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Les 4èmes Journées Maghrébines d’HématologieLes 9èmes Journées Nationales d’Hématologie
26,27 et 28 Avril 2007
INTRODUCTION (1)
TG :
Anomalie Felle Déficit quantitatif ou qualitatif des GP
IIbIIIa (intégrines αIIbβ3) Autosomale récessive Cause de saignement clinique
INTRODUCTION (2)
Exploration biologique :
TS/TO Num. Plaq. MO Fonctions plaquettaires SDS PAGE (classification) BM Phénotype membranaire (CMF)
INTRODUCTION (3)
Etude par CMF:
Méthode simple et précise Les données recueillies:
Le % des cellules qui expriment l’Ag L’intensité moyenne de fluorescence
(IMF)
IMF est proportionnelle à la quantité de sites antigéniques à la surface des plaquettes
Représentation schématique d’une plaquette
7-glycogène8-système canaliculaire9-granule α10-GP IbIXV: vWF11-granule dense12-GP IcIIa
1-GP IV: thrombospondine et collagène2-GP IIbIIIa: fibrinogène et vWF3-microtubules4-lysosome5-GP IaIIa: collagène6-recepteur de thrombine
Complexe GPIIbIIIa: intégrine αIIbβ3
MATERIELS
*Groupe témoin : 10 donneurs de sang
5 F / 5 H Sans ATCD de troubles de l’hémostase Age moyen : 36,4 ans (25-51 ans) Taux moyen de plaquettes : 294,2 103/µl * 13 patients:
5 F / 8 H Classés type I ou II par l’étude de la
rétraction du caillot et/ou le SDS PAGE
N/PSexe
Age actu
el
Age et symptômes au Dg
Type de Sd Hgique
Bilan hémostase
Fonctions plaquettaire
s
Classifi-
cation
T.N
H8
1 an, gingivorragies
gingivorragies,circoncision préparée
Plq: 270.103/µlTS: 2’30’’/ V= 45µlTP:86%, TCA:31/30
Ag. nulle à l’ADPRC: nul
IRC
J.N
F29
3ans, épistaxis, gingivorragies
hématurie, ménométrorragies, gingivorragies
Plq:246.103/µl TS: 4’30’’/ V: NPTP:80%, TCA: 32/32
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP et AdrénalineRC: bonne
IIRC
L.N
F27
2 ans, épistaxis, gingivorragies, hgie. digest.
épistaxis, gingivorragies, ménorragies
Plq:250.103/µl TS: 9’ / V: NPTP:100%,TCA: 30/30
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP et AdrénalineRC: bonne
ISDS
PAGE
K.I
F16
9 ans, épistaxis, gingivorragies
gingivorragies, ménorragies, Hématome de l’épaule
Plq:347.103/µl TS: 2’30’’/ V=38µlTP:96%,TCA: 27/30
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP
IIRC
Z.T
H21
14 ans, épistaxis, gingivorragies
épistaxis, gingivorragies, circoncision sans préparation
Plq:254.103/µl TS: 4’/ V: NPTP:74%,TCA: 30/30
CMFII
Z.K
H29
4 ans, circoncision hémorragique
épistaxis + , gingivorragies +
Plq:240.103/µl TS: NFTP:98%, TCA: 29/30
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADPRC: NF
II
Caractéristiques des patients
B.R
H23
2 ans, épistaxis, gingivorragies, circoncision hémorragique
épistaxis, hgie. digest.otorragie
Plq: 450.103/µlTS: 5’30’’/ V: NPTP:100%, TCA:30/35
Ag. Nle au Risto Ag. nulle à l’ADPRC: bonne
IIRC
N.H
F7
3ans, épistaxis
épistaxis, gingivorragies,
Plq:214.103/µl TS: 3’/ V: NPTP:100%,TCA: 23/26
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP
ICMF
I.RI
H18
3 ans, épistaxis, circoncision hémorragique
épistaxis, gingivorragies, hgie. digest.
Plq:220.103/µl TS: 5’30’’(Duke)TP:100%,TCA: 30/30
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP et AdrénalineRC: nulle
IRC
I.RA
F12
5 ans, épistaxis,
épistaxis, gingivorragies
Plq:297.103/µl TS: 2’/ V=13µlTP:65%,TCA: 30/32
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP RC: nulle
IRC
G.S
H16
13 ans, épistaxis, gingivorragies
épistaxis, gingivorragies
Plq:230.103/µl TS: 2’30’’/ V: 16µlTP:50%,TCA: 29/30
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP
IICMF
M.W
H24
8 mois épistaxis
épistaxis, gingivorragies, hgie. digest.
