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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
TATIANA PEREIRA PENA DUTRA
MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E
CÉLULAS NK POR CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
Orientador: Eliana Saul Furquin Werneck Abdelhay
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação
ii
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
TATIANA PEREIRA PENA DUTRA
Modulação da atividade antitumoral de linfócitos TCD8 e células NK por células-tronco
mesenquimais
Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer
como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre
em Oncologia.
Orientador: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação
iii
D978m DUTRA, Tatiana Pereira Pena. Modulação da atividade antitumoral de linfócitos TCD8 e células NK por células-tronco mesenquimais. / Tatiana Pereira Pena Dutra. – Rio de Janeiro, 2014. xiv, 47 f.: il. color. Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2014. Orientador: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay. 1. Células Tronco Mesenquimais. 2. Células Citotóxicas. 3. Células Mesenquimais Estromais. I. Abdelhay, Eliana. (orient). II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. III. Título.
CDD 616.41
iv
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
TATIANA PEREIRA PENA DUTRA
MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E
CÉLULAS NK POR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
ORIENTADOR : Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay
Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação
v
Aprovada em: 05 de Junho de 2014
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Martin Hernan Bonamino
Prof. Dra. Mariana Emerenciano Cavalcanti de Sá
Prof. Dr Robson de Queiroz Monteiro
Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault
Prof. Dra. Morgana Teixeira Lima Castelo Branco
RIO DE JANEIRO
2014
vi
Aos meus amigos queridos.
Aos meus pais, por todo carinho e apoio.
E por não me deixarem desistir.
Ao meu filho, simplesmente por ele existir.
AGRADECIMENTOS
À minha família, meus pais, à minha tia Vera Lúcia, à Tânia Flor e à tia Marília, pelo apoio e
carinho incondicionais durante todo esse período. À minha prima querida Patrícia, pelas
conversas infinitas.
Ao meu filho querido que só com um sorriso e suas histórias me inspirou bastante.
Aos amigos, Moisés Rocha, Gabriela de Bonis Eliane Rodrigues, Daiane Correa, Elizete
Nogueira, Luize Otero, Haline, pelos cafés descontraídos e pelas palavras de incentivo.
Às amigas, Mayara, Mércia, Karen e Cláudia Diniz, que também fizeram meus dias acolhedores
e divertidos.
Ao Domingos, Luiz Braga, Luiz, Mauricéia e Jose, por todo apoio e carinho.
Um agradecimento especial às amigas Luize Lima, Patrícia Redondo e Raquel Barbosa. Não
tenho palavras para descrever a minha gratidão e carinho por vocês. Obrigada, pelas horas de
discussão, pelas sugestões e incentivo.
Aos companheiros de laboratório Bruno Pires, Gerson Ferreira Gabriela Lemos, Stephany
Correa, Nathalia Correa, Lílian Ayres, Renata Binato e Luciana Pizzati. Especial à Lydiane
Schimidt e Thaís Basili, pela amizade incondicional.
À Bárbara Du Rocher, que ajudou a construir esse projeto.
À minha orientadora Eliana Abdelhay, pela oportunidade de desenvolver esse trabalho.
vii
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E CÉLULAS NK POR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Tatiana Pereira Pena Dutra
As células-tronco mesenquimais (CTMs) constituem uma população rara e heterogênea, presente no estroma da medula óssea. Por conta de suas características imunossupressoras, estas células ganharam atenção com a possibilidade de seu uso em terapia celular no contexto do transplante de células tronco hematopoiéticas (TCTH), especialmente para o controle da Doença enxerto-contra-hospedeiro (DECH). Entretanto, suas propriedades imunossupressoras também podem afetar o efeito enxerto contra leucemia (ECL), aumentando a recaída da doença de base, que continua sendo a principal causa de morte pós-transplante, segundo dados do Centro internacional de pesquisa em transplante de medula óssea (CIBMTR). Alguns trabalhos de fato, sugerem que a utilização de CTMs para contenção da DECH pode aumentar a recaída na doença de base, por outro lado outros autores não observaram tal correlação. Sabe-se que os linfócitos T citotóxicos e as células NK medeiam tanto o ECL, quanto a DECH, através da citotoxicidade. As CTMs são capazes de inibir a proliferação de linfócitos, porém os dados existentes na
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viii
literatura em relação a citotoxicidade ainda são controversos. Para a utilização destas células para terapia no contexto do TCTH, torna-se fundamental avaliar sua ação sobre os linfócitos T citotóxicos, bem como o mecanismo envolvido na inibição da citotoxicidade. Para avaliar se as CTMs interferem na capacidade citotóxica de linfócitos T e NK em matar células leucêmicas, co-cultivamos células mononucleares (CMNs) com células da linhagem de leucemia mielóide crônica K562, na presença ou ausência de CTMs. As CTMs foram capazes de reduzir a morte de células K562 induzidas na presença de CMNs. Para nos certificarmos de que este efeito não se deu em decorrência da privação de nutrientes, afetando a função de células citotóxicas, nós co-cultivamos CMNs com a linhagem K562 na presença de células HT29, uma linhagem tumoral de cólon altamente proliferativa, capaz de consumir rapidamente os nutrientes da cultura. Neste caso, não observamos uma inibição significativa da atividade citotóxica de CMNs, sugerindo um envolvimento específico ads CTMs . Para investigar os mecanismos envolvidos na inibição da citotoxicidade mediada pelas CTMs, analisamos a produção de moléculas usualmente envolvidas em processos de morte celular induzidas por células T efetoras e células NK como perforina, granzima, TNF-α, INFγ e FasL. Em relação as células TCD8, nossos resultados mostram um aumento na secreção de TNFα e nenhuma diferença foi observada em relação a secreção de INFγ. Em relação as células NK, observamos uma diminuição na secreção de TNFα e INFγ. Os níveis de FasL mostraram-se diminuídos na presença de CTMs nas células NK e nas células TCD8. No entanto, estas diferenças não atingiram significância estatística. Desta forma, o efeito inibitório promovido pelas CTMs não parece estar associado a modulação de nenhuma via citotóxica estudada até o momento. Palavras chave: Células Tronco Mesenquimais, células citotóxicas.
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MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E CÉLULAS NK POR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
ABSTRACT
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Tatiana Pereira Pena Dutra
The mesenchymal stem cells (MSCs) are a rare and heterogeneous population present in the bone marrow stroma. Because of its immunosuppressive characteristics, these cells have gained attention with the possibility of their use in cell therapy in context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), especially for the control of Graft-versus-host disease (GVHD). However, their immunosuppressive properties may also affect the graft versus leukemia effect (GVL), increasing the relapse of the underlying disease, which remains the leading cause of post-transplant death, according to the International Center for Research on bone marrow transplantation ( CIBMTR ). Some studies actually suggest that the use of MSCs for containment of GVHD may increase relapse in the underlying disease, on the other hand other authors found no such correlation. It is known that the cytotoxic T lymphocytes and NK cells mediate both the GVL as GVHD through cytotoxicity. MSCs are capable of inhibiting the proliferation of lymphocytes, but the existing data in the literature regarding the cytotoxicity are still controversial. For the use of these cells for therapy in the context of HSCT, it is essential to assess its effect on cytotoxic T
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lymphocytes, as well as the mechanism involved in the inhibition of cytotoxicity. To assess whether MSCs interfere with the cytotoxic potential of T and NK lymphocytes in killing leukemic cells co-cultivated mononuclear cells ( MNCs ) with the lineage leukemia K562 chronic myeloid cells in the presence or absence of MSCs. MSCs were able to reduce death induced MNCs in the presence of K562 cells. To make sure that this effect did not occur as a result of nutrient deprivation, affecting the function of cytotoxic cells, we co - cultivated with MNCs K562 cells in the presence of HT29 cells, a highly proliferative tumor cell line of colon able to consume quickly crop nutrients. In this case, we observed a significant inhibition of the cytotoxic activity of MNCs, suggesting a specific involvement ads MSCs. To investigate the mechanisms involved in inhibition of cytotoxicity mediated by MSCs, we analyzed the production of molecules usually involved in cell death processes induced by effector T cells and NK cells as perforin, granzyme, TNF - α, INFγ and FasL. Regarding the CD8 T cells , our results show an increase in the secretion of TNF and no difference was observed for the secretion of INFγ. Regarding NK cells, we observed a reduction in the secretion of TNF and INFγ. FasL levels were shown to be decreased in the presence of MSCs in NK cells and CD8 + T cells. However, these differences did not reach statistical significance. Thus, the inhibitory effect caused by MSC does not appear to be associated with any cytotoxic via modulation studied so far .Keywords: Mesenchymal stromal cells, cytotoxic cells.
LISTA DE ABREVIATURAS
AP1 Proteína de ativação 1, do inglês Activating protein-1.
APCs Células apresentadoras de antígeno, do inglês Antigen presenting cells.
Apaf-1 Fator de ativação da apoptose 1, do inglês Apoptotic protease activating
factor 1.
Ape1 Enzima ligada ao reparo do DNA, do inglês Apurinic\apirimidinic
endonuclease 1.
BCR Receptor de células B, do inglês B cell receptor.
Bak Proteína pró-apoptótica, do inglês Bcl-2 homologous antagonist/killer.
Bax Proteína pró-apoptótica, do inglês Bcl-2 associated X protein.
Bcl-2 Proteína pró-apoptótica, do inglês B-cell lymphoma 2.
BID Membro pró-apoptótico da família Bcl2, do inglês BH3 interacting-domain
death agonist.
CAD
Fas
Fas-L
Dnase ativada por caspase, do inglês Caspase-active Dnase.
Receptor da família TNF ligado à apoptose.
Proteína da família TNF ligada à apopstose
c- FLIP Proteína antiapoptótica, do inglês Celular inhibitory FLICE domain.
CFSE Rastreador celular, do inglês Carboxyfluorescein succinimidyl ester.
CTH Células-tronco hematopoiéticas
x
CTLA-4 Proteína inibidora da ativação de linfócitos T, do inglês CTL associated
antigen- 4.
CTM Células-tronco mesenquimais.
CXCR-4 Receptor de quimiocinas 4 com motivo CXC, do inglês CXC Chemokine
receptor-4.
CXCL-12 Quimiocina com motivo CXC, do inglês CXC motif chemokine 12.
DAP-10/12
DECH
Moléculas associadas à receptores da imunidade inata
Doença enxerto contra o hospedeiro.
DISC Complexo formado após ligação Fas-FasL, do inglês Death Inducing
Signaling Domain.
ECL Enxerto contra leucemia.
ECT Enxerto contra tumor.
FADD Proteína do complexo DISC, do inglês Fas-Associated Death Domain.
