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Klinische Chemie und LaboratoriumdiagnostikVorlesung: Chromatographie und Massenspektrometrie
Dr. rer. nat. Frank Kannenberg
½ŜƴǘNJŀƭŜ 9ƛƴNJƛŎƘǘdzƴƎ [ŀōƻNJ riumsmedizin – ¦Ya [ŀōƻNJ –
Universitätsklinikum Münster Albert‐Schweitzer‐Campus 1
48149 MünsterTel.: 0251 83‐47227Fax: 0251 83‐47225
kannenberg@uni‐muenster.de www.klichi.uni‐muenster.de
- 1 -Sommersemester 2022
Gliederung
1. Chromatographie, Geschichte, Prinzip2. DC (Dünnschicht-Chromatographie)3. HPLC (Flüssig-Chromatographie)4. GC (Gas-Chromatographie)5. Massenspektrometrie und MS-Kopplungen
- 2 -
• Chromatographie: „mit Farbe schreiben“
• Tswett 1903: Auftrennung von Chlorphyll
M.Tswett 1903
f
- 3 -
SäulenchromatographiePetroleum ether
CaCO3
Chlorophyll-Extrakt
Farbe“chroma”schreiben
“graphein”
- 4 -
Was ist Chromatographie?Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen
• Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und darin durch eine stationäre Phase transportiert.
• Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen.
• Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.
- 5 -
Trennprinzip
StationärePhase
mobile Phase
Zeit
Säulenanfang Säulenende• Stoffgemisch• Komponenten
wechseln ständigzwischen mobilerund stationärerPhase
• Gleichgewicht(Verteilung,Adsorption)
• Trennung- 6 -
TrennprinzipIInjektor
SSäule
DDetektor
CChromato-gramm - 7 -
Klassifikation der Chromatographie
• Planare Chromatographie:– Papierchromatographie– Dünnschichtchromatographie (DC)
• Säulenchromatographie:– gepackte Säulen– Flüssigchromatographie
(LC, HPLC, IEC, GPC)– Gaschromatographie
(GC, GLC, GSC)– Chromatographie mit
überkrit. Fluiden (SFC), z.B CO2- 8 -
Dünschichtchromatographie (DC)
• stationäre Phase:– z.B. Kieselgel (polar) auf
Glasplatte oder Alufolie• mobile Phase:
– Laufmittel, z.B. Ethanol• DC-Chromatogramm:
– Auftragen (man./autom.)– Entwickeln („DC-Lauf“)– Trocknen, Detektieren
(ggf. Anfärben)• Polaritäten beachten!
- polare (hydrophile) Analyten „laufen“ auf Kieselgel nicht
- 9 -
Retentionsfaktor (Rf –Wert)
1 2
Laufstrecke Substanz
Laufstrecke LösungsmittelRf =
Eintauch-tiefe
Rf 0.3
Rf 0.5
• Substanzspezifisch (bei gleichen chromat. Bedingungen)
- 10 -
Normal-/Umkehrphasen-Chomatographie• „Normalphase“:
Kieselgel (SiO2) polar (hydrophil) für hydrophobe Analyten Laufmittel unpolar
(z.B. Heptan)• RP-Phase
(„reversed phase“): Kieselgel (SiO2) mit
unpolaren Gruppen unpolar (hydrophob) Trennung hydrophiler
Analyten möglich Laufmittel polarer
(z.B. Acetonitril/Wasser)- 11 -
HPLC (HighPerformanceLiquidChromatography)
Eluent
Pumpe
Einspritzventil
Trennsäule
Detektor
Pumpe
Säulennofen
- 12 -
HPLC-Säule• Spezifikationen
CS-Chromatographie ServiceMultospher 120 RP-18 HP 5µ
Art.-Nr. xxxx HPLC-Säule 250x3 mmMultospher 120 RP-18 HP-5Ch. 70801Säulen-Nr. 0103-01 Flow --------Muster-ChromatographieTel., Fax, mail
Herstellername des Kieselgels
Porengröße (Angström)
Modifizierung des Kieselgels
Korngröße in µm
Säulendimension (Länge x ID)
Flussrichtung
- 13 -
RP-HPLC: Medikamentenanalyse
• Detektion + Quantifizierung– Photometrie
(„UV-/vis Detektor“)– auch andere
Detektoren• Peak
– Retentionszeitsubstanzspezifisch
– Höhe, Fläche proportional zur Konzentration
– Kalibration– Quantifizierung
- 14 -
Schnelle HPLC (FAST- HPLC)• kurze Säulen ca. 3 cm (statt 30 cm)
• sehr kleine Partikel ca. 1,5 µm (statt 5 µm)
• Vorteile:– erheblich kürzere
