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L3 Biochimie et Biologie Cellulaire – Biochimie et Machines Moléculaires James Sturgis 1
Le phage T4
L3 Biochimie et Biologie Cellulaire – Biochimie et Machines Moléculaires James Sturgis 2
Les Sujets
● Cycle virale de T4
● La structure de T4
● Autoassemblage d'un virus complexe
● Un machine a empaqueter l'ADN
● Un machine a injecter l'ADN
L3 Biochimie et Biologie Cellulaire – Biochimie et Machines Moléculaires James Sturgis 3
Le cycle virale
● T4 c'est un virus a ADN double brin.
● Il attaque E. coli (il est meme utilisé en thérapie).
● Il est de la famille des Myoviridae
● Il est petit environ 150 nm
100 nm
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Le cycle virale
● Cycle virale de T4– Virion libre
– Attachement
– Injection
– Digestion de l'ADN de l'hôte
– Biosynthèse
– Assemblage
– Lyse et dispersion
100 nm
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Le cycle virale
● Cycle virale de T4– Virion libre
– Attachement
– Injection
– Digestion de l'ADN de l'hôte
– Biosynthèse
– Assemblage
– Lyse et dispersion
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Le cycle virale
● Cycle virale de T4– Virion libre
– Attachement
– Injection
– Digestion de l'ADN de l'hôte
– Biosynthèse
– Assemblage
– Lyse et dispersion
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Le cycle virale
● Cycle virale de T4– Virion libre
– Attachement
– Injection
– Digestion de l'ADN de l'hôte
– Biosynthèse
– Assemblage
– Lyse et dispersion
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Le cycle virale
● Cycle virale de T4– Virion libre
– Attachement
– Injection
– Digestion de l'ADN de l'hôte
– Biosynthèse
– Assemblage
– Lyse et dispersion
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Un virus complexe
● Virion– Capsid (119,5 nm x 86 nm)
– Queue (100 nm x 21 nm ) avec une « baseplate» et des fibres.
● Genome de 168,903 bp avec 289 orf's de protéine et 8 tARN et au moins 2 autres ARN stables et petits.
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Un virus complexe
● Virion– Capsid (119,5 nm x 86 nm)
– Queue (100 nm x 21 nm ) avec une « baseplate» et des fibres.
● Genome de 168,903 bp avec 289 orf's de protéine et 8 tARN et au moins 2 autres ARN stables et petits.
Bacteriophage T4 genome Microbiology and Molecular Biology reviews 2003
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Un virus complexe
● Glucosylated hydroxy methyl cytosine– Différence entre hôte et
virus ADN.
– Haut niveau d'expression
– Résistance aux enzymes de restriction
Bacteriophage T4 genome Microbiology and Molecular Biology reviews 2003
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Un virus complexe
● Transcription [Rouge]
● Traduction [Marron]
● Métabolisme de Nucleotides [Orange]
● ADN [jaune]
● Virion [bleu]
● Chaperons [bleu points]
● Lyse [Vert]
● Interactions avec hôte [violet]
● Arrêt d'hôte [rose]
● Endonuclease [peche]
● Inconnue [blanc ou ~]
Bacteriophage T4 genome Microbiology and Molecular Biology reviews 2003
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Un virus complexe
● L'ADN est linéaire dans le virion.
● C'est une permutation circulaire du génome.
● Avec 102105% du genome
● Lié a une replication en « Rolling circle ».
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Structure globale de T4
● Virion– Capside
– Queue
– Fibres longues
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Assemblage du capside
● Une icosohédron allongé sur une axe S5.
● Plus de 1500 molécules de protéine
● gp23* les surfaces
● gp24* les vertices
● gp20 le portal
● décoré avec hoc et soc
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Assemblage du capside
● Initiation
● Assemblage du protete
● Maturation
● Insertion de l'ADN
● Stabilisation (hoc et soc)
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Assemblage du capside
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Assemblage du capside
● gp23 repliement demande GroEL et gp31 qui remplace completement GroES!
● la structure de gp23 contrôle la taille de la tête mais on comprend pas comment!
● gp23 et gp24 sont homologues...
● Protéolyse par le protéase a serine T4PP'ase donne une réorganisation de la tête.
● Coupure a L(/I)XXXE
● Augmentation de volume de 50% et exposition de sites pour hoc et soc.