G-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos, do inglês Granulocyte colony
Stimulating Factor.
HLA Antígeno leucocitário humano, do inglês Human antigen leukocyte.
HMG-2 Proteína do grupo de alta mobilidade 2, do inglês High mobility group G-2.
ICAD Inibidor de Dnase ativada por caspase, do inglês Inhibitor of caspase-active
Dnase.
ITAM Motivo de ativação ligado aos imunoreceptores, do inglês Immunoreceptor
Tyrosine-based Activator Motifis.
ITIMs Motivo de inibição ligado aos imunoreceptores, do ingês Immunoreceptor
tyrosine-based inhibitory motifis.
INFγ Interferon gama.
IL-1β Interleucina 1-β.
IL-2 Interleucina 2.
IL-6 Interleucina 6.
IL-8 Interleucina 8.
IL-7 Interleucina 7.
IL-11 Interleucina 11.
IL-14 Interleucina 14.
xi
IL-15 Interleucina 15.
JNK Quinase c-jun n-terminal, do inglês c-Jun N-terminal kinases.
KIR Receptor como imunoglobulina de células exterminadoras naturais, do inglês
Killer-cell immunoglobulin-like.
LIF Fator inibitório de Leucemia, do inglês Leukemia inhibitoty factor.
LT-α Linfotoxina α, do inglês Limphotoxin α.
LTC Linfócitos T citotóxicos.
M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos, do inglês Macrophage colony
stimulating factor.
NK Células exterminadoras naturais, do inglês Natural Killer.
NFkB Fator de transcrição nuclear kB, do inglês Nuclear factor kB.
NM23_H1 Proteína supressora de tumor ligada ao complexo SET, do inglês Non
metastatic, protein 23homologue 1.
PD- 1 Receptor de morte celular 1, do inglês Programmed cell death-1.
PDL-1 Ligante de morte celular 1, do inglês Programmed cell death ligand-1.
PDL-2 Ligante de morte celular 2, do inglês Programmed cell death ligand-2.
pp32 Fosfoproteína 32, do inglês Phophoprotein 32.
PI3K Fosfatidilinositol 3 quinase, do inglês Phosphatidil inositol 3 kinase.
RIP Receptor de interação proteica.
ROS Espécies reativas de oxigênio, do inglês Reactive oxygen species.
SDF-1 Fator derivado de células do estroma, do inglês Stromal cell-derived factor 1.
SET Complexo associado ao retículo endoplasmático
SHP Proteína de transdução de sinal intracelular com domínio SH2 contendo
fosfatase, do inglês SH2 containing phosphatase.
SHIP Proteína de transdução de sinal intracelular com domínio SH2 contendo
fosfatase, do inglês SH2 containing inositol phosphatase SH2 containing
inositol phosphatase.
SH2 Proteína de transdução de sinal intracelular com domínio SH2, do inglês Src
Homology 2.
TAP Proteína transportadora associada à apresentação de antígenos, do inglês
Transporter associated with antigen processing.
TCR Receptor de células T, do inglês T cell receptor.
xii
TCTH Transplante de células tronco hematopoiéticas
TNF-α Fator de necrose tumoralα, do inglês Tumor Necrosis Factor α.
TNFR Receptor para Fator de necrose tumoral, do inglês Tumor necrosis factor
receptor.
TRADD Proteína de ativação da apoptose, do inglês TNF receptor-associated death
domain.
TRAF-2 Fator 2 associado ao TNF, do inglês TNF associated factor 2.
XIAPs Proteína anti-apoptótica da família IAP, do inglês X linked inhibitor apoptosis
protein.
ZAP 70 Proteína citoplasmática associada à cadeia zeta com atividade tirosino
quinase, do inglês Zeta-chain-associated protein kinase 70.
7AAD Marcador para apoptosis, do inglés 7-Aminoactinomycin_D.
LISTA DE FIGURAS
xiii
TABELAS
Figuras Legendas Paginas
Figura 1 Nicho hematopoiético 1
Figura 2 Células tronco mesnquimais 2
Figura 3 Visão geral do transplante de células tronco
hematopoiéticas
5
Figura 4 Complexo gênico para o HLA 7
Figura 5 MHC de classe I e II 8
Figura 6 Patofisiologia da DECH aguda 10
Figura 7 Processamento de antídenos pelo MHCI 12
Figura 8 Esquema das vias intrínsecas e extríncecas
da apoptose
13
Figura 9 Interação de células NK com células Alvo 15
Figura 10 Mecanismo de citotoxicidade pela atividade
de granulos citotoxicos
18
Figura 11 Mecanismo de citotoxicidade através da
interação Fas-FasL
19
Figura 12 Ativação dos linfócitos T 21
Figura 13 Estratégia de análise da citotoxicidade 25
Figura 14 Estratégia de análise dos mediadores da
citotoxicidade
28
Figura 15 As CTMs inibem a atividade citotóxica de
CMNs contra células leucêmicas
30
Figura 16 O potencial inibidor da citotoxicidade é
inerente às CTMs
31
Figura 17 A inibição da citotoxicidade pelas CTMs
não envolve a modulação de grânulos
citotóxicos
32
Figura 18 As CTMs não inibem a secreção de
citocinas pelas células citotóxicas
33
Figura 19 As CTMs podem inibir a citotoxicidade de
CMNs através da regulaão da via Fas Fas-L
34
xiv
Quadro 1. Receptores das células NK 16
Quadro 2. Painel de marcação das células citotóxicas e citocinas INFγ e TNFα 26
Quadro 3. Painel de marcação das células citotóxicas moléculas citototóxicas Granzima
A e Perforina
26
Quadro 4. Painel de marcação das células citotóxicas e molécula citotóxica FasL 27
xv
SUMÁRIO
1. Introdução 1
1.1. Células estromais da medula óssea 1
1.2. Transplante de células-tronco hematopoiéticas 4
1.3. Doença enxerto contra o hospedeiro versus Enxerto contra leucemia 8
1.4. Citotoxicidade mediada por células 11
1.4.1. Citotoxicidade mediada por células NK 13
1.4.2. Citotoxicidade mediada por Linfócitos T 19
2. Objetivos 22
3. Materiais e métodos 23
3.1. Cultura primária de CTMs obtidas de aspirado de medula óssea 23
3.2. Cultura das linhagens tumorais K562 e HT29 23
3.3. Obtenção de células mononucleares humanas a partir de sangue periférico 24
3.4. Ensaio de citotoxicidade 24
3.5 Análise de citocinas, FasL, perforina e Granzima 25
3.6. Estatística 29
4. Resultados 30
4.1. As CTMs inibem a atividade citotóxica de CMNs contra células
leucêmicas
30
4.2. O potencial inibidor da citotoxicidade é inerente às CTMs 31
4.3. A inibição da citotoxicidade pelas CTMs não envolve a modulação de
grânulos citotóxicos
31
4.4. As CTMs não inibem a secreção de citocinas pelas células citotóxicas 33
4.5. As CTMs podem inibir a citotoxicidade de CMNs através da regulação da
via Fas Fas-L
34
5. Discussão 35
6. Conclusão 38
7. Bibliografia 39
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Células estromais da medula óssea
As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram descritas pela primeira vez em 1966, por
Friendstein et al., como células aderentes com capacidade de gerar unidades formadoras de
colônias (Friendstein et al., 1966). Já o nicho hematopoiético foi primeiramente descrito por
Owen em 1985, o qual propôs três sistemas celulares básicos na medula óssea: hematopoiético,
endotelial e estromal (Figura 1). Segundo Owen, o sistema estromal é composto por células
tronco residentes na medula, capazes de se diferenciar em diversos tecidos de linhagens
conectivas, (inclusive em osteócitos), bem como por células estromais (Friedstein et al., 1980;
Owen et al.,1988).
Figura1: Nicho hematopoiético. Componentes da zona trabecular: (1) Trabécula óssea, presente por toda a zona trabecular, (2) endósteo, interface entre o osso e a medula óssea, (3) sinusóides, vênulas especializadas que permitem a passagem de células. A- Progenitores hematopoiéticos maduros residem em meio a medula óssea.. B: Visão em maior aumento de A. Sinusóides estão representados em vermelho, tecido ósseo em cinza e áreas hematopoiéticas em rosa. Sinusóides estão associados com os megacariócitos em roxo, células reticulares produtoras da quimiocina CXCL-12 em verde e progenitores mesenquimais CTMs, em branco. A superfície óssea é coberta por osteoclastos e osteoblastos, responsáveis pela reabsorção e diferenciação óssea respectivamente. Progenitores hematopoiéticos PH, em azul estão adjacentes aos vasos sinusoidais (setas). Osteoclastos e osteoblastos produzem fatores que regulam a manutenção e localização dos progenitores hematopoiéticos. Propõe-se que células reticulares perivasculares e mesenquimais também produzem fatores que regulam a sua manutenção. Adaptado de Sugiyama et al., 2006
2
Estudos posteriores mostraram que CTMs são células capazes de se diferenciar em tipos
celulares presentes em tecidos de origem mesenquimal, tais como: adipócitos, osteócitos,
condrócitos e mioblastos (Owen e Friedenstein, 1988; Wakitani et al., 1995, Pittenger et al.,
1999). Devido ao fato de elas não possuírem marcadores exclusivos, a Sociedade Internacional de
Terapia Celular propôs três critérios mínimos para definir as CTMs humanas. Estes critérios são:
I - aderência ao plástico; II – capacidade de diferenciação in vitro em osteoblastos, condroblastos
e adipócitos (Figura 2) e III - expressão de CD105, CD73 e CD90, paralelamente à ausência de
expressão de CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR (Dominici et al.,
2006).
B C DA B C DA
Figura 2: Células-tronco mesenquimais. De acordo com a Sociedade de Terapia Celular as células-tronco mesenquimais (A) devem ser capazes de se diferenciar em (B) adipócitos, (C) condroblastos, (D) osteoblastos. Adaptado de Pittenger et al., 1999
A fonte de CTMs utilizada majoritariamente é a medula óssea, porém estas células
também podem ser isoladas a partir de outros tecidos, como tecido adiposo, líquido amniótico,
tecidos fetais, sangue periférico, sangue de cordão umbilical, além do próprio cordão (Barry
2002; Tolar et al., 2011).
Uma vez que as CTMs estão presentes no nicho hematopoiético, e considerando suas
características citadas acima, podemos supor que estas células tenham um papel na manutenção
desse nicho. De fato, estudos mostram a interação de CTMs com células hematopoiéticas,
auxiliando a formação de plaquetas por megacariócitos (Cheng et al., 2000), a diferenciação de
linfócitos B (Kierney e Dorshkind, 1987) e a linfopoiese de células T (Barda-Saad et al., 1996).