Analysendauer– weniger Lösungsmittel
• Nachteile:– schneller Detektor notw.– nicht alle Trennungen mögl.– höhere Drucke
- 15 -
HPLC: „Sensorische Verkostung“
• menschl. Geschmackals Detektor
• Eluat wird „verkostet“• Aroma-Analytik• „LC-Taste“
(Abb. Fa. Symrise)
- 16 -
Gaschromatographie: Vgl. HPLC• HPLC: Mobile Phase flüssig (Laufmittel)
– z.B. Methanol/Wasser, Acetonitril/Wasser• GC: Mobile Phase gasförmig (Trägergas)
– Stickstoff, Wasserstoff, Helium– Vorteile GC:
• Trennleistung (v.a. kleine, unpolare Moleküle)• Empfindlichkeit
– Nachteile GC:• Verbindungen müssen flüchtig oder leicht
verdampfbar sein (ggf. Derivatisierung)• Apparativer Aufwand (Gasleitungen)
- 17 -
GC: Schematischer Aufbau
Gasflaschemit Vorreinigung
Reservoir fürmobile Phase
InjektorAutosamplerHeadspace-Aufgabe
Probenaufgabe
gepackte SäuleKapillarsäule
Chromatogr.Trennsäule
FIDWLDMSDAEDNPDECD
DetektorSchreiber, EDV
- 18 -
Gaschromatograph
InjektorDetektor
Autosampler
GC-Ofen Bedienungsfeld
- 19 -
Quarzglas-Kapillaren im GC-Ofen
• GC-Säule aus Glas• Polyimidbeschichtung
(Flexibilität)• 10-100 m Länge• 0,1-0,5 mm
Innendurchmesser• 0,1-1,2 µm Beschichtung
stationäre Phase• dreidimesional vernetzt• verschiedene Polaritäten
- 20 -
Split-/Splitless-Injektor
• Injektion mit Spritze durch Septum (etwa 1 µl)
• Heißes Rohr (Liner)Verbindung zur Trennsäule
• Probe verdampft• Splitventil auf oder zu• Trägergas nimmt Probe mit
auf die Säule
- 21 -
Flammenionisationsdetektor (FID)• GC-Detektor universell
für org.Verbindungen• Pyrolyse in der Luft/
Wasserstoff-Flamme• Ionen + Elektronen• Spannung zwischen
Brennerende und Sammelelektrode:
• Strom• analoges Signal• digitales Signal (PC) - 22 -
GC: Olfaktometrische Detektion („Sniffer“)
Quelle: http://www.ak-hoffmann.chemie.uni-mainz.de/pdf/script/script2.pdf - 23 -
GC-Anwendung: Toxikologie Blutalkohol, Methanol-Vergiftung
Peak Identification1 . Acetaldehyde2 . Acetone3 . Methanol4 . 2-Propanol5 . Ethanol
Blood Alcohols
Column: Econo-Cap™ EC-WAX , 30m x 0.32mm x 0.25um Temp: 50°C Carrier: Helium at 1.08mL/min (22.5 cm/sec) Detector: FID at 300°C
Methanol (Methylalkohol)
- 24 -
Dr. F. Kannenberg
Methanol-Vergiftung, Behandlung
Ethanol =ADH=> Acetdehyd =langsam=> Essigsäure (==>Citratzyclus CO2, H2O)Methanol =ADH=> Formaldehyd =schnell=> Ameisensäure (metabolische Acidose)Isopropanol =ADH=> Aceton
Therapie:• Ethanol oder anderer ADH-
Inhibitor (z.B. 4-Methylpyrazol;kompetitve Hemmung von ADH)
• Hämodialyse (Gifte eliminieren)• Folsäure (Abbau Ameisensäure)• Na-Hydrogencarbonat (Azidose)
- 25 -
Smith-Lemli-Opitz Syndrom (SLO-S)Häufige Missbildungen
• Schädeldeformierung (Mikrozephalie)• breite Nasenwurzel• hoher Gaumen• abnorm kleiner Oberkiefer (Mikrognathie)• Herabhängen der Lidspalten (Ptosis)• Verwachsungen an Fingern + Zehen (Syndaktylie)• Minderwuchs• geistige Retardierung• Muskelschwäche• Entwicklungsanomalie der Genitalien
- 26 -
GC-Anwendung: StoffwechseldiagnostikSmith-Lemli-Opitz Syndrom
• SLO-Syndrom– vererbbarer Defekt in der Cholesterolbiosynthese– schwere Missbildungen– Cholesterin stark erniedrigt– 7-Dehydrocholesterin (7-DHC) und 8-DHC stark
erhöht (Marker)• Analytik
– Routine Cholesterin-Analytik ungeeignet– GC zur Quant. von Cholesterin, 7-DHC, 8-DHC– 24 Fälle seit 1995 hier entdeckt, davon 2 pränatal
- 27 -
SLO: GC-Chromatogramm
GC-Chromatogramm der Plasma-Neutralsterolfraktion eines SLO-Patienten.
