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Le
MCSa Il micro-innesto di tessuto in
Medicina Rigenerativa Estetica
Utilizzo delle Cellule Staminali
Mesenchimali Adulte
Fabiano Svolacchia MD
Universitagrave degli Studi di
Pavia
LA DEFINIZIONE
Come e cosa definiamo per MSCa in un micro-
innesto di tessuto
Fabiano Svolacchia MD
Per definire una cellula staminale sono necessari quattro
criteri primo la cellula deve poter andare incontro a
molteplici e sequenziali divisioni cellulari di auto-
mantenimento un prerequisito per sostenere una
popolazione cellulare
Fabiano Svolacchia MD
Secondo le cellule figlie derivate da una singola cellula
staminale devono poter differenziare in almeno un diverso
tipo cellulare rispetto a quello della staminale
Fabiano Svolacchia MD
Il terzo criterio per definire la staminalitagrave riguarda la
capacitagrave delle cellule di ripopolare il tessuto di origine se
trapiantate in un sito ricevente danneggiato
Fabiano Svolacchia MD
Il quarto ed ultimo criterio meno condiviso e meno
consolidato egrave che le cellule staminali devono essere in grado
di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in
assenza di danni tessutali
Fabiano Svolacchia MD
A differenza delle cellule staminali embrionali le cellule
staminali adulte hanno una minore capacitagrave di auto-
mantenimento in parte a causa di una carenza di alti livelli di
attivitagrave delle telomerasi che perograve sono superiori a quelli
medi delle cellule somatiche
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
LA DEFINIZIONE
Come e cosa definiamo per MSCa in un micro-
innesto di tessuto
Fabiano Svolacchia MD
Per definire una cellula staminale sono necessari quattro
criteri primo la cellula deve poter andare incontro a
molteplici e sequenziali divisioni cellulari di auto-
mantenimento un prerequisito per sostenere una
popolazione cellulare
Fabiano Svolacchia MD
Secondo le cellule figlie derivate da una singola cellula
staminale devono poter differenziare in almeno un diverso
tipo cellulare rispetto a quello della staminale
Fabiano Svolacchia MD
Il terzo criterio per definire la staminalitagrave riguarda la
capacitagrave delle cellule di ripopolare il tessuto di origine se
trapiantate in un sito ricevente danneggiato
Fabiano Svolacchia MD
Il quarto ed ultimo criterio meno condiviso e meno
consolidato egrave che le cellule staminali devono essere in grado
di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in
assenza di danni tessutali
Fabiano Svolacchia MD
A differenza delle cellule staminali embrionali le cellule
staminali adulte hanno una minore capacitagrave di auto-
mantenimento in parte a causa di una carenza di alti livelli di
attivitagrave delle telomerasi che perograve sono superiori a quelli
medi delle cellule somatiche
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Per definire una cellula staminale sono necessari quattro
criteri primo la cellula deve poter andare incontro a
molteplici e sequenziali divisioni cellulari di auto-
mantenimento un prerequisito per sostenere una
popolazione cellulare
Fabiano Svolacchia MD
Secondo le cellule figlie derivate da una singola cellula
staminale devono poter differenziare in almeno un diverso
tipo cellulare rispetto a quello della staminale
Fabiano Svolacchia MD
Il terzo criterio per definire la staminalitagrave riguarda la
capacitagrave delle cellule di ripopolare il tessuto di origine se
trapiantate in un sito ricevente danneggiato
Fabiano Svolacchia MD
Il quarto ed ultimo criterio meno condiviso e meno
consolidato egrave che le cellule staminali devono essere in grado
di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in
assenza di danni tessutali
Fabiano Svolacchia MD
A differenza delle cellule staminali embrionali le cellule
staminali adulte hanno una minore capacitagrave di auto-
mantenimento in parte a causa di una carenza di alti livelli di
attivitagrave delle telomerasi che perograve sono superiori a quelli
medi delle cellule somatiche
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Secondo le cellule figlie derivate da una singola cellula
staminale devono poter differenziare in almeno un diverso
tipo cellulare rispetto a quello della staminale
Fabiano Svolacchia MD
Il terzo criterio per definire la staminalitagrave riguarda la
capacitagrave delle cellule di ripopolare il tessuto di origine se
trapiantate in un sito ricevente danneggiato
Fabiano Svolacchia MD
Il quarto ed ultimo criterio meno condiviso e meno
consolidato egrave che le cellule staminali devono essere in grado
di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in
assenza di danni tessutali
Fabiano Svolacchia MD
A differenza delle cellule staminali embrionali le cellule
staminali adulte hanno una minore capacitagrave di auto-
mantenimento in parte a causa di una carenza di alti livelli di
attivitagrave delle telomerasi che perograve sono superiori a quelli
medi delle cellule somatiche
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
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FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il terzo criterio per definire la staminalitagrave riguarda la
capacitagrave delle cellule di ripopolare il tessuto di origine se
trapiantate in un sito ricevente danneggiato
Fabiano Svolacchia MD
Il quarto ed ultimo criterio meno condiviso e meno
consolidato egrave che le cellule staminali devono essere in grado
di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in
assenza di danni tessutali
Fabiano Svolacchia MD
A differenza delle cellule staminali embrionali le cellule
staminali adulte hanno una minore capacitagrave di auto-
mantenimento in parte a causa di una carenza di alti livelli di
attivitagrave delle telomerasi che perograve sono superiori a quelli
medi delle cellule somatiche
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il quarto ed ultimo criterio meno condiviso e meno
consolidato egrave che le cellule staminali devono essere in grado
di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in
assenza di danni tessutali
Fabiano Svolacchia MD
A differenza delle cellule staminali embrionali le cellule
staminali adulte hanno una minore capacitagrave di auto-