Acredita-se que parte dessa interação ocorra através da secreção de moléculas que dão suporte à
hematopoiese, como fibronectina, osteopontina, trombospondina e a quimiocina CXCL12
3
(também conhecida como SDF-1) (Pedemonte et al., 2007), além de citocinas promotoras da
hematopoese como IL-6, -7, -11, -14, -15, M-CSF e LIF (Deans et al., 2000).
As CTMs têm sido estudadas para diversos propósitos, desde o conhecimento da biologia
dos microambientes teciduais, ate aplicações médicas para fins terapêuticos. Estudos mostraram
que as CTMs possuem tropismo para sítios de injúria ou inflamatórios, auxiliando no reparo de
tecidos lesionados, o que já foi observado em modelos como fígado, pulmão, pâncreas e pele.
(Shinagawa et al., 2010; Tolar et al., 2011). Prockop et al. mostraram que, em resposta à injúria
tecidual, as CTMs secretam uma série de fatores, habilitando o reparo tecidual e limitando a
resposta ao estresse e à apoptose, através do recrutamento de células do sistema imune (Prockop
et al., 2009). Corroborando esses estudos, outros autores mostraram que CTMs também migram
em direção a tumores, os quais podem estar relacionados ao estabelecimento de sítios de injúria
ou inflamatórios. Deste modo, ao migrar para o sítio tumoral estas células se diferenciam e
adquirem perfil pró-tumoral, sendo agora chamadas de fibrobastos associados ao câncer (CAFs)
(Kloop et al., 2011). Os CAFs têm sido alvo de estudos frequentes para a sua utilização como
terapia antitumoral (Gonda et al., 2010).
Dois estudos pioneiros mostraram a capacidade das CTMs de modular o sistema imune.
Utilizando um modelo de enxerto e pele em babuínos e cultura mista de linfócitos (CML),
Bartolomew et al. mostraram que CTMs autólogas ou alogeneicas foram capazes de inibir a
proliferação de linfócitos e promoveram a sobrevivência prolongada do enxerto de pele. Di
Nicola, utilizando um modelo de CML, também mostrou a capacidade das CTMs de inibir a
proliferação de linfócitos. Além disso, utilizando um modelo de transwell, mostrou o
envolvimento de dois fatores solúveis neste fenômeno (Bartholomew et al., 2002; Di Nicola et
al., 2002).
Tal potencial imunossupressor indicou a possibilidade de sua utilização terapêutica em
diversas situações patológicas nas quais existe o envolvimento do sistema imune. Embora o
mecanismo pelo qual as CTMs diminuem a resposta imunológica ainda seja controverso, seu
potencial imunomodulatório já tem sido explorado em diferentes ensaios clínicos. Dentre os
diversos estudos em andamento, aqueles voltados para o tratamento de doenças autoimunes
(Zappia et al., 2005) e da Doença enxerto contra o hospedeiro (DECH) se destacam (Le Blanc et
al., 2004).
No contexto do transplante de células tronco hematopoiética (TCTH), essas células têm
sido apontadas como promissoras, por atuarem em três frentes: no tratamento da DECH, por
4
suprimirem o sistema imune (Le Blanc et al., 2004); na diminuição do período de aplasia pós
TCTH, por auxiliarem a hematopoiese (Muller et al., 2008); e na regeneração tecidos lesionados
(Horwitz et al., 2005).
Vale ressaltar que, com relação ao seu efeito imunossupressor, diversos trabalhos têm
demonstrado uma inibição global, não seletiva, sobre as células do sistema imune. Desta forma, é
possível que este efeito inespecífico seja capaz de inibir não só linfócitos do doador que reagem
contra células saudáveis do hospedeiro, como também linfócitos do doador que atuam eliminando
eventuais células leucêmicas que sobreviveram ao regime de condicionamento pré-TCTH, efeito
conhecido na clínica como enxerto contra leucemia (ECL). Neste sentido Ning et al utilizando
um estudo clínico randomizado utilizando 35 pacientes relataram que a infusão de CTMs para
contenção da DECH resultou no aumento da recaída da doença de base pós TCTH (Ning et al.,
2008), no entanto, em um estudo randômico utilizando 55 pacientes Liu et al. não observararam
tal efeito (Liu et al., 2011). Esta discrepância também é observada em modelos in vitro,
utilizando um modelo de citotoxicidade de células NK estímuladas contra linhagens celulares
leucêmicas ou provenientes de melanoma (Sotiropoulou et al., 2006; Spaggiari et al., 2008).
Diante de tais efeitos controversos, o papel das CTMs na citotoxicidade mediada por linfócitos
ainda precisa ser melhor elucidado.
1.2. Transplante de células tronco hematopoiéticas
Durante a última metade do século XX, o TCTH tornou-se uma modalidade terapêutica
bem estabelecida, utilizada para tratar milhares de indivíduos anualmente. Esta consiste na
substituição de um sistema hematopoiético anormal por outro competente. Inicialmente, o TCTH
foi desenvolvido para atender a três propósitos: tratar anemias herdadas e imunodeficiências, bem
como permitir a administração de altas doses de quimioterapia e radioterapia a pacientes com
câncer, visando depletar a maioria das células malignas existentes (Jenq et al., 2010). A
administração de altas doses de quimioterapia e radioterapia com este fim chama-se regime de
condicionamento (ou tratamento) mieloablativo. Após esse período, que pode durar até oito dias,
o paciente se submeterá à infusão de células tronco hematopoiéticas. A partir da infusão, essas
células migrarão para o microambiente medular, onde se estabelecerão e darão início à
reconstituição hematopoiética. No período entre o dia da infusão (D1), vinte e um dias após o
transplante (D21), o paciente estará em aplasia medular, ou seja, com produção insuficiente de
células e portanto, sem resposta imune. Clinicamente, considera-se pega medular quando, por três
5
dias consecutivos, o número de neutrófilos do paciente é constante, o que ocorre por volta do dia
D21 (Figura 3) (Voltarelli et al., 2009).
Figura 3: Visão geral do TCTH. Período de D8 ao D0: regime de condicionamento. Durante esse período, o paciente é tratado com altas doses de quimioterapia e/ou radioterapia. Período de D1 ao D21: período de aplasia medular pós TCTH. Período D21 em diante: período de recuperação da medula e reconstituição da hematopoiese. Adaptado de Bárbara Du Rocher, 2010.
Para a realização do TCTH, podem ser utilizadas três fontes de células-tronco
hematopoiéticas (CTH): a medula óssea, o sangue periférico mobilizado e o sangue de cordão
umbilical. Quando a fonte de CTH é a medula óssea, esta é extraída de um doador saudável,
através de punções feitas em suas cristas ilíacas, a fim de se obter aproximadamente 3x108
células nucleadas por quilo do paciente (Kumar et al., 2007).
Já no caso do sangue periférico mobilizado, são coletadas CTHs circulantes. Sendo assim,
faz-se necessário o aumento do número destas células na periferia, uma vez que sua concentração
sistêmica é de aproximadamente 0,02%. (Kumar et al., 2007). Em 1988, foi descoberto que a
molécula de membrana CD34 era um marcador de células precursoras hematopoiéticas. Logo
após, em 1990, observou-se que o fator de crescimento G-CSF aumentava a mobilização de
células CD34+ da medula óssea para o sangue periférico (Berenson, et al., 1988; Molineux, et al.,
1990). Com isso, foi possível aumentar a quantidade destas células na circulação para posterior
coleta e infusão em pacientes. Além disso, recentemente, o receptor CXCR4 e seu ligante
6
CXCL12 foram apontados como mediadores da migração de CTHs para o nicho medular. A
partir desse novo conhecimento, foi desenvolvido o medicamento plerixafor, antagonista de
CXCR4, que, quando administrado em conjunto com o G-CSF, aumenta a mobilização de células
CD34+ para o sangue periférico (Burger et al.,2009; DiPersio et al., 2009).
Outra fonte de CTHs é o sangue de cordão umbilical. Dentre as vantagens da utilização
desta fonte, está o fato de a mesma estar relacionada com o desenvolvimento de DECH mais
branda. O motivo ainda não está claro, porém estudos mostram que o sangue de cordão umbilical
apresenta células T predominantemente imaturas, portanto menos reativas, além de ser rico em
células T regulatórias, que também contribuem para supressão da resposta imune (Knudtzon et
al., 1974; Han et al., 1995, Godfrey et al., 2005). Para utilização clínica, recomendam-se doses
maiores que 2-5x107 células nucleadas ou 2-5x105 células CD34+ por quilo do paciente.
Finalmente, o TCTH pode ser classificado em: autólogo, quando o paciente é o próprio
doador; singeneico, entre irmãos gêmeos; ou alogeneico, entre indivíduos geneticamente
diferentes aparentados ou não. No que diz respeito aos pacientes submetidos ao TCTH
alogeneico, deve-se determinar o grau de compatibilidade entre doador e paciente, a fim de evitar
a rejeição do enxerto pelo paciente. Ou ainda evitar a doença enxerto contra o hospedeiro. Isso se
dá através da avaliação do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) denominado
antígeno leucocitário humano (HLA) em humanos. Os genes que compõem este complexo estão
localizados no braço curto do cromossomo 6 (Figura 4) e são altamente polimórficos, o que
determina uma grande variação entre os indivíduos. Desta forma, o processo de reconhecimento
dos antígenos do paciente pelo enxerto e, vice-versa, é um fenômeno imunológico disparado pela
diferença entre as moléculas de HLA. (Menhra et al.,2003)
7
Figura 4: Complexo gênico para o HLA localizado no braço curto do cromossomo 6. Aumento na região do HLA mostrando a localização específica de cada loci. Loci classe I (A, B e C) e classe II (DR, DP e DQ). Adaptado de: http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/childHCT/HealthProfessional/page3
Existem dois tipos principais de produtos codificados pelos genes do MHC, chamados de
moléculas de classe I e moléculas de classe II. Estas apresentam tipos diferentes de antígenos,
que podem ser citosólicos (sintetizados endogenamente) ou exógenos (endocitados em vesículas).
As moléculas de MHC de classe I estão presentes em todas as células nucleadas e apresentam
peptídeos intracelulares para os linfócitos T citotóxicos. Estas moléculas são especialmente úteis
na vigilância imunológica, pois quaisquer alterações intracitoplasmáticas que gerem proteínas
alteradas, como mutações e/ou infecções virais, podem ser detectadas, já que estas proteínas
poderão ser degradadas e apresentadas via MHC de classe I. Já as moléculas de classe II estão
presentes nas células apresentadoras de antígenos (APCs), como células dendríticas, macrófagos,
monócitos e linfócitos B. Estas são células fagocíticas que, uma vez tendo digerido o peptídeo, o
apresentam aos linfócitos T auxiliares via MHC de classe II (Figura 5).