0 10 20 30
0
20
40
60
80wl200195
8-D
ehyd
roch
oles
tero
l
7-D
ehyd
roch
oles
tero
l
Cho
lest
erol
Inte
rner
Sta
ndar
d
Res
pons
e in
mV
Retentionszeit in min
- 28 -
Cholesterinvorläufer & Defekte• Endogenes Cholesterol
Biosynthese (Leber)• Precurser
– Lanosterol, Cholestenol, Lathosterol, 7-DHC, 8-DHC
– Desmosterol• Enzymdefekte
– hereditär– schwere Erkrankungen
• Marker für die Cholesterolsynthese
- 29 -
Gliederung1. Chromatographie, Geschichte, Prinzip2. DC (Dünnschichtchromatographie)3. HPLC (Flüssigchromatographie)4. GC (Gaschromatographie)5. Massenspektrometrie und MS-Kopplungen
a) GC/MS (Gaschromatographie/Massenspektrometrie)b) LC/MS (HPLC/Massenspektrometrie)c) MS/MS (Tandem-Massenspekrometrie)d) MALDI-MS („Weiche Ionisierung“, Proteomics)
- 30 -
GC/MS-Kopplung• GC
– Chromatographische Gemisch-Trennung
• MS– Detektor– Ionisation durch
Elektronenstoß (EI)– Massenspezifische
Trennung– Massenspektrum
substanzspezifisch
Quelle der Animation: Trace GC. Thermo-Finnigan, 2002
- 31 -
Warum GC (oder HPLC) + MS?• alle GC-Methoden (FID) auch GC/MS tauglich
– vielfältige Anwendungsbereiche– Medizin, Lebensmittel, Umwelt, Industrie, Gericht
• höhere Empfindlichkeit– mind. Faktor 100 im Vergleich zu GC (FID)
• NWG Dioxin: 1967 GC-FID 500 pg; 1992 GC/HRMS 0,005 pg• z.B. Drogennachweis in Haaren („Drogenkarriere“ über Jahre)
• qualitativ besseres Messergebnis – mehr Informationen (Massenspektrum)– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung
(z.B. Doping-Kontrolle)– Analyse unbekannter Verbindungen
(Spektren-Bibliotheken)
- 32 -
CEC Model 21-103 Sector Field Mass Spectrometer (1950)
DIE 5OER JAHRE - KOMMERZIALISIERUNG
GC/MS 50er Jahre
- 33 -
DIE 70ER JAHRE - EXTRATERRESTRISCHE MASSENSPEKTROMETRIE
VIKING MISSION ZUM MARS: VIKING LANDER MIT GC/MS ZUR UNTERSUCHUNG DER
MARS-ATMOSPHÄRE (NASA 1975)
PIONEER 13 MISSION ZUR VENUS
MIT GC/MS (NASA 1979)
1969-1972: SECHS MISSIONEN ZUM MOND MIT GC/MS
KEINE BEWEISE FÜR LEBEN
MINIATURISIERTE MASSENSPEKTROMETER AN BORD VON SATELLITEN ZUR UNTERSUCHUNG
DER ÄUSSEREN ERDATMOSPHÄRE (SEIT 1961))
- 34 -
GC/MS heute
GCMS-System „QP2010Ultra“; Abb.: Fa. Shimadzu, 2010
- 35 -
Grundprizip der MS• geladene Teilchen (Ionen) können unter Vakuum
in einem Magnetfeld von ihrer Flugbahn abgelenkt werden
• Abhängig von– Masse (m)– Ladung (z)– Geschwindigkeit– Magnetfeldstärke
• massenabhängige Selektion von Ionen m/z
- 36 -
GC/MS: schematischer Geräteaufbau
• Verbindung zum GC:Interface, Transfer Line
• Ionenerzeugung:Quelle, Ionisierungskammer
• massenspezifische Trennung der Ionen:MS-Analysator, Magnetfeld
• Detektion der Ionen:Detektor, Multiplier
• Datenaufnahme und Auswertung:PC, EDV
Quelle der Animation: T.G. Chasteen 1996 (www.shsu.edu)
- 37 -
Auswertung: „Chromatogramm“
• „Summe aller Massenspektren“
• Totalionenstrom– Entspricht GC-
Chromatogramm
- 38 -
