Miniprep’Protocol’ - Brigham Young Universityweberlab.byu.edu/Portals/105/Protocols/Miniprep...

Miniprep  Protocol  9/23/13  TO  

 Total  Time:  1  day  to  grow  up  the  plasmid  and  about  1  hour  to  miniprep.    Purpose:  The  purpose  of  the  miniprep  protocol  is  to  isolate  plasmids  from  cells.  We  can  then  use  these  plasmids  to  perform  any  number  of  operations  from  PCR,  to  transformations.      We  keep  miniprepped  plasmids  in  the  -­‐20  freezer  in  the  “Lab  Plasmid  Stock”  box.  Check  this  box  to  see  if  your  plasmid  is  already  miniprepped.    1.)  Grow  up  a  patch  of  the  plasmid  you  want  to  isolate  from  either  the  -­‐80  stocks  or  a  transformation  you  have  completed  yourself.    2.)  From  the  patch  (or  colony)  take  a  swipe  of  cells  with  a  pipette  tip.  Colony  will  give  you  about  115  ng/μl  while  patch  will  give  you  about  300  ng/μl.

   3.)  Eject  this  tip  directly  into  a  5ml  tube  that  has  3mls  of  LB  +  Antibiotic.  (We  add  1μl  of  a  100  ng/μl  of  Amp  per  1ml  of  LB.)    4.)  Grow  this  up  overnight  at  37°  shaking  at  about  200-­‐230  rpm.    5.)  After  growth  phase,  remove  1.5  mls  into  the  provided  centrifuge  tube.  Centrifuge  for  1  min  at  13,000  rpm.    6.)  Descant  the  fluid  and  tap  on  a  clean  paper  towel.    7.)  Add  the  remaining  1.5  mls  into  that  same  centrifuge  tube.  Spin  for  another  min  at  13,000  rpm.  Descant  the  fluid  and  tap  on  clean  paper  towl.    8.)  Resuspend  cells  in  400μls  of  COLD  LYSIS  BUFFER.  Vortex  at  least  30  seconds  until  all  cells  are  in  solution.    Make  sure  cells  are  not  in  pellet  at  the  bottom.  This  step  is  critical  to  get  good  yield.        9.)  Incubate  at  Room  Temp  for  5  min.  

Colony   Patch  

 10.)  Centrifuge  1  min.  at  13,000  rpm    11.)  Add  400μl  of  Wash  Buffer    12.)  Centrifuge  1  min.  at  13,000  rpm    13.)  Dump  flow  through  and  tap  on  clean  paper  towel.    14.)  Centrifuge  for  an  additional  1.5  min  at  13,000  rpm  to  dry  the  filter.    15.)  Transfer  filter  to  a  new  GeneMate  1.5μl  microcentrifuge  tube.  Add  50μl  of  Elution  Buffer  to  each  sample.      16.)  Let  incubate  at  room  temperature  for  5  min.    17.)  Centrifuge  for  1  min.  at  13,000  rpm.  You  MUST  bend  back  the  cap  on  the  microcentrifuge  tube  so  that  it  is  flat,  or  else  the  cap  will  break  off.  The  GeneMate  brand  tend  to  break  less  than  the  FastPlasmid  brand.    18.)  Nanodrop  your  samples.  A  miniprep  done  from  a  colony  will  yield  about  113  ng/μl  whereas  a  minipred  done  from  a  patch  will  yield  about  300  ng/μl.