As moléculas de classe I são codificadas por diversos loci, entre eles: HLA-A, HLA-B,
HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. As moléculas de classe II são codificadas por 4 loci
diferentes, HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DM. Existe ainda uma terceira região, classe
III, que codifica componentes do sistema complemento, citocinas (fator de necrose tumoral,
linfotoxina e linfotoxina – β) e algumas proteínas do choque térmico.
8
Sítio de ligação
do peptídeo
MHC I MHC II
Sítio de ligação
do peptídeo
Membrana celular
Figura 5: O MHC de classe I encontra-se expresso em todas as células nucleadas e é fundamental para a imunidade antiviral. MHC de classe II, pelo contrário encontra-se expresso em um pequeno número de células especializadas designadas como células apresentadoras de antígenos (APCs). As células apresentadoras de antígenos incluem macrófagos, linfócitos B, linfócitos T citotóxicos entre outros. Adaptado de: http://doctor-jones.co.uk/Immunology/Tutorial/The%20Major%20Histocompatibility%20Complex.htm
1.3. Doença enxerto contra o hospedeiro versus Efeito Enxerto contra leucemia
A reação enxerto contra hospedeiro é disparada por células T maduras, contidas no
enxerto, contra células saudáveis do paciente (Shlomchik et al., 2007). Igualmente, são essas
mesmas células que irão reagir contra células residuais do tumor.
A DECH pode apresentar-se clinicamente de duas formas: aguda e crônica. Em sua forma
aguda, é caracterizada pelo envolvimento de pele, fígado e trato gastrointestinal como principais
órgãos alvos e, em menor grau, timo, medula óssea e outros sítios. Usualmente, aparece dentro de
algumas semanas pós TCTH (Shlomchik et al., 2007). A patofisiologia da doença envolve uma
complexa cascata de interações entre células do doador e hospedeiro (Jenq et al., 2010).
Bilingham et al. descreveram a doença e dividiram-na em três fases (Figura 6):
• Fase 1: O regime de condicionamento ao qual o paciente é exposto, leva a inflamação
e injúria tecidual. No caso da injúria ao trato gastrointestinal, a exposição a padrões
moleculares presentes na superfície de patógenos, como o LPS em bactérias GRAM
negativas, induz as células do sistema imune inato a reagirem (Lee et al., 2009) e a
produzirem diversas citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, como IL-1β e TNF-α.
Estas citocinas irão aumentar o reconhecimento de antígenos do paciente pelas células
T do doador, através do aumento de moléculas de adesão e moléculas co-
9
estimulatórias, que ativarão APCs residuais, bem células APCs do doador (Socié et
al., 2009; Jenq et al., 2010).
• Fase 2: Nesta fase, os linfócitos T do doador irão se ativar e proliferar em resposta às
APCs do hospedeiro. Esta apresentação pode ocorrer de forma direta, onde a
similaridade entre as moléculas de MHC do doador e do hospedeiro possibilita a
interação direta das APCs do hospedeiro com linfócitos T do doador. Outra forma de
apresentação de antígenos é indireta, ou seja, células e/ou restos celulares do paciente
são fagocitados tanto pelas APCs do paciente quanto pelas APCs do doador, e alguns
fragmentos de peptídeos resultantes desta degradação são apresentados via MHC
classe II aos linfócitos T auxiliares, ou via apresentação cruzada aos linfócitos T
citotóxicos (Lechler et al., 1991). Como consequência desse processo, mais citocinas
são produzidas, como IL-2 e INF-γ, levando à expansão e ativação de novos clones,
bem como à atividade efetora destes linfócitos.
• Fase 3: É a fase efetora da doença. Nesta fase, diversos mecanismos efetores são
acionados, dentre eles: a citotoxicidade mediada pelos linfócitos T citotóxicos, através
da liberação de grânulos de perforina e granzima; e a ativação de apoptose via
receptores de morte da família de receptores de TNF, que inclui os receptor Fas.
Manifestações clínicas da doença incluem rash e erupções cutâneas, perda de peso,
hemorragias gastrointestinais, inflamações na mucosa, causando dor e diarréia,
alterações metabólicas do fígado e outros problemas (Jaksch e Mattsson, 2005).
10
Figura 6: Patofisiologia da DECH aguda. No esquema, estão detalhadas as três fases sequenciais da DECH (Hill e Ferrara-Sociedade Americana de Hematologia). Adaptado de Hill et al., 2000.
Durante muito tempo, acreditou-se que o grande vilão da DECH seria o linfócito T, e que
sua retirada poderia ser útil para diminuir a incidência da doença. De fato, a incidência de DECH
diminuiu quando pacientes foram transplantados com medulas depletadas de linfócitos T, porém
a recaída na doença de base e a rejeição ao enxerto aumentaram. Dessa forma, ficou claro que,
embora os linfócitos fossem os grandes responsáveis pela DECH, estes também constituíam um
importante componente que não poderia ser eliminado (Wagner et al., 2005).
Os linfócitos T presentes no enxerto eliminam linfócitos do paciente, evitando a rejeição do
enxerto, bem como a eliminam de eventuais clones tumorais, evitando a recaída da doença. Este é
conhecido como efeito enxerto contra tumor (ECT) ou efeito enxerto contra leucemia (ECL).
Uma vez que esses linfócitos possuem um papel importante para a biologia do transplante, o
grande desafio é conseguir conter a DECH, mas sem permitir a recaída da doença (Figura 6).
Ainda assim, o tratamento de rotina para DECH continua sendo a utilização de
imunossupressores de amplo espectro, como metotrexato e ciclosporina. Imunoterapias atuais
ainda em fase de estudo envolvem estratégias menos tóxicas e mais direcionadas como depleção
1-Regime de condicionamento
Dano tecidual
Tecido paciente
IL-6 IL-1
TNFα
2-Ativação células T doador
IL-2
INFγ
IL-2
Perforina
FasL TNFα
3- Resposta celular
Morte célula alvo
IL-1
TNFα
Intestino
LPS
APC paciente
Célula TDoador
Th1
NK
LTC
Mφ
11
seletiva de células T virgens, inserção de genes suicidas em linfócitos, uso de células NK
alorreativas, transfusão de células T (Hill et al., 2000).
1.4. Citotoxicidade mediada por células
A atividade citotóxica constitui uma parte importante da resposta imune mediada por
células, uma vez que esta é uma das funções do sistema imune. Este processo consiste na indução
da morte celular das células alvo através das células citotóxicas efetoras. As principais células
efetoras são NK e os linfócitos T citotóxicos (LTC) (Galán et al., 2009).
As células T virgens se diferenciam em células T citotóxicas CD8+ através da ativação por
células dendríticas maduras. Após ativado o linfócito é capaz de produzir IL-2, citocina que irá
dirigir sua diferenciação e proliferação (Janeway, 2010). As células T CD8 reconhecem a
molécula de MHC classe I presentes nas células dendríticas. Para ser corretamente ativado o
linfócito precisará de três sinais: o primeiro consiste na ligação do TCR a molécula de MHC de
classe I, o segundo ,está na ação das moléculas co-estimulatórias e o terceiro dependerá do
microambiente de ativação desta célula.
No que diz respeito as células NK, estas não possuem a especificidade de um lifócito. Sua ação
irá depender do balanço entre a gama de seus receptores ativadores e inibidores. Desta
sinalização irá depender a sua ativação, proliferação e função efetora (Lanier et al., 2005).
A molécula de MHC de classe I é expressa por todas as células nucleadas e sua função é
processar e apresentar peptídeos intracelulares. Os peptídeos são processados pelo proteassoma e
transportados através do transportador associado com processamento de antígeno proteína (TAP)
contida no retículo endoplasmático. O MHC recém-formado é estabilizado através da calnexina
até a ligação da β2 microglobulina, quando então se liga ao complexo TAP–peptídeo e é
posteriormente endereçado ao complexo de Golgi (Figura 7) (Galán et al., 2009).
O reconhecimento de uma célula alterada pode ocorrer através da apresentação cruzada,
neste caso os peptídeos processados são oriundos de células endocitadas. Já a atividade citotóxica
das células NK é disparada pela ligação de receptores ativadores à molécula de MHC de classe I
alterada ou inibida pelo reconhecimento da molécula de MHC de classe I própria. (de Saint
Basile et al., 2010)
A apoptose é um processo fundamental para o equilíbrio de um organismo, no qual
células senescentes ou infectadas são induzidas à morte. Este mecanismo pode ser disparado de
forma intrínseca ou extrínseca.
12
A via extrínseca é iniciada pela ativação de receptores de morte celular, receptores da
família TNFR. Dentre estes, os mais compreendidos são Fas e TNFRI. Estes receptores possuem
um domínio de morte, cujo papel é importante na transdução do sinal de apoptose. A interação
receptor-ligante leva a formação do complexo de indução de morte DISC. Este complexo é
composto por receptores oligomerizados FADD, pró-caspase 8 (FLICE), pró-caspase 10 e c-
FLIP. Uma vez formado, este complexo ativa as pró-caspases 8 e 10, que levam a ativação das
pró-caspases 3, 6 e 7 (Figura 8). Estas caspases efetoras ativam enzimas que promovem a morte
celular, bem como uma série de proteínas críticas à sua integridade. A regulação desse processo
pode ser através das proteínas XIAPs (Lavrik et al., 2010).
Figura 7: Processamento do MHC de classe I. Geralmente os peptídeos apresentados pelo MHC de classe I são derivados de proteínas intracelulares. Ela é degradada pelo proteassoma e transportada através do TAP no retículo endoplasmático. Por outro lado, o MHC recém-sintetizado é estabilizado pela calnexina até que β2 microglobulina se ligue ao complexo. O MHC de classe I parcialmente formado se liga ao complexo TAP. Após a ligação do peptídeo, o MHC de classe I é transportado através do aparelho de Golgi para a superfície da célula. Adaptado de Andersen et al., 2006.
13
Figura 8: Esquema das vias intrínsecas e extrínsecas da apoptose. Na via extrínseca da apoptose o estímulo de um “ligante de morte” ao se receptor cognato leva a formação do DISC (Death inducing signaling complex), que ativa as pró-caspases 8 e 10. As agora caspases 8 e 10 clivam e ativam outras caspases efetoras. A ativação da pró-caspase 8 pode ser bloqueada pela proteína c-FLIP e a ativação das caspases efetoras (3,7 e 9), no citosol, pode ser bloqueada pelas proteínas XIAPs. A ativação das XIAPs pode ser bloqueada pela proteína SMAC/ DIABLO. A via intrínseca começa com a liberação do citocromo C, seguida da formação do apoptossomo, ativação e clivagem de substratos das caspases que levam a destruição da célula. Adaptado de Lavrik, 2010. 1.4.1. Citotoxicidade mediada por células NK
As células NK são componentes linfóides da imunidade inata reconhecidas por sua
capacidade de destruir células infectadas por patógenos intracelulares ou células transformadas.
