem
cells: a model of GABAergic neuron differentiation. Biochem. Biophys. Res. Com. 284: 674-680.
White E. (1994) p53, guardian of Rb. Nature, 371: 21-22.
144
Wong L. A., Mayer M. L., Jane D. E., and Watkins J. C. (1994) Willardiines differentiate agonist binding
sites for kainate- versus AMPA-preferring glutamate receptors in DRG and hippocampal
neurons. J. Neurosci. 14: 3881-3897.
Wong R. O., Chernjavsky A., Smith S. J., and Shatz C. J. (1995) Early functional neural networks in the
developing retina. Nature, 374: 716-718.
Zhang L., Zheng X., Paupard M-C., Wang A. P., Santchi L., Friedman L. K., Zukin S. R., and Bennett M.
V. (1994) Spermine potentiation of recombinant N-methyl-D-aspartate receptors is affected by
subunit composition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10883-10887.
Zheng J.Q., Wan J.J., and Poo M.M. (1996) Essential role of filopodia in chemotropic turning of nerve
growth cone induced by a glutamate gradient. J. Neurosci. 16: 1140-1149.
Zheng X., Zhang L., Durand G. M., Bennett M.V., and Zukin R. S. (1994) Mutagenesis rescues spermine
and Zn2+ potentiation of recombinant NMDA receptors. Neuron, 12: 811-818.
Zheng X., Zhang L., Wang A. P., Bennett M. L. V. and Zukin R. S. (1999) Protein kinase C potentiation
of N-methyl-D-aspartate receptor activity is not mediated by phosphorylation of N-methyl-D-
aspartate receptor subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 15262-15267.
Zhou L-M., Gu Z-Q., Costa A. M., Yamada K. A., Mansson P. E., Giordano T., Skolnick P., and Jones K.
A. (1997) (2S,4R)-4-methylglutamic acid (SYM 2081): a selective, high-affininty ligand for
kainate receptors. Pharmacol. Exper. Therap. 280: 422-427.
Ziegra C. J., Willard J. M., and Oswald R. E. (1992) Coupling of a purified goldfish brain kainate
receptor with a pertussis toxin-sensitive G protein. Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 89: 4134-4138.
Zimmerman L., Parr B., Lendhal U., Cunningham M., and McKay R. (1994) Independent regulatory
elements in the nestin gene direct transgene expression to neural stem cells or muscle precursors.
Neuron, 12: 11-24.
Zukin R. S,. and Bennett M. V. L. (1995) Alternatively spliced isoforms of the NMDAR1 receptor
subunit. Trends Neurosci. 18: 306-313.
Recommended