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Assemblage du capside
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Assemblage du capside
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Assemblage du capside
● Empaquetage d'ADN demande gp16 et gp17 et beaucoup d'énergie.
● Un moteur à envoyer l'ADN dans la tête....
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Assemblage du queue
● 22 protéines sont impliquées dans l'assemblage du queue.
● Cela dépend des interactions protéineprotéine séquentiels
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Assemblage du queue
● Wedge
● Hub
● Baseplate
● Queue
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Assemblage du queue
● Baseplate – 6 « wedges» autour d'un
« hub»– Les «w edges » sont fait de
gp11, gp10, gp7, gp8, gp6, gp53 et en dernier gp25
– le « hub » central est fait de gp5, gp27, gp29, et probablement gp26 et gp28.
– finalement le baseplate est complete par les fibres court de gp9 et gp12.
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Assemblage du queue
● Queue– d'abord attachement de
gp48 et gp54 au « baseplate» .
– polymérisation de gp19– gp29 fonction détermine le
nombre de gp19 (138).– ensuite 138 copies de gp18
dans un structure hélicoïdal.
– Terminaison avec gp15
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Assemblage du queue
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Assemblage
● Attachement du capsid au queue
● Fibres de queue
● Maturation des virions
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Assemblage
● gp15 et gp18 interagissent
● gpwac forme une gaine autour du collier avec des moustaches
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Assemblage
● gpwac ou fibritin est un homotrimer
● N terminal domaine un longue série de répétitions d'une héptad (abcdefg) typique de hélices a qui s'enroulent en oligomer « coiledcoil ».
● C terminal domain un « foldon » trimérique.
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Assemblage
● Les longues fibres du queue...
– gp343 partie proximale
– gp363/37
3 partie distale
– gp383 pied
● reconnaissance du récepteur OmpC
– gp35 genou
● Assemblage assisté par gpwac et gp63.
gpwac
gp35gp34gp36/gp37gp38
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Assemblage
● gp12 (fibres courtes)
● Interagissent avec LPS lors d'infection
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Assemblage
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T4
● Un machine à injecter l'ADN dans des cellules de E. coli.
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T4 – à suivre...
● Le machine a empaqueter l'ADN gp16 et gp17
● Un machine à injecter l'ADN dans des cellules de E. coli.
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T4 – Assemblage du capsid
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T4 – Densité d'ADN
DNA un cylindre de rayon 1nm et de longeur 0,34 nm/bp
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T4 – Densité d'ADN
DNA dans des phages est a plus haut densité que celui des virus d'animal.
DNA dans des phages est a haut densité. Similaire a un cristal.
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T4 – Densité d'ADN
Il faut plier l'ADN (qui est difficile) et il faut rapprocher des brins (qui comme ils sont fortement charge est difficile).
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T4 – Densité d'ADN
Il faut plier l'ADN (qui est difficile) et il faut rapprocher des brins (qui comme ils sont fortement charge est difficile).
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T4 – Densité d'ADN
On peut calculer les forces avec ce modèle géométrique...
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T4 – Densité d'ADN
Les forces nécessaires peuvent être très importants.
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T4 – Densité d'ADN
Les forces nécessaires peuvent être très importants, et ils varient avec la force ionique...
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T4 – Densité d'ADN
Les modèle mime la réalité assez bien...
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T4 – empaquetage d'ADN
Afin de mesurer l'empaquetage...
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T4 – empaquetage d'ADN
Longeur contre temps avec une force de 5pN avec beaucoup d'ATP...
Note des pauses...
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T4 – empaquetage d'ADN
Vitesse contre ADN restant avec une force de 5pN...
Une moteur relativement rapide
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T4 – empaquetage d'ADN
Distance contre temps sans déplacement du pipette.
Ca cale à environ 55pN.Des glissements.
Un moteur très fort, souvent les liens se cassaient avant l'arrêt.
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T4 – empaquetage d'ADN
Force contre vitesse.
Ca décline d'une façon régulier.
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T4 – empaquetage d'ADN
Force contre vitesse.
Ca décline d'une façon régulier
La courbe est comme si le remplissage du capside exerce un contre force.
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T4 – empaquetage d'ADN
Force contre vitesse.
Ca cale aux alentours de 60 pN normalement.
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T4 – empaquetage d'ADN
57 pN force moyenne de cale...