Estas células possuem muitas características semelhantes aos linfócitos, bem como o mesmo
progenitor e em particular o mesmo mecanismo de destruição dos linfócitos T citotóxicos, porém
as células NK não podem produzir IL-2 (Moretta et al., 2002; Lanier et al., 2005).
O processo de reconhecimento de uma célula alterada ou infectada pela célula NK, é
muito complexo e envolve a interação de sinais provenientes de seus receptores. Isso implica na
ligação da célula NK com a célula alvo, interação entre os sinais inibidores e ativadores com os
Ligantes de morte Ativadores da via extrinseca
Ligante de morte Receptor de morte
Ativadores da via extrinseca: Irradiação, dano DNA, etc
Apoptossomo
Apoptose
14
ligantes disponíveis na superfície da célula alvo, que irá determinar se a célula NK se desprende
da célula alvo ou se continua aderida e responde (Lanier et al., 2005).
As células NK respondem à expressão alterada ou à ausência da expressão de moléculas
MHC de classe I clássicas ou não clássicas (“missing self”). Também respondem a sinais de
estresse celular, através do reconhecimento das moléculas de MHCI não clássicas MIC A e B
(“Inducing self”) (Poggi et al., 2007; Chavez et al., 2009).
Ao contrário dos linfócitos T e B, as células NK não possuem especificidade, mas
expressam uma série de receptores ativadores e inibidores, através do balanço entre as vias de
sinalização desencadeadas por esses receptores, as células NK serão ativadas ou inibidas (Pegram
et al., 2010) (Figura 9).
Estas células utilizam dois mecanismos principais para exercer sua função, ambos
dependentes de contato. O primeiro mecanismo consiste na a atividade de grânulos citotóxicos,
como a perforina, responsável principalmente pela formação de poros na membrana celular, e a
granzima, uma serina protease com especificidade para inúmeros substratos. Juntos, granzima e
perforina induzem a apoptose da célula alvo. Essa via ativa mecanismos de morte que operam
através da ativação de caspases, porém também podem induzir a morte celular na ausência das
mesmas (Figura 9). O segundo mecanismo envolve o receptor de morte Fas, expresso pelas
células alvo e seu ligante cognato FasL, expresso pelas células NK. A conexão receptor-ligante
resulta na morte celular através da ativação de caspases (Figuras 10 e 11).
Para contribuir com a primeira linha de defesa, as células NK estão sempre prontas para
atacar células infectadas ou malignas. Essa característica requer um controle fino, pois essas
células podem ser prejudiciais às células normais, quando ativadas inapropriadamente (Pegram et
al., 2010).
15
Figura 9: Interação de células NK com células alvo. Células normais são protegidas da morte pelas células NK quando os sinais inibitórios e estimulatórios estão balanceados no momento do reconhecimento da molécula de MHCI. No entanto, se a célula alvo perde a expressão dessa molécula, resultado de uma infecção ou transformação, os sinais derivados da célula alvo não sofrem inibição, pois, sem a expressão do MHC de classe I, não existe o sinal inibitório, resultando na lise da célula alvo (“missing – self”). A infecção e a transformação podem induzir um estímulo mais forte do que a inibição oferecida pelos receptores inibitórios, levando a morte da célula alvo (“inducing – self”). É possível que em muitas situações ambos os sinais “inducing” e “missing self” atuem simultaneamente, aumentando a capacidade dessas células de discriminar entre células normais ou células alteradas ou infectadas. Adaptado de Raulet, 2006.
Os receptores ativadores contêm o motivo ITAM em sua cauda citoplasmática. Quando
fosforilados, esses receptores recrutam proteínas sinalizadoras que contêm um domínio Src
associados. Os domínios SH2 são encontrados em diversas proteínas sinalizadoras intracelulares,
onde estão associados a diferentes tipos de domínios enzimáticos ou outros domínios. No caso
dos ITAMs, o domínio quinase Src, Syk ou ZAP 70, é responsável pela cascata de sinalização
que levará a degranulação e transcrição de genes de citocinas e quimiocinas.
Alguns receptores de ativação utilizam mecanismos alternativos, utilizando as proteínas
DAP-10 ou 12, cuja via de sinalização difere de uma para outra. DAP-10 se liga a outras
proteínas, ativando a cascata de sinalização pela via de PI3K, e a DAP-12 sinaliza através do
ITAM. A sinalização através de DAP-10 resulta na citotoxicidade, porém a sinalização através de
DAP-12 resulta em produção de citocinas e citotoxicidade (Pegram et al., 2010).
Céllula
NK
Céllula Normal
Céllula Alvo
Céllula Alvo
Reconhecimento “missing – self”
Reconhecimento “induced – self”
Proteção
Receptor
inibitório
MHC I
Receptor estimulatório
Iigante estímulório
Transformação
infecção Transformação
infecção MORTE MORTE
SEM MORTE
16
Por outro lado, os receptores inibidores contêm o motivo ITIM, em sua cauda
citoplasmática. Quando fosforilados, esses receptores recrutam proteínas sinalizadoras do tipo
fosfatase (Quadro1).
Quadro 1. Receptores ativadores e inibidores de células NK (Pegram et al., 2010)
Em células normais, o MHC de classe I é reconhecido por receptores inibidores, que
inibem os sinais dos receptores ativadores. Quando o MHC de classe I está alterado ou não pode
ser reconhecido, este estimula a ativação das células NK através de seus receptores ativadores.
A ativação das células NK leva à degranulação de perforina e granzima. A perforina tem a
função de formar poros na membrana celular, possibilitando a entrada das granzimas. Sua porção
C terminal é ativada através de íons cálcio; então, a perforina se ancora na membrana e, uma vez
ancorada esta começa a polimerizar, formando poros, e possibilitando a entrada de granzimas
(Figura 9).
As granzimas são divididas em: granzima A, B, C, K e M. A Granzima A foi descoberta
no ano de 1986, pelo grupo do pesquisador Jürg Tschopp (Jenne et al., 1988). Esta triptase possui
50 kD e tem atividade serina protease. Ainda não está claro como a Granzima A é transferida
para a célula alvo, porém a hipótese é de que esta se ligue a serglicina, um proteoglicano, para se
proteger da inativação por proteínas como a trombina III e a α2 microglobulina na célula alvo, o
que possibilita a sua entrada.
Além de induzir a apoptose, esta proteína também possui efeito pró-inflamatório e atua
interferindo na coagulação (Zohu et al., 2010)..
O efeito Dnase da Granzima A é devido a NM23H1, que tem como inibidor o complexo
SET. Quando NM23H1 é ativada pela Granzima A, medeia a clivagem de SET através da
ativação retrógrada da Dnase, por sua vez ativada por caspase através da clivagem de seu inibidor
ICAD. Após o carregamento com Granzima A, SET e NM23H1 são transferidas para o núcleo.
SET é degradada e NM23H1 é direcionado ao DNA. Estudos mostraram que o silenciamento de
Receptor Função Reconhecimento Domínio
KIR Ativador/inibidor HLA-clássico (A, B e C). DAP-12/ITAM/ITIM
CD-94/NKG2 Ativador/Inibidor HLA-não clássico (C e E) DAP-12/ITIM
NKG2D Ativador MIC-A e B DAP-10/ITAM
NCKs Ativador Vírus
17
NM23H1 leva a resistência a apoptose, enquanto o silenciamento de SET e APE1 atribui maior
sensibilidade à indução de apoptose da célula alvo (Zhou et al., 2010).
A Granzima B ativa diretamente a caspase 3, promovendo a fragmentação do DNA. Além
disso, ela também pode ativar BID, levando à liberação do citocromo c e, ativando a via
intrínseca da apoptose (Zhou et al., 2010).
Figura 10: Mecanismo de citotoxicidade mediada pela atividade de grânulos citotóxicos. Uma vez no interior da célula alvo, granzima-A ativa um complexo associado ao retículo endoplasmático, formado pela fosfoproteína 32 (pp32), proteína não metastática 23 homóloga 1 (NM23_H1), oncoproteína SET, grupo de alta mobilidade 2 (HMG-2) e a enzima endonuclease apurinica 1 (Ape1). O aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a queda no potencial de membrana levam à translocação do complexo SET/NM23_H1 para o núcleo celular. Assim, a granzima-A cliva SET, que ativa NM23_H1, uma endonuclease que fragmenta o DNA. Em conjunto, Granzima-B cliva BID, ou ativa caspase 3 diretamente, degradando o DNA. A proteína BID truncada causa permeabilidade da membrana externa da mitocôndria e a liberação do citocromo- C diminuindo a função mitocondrial. O citocromo C, induz a ativação da caspase 9, que aumenta o processo de apoptose pela ativação da caspase 3. Adaptado de Galán, 2009.
Célula Alvo
NucleoClivagem
Citocromo
Função mitocondrial
SET
RE
18
Figura 11: Mecanismo de citotoxicidade através da interação Fas-FasL. Algumas células NK expressam Fas e FasL. A ligação ao seu respectivo receptor dispara a cascata de ativação levando a célula alvo a apoptose. Adaptado de Smyth, 2002.
1.4.2. Citotoxicidade mediada por Linfócitos T
Os linfócitos T e B são componentes da resposta imune adaptativa. Diferentemente da
imunidade inata, a imunidade adaptativa apresenta grande especificidade pelo antígeno. Isso é
possível porque tanto as células T, quanto as células B, possuem receptores antígeno específicos,
o TCR e o BCR, respectivamente. Através do rearranjo gênico, esses receptores são capazes de
reconhecer uma enorme diversidade de antígenos.
Nas células T, o TCR compreende duas cadeias polipeptídicas denominadas cadeias de
receptor de células T α (TCR α) e cadeias β (TCR β). Esses heterodímeros tem sua estrutura
semelhante ao fragmento Fab da molécula de imunoglobulina e são responsáveis pelo
reconhecimento de antígenos pela maioria das células T. Existe também uma minoria de células
T que expressa em sua superfície as cadeias polipeptídicas γ (TCR γ) e δ (TCR δ), cujas
propriedades de reconhecimento de antígenos e função diferem das células expressando as
cadeias α e β (Janeway, 2010).