mantenimento in parte a causa di una carenza di alti livelli di
attivitagrave delle telomerasi che perograve sono superiori a quelli
medi delle cellule somatiche
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
A differenza delle cellule staminali embrionali le cellule
staminali adulte hanno una minore capacitagrave di auto-
mantenimento in parte a causa di una carenza di alti livelli di
attivitagrave delle telomerasi che perograve sono superiori a quelli
medi delle cellule somatiche
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
La telomerasi egrave in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche
riallungando cosigrave i telomeri accorciati in modo da mantenere
integri i cromosomi Si tratta di una vera e propria trascrittasi
inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ) dal momento che
utilizza frammenti di RNA propri come stampo per
lelongazione dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un
numero differenziato di replicazioni dopodichegrave
divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno
stato di laquo senescenza replicativa laquo correlata
allrsquoaccorciamento dei telomeri
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri hanno una funzione protettiva delle
estremitagrave prevenendo le fusioni di cromosomi e
contribuendo al mantenimento della stabilita
genomica
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
I telomeri troppo corti sono riconosciuti
come una rottura del DNA e ciograve porta alla
formazione di foci contenenti H2AX (una
variante fosforilata dellrsquoH2A) e al fenotipo
senescente
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
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Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquo H2AX egrave un istone molto frequente nel genoma eucariotico
che si sostituisce allrsquo H2A La sua funzione egrave implicata nella
riparazione del DNA In caso di danneggiamento infatti viene
fosforilato listone H2AX piugrave vicino al sito di rottura tale
fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le
proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
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Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
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Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
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Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Gli istoni H1 H2A H2B H3 H4 sono proteine associate al DNA
Linterazione tra gli istoni ed il DNA e molto ben regolata infatti
ogni sequenza di 150-180 paio di basi di DNA e legata ad una
molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A H2BH3 e
H4 Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
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Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
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Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le conseguenze funzionali delle modificazioni
istoniche non influenzano la stabilitagrave del core
nucleosomale ma alterano solamente la carica
elettrostatica delle code N-terminali Ciograve modifica le
proprietagrave strutturali dellrsquoistone o il suo legame al
DNA
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Si crea cosigrave un meccanismo che altera la struttura della
cromatina la cui conseguenza egrave una modificazione
dello stato trascrizionale (ldquoon-offrdquo) oppure la
definizione di strutture cromosomali di ordine
superiore
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoaccorciamento dei telomeri quindi promuove
lo stato di non divisione e la cellula egrave
permanentemente bloccata nella fase G1 Si parla
allora di senescenza replicativa quando una
normale cellula si egrave divisa un certo numero di volte
Questo numero varia a seconda del tipo di cellula
ed anche dalle condizioni esterne alla cellula stessa
cioegrave la matrice extracitoplasmatica
International Journal of Morphology versioacuten On-line ISSN 0717-9502
Int J Morphol v28 n1 Temuco mar 2010 doi 104067S0717-95022010000100006
Int J Morphol 28(1)37-50 2010
The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis
Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigeacutenesis
Lilian Chuaire-Noack Magda Carolina Saacutenchez-Corredor amp Sandra Rociacuteo Ramiacuterez-Clavijo
Departamento de Biologiacutea Facultad de Ciencias Naturales y Matemaacuteticas Universidad del Rosario Bogotaacute DC Colombia
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Quindi le cellule senescenti contribuiscono e
paradossalmente incrementano lrsquoinvecchiamento e
la sua espressione fenotipica stimolando il tipico
rimodellamento tissutale della cute senescente
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
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FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Come accennato anche le cellule staminali adulte hanno
un potenziale di replicazione finito oltre il quale non
riescono piugrave a dividersi Raggiungeranno anchrsquoesse uno
stadio di cosigrave detta senescenza replicativa (Pittinger et al
1999)
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il potenziale replicativo delle cellule egrave infatti direttamente
correlato alla attivitagrave telomerasica (Brook e Gardner 1997
Thomson et al 1998 Rosler et al 2004) che come riportato
precedentemente egrave una caratterista di cellule ai primi stadi di
sviluppo embrionale (Wight e Shay 2002 Rubin 2002)
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy le
cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a
crescere in colture aderenti alle piastre esprimano markers - Cluster of
Differentiation (CD) - CD105 CD73 e CD90 in percentuale
superiore al 95
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
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Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
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Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
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Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