Auswertung: Massenspektren• Massenspektrum• M+ Fragmentierung
(EI-Ionisierung 70 eV)• substanzspezifisch;
„Fingerabdruck“• bekannte Substanzen:
eindeutige Identifizierung• unbek. Substanzen:
– Strukturmerkmale– Referenzspektren– Spektrenbibliotheken
• PMW > 6000 Pharmatka, Drogen, Gifte
• NIST > 190000 Substanzen
M+-15
M=638
M+-90
M+-2x90
M+-3x90M+-3x90-115
Basispeak=100%
- 39 -
GC/MS: Dopingkontrolle
Urin Isolierung GC/MS-Analyse
GC/MS-Gerät
LaborAnalyse
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
2.382.392.402.412.422.43
Time ->
Amphetamin
CoffeinInterner
x 10 6Standard
Positiver Dopingbefund
Quelle: „Doping im Sport“; W. Schänzer; Institut für Biochemie, DSHS Köln, 2000
- 40 -
Sitosterolämie (Phytosterolämie)• Klinik:
– Xanthome, Xanthelasmen– Gelenkschmerzen, Arthritis– frühe Arteriosklerose + KHK
• Serum:– Cholesterin norm bis leicht ↑– Phytosterine↑↑ (pflanzl.Kost)
bes. Sitosterin, Capesterin– CAVE! Cholesterinsenkende
Margarine u.ä. Produkte (falsch positives Ergebnis)
• Nachweis:– GC, GC/MS– Gen-Sequenzierung
• genetischer Defekt:– autosomal rezessiv– Mutation ABC G5, ABC G8 Quelle : www.meded.ucsd.edu - 41 -
LC/MS• HPLC (LC)
– Chromatographische Trennung
• MS– Problem: Lösungsmittel– Ionisation: Elektrospray (ESI)– Massenspezifische Trennung– „Sanfte Ionisierung“
• Analyse großer Moleküle und Proteine
Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”; Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004
- 42 -
MASSENANALYSATOR
10-2 mbar 10-5 mbar
DETEKTORSPRAY
5000 V
TROCKNUNGSGAS
ATMOSPHÄRENDRUCK
Verdampfen des Lösungsmittels
Desorption mehrfach geladener Ionen durch selbst erzeugtes elektrisches Feld
Rayleigh-Grenze Coulomb-Explosion
+ ++
+++
+++ +
++
+
++
++
++
++
+ +++ +
++
++
++++
++++
+
+
+
+
+
+Protonen auf Tropfen-Oberfläche
LCMS:Elektrospray-Ionisierung (ESI)
Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”; Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004
LCMS_ESI.avi
- 43 -
Tandem-Massenspektrometrie
• Kopplung von Massenspektrometern (MS)• „mehrdimensionale Massenspektrometrie“• Tandem-Massenspektrometrie = MS/MS• MS1: massenspezifisches „Clean up“
– Substanzgemisch– Matrix (Blut, Serum, Urin)
• MS2: Detektion der Analyten
- 44 -
MS/MS: Prinzip
- 45 -
GCMS/MS: Drogen in Haaren• Nachweis von Drogen in Haaren
– GC/MS (SIM)– Signal: Analyt (Konzentration)– S/N durch „clean up“ besser
• höhere Empfindlichkeit• qualitativ besseres Messergebnis
– Informationsgehalt 1000x höherim Vergleich zu GC/MS
– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung(z.B. Doping-Kontrolle)
– Analyse unbekannter Verbindungen(Spektren-Bibliotheken)
- 46 -
Isotopen-Verdünnungs-Analyse (ID/MS)
• Zugabe eines isotopenmarkierten Standards (gleiches Verhalten wie Analyt)
• Extrem hohe Richtigkeit/Präzision
• Referenzmethode für Kreatinin, Cholesterin, Testosteron, Glucose, Harnsäure, Harnstoff, Medikamente.....