A maioria das células T reconhece os complexos MHC de classe I ou II ligados a
peptídeos intracelulares ou extracelulares, respectivamente. As células TCD4 reconhecem o
MHC de classe II, e as células TCD8 reconhecem o MHC de classe I. As células TCD4 estão
ligadas à resposta celular auxiliar, e podem polarizar para vários subtipos, o que irá depender do
seu estímulo preliminar. Já os linfócitos TCD8, têm a função de monitorar todas as células do
organismo,e estão preparados para destruir qualquer ameaça à integridade do hospedeiro. Desta
19
forma, protegem o organismo de células infectadas por vírus ou células malignas (Andersen et
al., 2006).
Os linfócitos T citotóxicos expressam a molécula CD8 em sua membrana, que não só é
responsável pelo reconhecimento antigênico, mas também pela iniciação da transdução do sinal
de ativação do linfócito. O peptídeo reconhecido através do TCR pode ter atividade agonista,
antagonista ou agonista parcial. Ligantes agonistas são complexos MCH- peptídeos que induzem
a transdução completa do sinal de ativação pelo TCR. Ao contrário, o efeito do antagonista é de
inibir a transdução do sinal via TCR. Quando o ligante é um agonista parcial, a resposta é
qualitativamente diferente da resposta ao agonista.
A ativação dos LTCs pode ser dividida em duas fases: a primeira fase ativa os linfócitos T
naive e os diferencia em células efetoras; na segunda fase, a célula efetora reconhece antígenos
presentes nas células alvo e desencadeia o processo de morte celular da mesma.
Essa diferenciação de células T efetoras requer ao menos três sinais sequenciais: 1- a
ligação ao TCR, 2- co-estímulo e 3- sinalização mediada pela IL-2. A expressão do receptor de
IL-2 só é possível mediante ao co-estímulo, o qual pode ser a interação entre as moléculas B7-1
(CD80) ou -2 (CD86) ou CTLA-4 com a molécula CD28. A ligação B7-CD28 resulta na ativação
do linfócito T, porém a ligação com CTLA-4 resulta na inibição desse linfócito (Andersen et al.,
2006).
O CD28 é constitutivamente expresso na superfície de células T; ao contrário, o CTLA-4
é regulado positivamente após a sua ativação. É importante ressaltar que o CTLA-4 tem maior
afinidade com a molécula CD28 do que o B7-1 ou -2. Outra molécula da família do CD28, o
ICOS, também pode ser induzida pela ativação de células T, e tem um papel importante na
regulação de células T ativadas (Andersen et al., 2006).
A alta variabilidade do TCR α:β não é suficiente para criar um receptor de superfície
completo, outras moléculas são necessárias para sua expressão na superfície celular. Estas são
proteínas de cadeias CD3γ, CD3δ e CD3, que juntas formam o complexo CD3. A reunião do
complexo CD3 com o heterodímero α:β o estabiliza, permitindo que o complexo seja transferido
para a membrana. A sinalização a partir do complexo se dá devido à presença do complexo CD3
e de um motivo de ativação semelhante ao ITAM. Quando o linfócito T CD8 é ativado, através
da ligação do ligante ao Fas, TNFR ou receptores de INF, a cascata de sinalização dispara a
ativação da apoptose através de ambas as vias de apoptose (Figura 11).
20
Figura 12: Ativação dos linfócitos T. A ligação de peptídeos imunogênicos ao TCR leva a fosforilação (círculos em preto e vermelho) de todos os ITAMS presentes no complexo CD3, recrutamento e/ou ativação de src quinases e finalmente a sua ativação completa. Adaptado de Andersen, 2006.
Embora haja um grande interesse na utilização das CTMs no TCTH, deve-se ter muita
cautela já que as CTMs tem o potencial não só de inibir a proliferação de linfócitos que reagem
contra os antígenos do hospedeiro como também de clones anti-tumorais, aumentando a chance
de recaída do paciente. Além disso, existem indícios de que as CTMs também inibem a atividade
citotóxica dos linfócitos, o que pode aumentar ainda mais os índices de recaída. Logo, avaliar as
moléculas produzidas pelas CTMs que induzem imunossupressão bem como avaliar se as CTMs
interferem na citotoxicidade torna-se fundamental para o uso mais apropriado desta terapia
celular no contexto do TCTH. Além disso, a divisão de laboratórios do CEMO já desenvolve uma
linha de pesquisa com CTMs, possui a infraestrutura necessária à realização deste trabalho e tem
um grande intercâmbio com a unidade clínica, sendo as amostras de MO e de sangue periférico
facilmente adquiridas.
21
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Investigar o potencial imunomodulador das CTMs provenientes de medula óssea sobre
células mononucleares citotóxicas contra células leucêmicas, bem como os mecanismos
envolvidos nesta possível inibição.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar se CTMs obtidas a partir da medula óssea de doadores saudáveis:
- Alteram a atividade citotóxica de células mononucleares de sangue periférico frente a células
leucêmicas da linhagem K562;
- Alteram a secreção/expressão de Fas L, bem como, a produção de IFNy e TNFα pelas células
citotóxicas;
- Alteram a degranulação de perforina e granzima pelas células citotóxicas;
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostra biológica: Serão utilizadas amostras de medula óssea e de sangue periférico de
doadores saudáveis do CEMO e do banco de sangue do Instituto Nacional de Câncer – RJ. Este
projeto foi aprovado pelo comitê de ética do INCA (Registro CEP n°034/06)
3.2. Cultura primária de CTMs obtidas de aspirado de medula óssea
Aspirados de medula óssea foram obtidos de indivíduos que se submeteram à doação de
medula óssea no Centro de Transplante de Medula Óssea do Instituto Nacional de Câncer – Rio
de Janeiro. Células mononucleares foram separadas por gradiente de centrifugação Histopaque®
1077 (Sigma) e plaqueadas na concentração de 2,0 x 105 células/cm2. As células foram cultivadas
a 37°C em atmosfera com 5% de CO2, em meio completo - DMEM baixa glicose (Gibco -
Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (HyClone), 2mM de L-
glutamina (Invitrogen), 50 unidades/ml de penicilina e 50 µg/ml de estreptomicina (Invitrogen).
Após 48 horas, células não aderentes foram retiradas e as células aderidas foram mantidas em
cultura até atingirem confluência de aproximadamente 80%. Atingida a confluência, as CTMs
foram tripsinizadas com tripsina 0,05% (Gibco – Invitrogen) e plaqueadas na concentração de
4x103 células/cm2. As CTMs foram mantidas em cultura trocando-se metade do volume de meio,
duas vezes por semana, até atingirem a passagem 3. Neste momento, as CTMs foram utilizadas
nos experimentos.
3.3. Cultura das linhagens tumorais K562 e HT29
As células da linhagem leucêmica K562 e de adenocarcinoma colorretal HT29, foram
cultivadas nas concentrações de 3x104/ml e 5x104/cm2, respectivamente, a 37°C em atmosfera
com 5% de CO2. As linhagens celulares foram cultivadas em RPMI 1640 (Sigma) suplementado
com 10% de soro fetal bovino inativado, 2mM de L-glutamina, 50 unidades/ml de penicilina e 50
µg/ml de estreptomicina. Após 48h, as células estavam prontas para utilização como células alvo
nos ensaios de citotoxicidade.
23
3.4. Obtenção de células mononucleares humanas a partir de sangue periférico
Foram colhidos 20 ml de sangue periférico de doadores saudáveis e após separação por gradiente
de centrifugação Histopaque® 1077, células mononucleares (células efetoras) foram
ressuspendidas na concentração de 5x106 células/ml em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado
com 10% de soro fetal bovino inativado, 2mM de L-glutamina, 50 unidades/ml de penicilina e 50
µg/ml de estreptomicina
3.5. Ensaio de citotoxicidade
CTMs provenientes de medula óssea ou células da linhagem de carcinoma de colón HT29
foram plaqueadas na concentração de 5x104 por poço em placas de 96 poços, 24 horas antes do
plaqueamento da co-cultura.. Células alvo K562 (106 células/ml) foram marcadas com CFSE
(3uM) e posteriormente ajustadas para a concentração de 2x105 células/ml. Células K562 (2x104)
foram plaqueadas na presença ou ausência de CTMs ou células HT29 em placas de 96 poços
junto com diferentes concentrações de células efetoras (razões alvo e efetor, 1:25, 1:12, 5 e
1:6,25) em um volume final de 200 µl, e incubadas por 24 horas. Após a incubação, as células em
suspenssão foram transferidas para tubos de citometria, marcadas com 3 µl de 7AAD (BD)
segundo instruções do fabricante, e imediatamente analisadas no citômetro de fluxo. As amostras
foram adquiridos no citômetro FACScan® (BD) e as análises foram feitas utilizando-se o
software CellQuest® (BD Biosciences). Em todas as amostras foram adquiridos 5.000 eventos
CFSE+, e o percentual de células viáveis, 7AAD -, foi observado (figura 13).
24
Figura 13: Estratégia de análise da citotoxicidade. (A) região contendo somente eventos CFSE+ foi selecionada. (B) Análise do perfil de células CFSE+no dot plot FSC x SSC. (C) Região contendo somente eventos 7AAD+ foi selecionada a partir do total de células contidas em R1 E R2.
3.6 Análise de citocinas, FasL, perforina e Granzima
CTMs provenientes de medula óssea ou células da linhagem de carcinoma de colón HT29
foram plaqueadas na razão de 5x104 por poço em placas de 96 poços, 24 horas antes do
plaqueamento da co-cultura. Foram plaqueadas 2x104 células alvo K562 na presença ou ausência
de CTMs em placas de 24 poços na razão de 1:25 células alvo : efetor, em um volume final de
1200 µL, e incubadas por 24 horas
Após o período de incubação foram adicionados 3 µl (1 µl /106 células) de brefeldina à
co-cultura, que permaneceu incubada por quatro horas. Em seguida, as células em suspensão
(alvo e efetoras) foram retiradas e distribuídas em tubos para citometria de fluxo na concentração
de 5x105 células totais/ml no volume final de 200 µl. A esta suspensão, foram adicionados 500 µl
de PBS e as células foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 5 minutos. Ao término da
centrifugação, descartou-se o sobrenadante, e ao pellet de células foram adicionados 2,5 µl dos
anticorpos monoclonais anti-CD4 conjugado a isotiocianato de fluoresceina (FITC), anti-CD8
conjugado a ficoeritrina (PE), anti-CD3 conjugado à proteína peridinina-clorofila (PerCP) e anti-
(A) Células Totais
(B) R1 Células CFSE +(C) R1 e R2 (Células CFSE + na região R2 do dot plot de FSC X SSC)
25
CD56 conjugado a FITC e PE. Após 20 minutos à temperatura ambiente, as células foram fixadas
com formaldeído 1%.