0.68nm par ATP
39 pN nm = 39 i Nm
efficacité d'environ 30% comme ATP hydrolyse vaut environ 120 iJ mµnpfai
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T4 – empaquetage d'ADN
Force 57 pN divisé par surface donne un pression interne d'environ 6 Mpa
Limite d'élasticité du paroi (1.6nm épaisseur) d'environ 100MPa proche de celui de Titane.
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T4 – empaquetage d'ADN
Force contre distance.
La force interne en opposition est égale a la force maximale du moteur quand le capside est remplis.
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T4 – empaquetage d'ADN
Force contre distance.
Intégration donne l'énergie (force x distance) pour remplir le capsid = 75 aJ (Nm)
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T4 – empaquetage d'ADN
Force contre distance.
Intégration donne l'énergie (force x distance) pour remplir le capsid = 75 aJ (Nm)
Les énergies et forces utilisés sont similaires a ceux dans la structure donc c'est un travail réversible et peu dissipatif.
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T4 – empaquetage d'ADN
Comment l'[ATP] modifie des choses?
Précédemment beaucoup d'ATP....
1000,500,250,100,50,25,10,5 et 0 µM (ADP et Pi 5 µM et 5pN)
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T4 – empaquetage d'ADN
Text
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T4 – empaquetage d'ADN
Text
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T4 – empaquetage d'ADN
Coordination entre sousunités
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T4 – empaquetage d'ADN
Coordination entre sousunités
[AMPPNP] change la fréquence des pauses d'une façon linéaire donc une seule molécule est suffisante.
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T4 – empaquetage d'ADN
Coordination entre sousunités
Réponse à la [ATP] typique d'une inhibition compétitive.
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T4 – empaquetage d'ADN
Effet de force avec ATP
La force change Vmax et Km(ATP).
Pi n'a pas d'effet.
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T4 – empaquetage d'ADN
Rappel MichaelisMenten:
k2=vmax
[E t ]=kcat
ES ES EPk1
K-1
k2
K m=k−1k2
k1
Vm/Km = k1 k2/(k1+k2)si k2 >> k1Vm/Km = k1
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T4 – empaquetage d'ADN
Effet de force avec ATP
Vmax/Km (kb = liaison de substrat) indépendant de Force.
kcat dépendant de la Force.
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T4 – empaquetage d'ADN
Coordination entre sousunités effet de force – la force ne change que peu la longueur des pauses...
Liaison d'ATP indépendant de Force.
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T4 – empaquetage d'ADN
Le moteur doit lacher l'ADN a un moment pour progresser. Les glissements sont plus commun avec ADP dans la site active, ou avec une site active vide.
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T4 – empaquetage d'ADN
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T4 – empaquetage d'ADN
Forces during bacteriophage DNA packaging and ejection. Purohit et al. 2005 Biophysical Journal 88: 851866.
Bacteriophage φ29 portal motor can package DNA against a large internal force. Smith et al. 2001 Nature.
Mechanism of force generation of a viral DNA packaging motor. Chemia et al. 2005 Cell 122: 683692.
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T4 – à suivre...
● Une assemblage complexe.
● Le machine a empaqueter l'ADN gp16 et gp17
● Un machine à injecter l'ADN dans des cellules de E. coli.
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Un machine a injecter
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
LTF OmpC
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● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
Un machine a injecter
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
Hexagon to Star
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
Hexagon to Star
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
Hexagon to Star
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Un machine a injecter
● Attachement– Interaction OmpC – LTF
– Interaction LPS STF
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi– Contraction du queue
– Digestion du peptidoglycan
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi– Contraction du queue
– Digestion du peptidoglycan
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi– Contraction du queue
– Digestion du peptidoglycan
● Injection de l'ADN
L3 Biochimie et Biologie Cellulaire – Biochimie et Machines Moléculaires James Sturgis 87
Un machine a injecter
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi– Contraction du queue
– Digestion du peptidoglycan
● Injection de l'ADN
L3 Biochimie et Biologie Cellulaire – Biochimie et Machines Moléculaires James Sturgis 88
Un machine a injecter
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi– Contraction du
queue
– Digestion du peptidoglycan
● Injection de l'ADN
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Un machine a injecter
● Attachement
● Traversé du membrane externe et paroi
● Injection de l'ADN– Interaction avec le
membrane
– Éjection de l'ADN
L3 Biochimie et Biologie Cellulaire – Biochimie et Machines Moléculaires James Sturgis 90
Le phage T4
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