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Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
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Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
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La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
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Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
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IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
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Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
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Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
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Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Mentre esprimano i markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a
o CD19 in percentuale non superiore al 2 (Dominici et al 2006)
Il CD34 tipico di cellule emopoietiche CD14 proprio dei macrofagi
e CD45 marker leucocitario (Kuznetsov et al 2001 Fernandez et al
1997 Tondreau et al 2005) CD31 dei neurofilamenti (Kuznetsov et
al 2001)
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoimpiego di MSCa come supporto al pool di cellule
locali fornisce il vantaggio della presenza di una
riserva di cellule staminali autologhe impedendo e
limitando lrsquoespressione fenotipica senescente
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
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FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il tempo di duplicazione delle MSCa isolate da
tessuto nellrsquouomo egrave di 4 giorni (Mitchell et al 2006)
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
E sono conosciute anche con il nome di CFU-C
colony forming fibroblast - cells
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa le troviamo nei i tessuti degli organismi adulti
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
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Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
1) Con una variabilitagrave individuale determinabile solo a
posteriori dopo il prelievo e 2) nelle sede del prelievo
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di
cellule
4) Malattie endocrine gravi
5) Fumo di tabacco
7) Farmaci chemioterapici
8) Neoplasie in fase attiva Fabiano Svolacchia MD
9) Abuso di alcool
10) Etagrave
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Hanno la capacitagrave di muoversi e rispondono alla
chemiotassi producono sostanze anti-apoptotiche
citoprotettive anti-fibrotiche angiogeniche e mitotiche
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
LA PLASTICITArsquo DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono
una elevata plasticitagrave differenziativa
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
La plasticitagrave delle cellule staminali adulte egrave la capacitagrave di
acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del
tessuto di origine Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa
apparente plasticitagrave ed esistono dati a supporto di
ciascuno di quattro modelli
1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere
presenti nel tessuto ricevente dellrsquoospite
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
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Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
2) la plasticitagrave potrebbe essere il risultato della fusione
delle cellule del donatore con le cellule residenti in un
organo Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a de-
differenziamento e ri-differenziamento Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere
nella vita post-natale
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Non esiste quindi una definizione ldquoufficialerdquo di plasticitagrave
delle cellule staminali
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Una definizione possibile egrave che cellule staminali adulte
tessuto-specifiche teoricamente commissionate verso un
dato lineage cellulare possono in particolari condizioni di
microambiente acquisire lʼabilitagrave di differenziare in cellule
di un tessuto differente
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Questa definizione implica che 1) differenti lineage
cellulari devono poter derivare da una singola cellula
iniziale
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
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Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
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Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
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Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
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Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
I tipi cellulari differenziati devono mostrare
funzionalitagrave in vitro ed in vivo
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Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
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Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
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Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
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Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
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Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
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Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
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Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente
in presenza ma anche ed in assenza di danno
tessutale
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
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Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali adulte multipotenti rappresentano
uno strumento eccezionale per lo studio dellʼauto-
rinnovamento e del differenziamento
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