Para análise de produção de citotcinas, as células foram permeabilizadas com tween 0,5%
para posterior marcação com os anticorpos anti-TNF-α (PE) e anti-INFγ (FITC), ou com seus
respectivos isotipos (vide quadro 2). Após incubação por 20 minutos, as células foram lavadas e
ressuspendidas em formaldeído 1%.
Quadro 2. Painel de marcação das células citotóxicas e citocinas INFγ e TNFα:
Para análise da produção de granulos de células TCD8+ e NK, células foram
permeabilizadas com tween 0,5% para posterior marcação com os anticorpos anti-Granzima-A
PE e anti-Perforina FITC, ou com seus respectivos isotipos (Quadro 3). Após incubação durante
20 minutos, as células foram fixadas com formaldeído 1%.
Quadro 3. Painel de marcação das células citotóxicas moléculas citototóxicas Granzima A e
Perforina:
Para análise da secreção de FasL pelas células citotóxicas, células foram permeabilizadas
com tween 0,5% para posterior marcação com os anticorpos antiFasL PE e com o respectivo
isotipo (Quadro 4). Após incubação durante 20 minutos, as células foram fixadas com
formaldeído 1%.
26
Quadro 4. Painel de marcação das células citotóxicas e molécula citotóxica FasL:
As amostras foram analisadas no citômetro FACScan BD (10.000 eventos totais) e
analisadas através do programa Summit versão 4.3 (Dako, EUA).
Para analisar o perfil de secreção de citocinas, expressão de receptores e liberação de
grânulos citotóxicos apenas em células TCD8+ e NK, foi utilizada a seguinte estratégia de
análise. A região de células mononucleares R1, excluindo debris e células inerentes ao processo
como K562 e granulócitos, que não eram os alvos do estudo. Após o estabelecimento dessa
região, outras regiões contendo células CD8+/CD3+ (A2); CD56+CD3+ (B2); CD4- CD3+ (C2)
foram selecionadas. Nestas, foram analisadas a interseção dessas células com os marcadores de
interesse (A3, B3, C3).
27
Figura 14: Estratégia de análise dos mediadores da citotoxicidade. A1 B1 C1: células totais. A2 linfócitos TCD8+CD3+, B2 CD56+CD3-, C2 TCD4-CD3+. A3 Linfócitos TCD8 positivos para INF ϒ, B3 células CD56+ positivas para TNFα, C3 células TCD4- positivas para TNFα.
SS
C
FSC
CD
3
CD4C
D4
TNF
SS
C
FSCC
D3
CD8
INF
CD8
SS
C
FSC
CD
3
CD56
CD
56
TNF
SS
C
FSC
CD
3
CD4C
D4
TNF
SS
C
FSC
CD
3
CD4C
D4
TNF
SS
C
FSCC
D3
CD8
INF
CD8
SS
C
FSCC
D3
CD8
INF
CD8
SS
C
FSC
CD
3
CD56
CD
56
TNF
SS
C
FSC
CD
3
CD56
CD
56
TNF
28
3.7. Anticorpos
Os anticorpos utilizados para caracterização fenotípicas das células citotóxicas e moléculas
envolvidas na citotoxicidade estão listados nas tabelas abaixo (1-3).
Tabela 1: Anticorpos conjugados a fluorocromos: Antígeno Clone Fabricante Fluorocromo
Perforina DG9 BD FITC
Granzima eBioGrB BD PE
INF Mab 11 BD FITC
TNF 4S.B3 BD PE
CD56 NCAM 16.2 BD PE/FITIC
CD8 SK715-18 BD PE
CD3 SK3 BD PERCP
CD4 Leu 14 2a BD FITC
Tabela 2: Anticorpo primário: Antígeno Fabricante Hospedeiro
FasL Biolegend Jumento
Tabela 3: Anticorpo secundário: Descrição Fabricante Fluorocromo
Jumento anti camundongo Biolegend PE
FasL MFL-3 Biolegend
3.7. Estatística
Foram utilizados teste t de Student, One-way ANOVA ou Two-way ANOVA. Foram
considerados estatisticamente significativos experimentos cujo P Value foi menor que 0.05 após a
análise de, no mínimo, três experimentos independentes.
29
4. RESULTADOS
4.1. As CTMs inibem a atividade citotóxica de CMNs contra células leucêmicas
Com o objetivo de esclarecer se as CTMs interferem com a atividade citotóxica mediada
por linfócitos, CMNs foram co-cultivadas com células da linhagem K562 na presença e na
ausência de CTMs. Após 24h de incubação, foi observado um aumento na viabilidade das células
K562 na presença das CTMs (Figura 15).
Figura 15: Células CMNs foram co-cultivadas com células da linhagem K562 (2x10 4), previamente marcadas com CFSE, na presença ou ausência de CTMs. Após o período de 24h de incubação, as células foram recuperadas, marcadas com 7AAD e a citotoxicidade avaliada através da citometria de fluxo. Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão do percentual de células CFSE+ 7AAD+, para 5 experimentos independentes. *p<0,05, **p<0,01.
Citotoxicidade
0
25
50
75
100
CTL 1:6,25 1:12,5 1:25
Alvo:Efetor
C/CTM
S/CTM
**
*
% d
e cé
lula
s vi
ávei
s
30
4.2. O potencial inibidor da citotoxicidade é inerente às CTMs
Para nos certificarmos de que a inibição da citotoxicidade é devido a um mecanismo
inerente às CTMs, substituímos as mesmas pelas células da linhagem tumoral HT29. Estas
possuem alta atividade metabólica e poderiam diminuir a citotoxicidade de CMNs através da
indução de um estado de privação de nutrientes, de forma inespecífica
O efeito inibitório só pode ser observado na presença de CTMs, enquanto que na presença
das células da linhagem tumoral HT29 não houve redução significativa (Figura 16).
Estes resultados mostram que as CTMs inibem, de fato, a citotoxicidade mediada pelas
CMNs.
Figura 16: Células CMNs (5x105 ) foram co-cultivadas com células da linhagem K562 (2x10 4), previamente marcadas com CFSE, na presença ou ausência de CTMs ou HT29. Após o período de 24h de incubação as células foram recuperadas marcadas com 7AAD, e a citotoxicidade avaliada através da citometria de fluxo. Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão do percentual de células CFSE+ 7AAD+, para 4 experimentos independentes. **p < 0,01.
K562
Co-cultu
ra
+CTM
+HT29
0
50
100
150
**ns
Cél
ulas
viá
veis
(%
)
31
4.3. A inibição da citotoxicidade pelas CTMs não envolve a modulação de grânulos
citotóxicos
Para melhor compreender o processo de inibição da citotoxicidade mediada por CMNs,
pelas CTMs, diferentes mecanismos mediados por células citotóxicas, foram avaliados.
A perforina é exclusivamente encontrada nos grânulos citoplasmáticos de células
citotóxicas, e é responsável pela formação de poros na superfície celular. Isso permite a entrada
da Granzima na célula alvo, o que levará a apoptose.
Para avaliar a secreção de grânulos citotóxicos como Granzima e Perforina, CMNs foram
co-cultivadas com células da linhagem K562 na presença ou ausência de CTMs. Após incubação
de 24h, as células foram marcadas com os anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD56, anti-
CD8, anti-Granzima A, anti-Perforina (Figura 17).
A atuação supressora das CTMs pareceu não afetar o mecanismo de citotoxicidade
envolvendo grânulos citotóxicos. Estes resultados sugerem que as CTMs não inibem tal
mecanismo, uma vez que não houve diferença entre as co-culturas tratadas ou não tratadas com
CTMs.
A
B
32
Figura 17: A inibição da citotoxicidade pelas CTMs não envolve a modulação dos grânulos citotóxicos. Células da linhagem K562 (2x10 4), foram co-cultivadas com células mononucleares (5x105 ) na ausência ou presença de CTMs durante 24h. Após o período de incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti- CD8, anti- CD56, anti-Granzima A, anti-Perforina, e analisadas no citômetro de fluxo. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão para cinco experimentos independentes. A e B: secreção de perforina e granzima por células CD56+ CD3- (p=0,2 e 0,1). C e D: secreção de perforina e granzima por células CD8+ CD3+ (p= 0,9). ∆MFI: variação da média de intensidade de fluorescência
C
D
Legenda histograma Ctrl isotipo (Co-cult.) Ctrl isotipo (+CTMs) mAb especiífico (Co-cult.) mAb especifico (+CTMs)
33
4.4. As CTMs não inibem a secreção de citocinas pelas células citotóxicas
A citocina INFγ desempenha vários papéis no sistema imune. Uma de suas funções é
aumentar a expressão da molécula de MHC classe I pelas células alvo, facilitando seu
reconhecimento pelas células efetoras. Já o TNFα pode desencadear o processo de apoptose via
caspases através da ligação ao seu receptor TNFR
O mecanismo de citotoxicidade é mediado, dentre outros fatores, pelo aumento da
secreção destas citocinas. Portanto, a possibilidade da secreção de INFγ e TNFα estar diminuída
na presença das CTMs foi investigada.
Foi observada uma diminuição sutil na secreção de TNFα e INF γ pelas células NK
(CD56+ CD3-). Por outro lado, um aumento sutil da secreção de TNFα pelas células T CD8
(CD8+ CD3+) foi visto. A secreção de INFγ nas células TCD8 não apresentou diferença na
presença de CTMs (Figura 18).
4
A
B
34
Figura 18: As CTMs não inibem de forma significativa a secreção de citocinas pelas células citotóxicas. Células da linhagem K562 (2x104) foram co-cultivadas com células mononucleares (5x105 ) na ausência ou presença de CTMs durante 24h. Após o período de incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti- CD56 (A e B), anti- CD8 (C e D), anti-INFу (B e D), anti-TNFα (A e C) e analisados no citômetro de fluxo. A e B: secreção de TNF α e INF γ por células CD56+ CD3- (p=0,3). C e D: secreção de TNF α e INF γ por células CD8+ CD3+ (p= 0,6 e 0,2). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão para cinco experimentos independentes. ∆MFI: variação da média de intensidade de fluorescência
C
D
Legenda histograma Ctrl isotipo (Co-cult.) Ctrl isotipo (+CTMs) mAb especiífico (Co-cult.)
mAb especifico (+CTMs)
35
4.5. As CTMs podem inibir a citotoxicidade de CMNs através da regulação da via Fas Fas-
L
Dentre os diversos mecanismos que envolvem a citotoxicidade está a via Faz-FasL, para avaliar
possibilidade de as CTMs serem capazes de interferir nesta via, availiamos a secreção de FasL
pelas células efetoras, na presença ou ausência das CTMs. Observou-se que a secreção de FasL
foi diminuída na presença de CTMs, em ambos os tipos celulares NK ou TCD8. Embora a
inibição não tenha sido estatisticamente significativa, este resultado sugere a via de Fas Fas-L
como um dos alvos do mecanismo de inibição da citotoxicidade de CMNs pelas CTMs (Figura
19).