Plq:176.103/µl TS: 7’ (Duke) TP:80%,TCA: 30/30
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP RC: bonne
IISDS
PAGE
M.A
H23
3 mois, épistaxis, gingivorragies, circoncision hémorragique
épistaxisPlq:150.103/µl TS: 10’/ V: NPTP:80%,TCA: 30/30
Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADPRC: bonne
IIRC
METHODES (1)
Pour ces 2 groupes :
Prélèvements : 2 tubes sur citrate de sodium 1 tube sur EDTA
Agrégation plaquettaire : Chrono-Log 500VSMéthode optiqueSur PRP
ADP : 20µMCollagène : 5µg Acide arachidonique (AA) : 2mMRistocétine : 1,25 µg
METHODES (2)
CMF : Coulter EPICS XL
CD41a-PE clone HIP8: GPIIb (αIIb integrin) BD. Bioscience
CD61-PE clone SZ21: GPIIIa (β3 integrin) Immunotech
CD42b-FITC clone HIP1: GPIb BD. Bioscience
Mouse IgG1-FITC et IgG1PE BD. Bioscience
Pour chaque échantillon :IgG1-FITC/IgG1-PECD42b-FITC/CD41a-PECD42b-FITC/CD61-PE
METHODES (3)
Sang avec EDTA PRP + GR
Culot plaquettaire + PPP
2 lavages PBS + EDTA à 0,33%
Resuspension dans le PBS à une cc de 105/µl
50µl de plaquettes + 10 µl Ac
Incubation 30 mn à l’obscurité
200 µl de solution de lyse (10 mn)
lavage PBS Resuspension PBS Lecture
RESULTATS (1)
Agents inducteurs ADP
20µM Collagène
5µg AA
2mM
Ristocétine
1,25µg
Hauteurmaximale
:ΔTL
Moyenne 91,38 92,38 94,13Agglutinati
on +
Écart-type 11,35 10,04 7,63 -
Agrégation plaquettaire
Groupe Témoin :
Agents inducteurs ADP
20µM Collagène
5µg AA
2mM
Ristocétine
1,25µg
Hauteurmaximale
:ΔTL
Moyenne Abce 24,95 49,32Agglutinati
on +
Écart-type - 8,27 9,91 -
Patients :p<0,01
% des cellules Ag+ : patients classés Type I
Étude en CMF
N/PCD41a (%
d’expression)CD61 (%
d’expression)
T.NH
0 % (Absence) 98 %
L.NF
33 % 63 %
N.HF
98 % 0 % (Absence)
I.RIH
55 % 10 %
I.RAF
58 % 14 %
RESULTATS (2)
Ac anti-GP CD42b CD41a CD61
Intensité moyenne de fluorescence
IMF
Moyenne 31,20 9,78 242,86
Écart-type 3,24 1,09 77,18
Étude en CMF
Ac anti-GP CD42b CD41a CD61
Intensité moyenne de fluorescence
IMF
Moyenne 29,23 3,66 10,75
Écart-type 11,39 2,05 11,45
Groupe Témoin :
Patients :
RESULTATS (3)
p<0,01P=0,56 p<0,01
Patients :
Étude en CMF
Ac anti-GP CD42b CD41a CD61
Intensité moyenne de
fluorescence IMF
Type I 35,22 1,82 1,79
Type II 25,49 4,80 16,35
IMF (% par rapport à la
normale)
Type I 112.88 18,63 0,74
Type II 81.69 49,13 6,71
RESULTATS (4)
p<0,01P=0,14
Contrôle
IMF: 2,41 IMF: 38,3
TG type I
IMF: 1,28 IMF: 43
TG type I
TG type I
IMF: 4,49 IMF: 28,4
TG type II
IMF: 37,2 IMF: 31,7
TG type II
TG type II
Pour le type I
CD41a: 18,63% de la normale CD61: 0,74 % de la normale Surexpression de la GPIb:112,88%
Pour le type II
CD41a:49,13% de la normale CD61: 6,71 % de la normale expression de la GPIb:81,69%
COMMENTAIRES (1)
Peu d’études sont réalisées dans ce sens:
Etude indienne: Am.J.Hematol. 2003 :
10 Patients: CD41 et CD61
6 Type I: absence de GP IIb IIIa3 Type II: GP IIb IIIa de 7,72 à 20,40 % de la
normale1 Variant: GP IIb IIIa de 46 %, RC: 60 %
COMMENTAIRES (2)
La détermination de l’IMF quantifier le nombre de molécules à la surface des cellules
Il y’a des trousses permettant de quantifier les GP: nombre de sites antigéniques
utilisation d’une gamme de calibration (4 suspensions de billes de calibration correspondant chacune à un taux connu de sites antigéniques)
Conversion de l’IMF en nombre d’Ac fixés par
cellule
COMMENTAIRES (3)
Proposition d’une classification pour la TG:
Type I
IMF (CD41a): 0 à 20 % de la normaleet/ou
IMF (CD61): 0 à 2 % de la normale
Type II ou variants:
IMF (CD41a) > 20 % de la normaleet
IMF (CD61) > 2 % de la normale
CONCLUSION (1)
Notre étude doit être complétée
Confirmation de nos résultats sur un effectif beaucoup plus important
Etude par CMF de la capacité des plaquettes activées à lier le fibrinogène (Variants)
CONCLUSION (2)
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