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Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
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Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
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FAC side population analisi
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FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
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Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
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Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Esse sono in grado di differenziare in un numero di
tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
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Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
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Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
ORIGINE DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoorigine delle cellule staminali embrionali egrave conosciuta
mentre quella delle cellule staminali adulte non egrave ancora
ben chiara
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo
differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo
embrionale e a colonizzare appropriate nicchie
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la
potenzialitagrave delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i
processi di differenziamento (Lanza 2004)
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono
dotate di potere rigenerativo (El Tamer 2009 Miyahara 2006
Suzuki 2008 Harris 2009 Arnalich-Montiel 2008 Ferrari 1998)
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
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FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
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Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
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Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da diversi tessuti come
midollo osseo sangue periferico cordone ombelicale
tessuto adiposo e derma (Jiang 2002 Kuznetsov 2001 Biebak 2004 Koch
2007 Yamamoto 2007 Crigler 2007)
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Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
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La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una
morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa
quantitagrave di citoplasma pochi mitocondri ed un apparato del
Golgi poco sviluppato Possono essere espanse in vivo
(Pittenger 1999 Chamberlain 2007)
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Aesthet Surg J 2013 Aug 133(6)888-98 doi
1011771090820X13496115
Comparative analysis of adipose-derived mesenchymal stem
cells isolated from abdominal and breast tissue
Hanson SE Kim J Hematti P
Author information
Le MSCa possono essere estratte dal tessuto adiposo
permettendo un aumento dei valori di FGF2
necessario nei processi di guarigione delle ferite e
nellrsquoangiogenesi
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura ci dice anche che le MSCa possono
derivare dal derma e possono essere caratterizzate
attraverso la marcatura ( CD )
Stem Cells Dev 2014 Jan 24 [Epub ahead of print]
Characterization of Mesenchymal Progenitor Cell Populations Directly Derived
from Human Dermis
Feisst V Brooks AE Chen CJ Dunbar PR Author information bullSchool of Biological Sciences and Maurice Wilkins Centre University of Auckland Auckland New Zealand
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on
human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Tissue Eng Part C Methods 2010 Dec 16 (6) 1481-91 doi
101089tenTEC20100149
Comparative characterization of mesenchymal stem cells derived
from pig extract bone marrow and skin tissue
Ock SA Jeon BG Rho GJ
La letteratura internazionale ci conferma che le
MSCa estratte dalla cute hanno le stesse
caratteristiche di quelle estratte dal midollo osseo
esprimendo gli stessi marcatori
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura conferma anche che le cellule
staminali derivate dal derma sono cellule sane e che
non muoiono
Neuroscience 2004125(1)179-89
Fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic
injury (TSCI)
Gorio A Torrente Y Madaschi L Di Stefano AB Pisati F Marchesi C Belicchi M Di
Giulio AM Bresolin N
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
IL RICONOSCIMENTO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di
superficie per lo piugrave glicoproteine espresse sulla loro
membrana cellulare Queste molecole sono usate
comunemente come marker cellulari e sono dette ldquocluster
di differenziazionerdquo (CD)
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
A oggi sono stati identificati piugrave di 320 CD Generalmente
una combinazione di marker egrave in grado di caratterizzare un
solo tipo cellulare che viene quindi descritto come avente
questi marker
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
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Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
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Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza
le MSCa Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo
numero di marcatori che sfortunatamente perograve non sono
specifici per ciascuna MSCa
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
La letteratura internazionale afferma che i
CD73 CD90 e CD105 positivi sono
espressi sulla MSCa
Biotechnol Lett 2013 Dec 10 [Epub ahead of print]
Multiparameter flow cytometry for the characterisation of
extracellular markers on human mesenchymal stem cells
Chan AK Heathman TR Coopman K Hewitt CJ
Author information
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Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
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Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 105 endoglina egrave espresso nellrsquoendotelio dei
capillari arteriole venule e fibroblasti stromali
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lʼantigene endoglina CD105 riconosciuto