- 47 -
LCMS/MS: Immunsuppressiva• Kontrolle nach
Organtransplantationen– Enges therapeutisches Fenster– Zu niedrig: Organ-Abstoßung– Zu hoch: Nebenwirkungen (z.B.
Nierenversagen)• hohe Empfindlichkeit• qualitativ bessere Messergebnisse
im Vergleich zu Immunoassays– Bestimmung der „Muttersubstanz“– Metaboliten: keine Kreuzreaktivität
(Abb. LCMS/MS, Fa. Shimadzu)
- 48 -
MS/MS: Neugeborenen-Screening
• Phenylketonurie (PKU)• Ahornsirupkrankheit (Leu, Ile, Val) • Homocystinurie • Glutarsäure Acidämie• Methylmalonsäure Acidämie• Propionsäure Acidämie• Tyrosinämie• Nicht-ketotische Hyperglyzinämie• Argininbernsteinsäure-Krankheit• Hyperprolinämie• Hypermethioninämie
- 49 -
140 160 180 200 220 240 260 280
Gly
Ala
Val
Leu
MetCit
Phe
Tyr
GluGly
Ala
Ser
Pro
Val
Leu + Ile
GlnTyr
Phe
GluAsp
140 160 180 200 220 240 260 280
GlyAla
Val
Leu
MetCit
Phe
TyrGlu
Gly
Ala
Ser
Pro
Val
Leu + Ile
Gln
Tyr
Phe
GluAsp
m/z
Kontrolle
PKU
interner, isotopen-markierter Standard
Präparation und MS/MS-Analyse• Blutspot auf Filterpapier (3 mm )
Mikrotiterplatte
• Zugabe von Methanol plus isotopen-markierter interner Standard
• Butylierung aller Aminisäuren (AS)• Injektion und Ionisierung der Probe
keine Chromatographie !
• MS/MS-Analyse der AS-Produkte(Neutralverlust-Analyse)
• Quantifizierung der AS durch Standard
Neugeborenen-Screening: PKU
- 50 -
Protein Zelle
DNA
GenomeProteome
DNA fingerprint
3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)
2117.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117]
4424
.2
9476
.2
4861
.0
8823
.5
5897
.8
6271
.2
8054
.3
6629
.0
7424
.9
1227
1.4
4738
.6
6984
.6
8383
.8
6786
.7
6533
.3
9075
.2
3132
.3
6137
.3
7209
.8
8903
.3
8610
.6
1011
0.8
4765
.4
1097
5.2
4026
.9
4535
.6
3311
.8
1049
3.9
3491
.4
9611
.5
massfingerprint
SpeziesDefinition & Bestimmung
„Proteomics & Genomics“
- 51 -
• Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry• entwickelt in den 1980‘s von Karas & Hillenkamp und Tanaka et al.
• Nobelpreis für Chemie an Koichi Tanaka im Jahr 2002 (Fa. Shimadzu, Japan)
Historisches: MALDI-TOF-MS, Münster & Nobelpreis
- 52 -
MALDI-TOF MS:Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry
ion detector
+
+ +
+
++
template
matrix/analytecrystals
accelerationzone
field-freedrift range
grid electrode
Desorption
Ionisierung
Beschleunigung
Trennung
Detektion
- 53 -
automated spectrum acquisition ~60 sec
ionisation of intact proteins and molecular weight measurement
3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)
1648.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3
3775
7075
8074
8744
1093
9
9453
9994
7980
1034
7
5015
7863
1157
2
7092
5931
9654
3581
6837
9330
7367
1022
6
8450
1060
8
1190
6
MALDI-TOF-MS Analyse
(Abb. : Fa. Shimadzu)
- 54 -
• Spektrenbibliotheken• Identifizierung des
Stammes und der Spezies
• z.B. auch „EHEC“ (enterohämorrhagischeEscherichia coli)
Mikobiologie: Identifizierung von Keimen
- 55 -
ENDE
Herzlichen Dank fürs Zuhören!
- 56 -
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