Figura 19: As CTMs podem inibir a citotoxicidade através da via Fas/Fas-L: Células da linhagem K562 (2x104 ) foram co-cultivadas com células mononucleares (5x105 ) na ausência ou presença de CTMs durante 24h. Após o período de incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti- CD8, anti- CD56, anti-FasL, e analisadas no citômetro de fluxo. A : secreção de FasL por células CD56+ CD3- (p=0,1). C e D: secreção de FasL por células CD8+ CD3+ (p= 0,3). Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão para cinco experimentos independentes. ∆MFI: variação da média de intensidade de fluorescência
A
B
Legenda histograma Ctrl isotipo (Co-cult.) Ctrl isotipo (+CTMs) mAb especiífico (Co-cult.) mAb especifico (+CTMs)
36
5. DISCUSSÃO
As CTMs são células multipotentes que atraíram o interesse da comunidade científica não só
pelas características inerentes as células tronco adultas, como a capacidade de auto renovação e
diferenciação em diversos tecidos (Giordano et al., 2007), mas também pelo fato de possuírem
baixa capacidade de estimular respostas imunes (Le Blanc et al., 2003). Além disso, as CTMs
podem ser isoladas de diversos tecidos (Murphy et al., 2004; Tolar et al., 2010), e são de fácil
cultivo e expansão. Em conjunto, essas características apontam essas células como promissoras
no tratamento de diversas doenças.
Diversos trabalhos têm demonstrado uma inibição global das CTMs, não seletiva, sobre as
células do sistema imune. No contexto do TCTH, é possível que este efeito inespecífico seja
capaz de inibir não só linfócitos do doador que reagem contra células do hospedeiro saudáveis,
causando DECH, como também linfócitos do doador que atuam eliminando eventuais células
leucêmicas que sobreviveram ao regime de condicionamento pré TCTH, efeito conhecido na
clínica como enxerto contra leucemia (ECL).
Neste sentido, Ning et al., com o objetivo de avaliar o potenncial terapeutico das CTMs,
conduziu um estudo clínico utilizando dois grupos de pacientes tratados ou não com CTMs,
intravenoso. O grupo relatou que a infusão de CTMs para contenção da DECH resultou no
aumento da recaída da doença de base pós TCTH. Embora o tratamento adicional com CTMs
tenha diminuído a incidência de DECH aguda, cerca de 60% dos pacientes tratados com CTMs
recaíram contra 20% do grupo controle.(Ning et al., 2008).
No entanto, Liu et al. não observaram o mesmo efeito (Liu et al., 2011). Com um estudo
clínico abrangendo dois grupos distintos de pacientes, tratados ou não com CTMs. Neste estudo,
Liu teve como objetivo determinar se o tratamento com CTMs era seguro, se melhora a pega
medular, se diminui a incidência de DECH e se pacientes tratados com CTMs recaíam da doença.
Eles não observaram variaçoes entre os dois grupos, porém foi utilizada um concentração muito
baixa de CTMs neste estudo, o que pode ter impactado nos seus resultados.
Esta discrepância também é observada em modelos in vitro.
Karlson et al., objetivou avaliar se as CTMs possuem especificidade em seu efeito
imunossupressor, uma vez que as infecções são uma das maiores causas de co-morbidade pós
TCTH alogenico, particularmente pelo tratamento para GVHD que requer altas doses de
imunossupressores. Dois importantes agentes patogênicos são o citomegalovírus (CMV) e o
37
Epstein-Barr vírus (EBV). Entre 40% e 70% dos pacientes submetidos ao TCTH são CMV-soro
positivos ou o doador é CMV-soro positivo. A reativação do vírus pode levar ao desenvolvimento
de doenças linfoproliferativas, ocorrendo em torno de 11 a 26 % dos pacientes submetidos ao
TCTH depletados de células T. Neste estudo, utilizando um ensaio de citotoxicidade utilizando 51Cr e co-cultivo de lifócitos específicos e linfócitos pulsados com alo antígenos e antígenos
CMV na presença ou ausência de 10% de CTMs, observaram que as CTMs não foram capazer de
inibir a atividade citotóxica de linfócitos antígeno específicos. (Karlson et al., 2008)
Spaggiari et al., com a finalidade de avaliar o efeito das CTMs sobre as células NK,
mostrou que as CTMs inibem a sua atividade citotóxica contra diversas linhagens de células
tumorais. Utilizando o ensaio de citotoxicidade com 51Cr e o co-cultivo de células NK
purificadas, na presença ou ausência de 10% de CTMs. (Spaggiari et al., 2007)
Devido aos diferentes resultados obtidos por diferentres grupos, o papel das CTMs na
citotoxicidade mediada por linfócitos, bem como sua atuação, ainda precisam ser elucidados.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel das CTMs na citotoxicidade mediada por
linfócitos e células NK, bem como os mecanismos por trás dessa interação. Diversos estudos
foram conduzidos nesse sentido, mas os resultados obtidos por esses grupos foram controversos.
Pontian et al., observaram que as CTMs inibiram a citotoxicidade mediada por células NK e
linfócitos T, utilizando um modelo de CML (cultura mista de linfócitos), assim como Rasmusson
et al., (Pontian et al., 2003; Rasmusson et al., 2003). Outros grupos utilizaram um modelo de
citotoxicidade de células NK estimuladas contra linhagens celulares leucêmicas ou provenientes
de melanoma e obtiveram resultados controversos (Sotiropoulou et al., 2006; Spaggiari et al.,
2007). Finalmente Karlson et al. utilizaram células infectadas com peptídeos virais, e não
observaram inibição da citotoxicidade (Karlson et al., 2008; Ramassamy et al., 2008). Vale
ressaltar que nenhum dos grupos acima citados se propôs a desvendar o mecanismo de inibição
exercida pelas CTMs.
Em nosso estudo, utilizamos células da linhagem leucêmica K562. Escolhemos essa
linhagem, uma vez que nosso objetivo foi elucidar o mecanismo inibitório da citotoxicidade
contra células leucêmicas pelas CTMs. Além disso, essa linhagem foi utilizada em alguns
estudos. (Sotiropoulou et al., 2006)
Cultivamos as células da linhagem K562 com CMNs de doadores saudáveis, na presença
ou ausência de CTMs, e avaliamos a sua viabilidade. Dessa forma, mostramos que na presença
38
das CTMs houve um aumento na viabilidade das células K562 entre 25 e 50%. Para
confirmarmos que o efeito inibitório não se deu em decorrência da privação de nutrientes,
possivelmente ocasionada pela presença de CTMs, conduzimos um ensaio de citotoxicidade
substituindo as CTMs pela linhagem celular HT29 de câncer de colón retal, altamente
metabólicas. Pudemos observar que o efeito inibitório é de fato devido a um mecanismo inerente
as CTMs, uma vez que na presença das células da linhagem tumoral HT29 não houve inibição
significativa. As CTMs não interferem com o mecanismo de citotoxicidade envolvendo grânulos
produzidos pelas células citotóxicas T CD8 e NK, uma vez que não houve diferença na produção
de Granzima e Perforina entre o grupo controle e o grupo cultivado na presença de CTM.
Ribeiro et al observaram em um estudo de comparação da atividade de imunossupressão
utilizando CTMs oriundas de diferentes tecidos, que as CTMs diminuíram além de perforina a
secreção de TNFα em células NK. A secreção de TNFα e INFγ também estão relacionadas com a
citotoxicidade uma vez que TNF α pode induzir a morte celular diretamente através, da ligação
com seu receptor cognato e INFγ induz o aumento da expressão da molécula de MHC de classe I
pelas células alvo, aumentando a sua chance de reconhecimento pelas células citotóxicas. Em
relação às células TCD8, nossos resultados mostram um aumento na secreção de TNFα, porém
nenhuma diferença foi observada em relação a secreção de INFγ. Em relação as células NK,
observamos uma diminuição na secreção de TNFα e INFγ. Entretanto, cabe notar, que estes
dados não tiveram significância estatística. A diminuição da secreção de TNFα e INFγ pelas
células NK na presença das CTMs, sugere que este seja um possível alvo da inibição exercida
pelas CTMs.
Finalmente, o receptor de morte Fas é um membro da família de receptores TNF, sendo
um importante mediador na citotoxicidade, pois sua ativação leva a apoptose. Em nosso estudo
pudemos observar que a secreção de FasL foi inibida em ambos os tipos celulares NK ou TCD8,
embora não tenha sido estatisticamente significativa essa inibição. Estes dados sugerem que esta
via esteja envolvida no mecanismo de inibição da citotoxicidade pelas CTMs. Embora nossa
hipótese tenha sido avaliar a interferência das CTMs na secreção desta molécula pelas células
citotóxicas, alguns grupos vêm relatando a capacidade das CTMs em induzir a apoptose de
linfócitos através da ligação do FasL (CTMs) ao Fas expresso nos linfócitos T (Akyiama et al.,
2012; Murphy et al., 2012).
Em resumo, nossos dados revelaram que as CTMs protegem as células da linhagem
leucêmica K562 da citotoxicidade, uma vez que observamos um aumento na viabilidade das
39
mesmas, quando co – cultivadas com CMNs na presença de CTMs. Esse resultado nos mostrou
que a utilização dessas células para fins terapêuticos requer mais estudos, não somente na área do
TCTH, mas também no que concerne tratamentos de imunossupressão envolvendo doenças
tumorais, pois ainda não está claro se estas células auxiliam na progressão tumoral ou no seu
cerceamento (Sasser et al., 2007; Atsuta et al., 2013).
No que diz respeito ao TCTH, ainda que a DECH seja a co-morbidade mais desenvolvida
por pacientes que se submetem a esse procedimento, a maior taxa de óbitos ainda é a recaída da
doença. Assim, entender como funcionam os mecanismos de imunossupressão exercidos pelas
CTMs se torna fundamental.
40
6. CONCLUSÃO
Com base nos resultados mostrados nesse trabalho, concluímos:
� As CTMs inibem a citotoxicidade mediada pelas células por células mononucleares de
sangue periférico contra células da linhagem leucêmica K562.
� A inibição da citotoxicidade não parece ocorrer através da modulação de grânulos
citotóxicos, Granzima A e Perforina.
� As CTMs diminuíram a secreção da citocina pró-inflamatória TNFα, por células NK e
TCD8 +.
� As CTM diminuíram a secreção da citocina pró-inflamatória INF γ somente em células
NK.
� As CTMs diminuíram a secreção de FasL por ambas células citotóxicas estudadas.
41
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