dallʼanticorpo SH286 egrave una glicoproteina di 97 kDa
che lega ad alta affinitagrave il TGFbI e III ma non il
TGFbII
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che il TGFbeta II viene prodotto durante i fenomeni
infiammatori Questo stimola la moltiplicazione di Fibrotic
Fibroblast che producono collagene di I tipo e fibrosi dermica
non in linea con il concetto di rigenerazione delle MSCa
INFIAMMAZIONE TGFBETA II FIBROBLASTI FIBROTICI COLLAGENE
TIPO 1 FIBROSI
Dr Fabiano Svolacchia MD
INVECCHIAMENTO
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle
interazioni tra le cellule endoteliali e nello
sviluppo dei vasi
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il TGF-β egrave anche il piugrave forte induttore dei miofibroblasti esso
modula lrsquoespressione dei recettori di diverse citochine inclusi
i recettori per il TGF-β il PDGFR e di endotelina
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoendotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel
convertire i fibroblasti in miofibroblasti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 90 egrave espresso sui sottoinsiemi di fibroblasti
e delle cellule endoteliali mediante espressione
positiva alla fibronectina Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 11+ e CD11 dim vengono espressi nelle
molecole di adesione migrazione cellulare
sopravvivenza e proliferazione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD73 + egrave espresso tipicamente nelle cellule
staminali mesenchimali
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 146 dim egrave espresso nelle cellule endoteliali nel tessuto
vascolare cosigrave come nelle coesioni del monostrato
endoteliale alle giunzioni intercellulari del tessuto vascolare
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 31+ egrave espresso durante la rigenerazione
dei tessuti
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il CD 80+ egrave espresso nei segnali di
attivazione e sopravvivenza
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo
possiedono multipotenzialitagrave a livello di singola cellula
verso i commissionamenti di osteoblasti adipociti
condrociti fibroblasti e cellule reticolari avventiziali
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui
fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage e sulle vie
di segnalazione che sottintendono a tali processi
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
FINALITArsquo ED UTILIZZO DELLE MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente dopo opportuna estrazione possono essere utilizzate
da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una
rigenerazione come lrsquoaging crono o fotoindotto cicatrici
smagliature atonia dei tessuti ecchellip
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquointento egrave quello di aumentare la presenza di cellule che
andranno incontro a divisione simmetrica ed asimmetrica
aumentando cosigrave il numero delle cellule attive e non
senescenti allrsquointerno dei tessuti invecchiati
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Per indirizzare e velocizzare la risposta delle MSCa verso le
cellule della linea dermica ( i fibroblasti ) possiamo
associare il concentrato piastrinico sia nella sua forma
liquida sia in quella gelatinosa come matrice o scaffold per
lrsquoapplicazione di cellule mesenchimali adulte
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione
immunofenotipica anche il marcatore CD140A che ha
funzione recettoriale per il PDGF
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lo scopo egrave di ottenere dalle piastrine debitamente attivate la
liberazione dei diversi fattori di crescita necessari per la
differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerarne la
crescita e lrsquoimpianto (Lucarelli 2003 Kilian 2004 Doucet 2005 Del Bue 2006
Gobbi 2007 Everts 2007)
MSCa
MSCa e PRP
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
I fattori di crescita liberati dalle piastrine infatti hanno
dimostrato di possedere la capacitagrave di favorire la
differenziazione delle cellule staminali verso il destino
cellulare e di promuovere lrsquoangiogenesi (Fotia 2008) Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante
vantaggio che entrambi i biomateriali sono due composti autologhi
non tossici e biodegradabili
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoapplicazione intradermica di MSCa e PRP egrave
sicura e non induce nellrsquoospite alcuna reazione di
tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o
sistemici
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il trattamento con MSCa e PRP in associazione
determina quindi un potenziamento del processo di
rigenerazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo comunque che il trattamento con MSCa egrave in grado
di migliorare qualitativamente la capacitagrave rigenerativa del
tessuto in misura maggiore rispetto al trattamento con solo
PRP
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoassociazione di MSCa e PRP egrave caratterizzata
da un effetto sinergico che egrave in grado di
migliorare lrsquoefficacia drsquoazione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoutilizzo di MSCa o dellrsquoassociazione delle MSCa e PRP
risulta perciograve una prospettiva molto interessante nel
trattamento di patologie legate al processo
dellrsquoinvecchiamento del derma poicheacute induce una
rigenerazione migliore
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere utilizzate anche con
adipociti migliorando qualitativamente e
quantitativamente le cellule trapiantate
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Migliorano le prospettive di attecchimento del
grasso trapiantato poicheacute si differenziano in
adipociti ed aumentano le cellule vitali depositate
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
E la neo-angiogenesi indotta dalle MSCa risulta
indispensabile per un attecchimento degli adipociti
che duri nel tempo Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa vengono unite al supporto tissutale biologico
autologo ( STBA ) per completare il trattamento sulle rughe
superficiali come meglio indicato piugrave avanti
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
LA PROCEDURA DEL TRATTAMENTO CON MSCa
ADIPOCITI E FATTORI DI CRESCITA DI
DERIVAZIONE PLASMATICA
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Si preparano MSCa adipociti e Plasma
MSCa adipociti PRP
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Quota di MSCa PRP
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Unione delle due componenti
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Poi prepariamo il grasso estraendolo dallrsquoarea donatrice
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Quindi misceliamo le varie frazioni cellulari tra
loro con un rubinetto a tre vie
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Si trattano quindi le porzioni di tessuto depauperato
in tessuto adiposo Aiutandoci col polpastrello il
primo passo egrave infiltrare la linea al livello del bordo
infraorbitario sul periostio
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lago egrave introdotto attraverso lrsquoapertura piriforme e
collocato sulla semiluna infraorbitale a livello
periostale Depositiamo una frazione di MSCa
adipociti in quattro o cinque passaggi lungo il
bordo orbitale del muscolo orbicolare
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Successivamente si completa il deposito delle
frazioni adipocitarie e di MSCa sul resto delle
porzioni del viso
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Ed otteniamo questo risultato
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Con mantenimento a distanza di tempo
Fabiano Svolacchia MD
SN
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
DX
Con mantenimento a distanza di tempo
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Il secondo passo egrave lrsquoiniezione del PRP unito alla componente delle
MSCa nel muscolo profondo delleminenza malare noncheacute nei
componenti piugrave profondi della piega naso-labiale i muscoli e
sottocutaneo Questo si effettua con la tecnica lineare per consentire la
crescita ottimale dei vasi sanguigni
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del
derma per stimolare la rigenerazione generale di elementi
dermici collagene elastina e la produzione di GAGs Si
effettua con una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i
fattori di crescita
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Trattiamo il derma
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Completiamo il trattamento depositando nelle rughe del
viso il STBA che funziona da scaffold per le MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Modalitagrave di estrazione delle MSCa
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le MSCa possono essere ottenute da un prelievo di tessuto
adiposo Dopo opportuna espansione possono essere
reimpiantate sullo stesso paziente La procedura richiede
circa 1520 giorni di tempo per avere le cellule
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Oppure attraverso un prelievo dermoepidermico
Infatti nello strato basale dellrsquoepidermide vi egrave una
popolazione di cellule staminali di cheratinociti
(stem cells) dotate drsquoalta capacitagrave di auto-
rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale
proliferativo
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lrsquoepidermide egrave un epitelio dinamico che si rinnova
continuamente per tutta la vita Il suo turnover egrave di circa 7
giorni nellrsquouomo Questo rapido turnover nellrsquoadulto
richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a
cellule mature
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Epidermide strato basale (organizzazione in clusters)
strato spinoso e granulare
follicoli piliferi (porzione esterna)
Derma follicoli piliferi
cellule non follicolari
La localizzazione dermo-epidermica delle stem
cell la abbiamo
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Lo strato basale dellrsquoepidermide contiene due tipi di
cheratinociti
Stem cells indifferenziate slowly-cycling ampia capacitagrave di
proliferazione
Transit amplifying cell (TA) replicazione rapida con limitato
potenziale proliferativo
Lrsquoespressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento
terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al
transit amplifying
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le stem cell dermoepidermiche a loro volta generano
cellule che vanno incontro a differenziazione terminale
conosciute come ldquotransient amplifying cellsrdquo (TA) che
prima di andare incontro a differenziazione terminale
mostrano una limitata capacitagrave proliferativa
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
La differente capacitagrave proliferativa di tali cellule egrave stata
studiata molto accuratamente in coltura valutando la loro
efficienza nel formare colonie (CFE) Nellrsquo epidermide
umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di
formare colonie
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
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Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
olocloni che sono considerati cellule staminali con la piugrave
alta capacitagrave proliferativa (self-renewal telomerase
telomeri)
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
paracloni (TA) che vanno incontro a differenziazione
terminale dopo circa una decina di divisioni
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
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Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
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Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i
paracloni e gli olocloni
Esterno
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
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Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Ovviamente il passaggio da olo a mero e paraclone
egrave irreversibile e solo gli orocloni sono delle vere
stem-cell in virtugrave della loro capacitagrave di
autorinnovamento
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le cellule staminali dellrsquoepidermide sono presenti anche
tra i cheratinociti della guaina del bulbo pilifero
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
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Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
1) Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di
profonditagrave 2 ) Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37deg con
collagenasedispase 3 ) Selezione attraverso i reagenti attivazione
Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting a method for
separation of various cell populations depending on their surface
antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell
sorting a biophysical technique used in flow cytometry)
Procedura standard di estrazione dermoepidermica
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
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FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
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Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
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Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti
e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro
trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto
alle procedure abituali
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
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Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali
formano una popolazione con determinate
caratteristiche morfologiche chiamate SIDE
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION
sono 1) la dimensione le cellule hanno una dimensione
sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali
significativamente maggiore che nella WILD
POPULATION
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
FAC side population analisi
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) Lrsquoantigene CD34 egrave una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene down-
regolata durante il differenziamento Bonnet D Haematopoietic stem cells Journal of
Pathology 197430-4402002 Zanjani ED Almeida-Porada G Livingston AG et al Human bone
marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to
CD34+ cells Exp Hematol 26 353-360 1998
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Utilizzando esclusivamente il criterio della
dimensione possiamo selezionare una popolazione
sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule
staminali possono raggiungere lrsquo80
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
Laboratorio di Manipolazione Cellulare SC SIMT - Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
Fabiano Svolacchia MD
Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Infatti crsquoegrave una relazione biunivoca tra le cellule
filtrate e la sua attivitagrave
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
Fabiano Svolacchia MD
Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Si preleva un frustolo di tessuto in sede sottoascellare e si
inserisce allrsquointerno di una capsula dedicata con 1 ml di
sol fisiologica
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
Fabiano Svolacchia MD
Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Nella capsula il frustolo viene triturato con velocitagrave e
secondo delle grandezze definite e le cellule filtrate
Fabiano Svolacchia MD
Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
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Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
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Grazie per lrsquoattenzione
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Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione
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Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
Fabiano Svolacchia MD
Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
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Grazie per lrsquoattenzione
Fabiano Svolacchia MD
Da questa semplice manipolazione abbiamo il seguente
risultato
- vitalitagrave 92
- cellule CD90+ 52
- cellule CD105+ 82
- cellule CD11b+ 45
- cellule CD11b dim 43
- cellule CD73+ 82
- cellule CD146+ 36
- cellule CD146 dim 49
- cellule CD31+ 2
- cellule CD80+ 3
- cellule CD45+ CD14+ CD34 CD133 0
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Trasfusionale IRCCS Fondazione Policlinico S Matteo
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
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Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
di sostegno alle MSCa nel crono e foto aging
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Dalla foto della coltura si identificano 2 popolazioni
diverse di cellule una dalla forma allungata e una dalla
forma romboidale piugrave grande e cellule che risultano
appartenenti alla linea mesenchimale
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
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Da quanto sopra illustrato egrave evidente la validitagrave di un
trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
associazione a materiali biologici per favorire
lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
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Ricordo che secondo quanto riportato dallrsquoInternational Society for Cytotherapy
le cellule staminali mesenchimali sono definite tali qualora oltre a crescere in
colture aderenti alle piastre esprimano markers Cluster of Differentiation (CD)
CD105 CD73 e CD90 in percentuale superiore al 95 mentre esprimano i
markers CD34 CD45 CD14 o CD11b CD79a o CD19 in percentuale non
superiore al 2 (Dominici et al 2006) In linea con quanto sopra riportato
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trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
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lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
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trattamento che preveda lrsquoutilizzo di microinnesti di
tessuto da cui derivano MSCa singolarmente od in
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lrsquoattecchimento delle varie frazioni cellulari o
permettendo allo scaffold di svolgere la propria funzione
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